CN118591392A

CN118591392A - Gpc3结合剂、其缀合物以及使用它们的方法

Info

Publication number: CN118591392A
Application number: CN202280088588.3A
Authority: CN
Inventors: 玛丽亚·莱娅·史密斯; 梅·孔·苏瑟兰
Original assignee: Aidijian Co
Current assignee: Aidijian Co
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2024-09-03

Abstract

本发明提供了用于治疗癌症的抗GPC3抗体、其抗原结合部分及其GPC3缀合物。

Description

GPC3结合剂、其缀合物以及使用它们的方法

关于序列列表的声明

电子序列表(120301_404WO_seqListing_FINAL.xml；大小：161千字节；创建日期：2022年11月18日)的内容通过引用以其整体并入本文中。

发明背景

对于各种类型的癌症的有效和肿瘤靶向治疗仍然是改善患者存活的重要需求。2020年全世界有905,700例肝癌，其中死亡830,200例。同年，肺癌和胃癌分别导致180万人死亡和770,000人死亡。目前，肝细胞癌的治疗选择很少。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3或GPC3在人类恶性细胞上过表达，并且已知在这些肿瘤以及在结肠直肠癌、肺癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、卵巢癌、肾细胞癌、生殖细胞(睾丸)癌、外阴癌、黑色素瘤、胃癌、肉瘤和膀胱癌中高度表达。由于GPC3在正常成人组织中的有限表达，使用具有细胞毒性剂的抗体(抗体-药物缀合物)靶向GPC3提供了选择性攻击癌细胞且使正常组织不受伤害的方法。

发明简述

本公开内容部分地提供了特异性地结合GPC3的变体ARD103磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)结合抗体、其抗原结合部分和相关的结合剂，以及其缀合物，其表现出改善的治疗特性。GPC3是用于治疗某些癌症的重要且有利的治疗靶标。GPC3结合抗体、其抗原结合部分及其结合剂和缀合物提供了基于在GPC3+癌症的治疗中使用此类抗体、其抗原结合部分及相关结合剂和缀合物的组合物和方法。因此，本发明提供了与变体ARD103GPC3抗体、抗原结合部分，结合剂和缀合物相关的方法、组合物、试剂盒和制品。

在一些实施方案中，提供了缀合物，其包含：

结合剂；

与所述结合剂连接的至少一个接头；和

与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂；

其中所述结合剂包含：

(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

(iii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

(iv)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

(vi)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

(vii)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或者

(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；

其中所述重链框架区和轻链框架区在所述框架区中任选地被1至8个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中所述结合剂特异性地结合人GPC3。

在一些实施方案中，所述结合剂包含：

(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区。

在一些实施方案中，提供了缀合物，其包含

结合剂；

与所述结合剂连接的至少一个接头；和

与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂；

其中所述结合剂包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中：

(i)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列、具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的LCDR1序列、具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(ii)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(iii)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR2，和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(iv)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(v)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列、具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(vi)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(vii)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；或者

(viii)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内。

在一些实施方案中，所述框架区是鼠框架区。

在一些实施方案中，所述框架区是人框架区。

在一些实施方案中，所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫化物连接的Fc、scFv、单域抗体、双链抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方案中，所述重链可变区还包含重链恒定区。

在一些实施方案中，重链恒定区是人IgG同种型的。

在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG1恒定区。

在一些实施方案中，所述IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:57或59所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG4恒定区。

在一些实施方案中，所述轻链可变区还包含轻链恒定区。

在一些实施方案中，所述轻链恒定区是κ同种型的。

在一些实施方案中，所述κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。

在本公开内容的结合剂的一些实施方案中，

(i)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:65或66所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；

(ii)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；

(iii)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；

(iv)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:130或131所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列；

(v)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:72或73所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列；

(vi)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:76或77所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列；

(vii)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:79或80所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列；或者

(viii)所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:82或83所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述接头经由以下与所述结合剂连接：链间二硫化物残基、工程改造的半胱氨酸、聚糖或修饰的聚糖、结合剂的N-末端残基、或与结合剂连接的聚组氨酸残基。

在一些实施方案中，所述缀合物的平均载药量为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。

在一些实施方案中，所述结合剂是单特异性的。

在一些实施方案中，所述结合剂是二价的。

在一些实施方案中，所述结合剂包含第二结合结构域，并且所述结合剂是双特异性的。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂选自澳瑞他汀、喜树碱、多卡霉素和加利车霉素。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是澳瑞他汀。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是喜树碱。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是依喜替康。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是加利车霉素。

在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是SN-38(也称为7-乙基-10-羟基喜树碱)。

在一些实施方案中，所述接头选自mc-VC-PAB、CL2、CL2a和(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_n ²-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)-(SEQ ID NO:96)，其中n²代表2至8的整数。

在一些实施方案中，所述接头是mc-VC-PAB。

在一些实施方案中，所述接头与至少一个分子的MMAE连接。

在一些实施方案中，所述接头是CL2A。

在一些实施方案中，所述接头与至少一个分子的SN-38连接。

在一些实施方案中，所述接头是CL2。

在一些实施方案中，所述接头与至少一个分子的SN-38连接。

在一些实施方案中，所述接头是(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_n ²-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)-(SEQ ID NO:96)，其中n²代表2至8的整数。

在一些实施方案中，所述接头与至少一个分子的依喜替康连接。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含本文所述的任何实施方案的缀合物和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，提供了核酸，其编码本文所述的任何实施方案的结合剂。

在一些实施方案中，提供了载体，其包含前述实施方案的核酸。

在一些实施方案中，提供了细胞系，其包含本文所述的任何实施方案的核酸。

在一些实施方案中，提供了治疗GPC3+癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的缀合物的任何实施方案的缀合物或者任何这些缀合物的药物组合物。

在所述方法的一些实施方案中，所述GPC3+癌症是癌或恶性肿瘤。

在所述方法的一些实施方案中，所述GPC3+癌症选自肝细胞癌，肺癌如小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌，结肠直肠癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，卵巢癌，肾细胞癌，乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)，黑色素瘤，生殖细胞癌(例如睾丸)，外阴癌，胃癌，肉瘤和膀胱癌。

在所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用免疫疗法。

在所述方法的一些实施方案中，所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。

在所述方法的一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自特异性地结合人PD-1、人PD-L1或人CTLA4的抗体。

在所述方法的一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)或伊匹木单抗(ipilimumab)。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用化学疗法。

在所述方法的一些实施方案中，静脉内施用所述缀合物。

在所述方法的一些实施方案中，所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约12mg/kg的剂量施用。

在一些实施方案中，提供了改善接受针对GPC3+癌症的免疫疗法和/或化学疗法的对象的治疗结果的方法，其包括：向所述患有癌症的对象施用有效量的免疫疗法或化学疗法；以及向所述对象施用治疗有效量的本文所述的缀合物的任何实施方案的缀合物或者本文所述的缀合物中任一种的药物组合物；其中与施用单独的免疫疗法或化学疗法相比，所述对象的治疗结果得到改善。

在一些实施方案中，所述改善的治疗结果是选自稳定病情、部分反应或完全反应的客观反应。

在一些实施方案中，所述改善的治疗结果是降低的肿瘤负荷。

在一些实施方案中，所述改善的治疗结果是无进展存活或无疾病存活。

在一些实施方案中，所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂包括特异性地结合人PD-1、人PD-L1或CTLA4的抗体。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或伊匹木单抗。

在一些实施方案中，静脉内施用所述缀合物。

在一些实施方案中，所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。

在一些实施方案中，提供了本文所述的缀合物或者本文所述的缀合物的药物组合物用于治疗对象的GPC3+癌症的用途。

在一些实施方案中，提供了本文所述的缀合物或者本文所述的缀合物中任一种的药物组合物用于治疗接受免疫疗法或化学疗法的对象的GPC3+癌症的用途。

通过参考以下详述、具体实施方案的非限制性实例和附图，可以更全面地理解本公开内容的这些和其它方面。

附图说明

图1显示热处理对抗GPC3scFv与重组人GPC3结合的影响的图。

图2显示通过ELISA测定的ARD-103的前导IgG变体与重组hGPC3结合的图。

图3显示ARD-103的前导变体的MMAE缀合物对GPC3+HepG2肝癌细胞的体外细胞毒性活性的图和ARD-103的前导变体的MMAE缀合物的IC50值的表。

图4显示ARD103-CL2A-SN38和3种mAb变体的CL2A-SN38缀合物在HepG2-C3A肝癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用的图。

发明详述

本公开内容提供了抗GPC3抗体、包含抗GPC3抗体的细胞毒性剂缀合物以及包含这种抗体和缀合物的药物组合物。本公开内容的抗体、缀合物和药物组合物可单独或与其它癌症治疗剂组合用于治疗GPC3+癌症。与参考ARD103抗体相比，本公开内容的抗GPC3抗体在热处理后对GPC3表现出增强的结合能力。本公开内容的抗GPC3抗体与MMAE的缀合物显示出与参考ARD103抗体缀合物相当的对肝细胞癌细胞的体外细胞毒性。

为方便起见，此处定义了说明书、实施例和权利要求书中的某些术语。除非另有说明或者从上下文中暗示，以下术语和短语具有以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施方案，而并非旨在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所用并且除非另有说明，采用术语“一个/一种(a)”意指“一个/一种”、“至少一个/一种”或“一个或多个/一种或多种”。除非上下文另有要求，否则本文所用的单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。

替代方案(例如，“或者”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如整个公开内容所用的，术语“包括”和“包含”同义使用。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的要素、组分、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括要素、组分、事件或情况发生的情况和它们不发生的情况。

短语“至少一个/一种”在后面跟随有项目或要素的列表时是指列表中的一个或多个要素的开放式集合，其可以但不一定包括一个以上的要素。

在整个公开内容中在数字的上下文中使用的术语“约”是指以该数字为中心并跨越小于该数字的15％和大于该数字的15％的范围。在范围的上下文中使用的术语“约”是指跨越小于该范围中列出的最低数的15％和大于该范围中列出的最大数的15％的扩展范围。

在整个公开内容中，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何值(包括整数或分数)或子范围。

除非上下文另外明确要求，在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”、“包括”等应被解释为与排他性或穷尽性意义相反的包含性意义；也就是说，在“包括但不限于”的意义上。

术语“降低”、“减少”、“减少的”、、“降低的”和“抑制”在本文中一般都用于意指相对于参考的统计学上显著的量的降低。

术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文中都用于一般意指相对于参考以统计学上显著的量增加。

本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”在核酸、多肽或蛋白质的情况下是指与至少一种其它组分(例如，核酸或多肽或蛋白质)分离的核酸、多肽或蛋白质，所述其它组分与在其天然来源中发现的核酸、多肽或蛋白质一起存在和/或当由细胞表达或者在分泌的多肽和蛋白质的情况下分泌时与核酸、多肽或蛋白质一起存在。化学合成的核酸、多肽或蛋白质，或者使用体外转录/翻译合成的那些被认为是“分离的”。术语“纯化的”或“基本上纯化的”是指分离的核酸、多肽或蛋白质至少占主题核酸、多肽或蛋白质的95重量％，包括例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或更多。

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，表示一系列氨基酸残基，每个氨基酸残基通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接。术语“蛋白质”和“多肽”还指蛋白质氨基酸的聚合物，包括经修饰的氨基酸(例如，磷酸化的、糖化的、糖基化的等)和氨基酸类似物，而不管其大小或功能。“蛋白质”和“多肽”常用于提及相对大的多肽，而术语“肽”常用于提及小的多肽，但这些术语在本领域中的使用重叠。当涉及编码的基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物，天然存在的蛋白质，同源物，直系同源物，旁系同源物，片段和其它等同物，前述的变体、片段和类似物。

GPC3或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3是糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞表面蛋白，其可以作为细胞粘附蛋白发挥功能。(也被称为DGSX、OCI-5、SDYS、SGB、SGBS)。据报道，其在肝细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和大细胞肺癌、结肠直肠癌、食道癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、胃癌、肉瘤和膀胱癌以及其它癌症中过表达。GPC3多肽包括但不限于那些具有NCBI Ref Seq.NP_001158089.1、(SEQ ID NO:85)、NP_001158090.1(SEQ ID NO:86)、NP_001158091.1(SEQ ID NO:87)和NP_004475.1(SEQ ID NO:88)中所示的氨基酸序列；这些序列通过引用并入到本文中。

如本文所用，“表位”是指通常被免疫球蛋白VH/VL对结合的氨基酸，如本文所述的抗体和结合剂。表位可以在多肽上由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常至少5个，约9个或约8-10个氨基酸。表位限定抗体或其它结合剂的最小结合位点，因此代表抗体、其抗原结合部分或其它基于免疫球蛋白的结合剂的特异性靶标。在单域抗体的情况下，表位代表由独立的可变结构域结合的结构单位。

