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CN118599819B - 一种线粒体定位信号肽及应用 - Google Patents

一种线粒体定位信号肽及应用 Download PDF

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CN118599819B CN202411036884.6A CN202411036884A CN118599819B CN 118599819 B CN118599819 B CN 118599819B CN 202411036884 A CN202411036884 A CN 202411036884A CN 118599819 B CN118599819 B CN 118599819B
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Abstract

本发明属于生物医学领域，公开一种线粒体定位信号肽及应用。本发明提供的线粒体定位信号肽，由SEQ ID NO.6、14、18、20任一所示的氨基酸序列组成的多肽。本发明提供的线粒体定位信号肽将目标蛋白靶向定位于线粒体上。该定位信号肽可通过基因克隆或直接化学合成方式获得，与荧光蛋白融合后，可以实现对线粒体进行示踪，显示线粒体探针共定位现象，指示线粒体形态和位置。本发明提供的定位信号肽和适宜的目标蛋白形成融合蛋白，实现高效定向给药，对于生物技术领域和医药领域具有重大价值。

Description

一种线粒体定位信号肽及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种线粒体定位信号肽及应用。
背景技术
细胞器组成了细胞的基本结构，使真核细胞能正常的工作、运转。细胞器是一类通过生物膜，将细胞中的其他部分分隔开来的、功能上独立的亚细胞结构。细胞器可按各自所拥有的膜层数大致分为三类：双层膜细胞器主要包括线粒体和叶绿体等；单层膜细胞器主要包括内质网、高尔基体和溶酶体等；无膜细胞器主要包括核糖体和中心体等。
线粒体（mitochondrion）是一种两层膜包被的细胞器，存在于绝大多数细胞中，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，也被称为能量工厂。线粒体直径在0.5到1.0微米左右。大多数真核细胞或多或少都拥有线粒体，但它们各自拥有的线粒体在大小、数量及外观等方面上都有所不同，如肝脏细胞中有1000-2000个线粒体。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器，线粒体基因组属于母系遗传。据统计，人体中共有1136个定位线粒体的蛋白，这些蛋白绝大多数由细胞核DNA编码，然后在核糖体上进行合成，随后被运输至线粒体中；剩余部分蛋白则由线粒体自身遗传物质进行编码。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。线粒体功能异常与多种疾病密切相关，例如神经疾病、心脑血管疾病、母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leer遗传性视神经病等线粒体病等；另外，线粒体与其他细胞器也保持着密切互作关系，一旦线粒体受损，将会影响细胞器间的互作。研究还发现线粒体功能改变能促进肿瘤转移。线粒体拥有着一套十分精细且复杂的蛋白运输系统，包括线粒体蛋白中的分选定位信号肽和转运复合物等等。在这些定位序列和转运复合物的共同作用下，众多线粒体蛋白通过各类分选途径被精准运输至线粒体不同部位。故通过对这些定位序列进行研究，能够较好地对线粒体进行示踪。
研究蛋白质的转运和亚细胞定位具有很大的应用价值，因为蛋白质的功能通常和其亚细胞定位息息相关，比如病原的分泌蛋白往往是重要的毒力因子，与其致病性紧密相关。此外，信号肽在药物靶向运送及疾病治疗中也具有广泛的应用，比如可以利用核定位信号，可以将治疗基因转移到细胞核中，从而进行疾病的细胞定向基因治疗。由于线粒体与多种疾病有关，特别是一些由于线粒体基因突变而引起的疾病，线粒体定位的信号肽能够将治疗基因靶定位到线粒体上、进行线粒体定向基因治疗，为基因治疗提供一个好的前景。研究线粒体定位信号肽，不仅可以揭示线粒体定位蛋白质的生物学功能和机制，同时还能为特异的线粒体靶向生物技术药物开发提供技术支持。
溶酶体组织蛋白酶H（Cathepsin H，CTSH）是一类主要分布在胞质和溶酶体的组织蛋白酶。溶酶体蛋白同样具备一套精细且复杂的蛋白分选系统。正确的CTSH蛋白信号肽序列能够确保CTSH最终被运输到溶酶体中被加工，最终形成具有酶活的蛋白酶。前期发明人所在团队通过对我国阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者进行全外显子组测序，分析发现CTSH基因是新的AD易感基因，并且，CTSH基因表达增加与AD发病风险显著相关。另外还发现1个位于CTSH基因编码区的非同义变异rs2289702（CTSH c.31G>A/ p.G11R）能够通过干扰转录因子与CTSH基因结合，继而下调CTSH基因表达，降低AD发病风险，发挥一种AD保护学效应。
经检索，现有技术中没有检索到有关CTSH信号肽突变后的多肽具有引导目的蛋白定位到线粒体的报道。
发明内容
