CN105567641A - 一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法，包括以下步骤：(1)构建表达肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT-87aa的融合基因表达质粒；(2)将表达质粒转染到人的胚肾细胞HEK293细胞中，puro抗生素筛选获得稳定表达抗肿瘤融合蛋白的细胞系；(3)细胞扩增培养，对细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome进行分离纯化。本发明的方法成功构建了一种仿生物源性抗肿瘤蛋白输送载体，能够高效抑制肿瘤的生长，为恶性的治疗提供了一种潜在的理想的治疗方法。
Description
技术领域
本发明属于分子细胞生物学领域，具体涉及一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法及其应用。
背景技术
药物传输系统(drugdeliverysystem)是指为提高疗效，在防治疾病的过程中，人们采用多种治疗药物的不同的给予药物的方法，目前药物传输系统分为以下几种：缓释、控释给药系统；靶向给药系统；脉冲式给药系统；经皮给药系统等。
外泌体(exosome)是直径约为30-100nm、密度为1.13-1.21g/m1的囊泡，是由细胞分泌的纳米级颗粒。外泌体广泛天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳及体外细胞培养液。外泌体最早由Trams等于1981年在正常细胞和肿瘤细胞培养上清液中被发现。外泌体属于生物体内囊泡的一种，早期的研究认为，外泌体执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。直到2007年，研究人员发现外泌体也运输核酸，参与细胞间通讯。2013年美国、德国3位科学家James、RandyW和ThomasC因发现细胞内的主要运输系统——囊泡运输的调节机制，荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。外泌体由于携带多种蛋白质、miRNA、ncRNA，作为细胞物质运输的载体发挥重要的生物学功能。例如，肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、RNA等，成为细胞物质运输的天然载体，2011年Matthew等人通过构建携带沉默siRNA-BACE1的人工外泌体，将药物突破血脑屏障靶向送入大脑细胞，可见外泌体有望成为一种新型天然的理想药物运输载体。
我们前期研究发现了一种天然的抗肿瘤蛋白，该蛋白由人的LINC-PINT基因(基因登录号NR_015431)编码，该蛋白是由87个氨基酸组成的分子量为9.6KD的小蛋白，命名PINT-87aa；细胞功能学研究发现该蛋白可以进入外泌体(exosome)被细胞分泌出去，发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。Lamp2b基因属于外泌体膜上的一种蛋白，由研究者将目标蛋白与此蛋白融合表达，可以将目标蛋白装载到外泌体中。肿瘤穿透肽iRGD(CRGDK/RGPD/EC)是由9个氨基酸组成的肿瘤靶向性多肽，2010年KazukiSugahara等用这种可穿透实体肿瘤的iRGD多肽以化学方式和抗肿瘤药物发生结合使得药物进入到体内生长的肿瘤的血管外组织之中，发挥强效的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效抑制肿瘤生长的仿生物源性抗肿瘤蛋白输送载体。
为此，本发明提供了如下技术方案。
一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建表达肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT-87aa的融合基因表达质粒；
(2)将表达质粒转染到人的胚肾细胞HEK293细胞中，puro抗生素筛选获得稳定表达抗肿瘤融合蛋白的细胞系；
(3)细胞扩增培养，对细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome进行分离纯化。
优选地，所述步骤(1)中，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
优选地，所述步骤(1)中，将编码LAMP2蛋白的核苷酸序列，去掉终止密码子后添加T2A多肽连接子与PINT-87aa蛋白连接，lamp2b的另一端连接编码iRGD的核苷酸序列，获得此片段后通过NheI、BamHI两个限制性内切酶将所述片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒中。
优选地，所述步骤(2)中，将HEK293细胞50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和5微升表达质粒制成质粒MIX1混合液；将100微升无血清培养基DMEM+6微升liop2000脂质体均匀混合，制成脂质体MIX2混合液；将MIX1混合液和MIX2混合液等比例混合，室温放置20min；按照转染试剂操作说明书操作；最终6孔板中的孔终体积为1毫升，转染6小时后，换成1毫升普通培养基，细胞培养条件为37℃、5％(体积浓度)二氧化碳；细胞培养48小时后，换用终浓度为2mg/L的puro嘌呤霉素进行筛选，隔日换液，筛选5天后，建立稳定表达抗肿瘤蛋白PINT-87aa的HEK293细胞系。
优选地，所述正常培养基为DMEM培养基加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素，以上百分比为体积百分比。
优选地，所述步骤(3)中，采用差异离心的方法从HEK293培养细胞液中分离纯化exosome。