如本文所用，“特异性结合”是指本文所述的结合剂(例如抗体或其抗原结合部分)以10^-5M(10000nM)或更低，例如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更低的K_D与靶标(如GPC3)结合的能力。特异性结合可受例如抗体或其它结合剂的亲和力和亲合力以及靶标多肽的浓度的影响。本领域普通技术人员可以确定适当的条件，在该条件下，本文所述的抗体和其它结合剂使用任何合适的方法，如在合适的细胞结合测定中滴定结合剂，选择性地结合GPC3。特异性结合GPC3的结合剂不会被不相似的竞争剂取代。在某些实施方案中，当抗GPC3抗体或其抗原结合部分在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶标抗原GPC3时，其被称为特异性结合GPC3。

在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以10^-5M(10000nM)或更低，例如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更低的解离常数(K_D)特异性地结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-5M至10^-6M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-6M至10^-7M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-7M至10^-8M的解离常数(K_D)特异性地结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-8M至10^-9M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-9M至10^-10M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-10M至10^-11M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以约10^-11M至10^-12M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂以小于10^-12M的解离常数(K_D)特异性结合GPC3多肽。

如在整个公开内容中所用，“相同的”或“同一性”是指DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列与另一DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列之间的相似性。同一性可以用第一序列与第二序列的序列同一性百分比来表示。相对于参考DNA序列的序列同一性百分比(％)可以是在将序列比对后候选序列中与参考DNA序列中的DNA核苷酸相同的DNA核苷酸的百分比。相对于参考氨基酸序列的序列同一性百分比(％)可以是在将序列比对和引入缺口(如果需要)以实现最大的序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。如在整个公开内容中所用，使用Altschul等,“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs,”Nucleic Acids Res.2007,25,3389-3402所定义的NCBI BLAST 2.0软件(参数设置为默认值)生成序列同一性百分比值。

如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响该实施方案的基本且新颖或功能特性的要素。

术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其不包括在实施方案的描述中未陈述的任何要素。

除了在实施例中，或者在另外指出的情况下，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰。术语“约”在与百分比一起使用时可以意指+/-1％。

术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意指高于或低于参考值的两个标准偏差(2SD)的差异。

其它术语在本公开内容的各个方面的描述中定义。

I.抗体

本文提供了特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的变体ARD103结合抗体(也称为抗GPC3抗体或GPC3结合抗体)及其抗原结合部分。本文还提供了ARD103(抗GPC3)结合抗体和抗原结合部分以及细胞毒性剂的缀合物(也称为GPC3缀合物)。在一些实施方案中，GPC3缀合物减少对象中GPC3+癌细胞的数目。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：

在一些实施方案中，GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含：

其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：

其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。

在一些实施方案中，本文提供了结合剂，其包含：

其中所述结合剂特异性地结合GPC3。

在一些实施方案中，本文提供了结合剂，其包含：

其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰，并且其中所述结合剂特异性地结合GPC3。

在一些实施方案中，本文提供了结合剂，其包含：

(vii)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或

其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，并且其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。如本文所述，结合剂包含抗GPC3抗体或其抗原结合部分，并且可以包含共价连接至抗GPC3抗体或其抗原结合部分的其它肽或多肽。在这些实施方案的任一个中，结合剂特异性地结合GPC3。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链CDR可通过使用以下方法中的任一种来鉴定：Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT和/或Aho。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义。

在一些实施方案中，提供了包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的结合剂，其中：

(i)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(vi)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

(viii)所述VH区包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的互补决定区HCDR1序列，具有SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR3，其各自设置在重链框架区内；并且其中所述VL区包含具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的LCDR1序列，具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的LCDR3，其各自设置在轻链框架区内；

其中每个VH和VL包含人源化的框架区并且所述结合剂特异性地结合GPC3。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及通过抗GPC3抗体、其抗原结合部分、其它结合剂或其缀合物在体内减少对象中的GPC3+细胞(例如，减少癌症或肿瘤中的GPC3+细胞的数目)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及通过施用抗GPC3抗体、其抗原结合部分、其它结合剂或其缀合物来治疗对象的GPC3+癌症。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语通常是指由两个免疫球蛋白重链可变区和两个免疫球蛋白轻链可变区组成的抗体，包括全长抗体(具有重链和轻链恒定区)及其抗原结合部分；包括，例如，完整单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')²、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单域抗体(dAb)、双链抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、双特异性抗体和单链抗体(参见，例如，Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)以及Bird等,Science242,423-426(1988)，将其通过引用并入本文中)。抗体可以包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体以及基因工程改造的抗体及其抗原结合片段。抗体可以是，例如，鼠的、嵌合的、人源化的、异缀合物、双特异性的、双链抗体、三链抗体或四链抗体。

每个重链通常由可变区(缩写为VH)和恒定区组成。重链恒定区可包括三个结构域CH1、CH2和CH3以及任选的第四结构域CH4。每条轻链通常由可变区(缩写为VL)和恒定区组成。轻链恒定区是CL结构域。VH和VL区可进一步分成称为互补决定区(CDR)的高变区，并散布有称为框架区(FR)的保守区。因此，每个VH和VL区由三个CDR和四个FR组成，它们按照以下顺序从N末端到C末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。这种结构对于本领域技术人员而言是众所周知的。CDR和FR序列可以通过几种不同的编号方案确定，包括Kabat、Chothia、AbM、Contact、IMGT和/或Aho。在一些实施方案中，CDR和FR由Kabat定义。

在一些实施方案中、抗原结合部分包含轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)、轻链互补决定区3(LCDR3)、重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)。

本公开内容的示例性抗GPC3抗体的VH CDR和VL CDR、VH和VL以及恒定区的氨基酸序列列于表1中。短语“其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰”是指这些VH和VL CDR(例如，SEQ ID NO:3、15、5、16、7和17；SEQ ID NO:3、22、5、16、7和23；SEQ ID NO:3、22、5、27、7和28；SEQ ID NO:3、104、5、32、7和33；SEQ ID NO:3、4、5、16、7和36；SEQ ID NO:3、41、5、42、7和43；SEQ ID NO:3、48、5、49、7和50；或者SEQ ID NO:3、55、5、6、7和56)，其不具有氨基酸取代、缺失或插入。

表1：抗GPC3抗体序列

*与参考ARD103抗体相比CDR中的粗体氨基酸变化

如本文所用，抗GPC3抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指特异性地结合抗原的抗体分子的区域。在一些实施方案中，抗原结合部分是指如本文所述的抗GPC3抗体中具有抗GPC3抗体的VH和VL序列的部分(例如，SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45或者SEQ ID NO:51和52所示，任选地如本文所述经修饰)。根据术语抗体的“抗原结合部分”，抗原结合部分的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单域抗体(dAb)、双链抗体、重链抗体(HCAb)、VHH、VNAR，纳米抗体和单链抗体。如本文所用，术语Fab、F(ab')₂和Fv是指以下：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，即包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区中经由二硫键彼此连接；以及(iii)由抗GPC3抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段。尽管Fv片段的两个结构域(即VL和VH)由单独的编码区编码，但是它们还可以使用合成接头，例如聚-G₄S氨基酸序列(`(G₄S)_n`，其中n＝1至5，分别如SEQ ID NO：89、90、91、92和93所公开)彼此连接，使得将它们制备为单个蛋白链成为可能，其中VL和VH区结合以形成单价分子(称为单链Fv(ScFv))。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在包括这种单链抗体。其它形式的单链抗体，如“双链抗体”也包括在本文中。双链抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用连接VH和VL结构域的接头，该接头对于两个结构域太短以致不能在同一链上结合，从而迫使VH和VL结构域与不同链的互补结构域(分别为VL和VH)配对，并形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger,R等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J等,(1994)Structure 2:1121-1123)。

免疫球蛋白恒定区是指重链或轻链恒定区。恒定区提供抗体的整体框架，并且可以不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以参与各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体固定，与Fc受体(例如，CD16、CD32、FcRn)结合，相对于缺乏Fc区的多肽体内半衰期更长，蛋白质A结合，甚至可能胎盘转移(参见Capon等,Nature 337:525,1989)。如在整个公开内容中所用，“Fc区”是指来自抗体的Fc片段(“可结晶片段”区或Fc区)的重链恒定区区段，其可包括一个或多个恒定结构域，如CH2、CH3、CH4或其任何组合。在一些实施方案中，Fc区包括IgG、IgA或IgD抗体的CH2和CH3结构域，或者IgM或IgE抗体的CH3和CH4结构域。

人重链和轻链恒定区氨基酸序列是本领域已知的。恒定区可以是任何合适的类型，其可以选自免疫球蛋白的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几种免疫球蛋白类别可进一步分成同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区(Fc)可以分别是α、δ、ε、γ和μ。轻链可以是kappa(或κ)和lambda(或λ)中的一种。例如，对于IgG1、IgG2、IgG3和IgA重链，以及Igκ轻链，还存在免疫球蛋白恒定区的同种异型变体。

在一些实施方案中，恒定区可以具有IgG1同种型。在一些实施方案中，恒定区可具有IgG2同种型。在一些实施方案中，恒定区可具有IgG3同种型。在一些实施方案中，恒定区可具有IgG4同种型。在一些实施方案中，Fc区可以具有包含来自两种或更多种同种型的恒定结构域的杂合同种型。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区可以是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施方案中，恒定区是IgG1同种异型变体(例如，G1m1或nG1m1)。IgG1G1m1同种异型恒定区的示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:57。IgG1nG1m1同种异型恒定区的示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:59。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体具有IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:57或59所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体具有κ轻链恒定区。在一些实施方案中，κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:65、66、68、69、72、73、76、77、79、80、82、83、130和131中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:67、70、71、74、75、78、81和84中任一个所示的氨基酸序列。

在本公开内容的抗GPC3抗体的一些实施方案中，

(i)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:65或66所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；

(ii)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；

(iii)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；

(iv)抗GPC3抗体重链为IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:130或131所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列；

(v)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:72或73所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列；

(vi)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:76或77所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列；

(vii)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:79或80所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列；或者

(viii)抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:82或83所示的氨基酸序列，以及抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

此外，抗GPC3抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白或肽共价或非共价缔合而形成的较大结合剂的一部分。与这种结合剂相关的是使用链霉亲和素核心区域来制备四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等(1995),HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标志物肽和C-末端聚组氨酰基肽，例如六组氨酰基标签(如公开为SEQ ID NO:94的“六组氨酰基标签”)以产生二价生物素化scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等(1994)Mol.Immunol.31:10471058)。

关于VH和VL氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对编码VH或VL的核酸或者多肽中改变编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的氨基酸的单独取代、缺失或添加(插入)是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代(保守氨基酸取代)，并且改变的多肽保留了特异性结合GPC3的能力。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分的保守修饰变体可在框架区(FR)中具有改变(即，除了在CDR中以外)，例如，抗GPC3抗体的保守修饰变体具有VH和VLCDR的氨基酸序列(在SEQ ID NO:3、15、5、16、7和17；SEQ ID NO:3、22、5、16、7和23；SEQ IDNO:3、22、5、27、7和28；SEQ ID NO:3、104、5、32、7和33；SEQ ID NO:3、4、5、16、7和36；SEQ IDNO:3、41、5、42、7和43；SEQ ID NO:3、48、5、49、7和50；或SEQ ID NO:3、55、5、6、7和56中示出)，并且在FR中具有至少一个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在FR中总共具有不超过8个或6个或4个或2个或1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ IDNO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在FR中具有8至1个、6至1个、4至1个或2至1个保守氨基酸取代。在任何这些实施方案的其它方面，抗GPC3抗体、其抗原结合部分或其它结合剂的保守修饰变体表现出特异性结合GPC3。

对于保守氨基酸取代，给定的氨基酸可以被具有类似理化特征的残基取代，例如，用一个脂族残基取代另一个脂族残基(例如，用Ile、Val、Leu或Ala彼此取代)，或者用一个极性残基取代另一个极性残基(如Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间)。其它这样的保守氨基酸取代，例如具有类似疏水性特征的整个区域的取代是众所周知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以证实所需活性，例如天然或参考多肽的抗原结合活性和特异性(即针对GPC3)得以保留。

对于保守取代，氨基酸可根据其侧链特性的相似性而分组(A.L.Lehninger,inBiochemistry,第二版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975))：(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。

可选地，对于保守取代，天然存在的残基可基于共同的侧链特性而分成几组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将需要交换这些类别中的一个或另一个类别的成员。

特定的保守取代包括，例如，Ala至Gly或至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或至His；Asp至Glu；Cys至Ser；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Ala或至Pro；His至Asn或至Gln；Ile至Leu或至Val；Leu至Ile或至Val；Lys至Arg,至Gln或至Glu；Met至Leu,至Tyr或至Ile；Phe至Met、至Leu或至Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp；和/或Phe至Val、至Ile或至Leu。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分的保守修饰变体优选与参考VH或VL序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同，其中VH和VL CDR(SEQ ID NO:3、15、5、16、7和17；SEQID NO:3、22、5、16、7和23；SEQ ID NO:3、22、5、27、7和28；SEQ ID NO:3、104、5、32、7和33；SEQ ID NO:3、4、5、16、7和36；SEQ ID NO:3、41、5、42、7和43；SEQ ID NO:3、48、5、49、7和50；或SEQ ID NO:3、55、55、6、7和56)未被修饰。如在整个公开内容中所用，“相同的”或“同一性”是指DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列与另一DNA、RNA、核苷酸、氨基酸或蛋白质序列之间的相似性。同一性可以用第一序列与第二序列的序列同一性百分比来表示。相对于参考DNA序列的序列同一性百分比(％)可以是在将序列比对后候选序列中与参考DNA序列中的DNA核苷酸相同的DNA核苷酸的百分比。相对于参考氨基酸序列的序列同一性百分比(％)可以是在将序列比对和引入缺口(如果需要)以实现最大的序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。如在整个公开内容中所用，使用Altschul等,“GappedBLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs,”Nucleic Acids Res.2007,25,3389-3402所定义的NCBI BLAST 2.0软件(参数设置为默认值)生成序列同一性百分比值。