针对以上技术问题，本发明目的在于提供一种具备线粒体定位功能的信号肽序列，该信号肽序列能够引导目的蛋白定位到线粒体。
本发明第一方面提供了一种定位线粒体的信号肽，所述信号肽包括下列一种或几种： (a)、由SEQ ID NO .6、14、l8、20任一所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)、包含(a)中所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入中一种或多种的氨基酸序列的多肽。
本发明还保护一种融合蛋白，所述融合蛋白包括上述所述的线粒体定位信号肽和目标蛋白。
进一步地，所述目标蛋白是荧光蛋白。
进一步地，所述线粒体定位信号肽位于所述目标蛋白的N端。
本发明还保护一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码上述所述的线粒体定位信号肽的基因序列，编码所述线粒体定位信号肽的DNA序列选自SEQ ID NO.7、15、19、21任一序列。
本发明还保护一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上述所述的重组表达载体。
本发明还保护线粒体定位信号肽、融合蛋白、重组表达载体或宿主细胞的应用，包括以下几个方面：
1）制备定位线粒体或指示线粒体具体位置或形态的产品；
2）制备将目的蛋白定位或导入线粒体的产品；
3）制备在线粒体中过表达目的蛋白的产品；
4）制备治疗与线粒体相关疾病的药物；制备与线粒体相关疾病的疫苗；
5）制备研究目的蛋白与线粒体的相互作用的产品。
进一步地，所述的与线粒体相关疾病包括遗传病、恶性肿瘤、血液病，病毒、寄生虫、细菌感染。
与现有技术相比，本发明存在以下有益技术效果：
本发明首次发现鼠源或人源CTSH信号肽第11位氨基酸由甘氨酸突变成精氨酸时（CTSH c.31G>A/p.G11R）具有引导目的蛋白定位到线粒体的作用。鼠源CTSH或人源CTSHp.G11R突变信号肽前15位氨基酸截短体也具有将目的蛋白引导到线粒体的功能。本发明的线粒体定位信号肽可以通过基因克隆或直接化学合成方式获得，然后与荧光蛋白进行融合，可以实现对线粒体进行示踪，指示线粒体形态和位置，为线粒体示踪提供新的策略。将本发明提供的线粒体定位信号肽和适宜的目标蛋白形成融合蛋白，可以得到用于治疗遗传病、恶性肿瘤、血液病，病毒、寄生虫、细菌感染等疾病的疫苗和药物，并实现高效定向给药，对于生物技术领域和医药领域具有重大价值。
附图说明
图1为质粒plvx-puro-CTSHG11R-HA图谱；
图2为293T细胞中过表达野生型CTSHWT-HA与CTSHG11R-HA突变体蛋白条带发生变化图。注：KO为敲除细胞；KO-OE-Lentivirus-CTSH为在敲除细胞中，用慢病毒感染的方式进行外源基因表达；
图3为CTSH p.G11R能够将CTSH引导至线粒体结果图，其中图A为CTSHWT-HA免疫荧光结果图；图B为图A的共定位分析结果；图C为CTSHG11R-HA免疫荧光结果图；图D为图C的共定位分析结果。HA即CTSH，Mito-Red线粒体探针。注：红色荧光信号为Mito-Red线粒体探针；绿色荧光信号为CTSH-HA载体的HA蛋白信号；黄色荧光信号说明红色荧光与绿色荧光存在共定位；
图4为CTSHG11R-HA蛋白在线粒体组分富集结果图；
图5为CTSH蛋白结构分析图，其中图A为CTSH蛋白氨基酸序列示意图；图B为CTSH蛋白预测的关键活性氨基酸位点图；
图6为融合CTSH野生型和突变型信号肽(WT-GFP和G11R-GFP)的荧光表达载体测序结果图，WT-GFP与G11R-GFP分别为GFP带着CTSH野生型信号肽(WT)和CTSH突变体信号肽(G11R)；
图7为免疫荧光实验WT-GFP与G11R-GFP定位线粒体结果比较图，其中图A为WT-GFP免疫荧光结果图；图B为图A的共定位分析结果；图C为G11R-GFP免疫荧光结果图；图D为图C的共定位分析结果；WT-GFP与G11R-GFP分别为GFP带着CTSH野生型信号肽(WT)和CTSH突变体信号肽(G11R)；Mito-Red线粒体探针；
图8为CTSHG11R-signal-peptide-GFP蛋白在线粒体组分富集图；
图9为CTSH信号肽蛋白氨基酸序列在多个物种间比较图；
图10为mCtsh p.G11R信号肽GFP质粒测序结果图；
图11为免疫荧光实验mCtshWT-GFP和mCtshG11R-GFP定位线粒体结果比较图；其中图A为免疫荧光实验mCtshWT-GFP定位线粒体结果图，图B为图A中融合图的放大图；C分别为免疫荧光实验mCtshWT-GFP和mCtshG11R-GFP定位线粒体结果图，图D为图C中融合图的放大图；
图12为免疫荧光实验截短体15AA-CTSHWT-GFP与截短体15AA-CTSHG11R-GFP定位线粒体比较图，其中图A为截短体15AA-CTSHWT-GFP免疫荧光定位线粒体结果图，图B为图A中融合图的放大图；图C为截短体15AA-CTSHG11R-GFP免疫荧光定位线粒体结果图，图D为图C中融合图的放大图。
具体实施方式
为了更好地对本发明进行解释，下面结合具体的实验方案和实验结果进行描述。下述描述中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述描述中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可从相应生物试剂公司购买得到的。