优选地，所述步骤(3)包括：当HEK293细胞培养到80％融合度的时候，撤去培养基，PBS洗涤细胞3遍，换成无血清无双抗的基础培养基DMEM，继续培养细胞48小时；之后收取细胞培养上清，按照如下操作分离纯化培养上清中的exosome：所述细胞培养上清置于50ml离心管中，4℃、1000×g离心5min，去除较大的细胞碎片，取第一上清；然后将所述第一上清于4℃、16500×g离心30min，取第二上清；然后将所述第二上清于4℃、100000×g离心2h，弃上清，取第一沉淀；将所述第一沉淀用1mlPBS吹打洗涤，然后4℃、100000×g离心2h，弃上清，取第二沉淀；然后再用PBS洗涤所述第二沉淀，于4℃、100000×g离心2h，最后得到第三沉淀，即为分离纯化后的exosome。
本发明还提供了所述方法制备获得的exosome在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。
本发明将抗肿瘤蛋白PINT-87aa与肿瘤靶向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融合，构建基因融合表达质粒，将质粒转染到供体细胞HEK293中，嘌呤霉素puro筛选构建稳定表达融合蛋白的细胞株。我们将构建的稳定表达抗肿瘤蛋白融合基因的供体细胞扩增培养，提取细胞分泌的exosome，并采用恶性脑胶质瘤细胞U251对exosome的功能效果进行测试。细胞功能学实验结果显示，本发明人工制备的exosome能够有效的抑制肿瘤细胞U251的生长。由此可见，本发明成功构建了一种仿生物源性抗肿瘤蛋白输送载体，能够高效抑制肿瘤的生长,为恶性的治疗提供了一种潜在的理想的治疗方法。
附图说明
图1是抗肿瘤蛋白PINT-87aa与肿瘤靶向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融合表达质粒的构建示意图。
图2是供体细胞HEK293稳定表达抗肿瘤蛋白PINT-87aa的荧光图片。
图3是蛋白检测exosome中PINT-87aa的表达情况。
图4是MTT检测抗肿瘤exosome抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。除非另外指出，本发明及以下实施例中所涉及的术语、英文缩写均为本领域技术人员可理解。
一：肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT-87aa的融合基因表达质粒构建
根据文献RuoslahtiE等报道使用的的肿瘤靶向性多肽iRGD(氨基酸序列：CRGDKGPDC)，设计了编码该多肽的核苷酸序列；根据NCBI基因库中提交的LAMP2(基因号NM_013995)全长RNA序列，找出编码蛋白的序列，去掉终止密码子后添加T2A多肽连接子与PINT-87aa蛋白连接，lamp2b的另一端连接编码iRGD的核苷酸序列，该框架核苷酸全序列长度为1575bp，其构建示意图如图1所示，具体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。将1575bp序列采用全基因化学合成的方法获得完整片段(全基因合成委托商业化公司上海捷瑞生物)；获得此片段后通过NheI和BamHI两个限制性内切酶将片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(SBI公司货号CD513B-1)质粒中；同时构建对照质粒(即不携带PINT-87aa抗肿瘤蛋白)。抗肿瘤蛋白PINT-87aa与肿瘤靶向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融合表达质粒构建示意图如图1所示。
所述抗肿瘤蛋白PINT-87aa与肿瘤靶向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融合表达质粒构建1575bp基因全长序列，如SEQIDNO:1所示。
PINT-87aa氨基酸序列87个氨基酸全长序列如SEQIDNO:2所示。
二：肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT‐87aa的融合基因表达质粒转染HEK293细胞
将步骤一中构建的融合基因表达质粒转染HEK293细胞，并用puro抗生素筛选稳定表达细胞系，具体实施方式如下：
将HEK293细胞50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和5微升(2微克)表达质粒做成质粒MIX1混合液；将100微升无血清培养基DMEM+6微升liop2000脂质体均匀混合，做成脂质体MIX2混合液；将MIX1混合液和MIX2混合液等比例混合，室温放置20min；按照转染试剂操作说明书操作；最终6孔板中的孔终体积为1毫升，转染6小时后，换成正常培养基(DMEM培养基加10％(体积百分比)胎牛血清和1％(体积百分比)青霉素-链霉素)1毫升，细胞培养条件37℃、5％二氧化碳。细胞培养48小时后，换用含终浓度为2mg/L的puro嘌呤霉素进行筛选，隔日换液，筛选5天后，建立稳定表达抗肿瘤蛋白PINT-87aa的HEK293细胞系。通过荧光显微镜观察，成功构建稳定表达抗肿瘤蛋白的HEK293细胞，其100％发出绿色荧光蛋白，结果如图2所示。
三：分离纯化鉴定HEK293细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome
1.采用差异离心的方法从HEK293培养细胞液中分离纯化exosome
HEK293细胞培养到80％融合度的时候，撤去完全培养基，PBS洗涤细胞3遍，换成无血清无双抗的基础培养基DMEM，继续培养细胞48小时；然后收取细胞培养上清，按照如下操作分离纯化培养上清中的exosome：细胞培养上清于50ml离心管中，4℃、1,000×g离心5min，去除较大的细胞碎片，取上清到一个新的离心管中；然后4℃、16,500×g离心30min，取上清到一个新的离心管中；然后4℃、100,000×g离心2h，弃掉上清，沉淀是exosome；沉淀用1mlPBS吹打洗涤，然后4℃、100,000×g离心2h，弃掉上清，沉淀是exosome；然后再重复一遍用PBS洗涤，4℃、100,000×g离心2h，最后沉淀出来的exosome用PBS溶解用于细胞功能研究或或直接提取exosome中的RNA及蛋白做检测。
2.蛋白检测鉴定携带抗肿瘤蛋白的exosome