在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ IDNO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在框架区中总共具有不超过8个或6个或4个或2个或1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ IDNO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ IDNO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在框架区中总共具有8至1个、或6至1个、或4至1个、或2至1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ IDNO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在框架区中总共具有不超过8个或6个或4个或2个或1个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ IDNO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在框架区中总共具有8至1个、6至1个、4至1个或2至1个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与VH和VL的氨基酸序列(分别在SEQID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)相比，VH和VL氨基酸序列(分别在SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45、或SEQ ID NO:51和52中示出)在框架区中总共具有不超过8个或6个或4个或2个或1个氨基酸取代、缺失或插入。

天然(或参考)氨基酸序列的修饰可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来完成。例如，突变可以通过合成含有所需突变序列的寡核苷酸在特定基因座处引入，所述寡核苷酸的侧翼是能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得的重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的变体。可选地，可以采用寡核苷酸定向位点特异性诱变程序来提供改变的核苷酸序列，其具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。用于进行这种改变的技术是非常成熟的，并且包括例如Walder等(Gene 42:133,1986)；Bauer等(Gene 37:73,1985)；Craik(BioTechniques,January 1985,12-19)；Smith等(Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)；以及美国专利第4,518,584号和第4,737,462号(将其通过引用以其整体并入本文中)公开的那些。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分具有完全人恒定区。在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分具有非人恒定区。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:65或66所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:130或131所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:72或73所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:76或77所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:79或80所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗GPC3抗体重链是IgG1同种型的，并且具有SEQ ID NO:82或83所示的氨基酸序列；和/或抗GPC3抗体轻链是κ同种型的，并且具有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

在各种实施方案中，抗GPC3抗体、其抗原结合部分和其它结合剂可在人、鼠科动物或其它动物来源的细胞系中产生。重组DNA表达可用于产生抗GPC3抗体、其抗原结合部分和其它结合剂。这允许在选择的宿主物种中产生抗GPC3抗体以及一系列的GPC3抗原结合部分和其它结合剂(包括融合蛋白)。在细菌、酵母、转基因动物和鸡蛋中产生抗GPC3抗体、其抗原结合部分和其它结合剂也是基于细胞的生产系统的替代物。转基因动物的主要优点是来自可再生资源的潜在高产率。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQID NO:13所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:14所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQID NO:20所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:21所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQID NO:25所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:26所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQ ID NO:129所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:31所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQ IDNO:30所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:35所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQID NO:39所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:40所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQID NO:46所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:47所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的抗GPC3VH多肽由具有SEQID NO:53所示的序列的核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的抗GPC3VL多肽由具有SEQ ID NO:54所示的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:65或66所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:68或69所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:130或131所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:72或73所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:76或77所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:79或80所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:82或83所示的氨基酸序列的抗GPC3重链多肽由核酸编码。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的抗GPC3轻链多肽由核酸编码。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”或“多核苷酸序列”或“核苷酸”是指掺入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可以是变性双链DNA的一条核酸。如果是单链的，则核酸可以是编码链或非编码的(反义链)。核酸分子可以含有天然亚单位或非天然亚单位。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。某些版本的核苷酸序列也可以包括内含子，其程度为可以通过共转录或转录后机制除去内含子。换句话说，由于遗传密码的冗余或简并，或通过剪接，不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸可以是cDNA，例如没有内含子的核酸。

编码抗GPC3抗体、其抗原结合部分以及其它结合剂的氨基酸序列的核酸分子可以通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于制备编码抗GPC3抗体、抗原结合部分或其它结合剂的合成核苷酸序列。此外，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR介导的诱变和盒式诱变可用于制备编码抗GPC3抗体或抗原结合部分以及其它结合剂的核苷酸序列。如本文所述，编码至少抗GPC3抗体、其抗原结合部分、结合剂或其多肽的核酸序列可根据常规技术与载体DNA重组如，例如平端或错开端末端进行连接、限制性内切酶消化以提供适当的末端、根据需要填充粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接以及用适当的连接酶连接。用于这类操作的技术例如由Maniatis等,Molecular Cloning,Lab.Manual(ColdSpring Harbor Lab.Press,NY,1982and 1989)以及Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons),1987-1993公开，并且可以用于构建编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其VH或VL多肽的核酸序列和载体。

如果核酸分子(如DNA)包含含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且这种序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则认为其“能够表达”多肽。可操作的连接是这样的连接，其中调节DNA序列和寻求表达的DNA序列(例如，抗GPC3抗体或其抗原结合部分)以允许可回收量的多肽或抗原结合部分的基因表达的方式连接。基因表达所需的调节区的精确性质可能因有机体而异，这在类似领域中是众所周知的。参见，例如，Sambrook等,1989；Ausubel等,1987-1993。

因此，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分的表达可以在原核细胞或真核细胞中发生。合适的宿主包括细菌或真核宿主，包括酵母，昆虫，真菌，鸟类和体内或原位哺乳动物细胞，或者哺乳动物、昆虫、鸟类或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿类动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源的，但也可以使用任何其它哺乳动物细胞。此外，通过使用例如酵母泛素水解酶系统，可以实现泛素-跨膜多肽融合蛋白的体内合成。如此产生的融合蛋白可在体内加工或在体外纯化并加工，允许合成如本文所述的具有特定氨基末端序列的抗GPC3抗体或其抗原结合部分。此外，可以避免在直接酵母(或细菌)表达中与保留起始密码子衍生的甲硫氨酸残基有关的问题(参见，例如，Sabin等,7Bio/Technol.705(1989)；Miller等,7Bio/Technol.698(1989))。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以利用掺入来自编码大量产生的糖酵解酶的活性表达基因的启动子和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任一个来获得重组抗GPC3抗体或其抗原结合部分。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止子信号。

在昆虫中产生抗GPC3抗体或其抗原结合部分可以例如通过本领域普通技术人员已知的方法，用经工程改造以表达多肽的杆状病毒感染昆虫宿主来实现。参见Ausubel等,1987-1993。

在一些实施方案中，将引入的核酸序列(编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其多肽)掺入能够在受体宿主细胞中自主复制的质粒或病毒载体中。为此目的，可以采用多种载体中的任一种，并且其是本领域普通技术人员已知的且可获得的。参见，例如，Ausubel等,1987-1993。在选择特定质粒或病毒载体中重要的因素包括：含有载体的受体细胞可以被识别并且从不含有载体的那些受体细胞中选择出的容易程度；特定宿主中所需的载体拷贝数；以及是否希望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。

示例性病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(例如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒如正粘病毒(例如流感病毒)，弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、禽痘和金丝雀痘)。其它病毒包括，例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields等编,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。在一些这样的实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。

本领域已知的示例性原核载体包括质粒，如能够在大肠杆菌中复制的那些。用于表达编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分的DNA的其它基因表达元件包括但不限于：(a)病毒转录启动子及其增强子元件，如SV40早期启动子(Okayama等,3Mol.Cell.Biol.280(1983))，劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman等,79PNAS 6777(1982))和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等,41Cell 885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，如衍生自SV40晚期区域的那些(Okayarea等,1983)，以及(c)聚腺苷酸化位点，如在SV40中(Okayama等,1983)。可以如Liu等，下文和Weidle等,51Gene 21(1987)所述，使用SV40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区域mRNA剪接、兔S-珠蛋白插入序列、免疫球蛋白和兔S-珠蛋白聚腺苷酸化位点和SV40聚腺苷酸化元件作为表达元件表达编码免疫球蛋白的DNA基因。

对于编码免疫球蛋白的核苷酸序列，转录启动子可以是例如人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白。

在一些实施方案中，为了在啮齿动物细胞中表达DNA编码区，转录启动子可以是病毒LTR序列，转录启动子增强子可以是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒LTR增强子之一或两者，以及聚腺苷酸化和转录终止区。在其它实施方案中，编码其它蛋白质的DNA序列与上述表达元件组合以在哺乳动物细胞中实现蛋白质的表达。

每个编码区或基因融合体在表达载体中组装或插入到表达载体中。能够表达抗GPC3可变区或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)的受体细胞接着用编码抗GPC3抗体或抗体多肽或其抗原结合部分的核苷酸单独转染，或者用编码VH和VL链编码区的多核苷酸共转染。在允许掺入的编码区表达的条件下培养转染的受体细胞，并从培养物中回收表达的抗体链或完整抗体或抗原结合部分。

在一些实施方案中，将含有编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)的编码区的核酸在单独的表达载体中组装，然后将其用于共转染受体宿主细胞。每个载体可以含有一个或多个选择基因。例如，在一些实施方案中，使用两个选择基因，第一选择基因设计用于在细菌系统中进行选择，并且第二选择基因设计用于在真核系统中进行选择，其中每个载体具有一组编码区。这种策略产生首先指导在细菌系统中产生核苷酸序列并允许所述核苷酸序列扩增的载体。随后将在细菌宿主中如此产生和扩增的DNA载体用于共转染真核细胞，并允许选择携带所需转染核酸(例如，含有抗GPC3抗体重链和轻链)的共转染细胞。用于细菌系统的选择基因的非限制性实例是赋予氨苄青霉素抗性的基因和赋予氯霉素抗性的基因。用于真核转染子的选择基因包括黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(命名为gpt)和来自Tn5的磷酸转移酶基因(命名为neo)。可选地，编码VH和VL链的融合核苷酸序列可以在同一表达载体中组装。

为了转染表达载体和产生抗GPC3抗体或其抗原结合部分，受体细胞系可以是中国仓鼠卵巢细胞系(例如DG44)或骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装和分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具有免疫球蛋白糖基化的机制。例如，在一些实施方案中，受体细胞是产生重组Ig的骨髓瘤细胞SP2/0。SP2/0细胞仅产生由转染的基因编码的免疫球蛋白。骨髓瘤细胞可以在培养物中或在小鼠的腹膜腔中生长，所分泌的免疫球蛋白可以从腹水中获得。

可以将编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ IDNO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)的表达载体通过多种合适的方法中的任一种引入到适当的宿主细胞中，所述方法包括诸如转化、转染、原生质体融合、磷酸钙沉淀和应用聚阳离子如二乙基氨基乙基(DEAE)葡聚糖的生化手段，以及诸如电穿孔、直接显微注射和微粒轰击的机械手段。Johnston等,240Science 1538(1988)，如本领域普通技术人员已知的。

酵母为免疫球蛋白重链和轻链的生产提供了优于细菌的某些优点。酵母进行翻译后肽修饰，包括糖基化。存在许多重组DNA策略，其利用强启动子序列和可用于在酵母中产生所需蛋白质的高拷贝数质粒。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列并分泌带有前导序列的多肽(即，前多肽)。参见，例如，Hitzman等,11th Intl.Conf.Yeast,Genetics&Molec.Biol.(Montpelier,France,1982)。

可以常规地评价酵母基因表达系统的抗体以及组装的抗GPC3抗体及其抗原结合部分的产生、分泌和稳定性水平。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以利用掺入来自编码大量产生的糖酵解酶的活性表达基因的启动子和终止元件的各种酵母基因表达系统。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。另一个实例是翻译延伸因子1α启动子。可以采用多种方法来评价用于在酵母中表达免疫球蛋白的最佳表达质粒。参见IIDNA Cloning 45,(Glover编,IRL Press,1985)以及例如美国公开号US2006/0270045A1。

细菌菌株也可用作产生本文所述的抗体分子或其抗原结合部分的宿主，可以使用大肠杆菌K12菌株如大肠杆菌W3110、芽孢杆菌物种、肠细菌如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和各种假单胞菌物种。来源于与宿主细胞相容的物种的含有复制子和控制序列的质粒载体与这些细菌宿主结合使用。载体携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。可以采用多种方法来评价用于在细菌中产生抗GPC3抗体及其抗原结合部分的表达质粒(参见Glover,1985；Ausubel,1987,1993；Sambrook,1989；Colligan,1992-1996)。

宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞为免疫球蛋白分子提供翻译后修饰，包括前导肽去除、VH和VL链的折叠和组装、抗体分子的糖基化以及功能抗体和/或其抗原结合部分的分泌。

除了上述淋巴来源的细胞外，可用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞包括成纤维细胞来源的细胞，如Vero或CHO-K1细胞。可用于表达免疫球蛋白多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO--S和DG44细胞；PERC6^TM细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，基于特定真核宿主细胞对重链和/或轻链进行所需的翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生具有比在293细胞中产生的相同多肽更高水平的唾液酸化的多肽。