细胞株：U251-APP细胞（U251细胞购买自中国科学院昆明动物研究所细胞库），U251-APP的构建方法源自[1]
主要使用的生化试剂：
磷酸盐粉末（Phosphate buffered saline，PBS）（Servicebio，G0002-15），磷酸盐缓液溶液（Servicebio，G4202-500ML），胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）（Gibco-BRL，10099-141），双抗（青霉素和链霉素）（Gibco-BRL，10378016），0.25% Trypsin-EDTA 胰蛋白酶（Gibco，1806021），嘌呤霉素（Solarbio，P8230），Opti-MEM减血清培养基（Gibco，11058021），DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培养基（Gibco，11965092），RPMI1640培养基（Gibco，11875093），基因组DNA提取试剂盒（Axygen，26817KC1），无内毒素质粒小提中量试剂盒（TIANGEN，DP118-02），普通DNA产物纯化试剂盒（TIANGEN，DP204-03），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（增强型）（TIANGEN，DP219-02），DH5α 感受态细胞（DH5α ChemicallyCompetent Cell）（擎科生物，TSC-C14），P克隆粘性末端试剂盒（擎科生物，TSV-007S），P克隆平末端试剂盒（擎科生物，TSV-007B），1.1×T3 Super PCR Mix（擎科生物，TSE030），金牌Mix（擎科生物，TSE101），Lipofectamine 3000转染试剂盒（ThermoFisher Scientific，L3000015），KOD-Plus-Neo 高保真酶（TOYOBO，KOD-401），FastDigest DpnI（ThermoFisherScientific，FD1704），琼脂糖粉（生工，111860），LB培养基（Sigma，L3522），FastDigestBamHI（ThermoFisher Scientific，FD0054），FastDigest XhoI（ThermoFisherScientific，FD0694），抗荧光淬灭封片液（碧云天，P0126），免疫染色通透液（Triton X-100）（碧云天，P0096），DAPI（碧云天，C1002），polybrene（Sigma，TR-1003），多聚甲醛（Paraformaldehyde）（Sigma，158127）。
主要使用的表达载体：
pTango-zeo-C1ORF141-CEGFP的构建方法源自[2]，mito-Red（PT3633-5），plvx-puro-CTSHWT-HA与plvx-puro（PPL，PT4002-5），plvx-puro--CTSHG11R-HA（以plvx-puro-CTSHWT-HA质粒为模版，自行构建），CTSHWT-signal-peptide-GFP和-CTSHG11R-signal-peptide-GFP（以pTango-zeo-C1ORF141-CEGFP质粒为模版，自行构建），mCtshWT-signal-peptide-GFP和mCtshG11R-signal-peptide-GFP（以pTango-zeo-C1ORF141-CEGFP质粒为模版，自行构建）
1. Luo R, Su LY, Li G, et al. Activation of PPARA-mediated autophagyreduces Alzheimer disease-like pathology and cognitive decline in a murinemodel.Autophagy2020; 16: 52-69.
2. Bi R, Li Y, Xu M, et al. Direct evidence of CRISPR-Cas9-mediatedmitochondrial genome editing.The Innovation2022; 3: 100329.
实施例1 线粒体定位信号肽的制备方法以及功能验证
1.1、构建CTSH p.G11R点突变表达载体
以从PPL公司购买的质粒plvx-puro-CTSHWT-HA为模版，通过PCR扩增获得带有突变的质粒plvx-puro-CTSHG11R-HA，质粒图谱如图1所示，其序列如SEQ ID NO.25所示。具体实验步骤如下：
以plvx-puro-CTSHWT-HA为模版，通过点突变引物引入突变位点，人源CTSH p.G11R点突变引物为：
CTSH-31-F：TCTGCGCCAGGGCCT
CTSH-31-R：GGCCCTGGCGCAGAG，引物序列如SEQ ID NO. 1-2所示，