采用常用的exosome分子标志物CD9分子对上述提取的exosome进行鉴定，用PINT-87aa特异性抗体对exosome中存在抗肿瘤融合蛋白iRGD-lamp2b-PINT-87aa进行检测，内参蛋白采用β-tubulin微管蛋白，检测结果如图3所示，结果显示，抗肿瘤融合蛋白iRGD-lamp2b-PINT-87aa在制备的exosome中大量存在；NC对照(即没有融合PINT-87aa的对照质粒)组中没有检测到PINT融合蛋白的表达；CD9分子在两组中显示高水平表达，证明exosome分离提取成功。本发明通过化学合成针对PINT-87aa的氨基酸序列，然后制备了特异性检测PINT-87aa的抗体，该检测PINT-87aa的抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示(抗体识别PINT87aa的C末端14个氨基酸)。
详细的蛋白检测流程如下：
用RAPA(雷帕霉素)提取exosome中的总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量(按试剂盒说明书操作)；配置5％SDS-PAGE浓缩胶、12％SDS-PAGE分离胶，上样总蛋白为10微克；采用80V20分钟、150V1h跑蛋白电泳；转膜采用100V转膜2h；5％的脱脂牛奶封闭1h；CD9抗体(abcam，货号ab92726)(1:500)，PINT-87aa兔抗人抗体(1:1000)、β-tubulin抗体(abcam，货号ab179512)(1:2000)比例分别孵育4℃过夜；第二天采用兔二抗(1:10000)常温孵育1h，TBST洗涤缓冲液(Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween)洗涤5遍，每次5min，然后发光、显影、定影。蛋白检测exosome中PINT-87aa表达情况如图3所示，结果表明，存在抗肿瘤蛋白PINT-87aa。
四：携带抗肿瘤蛋白的exosome抑制恶性脑胶质瘤细胞U251的增殖
将提取分离的携带抗肿瘤蛋白PINT‐87aa的exosome用恶性脑胶质瘤细胞U251进行实验研究，结果显示，通过本发明的方法制备的携带PINT-87aa的抗肿瘤exosome能够有效抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖，结果如图4所示。
具体实施的详细步骤描述如下：
MTT检测细胞增殖：
将U251细胞以细胞数2000个/孔接种于96孔板中,细胞培养24h后分别加入最终浓度为1微克/毫升，最终培养基为100微升，加入exosome后分别于0h、24h、48h、72h后用于MTT测定；每组做3个复孔；检测前加入5mg/mLMTT溶液,4h后以DMSO溶解MTT,并于492nm处测定吸收度(A)值。
分组如下：(1)exosome-NC；(2)exosome-PINT-87aa。MTT检测细胞增殖实验结果如图4所示。
Claims (8)
1.一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建表达肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT-87aa的融合基因表达质粒；
(2)将表达质粒转染到人的胚肾细胞HEK293细胞中，puro抗生素筛选获得稳定表达抗肿瘤融合蛋白的细胞系；
(3)细胞扩增培养，对细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome进行分离纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将编码LAMP2蛋白的核苷酸序列，去掉终止密码子后添加T2A多肽连接子与PINT-87aa蛋白连接，lamp2b的另一端连接编码iRGD的核苷酸序列，获得此片段后通过NheI、BamHI两个限制性内切酶将所述片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将HEK293细胞50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和5微升表达质粒制成质粒MIX1混合液；将100微升无血清培养基DMEM+6微升liop2000脂质体均匀混合，制成脂质体MIX2混合液；将MIX1混合液和MIX2混合液等比例混合，室温放置20min；按照转染试剂操作说明书操作；最终6孔板中的孔终体积为1毫升，转染6小时后，换成1毫升正常培养基，细胞培养条件为37℃、5％二氧化碳；细胞培养48小时后，换用终浓度为2mg/L的puro嘌呤霉素进行筛选，隔日换液，筛选5天后，建立稳定表达抗肿瘤蛋白PINT-87aa的HEK293细胞系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述正常培养基为DMEM培养基加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素，以上百分比为体积百分比。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用差异离心的方式从HEK293培养细胞液中分离纯化exosome。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：当HEK293细胞培养到80％融合度的时候，撤去培养基，PBS洗涤细胞3遍，换成无血清无双抗的基础培养基DMEM，继续培养细胞48小时；之后收取细胞培养上清，按照如下操作分离纯化所述细胞培养上清中的exosome：所述细胞培养上清置于50ml离心管中，4℃、1000×g离心5min，去除较大的细胞碎片，取第一上清；然后将所述第一上清于4℃、16500×g离心30min，取第二上清；然后将所述第二上清于4℃、100000×g离心2h，弃上清，取第一沉淀；将所述第一沉淀用1mlPBS吹打洗涤，然后4℃、100000×g离心2h，弃上清，取第二沉淀；然后再用PBS洗涤所述第二沉淀，于4℃、100000×g离心2h，最后得到第三沉淀，即为分离纯化后的exosome。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法制备获得的exosome在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。
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