在一些实施方案中，一种或多种抗GPC3抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)可以根据任何合适的方法在已经用一种或多种编码多肽的核酸分子工程改造或转染的动物体内产生。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ IDNO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)在无细胞系统中产生。非限制性的示例性无细胞系统描述于，例如，Sitaraman等,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。

许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达VH和VL链(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)(参见Glover,1985)。可以采用各种方法获得完整抗体。如上所述，可以在同一细胞中共表达VH和VL链以及任选的相关恒定区，以实现VH和VL链的细胞内缔合以及VH和VL链连接成完整的四聚H₂L₂抗体或其抗原结合部分。共表达可以通过在同一宿主中使用相同或不同的质粒来进行。可以将编码VH和VL链或其抗原结合部分(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者本文所述的其变体)的核酸置于同一质粒中，然后将其转染到细胞中，从而直接选择表达两条链的细胞。可选地，可以先用编码一条链(例如VL链)的质粒转染细胞，接着用含有第二选择标志物的VH链质粒转染所得细胞系。可以用编码另外拷贝的肽、VH、VL或VH加VL链(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)结合另外的选择标志物的质粒转染经由任一路径产生抗体、其抗原结合部分的细胞系，以产生具有增强特性的细胞系，如经转染的细胞系的组装的抗GPC3抗体或其抗原结合部分的较高产量或者增强的稳定性。

另外，植物已经成为用于基于大规模培养微生物或动物细胞的重组抗体生产的方便、安全和经济的替代表达系统。抗GPC3抗体或抗原结合部分可以在植物细胞培养物或常规生长的植物中表达。植物中的表达可以是系统的、限于亚细胞质体或限于种子(胚乳)。参见，例如，美国专利公开号2003/0167531；美国专利第6,080,560号；美国专利第6,512,162号；PCT公开号WO 0129242。几种植物来源的抗体已经达到了开发的高级阶段，包括临床试验(参见，例如，Biolex,N.C.)。

对于完整抗体，抗GPC3抗体的可变区(VH和VL)(例如，具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者具有SEQID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的Fc)的至少一部分连接。人恒定区DNA序列可以根据众所周知的程序从多种人细胞，如永生化的B细胞中分离(PCT公开号WO87/02671；将其通过引用以其整体并入本文中)。抗GPC3抗体可以含有轻链和重链恒定区。重链恒定区可包括CH1，铰链区，CH2，CH3，有时还包括CH4区。在一些实施方案中，可以缺失或省略CH2结构域。

可选地，描述用于生产单链抗体的技术(参见，例如，美国专利第4,946,778号；Bird,Science 242:423-42(1988)；Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；以及Ward等,Nature 334:544-54(1989)；将其通过引用以其整体并入本文中)可适于产生特异性结合GPC3的单链抗体。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链可变区(例如，具有SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:18和24、SEQ ID NO:128和29、SEQ ID NO:1和34、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:44和45或SEQ ID NO:51和52所示的氨基酸序列，或者如本文所述的其变体(例如，任选地用1至8个氨基酸取代、缺失和/或插入修饰))，产生单链多肽，从而形成单链抗体。也可使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(参见，例如Skerra等,Science242:1038-1041(1988)；将其通过引用以其整体并入本文中)。

完整(例如，完全)抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或其抗原结合部分可以通过已知的技术回收和纯化，例如免疫吸附或免疫亲和色谱、色谱方法如HPLC(高效液相色谱)、硫酸铵沉淀、凝胶电泳或这些的任意组合。一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。至少约90％至95％同质性的基本上纯的抗GPC3抗体或其抗原结合部分是有利的，如具有98％至99％或更多同质性的那些抗体或其抗原结合部分一样，特别是对于制药用途。一旦根据需要纯化、部分纯化或达到同质性，完整的抗GPC3抗体或其抗原结合部分就可以在治疗上使用或用于开发和进行测定程序、免疫荧光染色等。一般参见Vols.I&II Immunol.Meth.(Lefkovits&Pernis,eds.,Acad.Press,NY,1979and1981)。

另外，并且如本文所述，可以进一步优化抗GPC3抗体或其抗原结合部分，以降低潜在的免疫原性，同时保持功能活性，用于人的治疗。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于抗GPC3抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，优化的GPC3结合抗体或其抗原结合部分来源于GPC3结合抗体，其包含(i)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在这方面，功能活性意指能够显示与GPC3结合抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分，所述GPC3结合抗体或其抗原结合部分包含(i)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变区和(ii)具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在这些实施方案的任一个中，GPC3结合抗体或其抗原结合部分的功能活性包括特异性地结合GPC3。另外的功能活性包括抗癌活性。另外，具有功能活性的抗GPC3抗体或其抗原结合部分意指多肽表现出与本文所述的参考抗体或其抗原结合部分的活性类似的活性或者比本文所述的参考抗体或其抗原结合部分的活性更好的活性(例如，GPC3结合抗体或其抗原结合部分，其包含(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的VL；(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VL；(iii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VL；(iv)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL；(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；(vi)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的VL；(vii)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的VL；或者(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的VL；或者如本文所述的其变体)，如在具有或不具有剂量依赖性的情况下在特定测定，诸如例如生物测定中测量的。在剂量依赖性确实存在的情况下，其不必与参考抗体或其抗原结合部分的剂量依赖性相同，而是与本文所述的参考抗体或其抗原结合部分相比，其基本上类似于或好于给定活性中的剂量依赖性(即，候选多肽相对于参考抗体将表现出更大的活性)。

II.抗体药物缀合物

在一些实施方案中，抗GPC3(ARD103变体)抗体是抗GPC3抗体药物缀合物(或GPC3缀合物)的一部分。在一些实施方案中，抗GPC3抗体与至少一个接头连接，并且至少一种细胞毒性剂与每个接头连接。

如本文所用，“细胞毒性剂”是指例如通过防止细胞生长或复制对细胞产生细胞毒性或细胞抑制作用的化合物。“小分子”或“化合物”是分子量小于1500、或100、或900、或750、或600、或500道尔顿的有机化合物。“小分子药物”是具有治疗效果如治疗疾病或病症的小分子。在一些实施方案中，小分子不是蛋白质、多糖或核酸。

在一些实施方案中，细胞毒性剂是微管破坏剂(例如，微管蛋白破坏剂)或DNA修饰剂。

在一些实施方案中，GPC3缀合物包括作为微管蛋白破坏剂的细胞毒性剂。已知几种不同类别的微管蛋白破坏剂，包括澳瑞他汀类(auristatins)、微管蛋白抑制剂类(tubulysins)、秋水仙素类、长春碱类、紫杉烷类、隐藻素类(cryptophycins)、美登木素类(maytansinoids)、哈米特林类(hemiasterlins)以及其它微管蛋白破坏剂。澳瑞他汀类是天然产物尾海兔素10(dolastatin 10)的衍生物。示例性的澳瑞他汀类包括MMAE(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸(dolaisoleuine)-多拉脯氨酸(dolaproine)-去甲麻黄碱或单甲基澳瑞他汀E)和MMAF(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸或单甲基澳瑞他汀F))和AFP(参见PCT公开号WO2004/010957和WO2007/008603)。PCT公开号WO2015/057699描述了包括MMAE在内的聚乙二醇化澳瑞他汀。在美国专利9,345,785中公开了考虑使用的其它尾海兔素衍生物，该专利通过引用并入到本文中。

微管蛋白抑制剂类包括但不限于微管蛋白抑制剂D、微管蛋白抑制剂M、tubuphenylalanine和tubutyrosine。PCT公开号WO 2017/096311和WO 2016/040684描述了包括微管蛋白抑素M在内的微管蛋白抑素类似物。

秋水仙素类包括但不限于秋水仙素和CA-4。

长春碱类包括但不限于长春花碱(VBL)、长春瑞滨(VRL)、长春新碱(VCR)和长春地辛(VOS)。

紫杉烷类包括但不限于紫杉醇和多西他赛。

隐藻素类包括但不限于隐藻素-1和隐藻素-52。美登木素类包括但不限于美登素、美登醇、DM1、DM3和DM4中的美登素类似物以及安沙霉素-2(ansamatocin-2)。示例性的美登木素类药物部分包括具有修饰的芳族环的那些，如：C-19-脱氯(美国专利第4,256,746号)(通过安丝菌素P2的氢化铝锂还原制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利第4,361,650号和第4,307,016号)(通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或者使用LAH的脱氯制备)；以及C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(--OCOR)、+/-脱氯(美国专利第4,294,757号)(使用酰氯通过酰化制备)；以及在其它位置具有修饰的那些。

美登木素类药物部分还包括具有修饰的那些，如：C-9-SH(美国专利第4,424,219号)(通过美登醇与H₂S或P₂S₅反应制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH₂OR)(美国专利第4,331,598号)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(美国专利第4,450,254号)(由诺卡氏菌制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利第4,364,866号)(通过链霉菌转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利第4,313,946号和第4,315,929号)(分离自滑桃树(Trewianudiflora))；C-18-N-脱甲基(美国专利号第4,362,663号和第4,322,348号(通过链霉菌使美登醇脱甲基化制备)；以及4,5-脱氧(美国专利第4,371,533号)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上体外测试了结合HER-2的TA.1-美登木素类化合物缀合物的细胞毒性(Chari等,Cancer Research52:127-131)。药物缀合物达到了与游离美登木素类化合物药物类似的细胞毒性程度，其可以通过增加每抗体分子的美登木素类化合物分子的数目来增加。

哈米特林类包括但不限于哈米特林和HT1-286。

其它微管蛋白破坏剂包括箭根薯酮内酯(taccalonolide)A、箭根薯酮内酯B、箭根薯酮内酯AF、箭根薯酮内酯AJ、箭根薯酮内酯Al-环氧化物、圆皮海绵内酯(discodermolide)、埃博霉素A、埃博霉素B和月桂内酯(laulimalide)。

在一些实施方案中，细胞毒性剂是DNA修饰剂。在一些实施方案中，DNA修饰剂是烷化剂或拓扑异构酶抑制剂。在一些实施方案中，DNA修饰剂是多卡霉素或其类似物、加利车霉素(calicheamicin)或吡咯并苯并二氮杂卓。

在一些实施方案中，细胞毒性剂可以是拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱或喜树碱类似物、或蒽环类。喜树碱(camptothecin)或其类似物的实例包括伊立替康(irinotecan,也称为CPT-11)、拓扑替康(topotecan)、10-羟基-CPT、SN-38、依喜替康(exatecan)和依喜替康类似物DXd(参见美国专利公开第2015/0297748号)。蒽环类的实例包括阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、奈莫柔比星(nemorubicin)；PNU-159682及其衍生物(参见美国专利第10,960,083号；Quintieri等,(2005)Clin.Cancer Res.11:1608-1617；Stefan等,(2017)Mol.Cancer Ther.16:879-892)。

在一些实施方案中，细胞毒性剂是多卡霉素(duocarmycin)，包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI。

预期用于本文方法的GPC3缀合物包含至少一个接头，每个接头具有至少一个与其连接的细胞毒性剂。通常，缀合物包含抗GPC3抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂之间的接头。接头可以是蛋白酶可切割的接头(参见，例如，PCT公开号WO2004/010957)、酸可切割的接头、二硫化物接头、自稳定接头(参见，例如PCT公开号WO2018/031690和WO2015/095755)、不可切割的接头(参见，例如PCT公开号WO2007/008603)和/或亲水性接头(参见，例如PCT公开号WO2015/123679)。在各种实施方案中，接头在细胞内条件下是可切割的，这样接头的切割在细胞内环境中从抗体释放出细胞毒性剂。

例如，在一些实施方案中，接头可被存在于细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝(caveolea)内)中的切割剂切割。接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割的肽基接头。通常，肽基接头长为至少一个氨基酸或至少两个氨基酸。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知所有这些都水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内活性药物的释放(参见，例如，Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。最典型的是可被存在于靶抗原表达细胞中的酶切割的肽基接头。例如，可以使用在癌组织中高度表达的可由硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽基接头(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:95)接头)。其它此类接头描述于例如美国专利第6,214,345号中。在具体的实施方案中，可被细胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见，例如，美国专利第6,214,345号，其描述了具有val-cit接头的阿霉素的合成)或Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:96)接头(参见，例如美国专利公开2015/0297748)。使用细胞毒性剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是，当缀合时，该试剂通常是减毒的，并且缀合物的血清稳定性通常很高。还参见美国专利第9,345,785号。

如本文所用，术语“在细胞内切割的”和“细胞内切割”是指细胞内对抗体药物缀合物的代谢过程或反应，由此细胞毒性剂和抗体之间的共价连接(例如接头)被破坏，导致游离的细胞毒性剂或缀合物的其它代谢物从细胞内的抗体解离。因此，缀合物的切割部分是细胞内代谢物。

在一些实施方案中，可切割接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见，例如，美国专利第5,122,368号；第5,824,805号；以及第5,622,929号；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等,1989,Biol.Chem.264:14653-14661)。这种接头在中性pH条件(如血液中的那些)下相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)时是不稳定的。在某些实施方案中，可水解的接头是硫醚接头(如，例如经由酰腙键与治疗剂连接的硫醚(参见，例如，美国专利第5,622,929号))。