再以质粒为模板通过PCR扩增质粒。扩增完成后用FastDigest DpnI 酶切消化PCR扩增产物，目的是将PCR产物中的原始质粒模版去除（因为模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的），DpnI能够识别甲基化并去除模版（甲基化的GATC序列为DpnI识别序列，并且GATC这段序列广泛存在各种质粒中，因此可以通过识别这段序列去除质粒模板，而PCR扩增得到的带有突变位点的质粒由于不存在甲基化进而不会被DpnI酶切，故而在转化实验中可以成功转化，所以可获得突变的质粒）。DpnI酶切完成后通过普通DNA产物纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物。将DH5α感受态细胞与纯化回收后的PCR产物进行混匀，随后进行转化实验（体积比100:10）。将经过生化培养箱培养后的菌液涂抹于带有氨苄抗性的LB平板。将涂抹后的LB平板倒置放于37 ℃生化培养箱中过夜培养。第二天早上挑取单克隆菌落扩大培养，提取质粒DNA并测序验证是否带有目的变异突变位点，将构建成功的突变质粒保存备用。具体实验方法如下：
表1 PCR点突变体系
表2 PCR点突变程序
表3 DpnI酶切体系及方法
按照上述表格内的加样顺序配制DpnI酶切体系于1.5 mL离心管中，随后将1.5 mL离心管放于37 ℃酶切1小时，再接着做普通DNA产物纯化回收实验。
（4）普通DNA产物纯化回收实验步骤如下所示：
1)平衡吸附柱CB2。向后续使用到的吸附柱CB2中（吸附柱需要放入收集管中）加入500 μL的平衡液BL，12000 rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2重新放回收集管中备用；向PCR反应液或酶切反应液（即DpnI酶切后的PCR产物）加入5倍体积的结合液PB，用移液枪吹吸混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。如果PCR反应体系为50μL，则加入250 μL结合液PB。将所得溶液转移至平衡后的一个吸附柱CB2（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12000 rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CB2重新放入收集管中向吸附柱CB2中加入600 μL漂洗液PW（使用前按照试剂盒说明书或试剂瓶身上的标签提示加入无水乙醇，混匀后再使用），室温放置5 min，12000 rpm（~13400× g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放入收集管中。重复上一步骤操作；将吸附柱CB2重新放回收集管中，12000 rpm（~13400 × g）离心2 min，弃掉收集管中废液。室温放置10 min，彻底晾干。将吸附柱CB2重新放回新的干净1.5 mL离心管中，向吸附柱CB2膜中心悬空滴加30 μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12000 rpm（~13400 × g）离心2min收集纯化回收到的DNA溶液。为了提高DNA纯化回收效率，可以将离心后的溶液重新悬空滴加到吸附柱CB2膜中心，室温再放置2 min，12000 rpm（~13400 × g）离心2 min，再次收集离心后的DNA溶液，即为纯化回收后的DNA溶液。通过琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计NanoDrop 2000检测纯化回收后的DNA溶液浓度与纯度。
（5）转化实验步骤如下所示：
取1管DH5α 感受态细胞（体积100 µL）放置冰上融化约3 min。加入10 µL目的DNA溶液（上一步纯化回收后的DNA溶液），用移液枪轻轻混匀细胞悬液，将混匀后的细胞悬液放置冰上30 min。冰上静置30 min后，将细胞悬液静置于42 ℃水浴进行热激45 s，热激结束后迅速将细胞悬液放至冰浴中，静置2 min。在超净工作台中向装有细胞悬液的离心管中加入700 µL不含抗生素的无菌液体培养基（如LB培养基），移液枪轻轻混匀，将感受态细胞悬液横放于37 ℃ 200 rpm转速的生化培养箱中复苏60 min。根据实验需要吸取不同体积（本次实验取100 µL）的复苏液均匀涂布到含有氨苄抗生素LB固体培养基上（平板），随后将平板倒置放于37 ℃培养箱过夜培养。第二天早上在超净工作台中挑取平板上的单克隆菌落于带有氨苄抗生素的LB液体培养基（氨苄抗生素终浓度为50 μg/mL）中扩大培养，提取质粒DNA并测序验证是否带有目的变异突变位点，保存突变成功的质粒备用。
（6）无内毒素质粒小提中量试剂盒提取质粒DNA实验步骤如下所示：
柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 µL平衡液BL，12000rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，再将吸附柱CP4重新放回收集管中备用。取15 mL过夜培养的菌液至2 mL离心管中，室温12000 rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉上清培养基。向留有菌体沉淀的2 mL离心管中加入500 µL溶液P1（使用溶液P1前，请先将试剂盒带有的RNaseA加入至溶液P1中），使用移液枪吹吸或旋涡振动器彻底悬浮细菌细胞沉淀。这步需要彻底悬浮细菌细胞沉淀，肉眼观察无明显团块为止。向离心管中加入500 µL溶液P2，温和上下颠倒离心管8次，使离心管中的溶液充分达到充分裂解细菌细胞团块目的。此时管子混匀后菌液应该变得清亮粘稠。向离心管中加入500 µL溶液P4，立即混合上下颠倒离心管8次，充分混匀溶液，此时应该会出现白色絮状沉淀，然后将离心管室温静置10min。随后12000 rpm（~13400 × g）离心10 min，离心后离心管底部应该出现大量沉淀。溶液P4加入后需要立即混匀，避免出现局部反应产生局部沉淀。如果离心后上清中还有白色小颗粒，可以再次离心后取上清。将上一步收集到的上清液分次转移到过滤柱CS（过滤柱放入收集管中，过滤柱最大容积800 µL），12000 rpm（~13400 × g）离心2 min，滤液收集在新的干净2 mL离心管中。向收集好的滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，混匀后分批次转移至平衡好的吸附柱CP4中（吸附柱最大体积800 µL，吸附柱CP4放入收集管中）。室温12000rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放回收集管中，再次加入上一步混匀后的液体，重复操作离心，弃掉滤液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。直至上一步混匀的液体转移完毕。向吸附柱CP4中加入500 µL去蛋白液PD，室温12000 rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。向吸附柱CP4中加入600 µL漂洗液PW（使用前按照试剂盒说明书或试剂瓶身上的标签提示加入无水乙醇，混匀后再使用），室温放置5 min，12000 rpm（~13400 × g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放入收集管中。重复上述步骤。将吸附柱CP4重新放回收集管中，12000 rpm（~13400 × g）离心2 min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CP4放置于一个新的干净离心管中，室温放置10 min，彻底晾干；向吸附柱CP4的吸附膜中间部位悬空滴加100 µL洗脱缓冲液TB，室温放置2 min。12000 rpm（~13400 × g）离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。为了提高质粒DNA的回收效率，可以将离心后的溶液重新悬空滴加到吸附柱CP4膜中心，室温再放置2 min，12000 rpm（~13400 × g）离心2 min，再次收集离心后的质粒DNA溶液。得到的质粒DNA一方面可以冻存备用，另外一方面可以用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所提取的质粒DNA浓度与纯度。
1.2、构建带有CTSHWT-signal-peptide-GFP与CTSHG11R-signal-peptide-GFP信号肽荧光质粒
分别以从PPL公司购买的质粒plvx-puro-CTSHWT-HA和上述构建成功的plvx-puro-CTSHG11R-HA为模版，分别设计克隆CTSH质粒信号肽区域的PCR引物，人源CTSH信号肽克隆引物：
MTS-CTSH-BamHI-F：CGCGGATCCATGTGGGCCACGCTGCC
MTS-CTSH-XhoI-R：CCGCTCGAGGGCACCGCAGACGGGGA，引物序列如SEQ ID NO. 3-4所示。
同时，在上游引物的5`端增加BamHI酶切序列与保护碱基序列（保护酶切位点）；在下游引物的5`端增加XhoI酶切序列与保护碱基序列，分别克隆CTSHWT野生型与CTSHG11R突变体的信号肽序列，所述的人源CTSHWT野生型与CTSHG11R突变体的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO. 5-6所示，所述的人源CTSHWT野生型与CTSHG11R突变体的信号肽的DNA序列如SEQ ID NO.7-8所示，然后再用DpnI酶将模版质粒去除，再用PCR产物纯化回收试剂盒纯化回收DpnI酶切后的产物，并测定回收产物浓度（具体操作同上）。然后用BamHI和XhoI酶对纯化后的PCR产物进行双酶切，双酶切体系如下：
表4 双酶切工作液-PCR产物
按照上述体系配制双酶切混合液，静置放于水浴锅37 ℃ 1 hour。同时，再以pTango-zeo-C1ORF141-CEGFP质粒为模版，用BamHI和XhoI酶同时进行双酶切，双酶切体系如下：
表5 双酶切工作液-质粒
双酶切实验完成后，用普通纯化回收试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。然后通过T4 DNA连接酶将克隆带有CTSHWT野生型与CTSHG11R突变体的信号肽片段与pTango-zeo-C1ORF141-CEGFP进行连接，连接体系如下：
表6 T4 DNA连接酶工作液
按照上述表格配制T4 DNA连接酶连接体系，温和混匀后静置于22 ℃ PCR仪上反应1 hour。连接反应结束后开始转化实验，然后提质粒DNA与测序验证质粒是否构建成功，具体实验操作同上。得到的带有CTSHWT-signal-peptide-GFP与CTSHG11R-signal-peptide-GFP信号肽荧光质粒如图6所示。
1.3、将构建成功的质粒通过脂质体转染方式在细胞中进行表达