在各种实施方案中，接头在还原条件(例如，二硫化物接头)下是可切割的。已知多种二硫化物接头，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-形成的那些。(参见，例如，Thorpe等,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等,Inlmmunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编,Oxford U.Press,1987。还参见美国专利第4,880,935号。)

在各种实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等,1995,Anticancer Res.15:1387-93)、马来酰亚胺基苯甲酰基接头(Lau等,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(Lau等,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。在一些实施方案中，接头单元是不可切割的，并且药物通过抗体降解而释放(参见美国公开号2005/0238649)。

在各种实施方案中，接头对细胞外环境基本上不敏感。如本文所用，“对细胞外环境基本上不敏感”在接头的上下文中意指抗体药物缀合物(ADC)或ADC衍生物的样品中不超过约20％，通常不超过约15％，更通常不超过约10％，甚至更通常不超过约5％，不超过约3％或不超过约1％的接头在ADC或ADC衍生物存在于细胞外环境(例如，在血浆中)时被切割。接头对细胞外环境是否基本上不敏感可例如通过独立地将(a)ADC或ADC衍生物(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的未缀合抗体或治疗剂(“对照样品”)与血浆孵育预定的时间段(例如2、4、8、16或24小时)，然后将ADC样品中存在的未缀合抗体或治疗剂的量与对照样品中存在的未缀合抗体或治疗剂的量进行比较来确定，如例如通过高效液相色谱法测量的。

在各种实施方案中，接头促进细胞内化。在某些实施方案中，当与细胞毒性剂缀合时(即，在本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境中)，接头促进细胞内化。在其它实施方案中，当与细胞毒性剂和抗GPC3抗体或其衍生物缀合时(即，在本文所述的ADC或ADC衍生物的环境中)，接头促进细胞内化。

可用于本发明组合物和方法的各种接头描述于PCT公开WO 2004010957中。在各种实施方案中，蛋白酶可切割接头包含硫醇反应性间隔基和二肽。在一些实施方案中，蛋白酶可切割接头由硫醇反应性马来酰亚胺基己酰基间隔基、缬氨酸-瓜氨酸二肽和对氨基苄氧基羰基间隔基组成。

在各种实施方案中，酸可切割接头是肼接头或季铵接头(参见PCT公开WO2017/096311和WO2016/040684)。

包含马来酰亚胺基团的自稳定接头描述于美国专利9,504,756中。

在各种实施方案中，微管蛋白破坏剂，如澳瑞他汀，通过与如美国专利第9,463,252号(将其通过引用并入本文中)中所述的接头单元(LU)形成酰胺键的C-末端羧基与接头缀合。在各种实施方案中，接头单元包含至少一个氨基酸。N,N-二烷基澳瑞他汀的结合剂-药物缀合物(ADC)公开于美国专利第8,992,932号中。

在各种实施方案中，接头还包含延伸单元和/或氨基酸单元。示例性的延伸单元和氨基酸单元描述于美国专利第9,345,785号和美国专利第9,078,931号中，其各自通过引用并入本文中。

在各种实施方案中，本文提供了包含通过mc-val-cit-PAB接头共价连接至MMAE的抗GPC3抗体的抗体药物缀合物的用途。将GPC3缀合物作为药物组合物递送至对象。

在一些实施方案中，GPC3缀合物具有下式：

或其药学上可接受的盐；其中：mAb是抗GPC3抗体，S是抗体的硫原子，A-是延伸单位，以及p为约3至约5、或约3至约8。

载药量由p表示，p是药物组合物中每个抗体的药物分子(细胞毒性剂)的平均数目。例如，如果p为约4，考虑的药物组合物中存在的所有抗体的平均载药量为约4。在一些实施方案中，P的范围为约3至约5，更优选约3.6至约4.4，甚至更优选约3.8至约4.2。p可为约3、约4或约5。在一些实施方案中，P的范围为约6至约8，更优选约7.5至约8.4。p可为约6、约7或约8。在缀合反应的制备中每个抗体的药物的平均数目可以通过常规手段，如质谱法、ELISA测定和HPLC来表征。也可以确定抗体-药物缀合物用p表示的定量分布。在一些情况下，同质抗体-药物缀合物的分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段实现，其中p是来自具有其它载药量的抗体-药物缀合物的某个值。

延伸单元(A)能够经由抗体的巯基将抗体单元与氨基酸单元(例如缬氨酸-瓜氨酸肽)连接。巯基可以例如通过还原抗GPC3抗体的链间二硫键来产生。例如，延伸单元可以经由由抗体的链间二硫键的还原产生的硫原子与抗体连接。在一些实施方案中，延伸单元仅经由由抗体的链间二硫键的还原产生的硫原子与抗体连接。在一些实施方案中，巯基可通过抗GPC3抗体的赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特(Traut’s)试剂)或其它巯基产生试剂反应而产生。在某些实施方案中，抗GPC3抗体是重组抗体，并且经工程改造以携带一个或多个赖氨酸。在某些其它实施方案中，将重组GPC3抗体工程改造以携带另外的巯基，例如另外的半胱氨酸。

MMAE的合成和结构描述于美国专利第6,884,869号中，将所述专利出于所有目的以其整体通过引用并入本文中。示例性延伸单元的合成和结构以及用于制备抗体药物缀合物的方法描述于，例如美国公开号2006/0074008和2009/0010945中，将其各自通过引用以其整体并入本文中。

代表性的延伸单元描述于美国专利第9,211,319号的式IIIa和IIIb的方括号内，并且通过引用并入本文中。

在各种实施方案中，抗体药物缀合物包含单甲基澳瑞他汀E和蛋白酶可切割的接头。预期蛋白酶可切割接头包含硫醇反应性间隔基和二肽。在各种实施方案中，蛋白酶可切割接头由硫醇反应性马来酰亚胺基己酰基间隔基、缬氨酸--瓜氨酸二肽和对氨基-苄氧羰基或PAB间隔基组成。

缩写“MMAE”是指单甲基澳瑞他汀E。

缩写“vc”和“val-cit”是指二肽缬氨酸-瓜氨酸。

缩写“PAB”是指自消解间隔基：

缩写“MC”是指延伸剂马来酰亚胺基己酰基：

在其它示例性实施方案中，所述缀合物具有以下通式：

Ab-[L3]-[L2]-[L1]_m-AA_n-细胞毒性剂，

其中Ab是抗GPC3抗体；细胞毒性剂可以是微管蛋白破坏剂或拓扑异构酶抑制剂；L3是包含抗体偶联部分和一个或多个乙炔(或叠氮化物)基团的接头的组分；L2在一端包含与L3中的乙炔(或叠氮化物)部分互补的限定的PEG(聚乙二醇)叠氮化物(或乙炔)，并且在另一端包含反应性基团，如羧酸或羟基；L1包含可分解单元(例如，自消解基团)，或者任选地与可分解单元连接的肽酶可切割部分，或者酸可切割部分；AA是氨基酸；m是值为0或1的整数，以及n是值为0、1、2、3或4的整数。这种接头可以经由点击化学来组装(参见，例如，美国专利第7，591，944号和第7，999，083号)。

在一些实施方案中，细胞毒性剂是喜树碱或喜树碱(CPT)类似物，如伊立替康(也称为CPT-11)、拓扑替康、10-羟基-CPT、依喜替康、DXd和SN-38。代表性的结构如下所示。

CPT：R₁＝R₂＝R₃＝R₄＝H

10-羟基-CPT：R₁＝OH；R₂＝R₃＝R₄＝H

CPT-11：R₂＝乙基；R₃＝R₄＝H

SN-38：R₁＝OH；R₂＝乙基；R₃＝R₄＝H

拓扑替康：R₁＝OH；R₂＝R₄＝H；R₃＝CH₂-N(CH₃)₂

依喜替康＝R₁＝甲基；R₄＝F；R₂和R₃连接在一起以形成

Dxd＝R₁＝甲基；R₄＝F；R₂和R₃连接在一起以形成

关于缀合物式Ab-[L3]-[L2]-[L1]_m-AA_n-细胞毒性剂，在一些实施方案中，m是0。在这样的实施方案中，首先在氨基酸(AA)(如甘氨酸、丙氨酸或肌氨酸)的羧酸或肽(如甘氨酰甘氨酸)的羧酸与细胞毒性剂的羟基之间形成酯部分。在该实例中，氨基酸或多肽的N-末端可以被保护为Boc或Fmoc或单甲氧基三苯甲基(MMT)衍生物，其在与细胞毒性剂的羟基形成酯键之后被去保护。在含有另外羟基的细胞毒性剂的羟基位置处的BOC保护基团的存在下，胺保护基团的选择性去除可以使用单甲氧基三苯甲基(MMT)作为参与酯形成的氨基酸或多肽的氨基的保护基团来实现，因为通过不切割BOC基团的弱酸(如二氯乙酸)处理，可去除`MMT`。在与细胞毒性剂的羟基形成酯键的氨基酸或多肽的氨基被去掩蔽后，氨基与L2的PEG部分上的活化形式的COOH基团在标准酰胺形成条件下反应。在一个优选的实施方案中，L3包含与抗体的硫醇基团连接的硫醇反应性基团。硫醇反应性基团任选地是马来酰亚胺或乙烯砜、或溴乙酰胺、或碘乙酰胺，其与抗体的硫醇基团连接。在一些实施方案中，带有硫醇反应性基团的试剂由琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺基-(ε-马来酰亚胺基)己酸酯产生，例如，其中硫醇反应性基团是马来酰亚胺基团。

在另一个实施方案中，m是0，并且AA包含可被细胞内肽酶如组织蛋白酶-B切割的肽部分，优选二肽、三肽或四肽。组织蛋白酶-B可切割的肽的实例是：Phe-Lys、Val-Cit(Dubowchick,2002)、Ala-Leu,Leu-Ala-Leu和Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:97)(Trouet等,1982)。

在一个优选的实施方案中，L1由细胞内可切割的肽组成，如组织蛋白酶-B可切割的肽，其在肽的C-末端与可分解单元对氨基苄醇(或对氨基苄氧基羰基)连接，其苄醇部分又与氯甲酸酯形式的细胞毒性剂的羟基直接连接。在该实施方案中，n是0。可选地，当`n`是非零时，对酰胺基苄醇(或对氨基苄氧羰基)部分的苄醇部分通过活化形式的对酰胺基苄醇(即PABOCOPNP，其中PNP为对硝基苯基)与在细胞毒性剂的羟基处连接的氨基酸或肽的N-末端连接。在一个优选的实施方案中，接头包含与抗体的硫醇基团连接的硫醇反应性基团。硫醇反应性基团任选地是马来酰亚胺或乙烯砜、或溴乙酰胺、或碘乙酰胺，其与抗体的硫醇基团连接。在优选的实施方案中，带有硫醇反应性基团的组分由琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺基-(ε-马来酰亚胺基)己酸酯生成，例如，其中硫醇反应性基团是马来酰亚胺基团。

在一个优选的实施方案中，当细胞毒性剂是喜树碱或其具有20-羟基的类似物或衍生物时，L1由细胞内可切割的肽组成，如组织蛋白酶-B可切割的肽，其在肽的C-末端与可分解接头对氨基苄醇(或对氨基苄氧基羰基)连接，其苄醇部分又与CPT-20-O-氯甲酸酯直接连接。在该实施方案中，n是0。可选地，当`n`是非零时，对酰胺基苄醇部分的苄醇部分通过活化形式的对酰胺基苄醇(即PABOCOPNP，其中PNP为对硝基苯基)与在CPT的20位置处连接的氨基酸或多肽的N-末端连接。在一个优选的实施方案中，接头包含与抗体的硫醇基团连接的硫醇反应性基团。硫醇反应性基团任选地是马来酰亚胺或乙烯砜、或溴乙酰胺、或碘乙酰胺，其与抗体的硫醇基团连接。在优选的实施方案中，带有硫醇反应性基团的组分由琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺基-(ε-马来酰亚胺基)己酸酯生成，例如，其中硫醇反应性基团是马来酰亚胺基团。

在另一个实施方案中，缀合物的L2组分含有聚乙二醇(PEG)间隔基，其大小可以高达MW 5000，并且在优选的实施方案中，PEG是具有(1-12或1-30)个重复单体单元的限定PEG。在进一步优选的实施方案中，PEG是具有1-12个重复单体单元的限定PEG。PEG的引入可以包括使用可商购的异双官能化PEG衍生物。在本公开内容的上下文中，异双官能化PEG含有叠氮化物或乙炔基。含有8个重复单体单元的异双官能化限定PEG的实例在下式中给出，其中`NHS`是琥珀酰亚胺基：

在一个优选的实施方案中，L3具有多个乙炔(或叠氮化物)基团，其范围为2-40，但优选2-20，并且更优选2-5；以及单个抗体结合部分。

下面给出了一种代表性缀合物，其中细胞毒性剂是SN-38(CPT类似物)，用含有马来酰亚胺的SN-38-接头衍生物与表示为琥珀酰亚胺的抗体(命名为MAb)键合制备。这里，m＝0，并且与SN-38键合的20-O-AA酯是甘氨酸酯；L2和L3的叠氮化物-乙炔偶联连接产生如所示的三唑部分。

下面示出了另一种代表性的缀合物，用含有马来酰亚胺的SN-38-接头衍生物与表示为琥珀酰亚胺的抗体(MAb)键合制备。这里，通式2中的n＝0；`L1`含有与可分解的对氨基苄醇部分连接的组织蛋白酶-B可切割的二肽，并且后者在第20位以碳酸酯键与SN-38连接；连接`L2`和`L3`部分的叠氮化物-乙炔偶联产生如所示的三唑部分。

下面给出了另一种代表性的SN-38缀合物Mab-CL2-SN-38，用含有马来酰亚胺的SN-38-接头衍生物与表示为琥珀酰亚胺的抗体键合制备。这里，与SN-38键合的20-O-AA酯是经由对氨基苄醇部分和组织蛋白酶-B可切割的二肽与L1部分连接的甘氨酸酯；后者又经由酰胺键与`L2`连接，而`L2`和`L3`部分经由叠氮化物-乙炔`点击化学`偶联。

在下面给出的优选实施方案的另一个实例中，‘L1’含有与可分解的对氨基苄醇部分连接的单个氨基酸，其中对氨基苄醇是取代的或未取代的(R)，其中在通用的缀合物式中，m＝1且n＝0，并且细胞毒性剂用SN-38示例。该结构如下表示(称为MAb-CLX-SN-38)。AA的单个氨基酸可选自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。4-氨基苄醇部分上的取代基R是氢或选自C1-C10烷基的烷基。

下面显示了MAb-CLX-SN-38(上文)的一个实施方案，其中单个氨基酸AA是L-赖氨酸并且R＝H，并且细胞毒性剂用SN-38示例(称为MAb-CL2A-SN-38)：

在其它实施方案中，细胞毒性剂与接头连接，所述接头包含连接到与间隔单元(Y)连接的氨基酸单元(AA)的延伸单元(Z)，其中延伸单元与抗体(Ab或MAb)连接，并且间隔单元与细胞毒性剂的氨基连接。此类接头具有下式：

AB-Z-AA-Y-细胞毒性剂，

其中Z选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)--(CH₂)_n ²-C(＝O)--、--CH₂--C(＝O)--NH--(CH₂)n³-C(＝O)--、-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂--(N-ly-3-diminiccuS)-或--C(＝O)--(CH₂)n⁴-C(＝O)--，其中n²代表2至8的整数，n³代表1至8的整数，并且n⁴代表1至8的整数；cyc.Hex(1,4)代表1,4-亚环己基；并且(N-ly-3-diminiccuS)-具有由下式表示的结构：

AA是2至7个氨基酸的肽。间隔单元Y是-NH-(CH₂)_b-(C＝O)-或-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)-，其中b是1至5的整数。

在一些实施方案中，细胞毒性剂是依喜替康。在一些实施方案中，氨基酸单元(AA)是-Gly-Gly-Phe-Gly-(SEQ ID NO:96)。在一些实施方案中，间隔单元Y是-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)-。

在一些实施方案中，所述接头-细胞毒性剂具有以下结构：

其中释放的细胞毒性剂是DXd(参见美国专利第9,808,537号)。

细胞毒性剂-接头与抗体或抗体结合部分的连接

将细胞毒性剂经由接头与抗体或其抗原结合部分连接的技术是本领域众所周知的。参见，例如，Alley等,Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9；Senter,Cancer J.,2008,14(3):154-169。在一些实施方案中，先将接头与细胞毒性剂连接，然后将接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分连接。在一些实施方案中，先将接头与抗体或其抗原结合部分连接，然后将细胞毒性剂与接头连接。在以下论述中，术语接头-细胞毒性剂用于示例接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的连接；本领域技术人员将理解，可以根据接头和细胞毒性剂来选择所选择的连接方法。在一些实施方案中，细胞毒性剂以降低其活性的方式经由接头与抗体或其抗原结合部分连接，直到其从缀合物中释放(例如通过水解，通过蛋白水解降解或通过切割剂。

通常，可以采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂通过几种途径来制备缀合物，包括：(1)抗体或其抗原结合部分的亲核基团与二价接头试剂反应，以经由共价键形成抗体-接头中间体，随后与细胞毒性剂反应；以及(2)使细胞毒性剂的亲核基团与二价接头试剂反应，以经由共价键形成接头-细胞毒性剂，随后与抗体或其抗原结合部分的亲核基团反应。用于经由后一途径制备缀合物的示例性方法描述于美国专利第7,498,298号中，将所述专利通过引用明确地并入本文中。

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，以及(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。胺、硫醇和羟基是亲核的，并且能够与接头部分和接头试剂的亲电基团反应形成共价键，包括：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；以及(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。抗体可以通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理而与接头试剂反应缀合，使得抗体完全或部分还原。因此，理论上，每个半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核试剂。通过赖氨酸残基的修饰，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(特劳特试剂)反应，导致胺转化为硫醇，可以将另外的亲核基团引入到抗体中。也可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)，将反应性硫醇基团引入到抗体中。

也可以通过抗体上的亲电基团(如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来产生本公开内容的缀合物。接头试剂上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电部分。在另一个实施方案中，糖基化抗体的糖可以例如用高碘酸盐氧化试剂氧化，以形成醛基或酮基，其可以与接头试剂或药物部分的胺基反应。所得到的亚胺席夫(Schiff)碱基团可以形成稳定的键，或者可以被还原，例如通过硼氢化物试剂，以形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体或其抗原结合部分中产生羰基(醛和酮)基团，其可以与药物上的合适基团反应(参见，例如，Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致产生取代第一个氨基酸的醛(Geoghegan&Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；美国专利第5,362,852号)。这种醛可以与细胞毒性剂或接头反应。

细胞毒性剂上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼基团，其能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应形成共价键，包括：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。

可用于制备缀合物的非限制性示例性交联剂试剂在本文中描述或者为本领域普通技术人员所知。使用这种交联剂试剂连接两个部分(包括蛋白质部分和化学部分)的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白可例如通过重组技术或肽合成来制备。重组DNA分子可以包含编码缀合物的抗体和细胞毒性部分的区域，所述抗体和细胞毒性部分彼此相邻或被编码接头肽的区域隔开，所述接头肽不破坏缀合物的期望特性。

在另一个实施方案中，抗体可以与“受体”(如链霉亲和素)缀合以用于肿瘤预靶向，其中将抗体-受体缀合物施用至患者，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。

在一些实施方案中，接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合片段的链间半胱氨酸残基连接。参见，例如，PCT公开号WO2004/010957和WO2005/081711。在这样的实施方案中，接头通常包含马来酰亚胺基团，用于连接链间二硫化物的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的半胱氨酸残基连接，如美国专利第7,585,491号或第8,080,250号所述。所得到的缀合物的载药量范围通常为1至8。

在一些实施方案中，接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的赖氨酸或半胱氨酸残基连接，如PCT公开号WO2005/037992或WO2010/141566所述。所得到的缀合物的载药量范围通常为1至8。

在一些实施方案中，工程改造的半胱氨酸残基、聚组氨酸序列、糖工程标签或转谷氨酰胺酶识别序列可用于接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的位点特异性连接。

在一些实施方案中，接头-细胞毒性剂在除链间二硫化物以外的Fc区残基处与工程改造的半胱氨酸残基连接。在一些实施方案中，接头-细胞毒性剂连接到工程改造的半胱氨酸，所述半胱氨酸在重链的位置118、221、224、227、228、230、231、223、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、249、250、258、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、275、276、278、280、281、283、285、286、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、302、305、313、318、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、335、336、396和/或428和/或轻链位置106、108、142(轻链)、149(轻链)和/或位置V205处引入到IgG(通常为IgG1)，所述位置根据Kabat的EU编号。使用工程改造的半胱氨酸进行位点特异性缀合的示例性取代是S239C(参见，例如，美国专利公开号2010/0158909；Fc区的编号根据EU索引)。

在一些实施方案中，接头或接头-细胞毒性剂与抗体或其抗原结合部分的一个或多个引入的半胱氨酸残基连接，如PCT公开号WO2006/034488、WO2011/156328和/或WO2016040856中所述。

在一些实施方案中，使用细菌转谷氨酰胺酶进行位点特异性缀合的示例性取代是Fc区的N297S或N297Q。在一些实施方案中，接头或接头-细胞毒性剂与抗体或抗原结合部分或者糖基工程改造的抗体或其抗原结合部分的聚糖或经修饰的聚糖连接。参见，例如，PCT公开号WO2017/147542、WO2020/123425、WO2014/072482；WO2014//065661、WO2015/057066和WO2016/022027。

III.药物制剂

抗GPC3抗体及其抗原结合部分或其它结合剂的其它方面涉及包含活性成分(即，包括如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或其缀合物或者编码如本文所述的抗体或其抗原结合部分或其它结合剂的核酸)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(其被接受用于制药工业)组合的活性剂。短语“药学上可接受的”在本文用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

含有溶解或分散于其中的活性成分的药理学组合物的制备在本领域中是充分理解的，并且不需要基于任何特定的制剂来限制。通常，将此类组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；然而，也可以制备适于在使用前再水合的固体形式，或在液体中的悬浮液。制剂也可以被乳化或作为脂质体组合物提供。抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或其缀合物可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的且与活性成分相容，且其量适合用于本文所述的治疗方法。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，药物组合物可以含有少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其增强或维持活性成分(例如，抗GPC3抗体或其抗原结合部分)的有效性。本文所述的药物组合物可以包含其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(如，例如盐酸或磷酸)或者有机酸(如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(如，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(如，异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。生理学上可耐受的载体是本领域众所周知的。示例性的液体载体是无菌水溶液，其含有活性成分(例如，抗GPC3抗体和/或其抗原结合部分或其缀合物)和水，并且可以含有缓冲液，如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，如磷酸盐缓冲盐水。此外，水性载体可以含有一种以上的缓冲盐，以及诸如氯化钠、氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质的盐。除了水之外，液体组合物还可以含有液相。这种另外的液相的实例是甘油、植物油(如棉籽油)和水-油乳液。有效治疗特定病症或病症的活性剂的量取决于病症或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。

本文所述的药物组合物可配制用于口服施用、局部施用、透皮施用、吸入施用、肠胃外施用、舌下施用、口腔施用、直肠施用、阴道施用和鼻内施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、胸骨内和肿瘤内注射或输注技术。

在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物被配制成单剂量单位或包含多个剂量单位的形式。制备此类剂型的方法是本领域技术人员已知的或对本领域技术人员而言将是显而易见的；例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。

在一些实施方案中，药物组合物可以是冻干物(lyophilisate)，所述药物组合物包含如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其缀合物或者编码如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分的核酸。

在一些实施方案中，提供了注射器，其包含治疗有效量的本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其缀合物或者药物组合物。

IV.抗GPC3抗体、其抗原结合部分、结合剂和缀合物的治疗用途

在一些方面，如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分、结合剂和缀合物可用于包括向有需要的对象施用如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物的方法中。在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：(i)具有SEQID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iv)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vi)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vii)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或者(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区。

在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iv)具有SEQ IDNO:128所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vi)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vii)具有SEQID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或者(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个保守氨基酸取代修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。在一些实施方案中，所述抗GPC3抗体或其抗原结合部分包含：(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iii)具有SEQID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iv)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vi)具有SEQID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vii)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或者(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，其中重链可变框架区和轻链可变框架区在所述框架区中任选地被1至8个、1至6个、1至4个或1至2个氨基酸取代、缺失或插入修饰，其中重链可变区或轻链可变区的CDR未被修饰。GPC3缀合物包含任何这些实施方案的抗体或抗原结合部分。

在一些实施方案中，对象需要治疗癌症和/或恶性肿瘤。在一些实施方案中，对象需要治疗GPC3+癌症或GPC3+恶性肿瘤，如，例如肝细胞癌，肺癌如小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌，结肠直肠癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，卵巢癌，外阴癌，肾细胞癌，乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、黑色素瘤、生殖细胞癌(例如，睾丸生殖细胞癌)、胃癌、肉瘤和膀胱癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有GPC3+癌症或恶性肿瘤的对象。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的肝细胞癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的肺癌，如小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的食道癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的宫颈癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的头颈癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的卵巢癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的外阴癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的肾细胞癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的乳腺癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的黑色素瘤。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象中的生殖细胞癌症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的肉瘤。在一些实施方案中，所述方法用于治疗胃癌。在一些实施方案中，所述方法用于治疗对象的膀胱癌。

本文所述的方法包括向患有GPC3+癌症或恶性肿瘤的对象施用治疗有效量的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物。如本文所用，短语“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是指如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物在治疗癌症或恶性肿瘤、管理或预防癌症或恶性肿瘤的复发方面提供治疗益处的量，例如在肿瘤或恶性肿瘤的至少一种症状、体征或标志物中提供统计学上显著降低的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可随对象的病史、年龄、病况、性别以及对象的医学病况的严重程度和类型以及其它药物活性剂的施用而变化。