主要是采用脂质体介导外源DNA表达的方式，通过Lipofectamine 3000转染试剂盒来完成质粒DNA外源表达实验，下面以细胞6孔板体系进行描述，具体方法如下所示：
1)提前一天接种细胞至6孔板（2 × 105/孔），需要提前计算好细胞密度。接种24小时后（细胞密度约80% - 90%）开始进行转染实验。
2)按照下表配制转染体系
表7 转染工作液配方
该体系主要适用于6孔板体系，如果转染体系是12孔板或24孔板，则按照等比例减少体系内各试剂使用量即可。
3)A管和B管配制好后，将两管混合在一起，温和地用移液器吹吸混匀，静置15min; 将6孔板的细胞培养基置换成Opti-MEM培养基（6孔板500 μL/孔）; A管和B管混匀静置15 min后，将混匀后的溶液均匀滴加到各自对应的6孔板中，随后温和晃动摇匀孔板中的溶液，静置于5% CO2和95%湿度的37 ℃培养箱4 - 6 hours; Opti-MEM孵育4 - 6 hours后换成正常培养基培养细胞。
1.4、免疫荧光实验
1)细胞处理和细胞固定：将目的细胞提前接种至腔式玻片内，细胞密度为5 ×104个/mL，在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养24 hours。细胞固定：将腔式玻片从细胞培养箱中取出，弃掉细胞培养基，用PBS室温条件下清洗3次，5 min/次。随后加入500 μL 4%PFA固定液，在37 ℃条件下固定15 min或4 ℃条件下过夜固定。
2)细胞膜打孔透膜和封闭：弃掉4% PFA固定液，室温条件下用PBS清洗3次，5 min/次。随后加入500 μL TritonX-100试剂进行细胞膜打孔透膜，室温条件下静置10 min。封闭：弃掉TritonX-100试剂，室温条件下用PBS清洗1次，5 min/次，加入500 μL 5% BSA封闭液进行封闭，室温条件下封闭30 min。
3)孵育一抗和孵育二抗：弃掉封闭液，室温条件下用PBS清洗3次，5 min/次，随后加入一抗（如HA抗体和CTSH抗体等，一抗比例根据抗体说明书进行摸索），4 ℃条件下孵育过夜。孵育二抗：回收一抗孵育溶液，室温条件下用PBS清洗3次，5 min/次，随后加入对应种属的二抗荧光抗体，室温条件下孵育1 hour。
4)染核、封片、拍照：弃掉二抗孵育液体，室温条件下用PBS清洗3次，5 min/次，随后加入DAPI试剂（染色浓度为10 μg/mL）室温条件下染核10 min;)封片：弃掉DAPI溶液，室温条件下用PBS清洗3次，5 min/次。然后滴加抗荧光淬灭剂于细胞表面进行封片。使用激光共聚焦或其他荧光高分辨显微镜进行观察拍照。
1.5、检测目的载体蛋白表达情况
主要通过Western Blot技术来检测外源表达质粒是否正常表达，具体操作如下：
1)蛋白提取和总蛋白浓度测定：使用WB/IP细胞裂解液裂解扩大培养收集后的单细胞团块，提取细胞总蛋白。先往96孔板中加入18 μL PBS，然后分别加入2 μL待测样品，再加入BCA试剂盒中A液和B液（体积比50:1）的混合物200 μL/孔，试剂加完后将96孔板静置于生化培养箱37 ℃，30 min，随后利用酶标仪测定蛋白浓度，计算以同样以20 μg为标准上样量时，各组样品所需的体积及配置溶液进行蛋白表型。变性后的样品直接用于后续实验，或者置于-80 ℃冰箱中备用（具体请参考2.2）。
2)对蛋白样品进行变性处理：根据测定的浓度，每个样品总体积为20 μL，然后分别取20 μg蛋白，取4 μL 5 × SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，用PBS补足20 μL后，混匀适当离心，接着95 ℃热变性5 min，然后立即静置于冰上3 min。
3)跑电泳和转膜：将上一步变性好的蛋白加入到SDS-PAGE胶孔中，先以80 V电泳跑40 min，然后以120 V电泳跑90 min。将从Servicebio公司购买的SDS-PAGE转膜粉末溶解于水中，每袋SDS-PAGE转膜粉末可以配1 L转膜液（800 mL水加入200 mL甲醇），充分混匀备用。接着裁剪与PAGE胶大小差不多PVDF膜，将PVDF膜放置到甲醇溶液中30 sec，激活PVDF膜，随后将其放入转膜液中备用。然后将滤纸和海绵（大小接近PAGE胶大小）都浸泡在转膜液中，通过“三明治”和“湿转”完成转膜。“三明治”：按照黑面转膜装置-海绵-滤纸-蛋白胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白面转膜装置的顺序将“三明治”放入浸泡有转膜液的转膜仪中（转膜过程会放热，因此需要用冰水保持一定的低温），“湿转”不超过2.5 hour，转膜条件为100V，200 mA（单个转膜仪）。
4)封闭、孵育一抗和孵育二抗：转膜结束后，将PVDF膜从“三明治”中取出，并转移到盛有用1 × TBST和5%脱脂奶粉溶液配制的封闭液中，放于水平摇床上室温孵育两小时。封闭完成后，在室温条件下，在水平摇床上用1 × TBST洗PVDF膜3次，5 min/次，目的是将PVDF膜上残留的封闭液除尽。洗膜结束跟，根据实验需求，提前规划好目标蛋白的分子量大小，然后根据目的蛋白抗体的大小对PVDF膜进行裁剪，然后将抗体分别倒进装有裁剪后PVDF膜的盒子中，放在4 ℃冰箱中孵育过夜。第二天将4 ℃冰箱中的一抗分别回收到原管中，在室温条件下，在水平摇床上用1 × TBST洗PVDF膜3次，5 min/次，目的是将PVDF膜上残留的一抗除尽。然后根据一抗的种属分别用对应的二抗配制二抗稀释液，并在室温水平摇床上缓慢摇动进行孵育1 hour。