术语“癌症”和“恶性肿瘤”是指干扰身体器官和系统的正常功能的不受控制的细胞生长。癌症或恶性肿瘤可以是原发性的或转移性的，即它已经变成侵入性的，在远离原始肿瘤部位的组织中播散肿瘤生长。“肿瘤”是指干扰身体器官和系统的正常功能的不受控制的细胞生长。患有癌症的对象是具有存在于对象体内的客观可测量的癌细胞的对象。在该定义中包括良性肿瘤和恶性癌症，以及潜在的休眠肿瘤和微转移。从它们的原始位置迁移并播散其它重要器官的癌症最终可以通过受影响器官的功能退化而导致对象的死亡。血液恶性肿瘤(造血癌症)，如白血病和淋巴瘤，能够竞争超过对象中的正常造血区室，从而导致造血衰竭(以贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。

癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、腹膜癌、宫颈癌；胆管癌，绒毛膜癌，软骨肉瘤，结肠和直肠癌(结肠直肠癌)，结缔组织癌症，消化系统的癌症，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，头颈癌，胃癌(包括胃肠道癌症和胃癌)，成胶质细胞瘤(GBM)，肝癌，肝细胞瘤，上皮内赘生物，肾癌或肾脏癌(例如，透明细胞癌)、喉癌、白血病、肝脏癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌，口和咽)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，呼吸系统癌症，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌或子宫内膜癌，子宫浆液性癌，泌尿系统癌症，外阴癌；以及其它癌和肉瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小非核裂细胞NHL、巨大肿块NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞白血病和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增殖、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯(Meigs’)综合征。

在一些实施方案中，癌选自实体瘤，包括但不限于肝细胞癌，肺癌如小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌，结肠直肠癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，卵巢癌，肾细胞癌，乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)，黑色素瘤，生殖细胞癌(例如，睾丸的)，外阴癌，胃癌，肉瘤和膀胱癌。

在一些实施方案中，癌症或恶性肿瘤是GPC3阳性(GPC3+)。如本文所用，术语“GPC3阳性”或“GPC3+”用于描述在细胞表面上表达GPC3(膜结合的GPC3)的癌细胞、癌细胞簇、肿瘤块或转移细胞。GPC3阳性癌症的一些非限制性实例包括肝细胞癌，肺癌(如小细胞肺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌)，结肠直肠癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，卵巢癌，肾细胞癌，乳腺癌(如，三阴性乳腺癌)，黑色素瘤，生殖细胞癌(如，睾丸生殖细胞癌)，外阴癌，胃癌，肉瘤和膀胱癌。

预期本文的方法减小对象中的肿瘤大小或肿瘤负荷，和/或减少对象中的转移。在各种实施方案中，对象中的肿瘤大小减小约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。在各种实施方案中，所述方法将肿瘤大小减小10％、20％、30％或更多。在各种实施方案中，所述方法将肿瘤大小减小10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

如本文所用，“对象”是指人或动物。通常，所述动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛，马，猪，鹿，野牛，水牛，猫科动物物种(例如家猫)，犬科动物物种(例如狗)，狐狸，狼，鸟类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在某些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”、“个体”和“对象”在本文中可互换使用。

优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作例如代表例如各种癌症的动物模型的对象。此外，本文所述的方法可用于治疗驯养的动物和/或宠物。对象可以是雄性或雌性。在某些实施方案中，对象是人。

对象可以是先前已经被诊断患有或被鉴定患有GPC3+癌症并且需要治疗的对象，但不需要已经经历GPC3+癌症的治疗。可选地，对象也可以是先前未被诊断为患有需要治疗的GPC3+癌症的对象。对象可以是表现出与GPC3+癌症有关的病症或者一种或多种并发症的一种或多种风险因素的对象或者不表现出风险因素的对象。针对GPC3+癌症“需要治疗的对象”特别可以是患有该病况或者被诊断为患有该病况的对象。在其它实施方案中，“处于发展病症的风险中”的对象是指被诊断为处于发展该病症(例如GPC3+癌症)的风险中的对象。

如本文所用，术语“治疗(treat“/treatment/treating)”或“改善”在用于提及疾病、病症或医学病症时是指对病症的治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症的至少一种副作用或症状。如果一种或多种症状或者临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可选地，如果病症的进展降低或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下所预期的症状的进展或恶化。有益的或所需的临床结果包括但不限于与没有治疗的情况下所预期的相比，对象中GPC3+癌细胞的减少、一种或多种症状的减轻、缺陷程度的减小、癌症或恶性肿瘤的稳定(即不恶化)状态、肿瘤生长和/或转移的延迟或减缓以及增加的寿命。如本文所用，术语“施用”是指通过导致与GPC3结合抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物与GPC3+癌细胞或恶性细胞结合的方法或途径向对象提供如本文所述的GPC3结合抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物或者编码如本文所述的抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂的核酸。类似地，可以通过导致对象的有效治疗的任何适当的途径来施用药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的GPC3结合抗体或其抗原结合部分或其它结合剂或缀合物或者如本文所述的编码抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它结合剂的核酸。

抗GPC3抗体或其抗原结合部分或结合剂或缀合物的剂量范围取决于效力，并且涵盖足够大以产生所需效果(例如肿瘤生长减慢或肿瘤大小减小)的量。剂量不应太大，以免引起不可接受的不良副作用。通常，剂量随对象的年龄、状况和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，则剂量也可以由单独的医师调整。在一些实施方案中，剂量范围为0.1mg/kg体重至10mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围为0.5mg/kg体重至15mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围为0.5mg/kg体重至5mg/kg体重。可选地，可以滴定剂量范围以将血清水平维持在1μg/mL至1000μg/mL。对于全身性施用，可以向对象施用治疗量如，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg或更多。

可以重复上述剂量的施用。在优选的实施方案中，上述剂量以每周、每两周、每三周或每月施用，持续数周或数月。治疗的持续时间取决于对象的临床进展和对治疗的响应。

在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约2mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约4mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约5mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约6mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约8mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约10mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约10mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约12mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以是约100mg/m²至约700mg/m²。在一些实施方案中，剂量可以是约250mg/m²。在一些实施方案中，剂量可以是约375mg/m²。在一些实施方案中，剂量可以是约400mg/m²。在一些实施方案中，剂量可以是约500mg/m²。

在一些实施方案中，可以静脉内施用剂量。在一些实施方案中，静脉内施用可以是在约10分钟至约4小时的时间段内发生的输注。在一些实施方案中，静脉内施用可以是在约30分钟至约90分钟的时间段内发生的输注。

在一些实施方案中，可以每周施用剂量。在一些实施方案中，可以每两周施用剂量。在一些实施方案中，可以约每2周施用剂量。在一些实施方案中，可以约每3周施用剂量。在一些实施方案中，可以每三周施用剂量。在一些实施方案中，可以每四周施用剂量。

在一些实施方案中，将总共约2至约10个剂量施用至对象。在一些实施方案中，施用总共4个剂量。在一些实施方案中，施用总共5个剂量。在一些实施方案中，施用总共6个剂量。在一些实施方案中，施用总共7个剂量。在一些实施方案中，施用总共8个剂量。在一些实施方案中，施用总共9个剂量。在一些实施方案中，施用总共10个剂量。在一些实施方案中，施用总共多于10个剂量。

包含抗GPC3抗体或其抗原结合部分或其它GPC3结合剂或GPC3缀合物的药物组合物可以以单位剂量施用。在提及药物组合物使用时，术语“单位剂量”是指适于作为对象的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有与所需的生理学上可接受的稀释剂(即，载体或介质)结合的经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质(例如，抗GPC3抗体或其抗原结合部分或缀合物)。

在一些实施方案中，抗GPC3抗体或其抗原结合部分或缀合物或者这些中任一种的药物组合物与免疫疗法一起施用。如本文所用，“免疫疗法”是指设计用于诱导或增强对象自身免疫系统以对抗癌症或恶性肿瘤的治疗策略。免疫疗法的实例包括但不限于抗体，如检查点抑制剂。

在一些实施方案中，免疫疗法包括施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自抑制剂或CTLA-4、PD-1、PD-L1、PL-L2、B7-H3、B7-H4、BMA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2和A2aR。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抑制CTLA-4、PD-1、PD-L1等的药剂。合适的抗CTLA-4治疗剂包括，例如抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、伊匹木单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、抗CTLA-4adnectins、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4mAb、重链抗CTLA-4mAb、轻链抗CTLA-4mAb、激动共刺激途径的CTLA-4抑制剂、PCT公开号WO2001/014424中公开的抗体、PCT公开号WO2004/035607中公开的抗体、美国公开号2005/0201994中公开的抗体和授权的欧洲专利号EP1212422B1中公开的抗体。另外的抗CTLA-4抗体描述于美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号；PCT公开号WO 01/14424和WO 00/37504；以及美国公开号2002/0039581和2002/086014中。可用于本公开内容的方法的其它抗CTLA-4抗体包括，例如，在PCT公开号WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等,J.Clin.Oncology,22(145):Abstract No.2505(2004)(antibody CP-675206)；Mokyr等,Cancer Res,58:5301-5304(1998)，美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号中公开的那些。

合适的抗PD-1和抗PD-L1治疗剂包括，例如抗PD-1和抗PD-L1抗体、人抗PD-1和抗PD-L1抗体、小鼠抗PD-1和抗PD-L1抗体、哺乳动物抗PD-1和抗PD-L1抗体、人源化抗PD-1和抗PD-L1抗体、单克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体、多克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体、嵌合抗PD-1和抗PD-L1抗体、抗PD-1adnectins和抗PD-L1adnectins、抗PD-1结构域抗体和抗PD-L1结构域抗体、单链抗PD-1mAb和单链抗PD-L1mAb、重链抗PD-1mAb和重链抗PD-L1mAb以及轻链抗PD-1mAb和轻链抗PD-L1mAb。在具体的实施方案中，抗PD-1治疗剂包括纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、MEDI0680及其组合。在其它具体的实施方案中，抗PD-L1治疗剂包括阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、BMS-936559、德瓦鲁单抗(durvalumab，MEDI4736)、MSB0010718C及其组合。

合适的抗PD-1和抗PD-L1抗体也描述于Topalian等,Immune CheckpointBlockade:ACommon Denominator Approach to Cancer Therapy,Cancer Cell 27:450-61(April 13,2015)中，将其通过引用以其整体并入本文中。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹木单抗(Yervoy)、钠武单抗(Opdivo)、派姆单抗(Keytruda)、阿替利珠单抗(Tecentriq)、德瓦鲁单抗(Bavencio)或德瓦鲁单抗(Imfinzi)。

在一些实施方案中，提供了改善接受免疫疗法的对象的治疗结果的方法。所述方法通常包括向患有癌症的对象施用有效量的免疫疗法；以及向所述对象施用治疗有效量的GPC3结合剂或其缀合物或药物组合物，其中所述结合剂或缀合物特异性地结合GPC3+癌细胞；其中与施用单独的免疫疗法相比，对象的治疗结果得到改善。在一些实施方案中，结合剂或其缀合物包含：(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iv)具有SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vi)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vii)具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或者(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，其中所述重链框架区和轻链框架区在所述框架区中任选地被1至8个氨基酸取代、缺失或插入修饰。在一些实施方案中，所述结合剂或其缀合物包含：(i)具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(ii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iii)具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(iv)具有SEQ IDNO:128所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(v)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vi)具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；(vii)具有SEQID NO:44所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区；或者(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，其中所述结合剂特异性地结合GPC3+癌细胞。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫化物连接的Fc、scFv、单域抗体、双链抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，所述结合剂是抗GPC3单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫化物连接的Fc、scFv、单域抗体、双链抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的缀合物。

在一些实施方案中，所述改善的治疗结果是选自稳定疾病、部分反应或完全反应的客观反应，如通过所治疗的癌症的标准医学标准所确定的。在一些实施方案中，改善的治疗结果是降低的肿瘤负荷。在一些实施方案中，改善的治疗结果是无进展存活或无疾病存活。

本公开内容的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开内容限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明目的描述了本公开内容的具体实施方案和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开内容的范围内，各种等同的修改是可能的。本文提供的本公开内容的教导可适用于其它程序或方法，视情况而定。本文所述的各种实施方案可以组合以提供其它实施方案。如果需要，可以修改本公开内容的方面以采用上述参考文献和申请的组成、功能和概念来提供本公开内容的其它实施方案。根据详述，可以对本公开内容进行这些和其它改变。

在其它实施方案中，任何前述实施方案的特定要素可以组合或替代要素。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开内容的某些实施方案相关的优点，但是其它实施方案也可以表现出这些优点，并且不是所有实施方案都必须表现出此类有点才落入本公开内容的范围内。

所鉴定的所有专利和其它出版物出于描述和公开例如可能在结合本公开内容使用的这类出版物中描述的方法的目的通过引用明确地并入本文中。在本申请的申请日之前，这些出版物仅处于它们的公开内容而提供。就此而言，任何事情都不应被解释为承认发明人不享有先于由于在先发明或出于任何其它原因的此类公开内容。关于这些文件的日期或内容的表示的所有声明都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