5)清洗、显影：室温孵育完二抗后，弃掉二抗，在室温条件下，在水平摇床上用1 ×TBST洗PVDF膜3次，5 min/次，目的是将PVDF膜上残留的二抗除尽，避免对后续显影造成干扰。按照等体积（体积比1:1）配制方法将化学发光底物A液和化学发光底物B液进行混匀，配制成显影工作液，随后将PVDF膜放于自封袋中，将显影工作液滴加到PVDF膜上，用Bio-Rad荧光图像分析仪进行曝光显影。
1.6、线粒体蛋白酶保护实验原理及方法
由于线粒体是一种双层膜结构的细胞器，因此可以用蛋白酶对提取到的线粒体蛋白进行处理。如果一个蛋白位于线粒体外膜或外部，那就会被蛋白酶进行消化降解；反之如果一个蛋白位于线粒体内部，那么该蛋白就会被线粒体膜所保护，抵抗蛋白酶对其进行降解。根据这一原理，发明人使用浓度为15 μg/mL Proteinase K处理粗提得到的线粒体蛋白悬液，冰上反应30 min，立刻加入PMSF（1 x）终止反应，然后进行蛋白变性实验，最终通过WB实验验证目的蛋白的分布情况。
实验结果：
（1）表达CTSH p.G11R突变导致CTSH出现新的蛋白条带。在敲除CTSH基因的293T细胞（KO）中，过表达CTSHWT野生型时，CTSH抗体条带与野生型细胞293T条带均一致（28 kDa），说明本发明过表达CTSHWT质粒能够正确表达CTSH目的蛋白，而HA抗体识别的则是CTSH前体（41 kDa），说明CTSHWT质粒构建是成功的。在过表达CTSHG11R突变体时，发现CTSHG11R突变体并没有形成28 kDa的CTSH成熟体，而是形成了新的截短体（图2），提示CTSHG11R突变可能介导了某些新的蛋白加工方式，导致新的截短体出现。
（2）CTSH p.G11R突变导致CTSH亚细胞定位发生改变，将CTSH蛋白易位线粒体。在敲除CTSH基因的U251-APP细胞中分别过表达CTSHWT-HA和CTSHG11R-HA，通过对HA标签进行示踪。发现CTSHWT-HA野生型呈现一种胞质分布；而CTSHG11R-HA则呈现一种类似点状聚集体的分布，结合Mito-Red探针（融合线粒体基因COX8A信号肽的红色荧光表达质粒，作为线粒体示踪的阳性对照），提示CTSH p.11G>R突变能够将CTSH易位至线粒体（图3）。
此外，进一步通过提取线粒体蛋白来证明CTSHG11R突变体具有线粒体定位功能。首先将所提取的蛋白组分分成粗提线粒体组分和除线粒体以外的其他组分两组。已知的线粒体蛋白，如MFN2、COXIV，均富集于线粒体组分，而胞质分布的蛋白如TUBULIN、GAPDH，均富集于其他组分。针对CTSH，我们在粗提线粒体组分中检测到野生型CTSHWT-HA，但其主要还是富集于其他组分，说明野生型CTSHWT-HA主要分布在胞质中，同时少量分布在线粒体（图4），这一结果也与前期免疫荧光结果一致，均能够证明CTSHWT-HA野生型主要在胞质分布。有意思的是，结果发现CTSHG11R-HA突变体明显在线粒体组分中富集，这进一步证明了CTSHG11R突变体转位到了线粒体（图4）。发明人又通过蛋白酶K保护实验来进一步确定CTSHG11R-HA是否能够进入线粒体，还是仅停留在外膜上。线粒体是一种双层膜结构的细胞器，在蛋白酶K处理的情况下，位于线粒体内的蛋白，会被线粒体膜保护，而不会被蛋白酶K所降解。依据这一原理，将粗提的线粒体用不同浓度的蛋白酶K处理，再提取线粒体蛋白。结果显示，线粒体外膜蛋白如MFN2在线粒体组分中能够被检测到（图4），但在用蛋白酶K处理过的线粒体组分中无法检测到（图4）；相反，线粒体内膜蛋白COXIV则依然能够在蛋白酶K处理过的线粒体组分中检测到（图4）。而富集于线粒体组分的CTSHG11R-HA在蛋白酶K处理以后就检测不到了，提示突变型CTSHG11R-HA富集于线粒体，并在线粒体外膜发挥功能。
（3）CTSH p.G11R突变位于CTSH蛋白信号肽区域。
为了进一步研究CTSH p.G11R突变所编码的氨基酸位于CTSH蛋白的哪种结构域上，通过AlphaFold Protein Structure Database蛋白结构预测网站（https://alphafold.ebi.ac.uk/）和NCBI数据库与文献报道对CTSH蛋白结构进行分析，人源CTSH蛋白信号肽由22个氨基酸组成，CTSH p.G11R突变位点所编码的氨基酸位于信号肽区域第11位氨基酸，导致甘氨酸到精氨酸的突变（p.G11R）（图5）。人源CTSH蛋白信号肽及突变肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 5-6所示，编码其的DNA序列分别如SEQ ID NO. 7-8所示。
（4）CTSH p.G11R突变信号肽能够将GFP引导到线粒体上。
为进一步探索CTSHG11R突变介导CTSH转位线粒体是否直接由信号肽介导，分别将CTSHWT野生型的信号肽序列与CTSHG11RCTSHG11R突变体的信号肽序列克隆至GFP荧光蛋白上游（信号肽与GFP序列融合在一起，位于GFP序列的N端，图6）。
将构建成功的野生型CTSH引导肽的GFP（WT-GFP）荧光蛋白表达质粒和突变体CTSH引导肽的GFP（G11R-GFP）荧光蛋白表达质粒分别在敲除CTSH基因的U251-APP细胞中过表达，发现融合了WT野生型信号肽的GFP荧光蛋白（WT-GFP）弥散分布在整个细胞中（图5），而融合了G11R突变体信号肽的GFP荧光蛋白（G11R-GFP）则与线粒体荧光探针Mito-Red共定位（图7），证明野生型CTSH蛋白信号肽不具备线粒体定位功能，而CTSHG11R突变型CTSH蛋白信号肽具备线粒体定位功能，能够将GFP荧光蛋白定位到线粒体。另外，利用同样的生化方式进行验证，发现G11R突变型信号肽的GFP蛋白在线粒体组分富集，进一步验证了带有CTSHp.G11R突变的CTSH蛋白信号肽具有线粒体定位功能（图8）。
可见，本发明线粒体荧光定位多肽可以显示线粒体探针共定位现象，且对细胞无毒副作用，能够用于线粒体相关的基础研究中过表达基因或者作为线粒体指示蛋白。
（5）CTSH p.G11R突变信号肽在不同物种间序列相似度高。
通过比对多个物种的CTSH信号肽氨基酸组成，发现CTSH信号肽区域（前22个氨基酸）相对保守，尤其是前15位氨基酸区域。此外，CTSH p.G11R突变所处位置更为保守（图9）。因此推断不同物种间的CTSH蛋白突变（CTSH p.G11R）信号肽同样具备线粒体定位功能。
通过PCR克隆相关方法（方法同实施例1.2），获得带有鼠源CTSH野生型信号肽GFP载体，鼠源CTSH野生型信号肽克隆引物序列如下：
Mouse-MTS-CTSH-BamHI-F：cgcggatccatgtgggctgcgctgcc
Mouse-MTS-CTSH-XhoI-R：ccgctcgagggcggtggccccagtactc，引物系列如SEQ IDNO. 9-10所示。
在获得带有鼠源CTSH野生型信号肽GFP质粒后，按照构建点突变质粒方法（方法同实施例1.1），获得鼠源CTSH p.G11R突变信号肽GFP质粒。构建鼠源CTSH p.G11R突变信号肽GFP质粒引物序列如下：
Mouse-G11R-F：TGTGCGCTAGGGCCTGG
Mouse-G11R-R：CCAGGCCCTAGCGCACA，所述引物序列如SEQ ID NO. 11-12所示。
所述的鼠源CTSH野生型信号肽和鼠源CTSH p.G11R突变信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 13-14所示，编码其的DNA序列如SEQ ID NO. 15-16所示。分别获得带有鼠源CTSH p.G11R突变信号肽GFP质粒（mCtshG11R-signal-peptide）和不带鼠源CTSH p.G11R突变信号肽GFP质粒（mCtshWT-signal-peptide），鼠源CTSH信号肽相关质粒测序结果均正确（图10）。按照上述的方法，将它们分别转染至鼠源N2A细胞。
结果发现：带有鼠源CTSH p.G11R突变信号肽同样能够将GFP定位至线粒体，即鼠源CTSH p.G11R突变信号肽具备线粒体定位功能（图11）。
（6）1-15截短体mCtsh p.G11R突变信号肽同样具备线粒体定位功能。
在对CTSH蛋白信号肽物种保守性分析时，发明人发现CTSH蛋白信号肽前15位氨基酸区域较为保守。通过体外化学合成方法，分别获得人源和鼠源CTSH p.G11R突变的截短体序列（擎科公司，订单号KM0052572）。人源CTSH信号肽前15位氨基酸、人源CTSH p.G11R突变信号肽前15位氨基酸、鼠源CTSH信号肽前15位氨基酸、鼠源CTSH p.G11R突变信号肽前15位氨基酸的序列分别如SEQ ID NO. 17-20所示，编码其的DNA序列分别如SEQ ID NO. 21-24所示。当这15位氨基酸序列与GFP荧光蛋白进行融合后，同样发现带有mCTSH p.G11R突变的截短体序列依然具备线粒体定位功能（图12）。图12的结果表明：无论是鼠源CTSH还是人源CTSH p.G11R突变信号肽前15位氨基酸截短体，都能够将GFP蛋白引导到线粒体。

Claims (7)

1.一种线粒体定位信号肽，其特征在于：所述信号肽包括下列一种或几种：由SEQ IDNO .6、14、l8、20任一所示的氨基酸序列组成的多肽。
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如权利要求1所述的线粒体定位信号肽和目标蛋白。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述目标蛋白是荧光蛋白。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述线粒体定位信号肽位于所述目标蛋白的N端。
5.一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码权利要求1所述的线粒体定位信号肽的基因序列，编码所述线粒体定位信号肽的DNA序列选自SEQID NO.7、15、19、21任一序列。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求5所述的重组表达载体。
7.一种如权利要求1所述的线粒体定位信号肽、如权利要求2所述的融合蛋白、如权利要求5所述的重组表达载体或如权利要求6所述的宿主细胞的应用，其特征在于：包括以下几个方面：
1）制备定位线粒体或指示线粒体具体位置或形态的产品；
2）制备将目的蛋白定位或导入线粒体的产品；
3）制备在线粒体中过表达目的蛋白的产品；
4）制备研究目的蛋白与线粒体的相互作用的产品。
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