通过以下实施方案进一步说明本公开内容，所述实施方案不应被解释为限制性的。

1.缀合物，其包含：

结合剂，

与所述结合剂连接的至少一个接头；和

与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂；

其中所述结合剂包含：

(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，

其中所述重链框架区和轻链框架区在所述框架区中任选地被1至8个氨基酸取代、缺失或插入修饰，

其中所述结合剂特异性地结合人GPC3。

2.如实施方案1所述的缀合物，其中所述结合剂包含：

3.缀合物，其包含：

结合剂，

与所述结合剂连接的至少一个接头；和

与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂；

4.如实施方案3所述的缀合物，其中所述框架区是鼠框架区。

5.如实施方案3所述的结合物，其中所述框架区是人框架区。

6.如实施方案1至5中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。

7.如实施方案6所述的缀合物，其中所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv，二硫化物连接的Fc、scFv、单域抗体、双链抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

8.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述重链可变区还包含重链恒定区。

9.如实施方案8所述的缀合物，其中重链恒定区是人IgG同种型的。

10.如实施方案9所述的缀合物，其中所述重链恒定区是IgG1恒定区。

11.如实施方案10所述的缀合物，其中所述IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:57或59所示的氨基酸序列。

12.如实施方案9所述的缀合物，其中所述重链恒定区是IgG4恒定区。

13.如实施方案10或11所述的缀合物，其中所述重链可变区和恒定区具有SEQ IDNO:65、66、68、69、72、73、76、77、79、80、82、83、130和131中任一个所示的氨基酸序列。

14.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述轻链可变区还包含轻链恒定区。

15.如实施方案14所述的缀合物，其中所述轻链恒定区是κ同种型的。

16.如实施方案15所述的缀合物，其中所述κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。

17a.如实施方案15或16所述的缀合物，其中所述轻链可变区和恒定区具有SEQ IDNO:67、70、71、74、75、78、81和84中任一个所示的氨基酸序列。

17b.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中：

18.如实施方案1至17b中任一项所述的缀合物，其中所述接头经由链间二硫化物残基、工程改造的半胱氨酸、聚糖或修饰的聚糖、结合剂的N-末端残基或与结合剂连接的聚组氨酸残基与所述结合剂连接。

19.如实施方案1至18中任一项所述的缀合物、其中所述缀合物的平均载药量为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。

20.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是单特异性的。

21.如实施方案1至20中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是二价的。

22.如实施方案1至19中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂包含第二结合结构域，并且所述结合剂是双特异性的。

23.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂选自澳瑞他汀、喜树碱、多卡霉素、蒽环类药物和加利车霉素。

24.如实施方案23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是澳瑞他汀。

25.如实施方案24所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE。

26.如实施方案23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是喜树碱。

27.如实施方案26所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是依喜替康。

28.如实施方案23所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是加利车霉素。

29.如实施方案28所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是SN-38。

30.如前述实施方案中任一项所述的缀合物，其中所述接头选自mc-VC-PAB、CL2、CL2A和(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_n ²-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)(SEQ ID NO:96)，其中n²代表2至8的整数。

31.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是mc-VC-PAB。

32.如实施方案31所述的缀合物，其中所述接头与至少一个分子的MMAE连接。

33.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是CL2A。

34.如实施方案33所述的缀合物，其与至少一个分子的SN-38连接。

35.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是CL2。

36.如实施方案35所述的缀合物，其与至少一个分子的SN-38连接。

37.如实施方案30所述的缀合物，其中所述接头是(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_n ²-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)-(SEQ ID NO:96)，其中n²代表2至8的整数。

38.如实施方案37所述的缀合物，其中所述接头与至少一个分子的依喜替康连接。

39.药物组合物，其包含前述实施方案中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。

40.核酸，其编码实施方案1至22中任一项所述的结合剂。

41.载体，其包含实施方案40所述的核酸。

42.细胞系，其包含实施方案41所述的核酸。

43.治疗GPC3+癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的实施方案1至38中任一项所述的缀合物或者实施方案39所述的药物组合物。

44.如实施方案43所述的方法，其中所述GPC3+癌症是癌或恶性肿瘤。

45.如实施方案44所述的方法，其中所述GPC3+癌症选自肝细胞癌，肺癌(如小细胞肺癌和大细胞肺癌)，结肠直肠癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，卵巢癌，肾细胞癌，乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)，黑色素瘤，生殖细胞癌(如睾丸生殖细胞癌)，胃癌，肉瘤和膀胱癌。

46.如实施方案43至45中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用免疫疗法。

47.如实施方案46所述的方法，其中所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。

48.如实施方案47所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自特异性结合人PD-1、人PD-L1或人CTLA4的抗体。

49.如实施方案48所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或伊匹木单抗。

50.如实施方案43至49中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用化学疗法。

51.如实施方案43至50中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述缀合物。

52.如实施方案43至51中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg或者约0.1mg/kg至约12mg/kg的剂量施用。

53.改善接受针对GPC3+癌症的免疫疗法和/或化学疗法的对象的治疗结果的方法，其包括：

向所述患有癌症的对象施用有效量的免疫疗法或化学疗法；以及

向所述对象施用治疗有效量的实施方案1至36中任一项所述的缀合物或者实施方案37所述的药物组合物；

其中与施用单独的免疫疗法或化学疗法相比，所述对象的治疗结果得到改善。

54.如实施方案53所述的方法，其中所述改善的治疗结果是选自稳定病情、部分反应或完全反应的客观反应。

55.如实施方案53所述的方法，其中所述改善的治疗结果是降低的肿瘤负荷。

56.如实施方案53所述的方法，其中所述改善的治疗结果是无进展存活或无疾病存活。

57.如实施方案53至56中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是检查点抑制剂。

58.如实施方案57所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括特异性结合人PD-1、人PD-L1或CTLA4的抗体。

59.如实施方案58所述的方法，其中所述检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或伊匹木单抗。

60.如实施方案53至59中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述缀合物。

61.如实施方案53至60中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。

62.实施方案1至38中任一项所述的缀合物或者实施方案37所述的药物组合物用于治疗对象的GPC3+癌症的用途。

63.实施方案1至38中任一项所述的缀合物或者实施方案37所述的药物组合物用于治疗接受免疫疗法或化学疗法的对象的GPC3+癌症的用途。

实施例

方法和材料

在以下实施例中使用以下方法和材料。

通过软(Soft)诱变进行的抗体工程-通过对ARD-103抗体的HCDR3(SEQ ID NO:5)和LCDR3(SEQ ID NO:8)上的区域进行软随机化并在LCDR1(SEQ ID NO:6)和HCDR2(SEQ IDNO:4)上引入位点饱和突变而产生噬菌体文库。通过Kabat编号确定CDR位置。将含有scFv产物的噬菌粒载体转化到感受态细菌TG1细胞中。文库大小为4E+07至3.2E+09。在一系列亲和力驱动的淘选(panning)和热处理筛选后选择稳定的变体。通过针对高和低抗原浓度进行淘选以选择高亲和力结合物来进行亲和淘选。将回收的噬菌体包装成多价噬菌体并进行热处理。在每轮淘选后，滴定回收的噬菌体并对其进行测序。通过Octet的结合、聚集和解离率分级来选择和筛选前导scFv变体。IgG转化后，优势克隆的表征包括结合ELISA、用于亲和力测量的Biacore和热稳定性。

结合ELISA-Nunc Immuno Maxisorp 96孔板(ThermoFisher)用重组人GPC3蛋白(R&D Systems)包被过夜。然后将板洗涤，封闭并与测试mAb一起孵育2小时。随后与山羊抗人Fc特异性二抗(Sigma)和TMB底物孵育测定结合测试试剂的检测。

细胞培养-GPC3+HepG2和HepG2-C3A肝癌细胞获自ATCC(Manassas,VA)并根据供应商的说明维持培养。

药物缀合物的制备-ARD103-vcMMAE(ARD103-mc-vc-PAB-MMAE)和变体ARD103-vcMMAE缀合物通过于室温在硼酸钠缓冲液(pH 7.4)中随机缀合来制备。简而言之，在与药物接头mc-vc-PAB-MMAE以10:1的有效载荷：抗体比孵育之前，ARD103(重链＝SEQ ID NO:9；轻链＝SEQ ID NO:10)或变体(VH和VL分别与IgG1恒定区和Igκ恒定区连接，序列示于表A中)用TCEP(三(2-羧乙基膦))还原。通过透析去除过量的药物接头。尺寸排阻HPLC证实缀合物纯度(99％单体，<1％聚集体)。通过LC-MS评估的载药量平均为4。ARD103-vcMMAE的代表性结构如下所示(对于变体ARD103的vcMMAE缀合物，用变体ARD103代替ARD103)。

ARD103-CL2A-SN38和变体(P1-B9、P1-D6和P6-D11)CL2A-SN38缀合物于室温在PBS缓冲液(pH7.4)中制备。简而言之，在与药物接头CL2A-SN38以10:1的比例孵育之前，将ARD103或变体抗体用TCEP还原。用N-乙基马来酰亚胺终止反应。通过透析去除过量的药物接头。尺寸排阻HPLC证实缀合物纯度(98.5％单体，1.5％聚集体)。通过LC-MS评估的载药量平均为8。ARD103-CL2A-SN38的代表性结构如下所示(对于变体ARD103抗体的CL2A-SN38缀合物，用变体ARD103代替ARD103)。

体外细胞毒性测定–用胰蛋白酶收获HepG2细胞，并以每孔1500个细胞铺在96孔透明平底黑色壁的组织培养板的组织培养基中。第二天，添加测试化合物(通过连续稀释以产生10点剂量曲线而制备的ADC)或介质。将细胞孵育96h。按照制造商的说明用CelltiterGlo(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。用Prism(GraphPad,La Jolla,CA)绘制数据。

小鼠异种移植研究-根据IACUC(机构动物护理和使用)批准的方案，按照AAALAC(实验室动物护理评估和认可协会)指南进行所有动物实验。对于肝癌模型，将500万个HepG2-C3A细胞植入NOD/SCID小鼠的右侧腹。用卡尺测量以每周两次监测肿瘤生长，并用公式(V＝0.5a×b²，其中a＝最长直径且b＝最短直径)计算肿瘤体积。当肿瘤达到180mm³时，用测试化合物静脉内治疗小鼠。在最后一次给药测试药剂后，监测小鼠的肿瘤生长、体重和一般健康状况，持续3周。用Prism(GraphPad,La Jolla,CA)绘制数据。

实施例1：抗GPC3抗体工程

通过对ARD103抗体的HCDR3和LCDR3上的区域进行软随机化并在LCDR1和HCDR2上引入位点饱和突变而产生ARD103抗体变体。在一系列亲和力驱动的淘选和热处理筛选后选择稳定的变体。图1显示了热处理对scFv结合重组hGPC3的能力的影响。在通过ELISA测试其与hGPC3的结合之前，在连续几轮的亲和力驱动的淘选后产生的多价噬菌体在不同温度(25℃、60℃和70℃)下加热5分钟。选择最佳克隆用于通过Octet进行解离率分级。在本实施例中，与亲本ARD-103相比，噬菌体P1-B9、P1-E6、P3-A1和P1-C11在热处理后显示出更好的结合能力。

表2显示了15个前导scFv的CDR中的氨基酸变化(测序从噬菌体展示筛选的构建体)。在多轮淘选、热处理测试及根据通过Octet测量的解离率分级后选择变体。与参考ARD-103相比的氨基酸变化以粗体显示。

表2：在CDR中具有氨基酸变化的前导scFv克隆

*L3A仅显示根据Kabat编号的关于ARD103参考抗体的LCDR3的一部分，例如“SQNTH”(SEQ ID NO:98)。L3B仅显示根据Kabat编号的关于ARD103参考抗体的LCDR3的一部分，例如“VPPT”(SEQ ID NO:99)。L3A和L3B共同构成LCDR3。

通过将VH与IgG1nG1m1同种异型变体恒定区连接以及将VL与Igκ恒定区连接，将前导scFv转化为IgG形式。并非所有克隆都能很好地表达全长IgG形式。表3显示了通过Biacore测定的ARD-103的8个前导IgG变体的结合动力学。动力学模型为1:1结合。分析物为重组hGPC3-His。捕获溶液为2至5μg/ml抗体。P6-D11抗体的结合常数(k_a)比ARD-103的结合常数(k_a)更高约2X。

表3：ARD-103的前导IgG变体的结合动力学

变体	动力学Chi²(RU²)	k_a(1/Ms)	K_d(1/s)	K_D(M)
					ARD-103	2.01E-01	4.81E+04	1.85E-04	3.85E-09
P1-A1	6.25E-02	1.10E+05	1.72E-04	1.56E-09
					P1-B9	1.15E-01	7.80E+04	2.60E-04	3.33E-09
P1-D6	1.97E-01	9.13E+04	3.30E-04	3.62E-09
					P1-E6	2.44E-01	7.56E+04	2.99E-04	3.95E-09
P1-G5	2.27E-01	7.85E+04	3.26E-04	4.15E-09
					P3-A1	5.43E-02	8.23E+04	1.96E-04	2.38E-09
P3-F7	6.80E-01	8.56E+04	7.24E-04	8.46E-09
					P6-D11	5.92E-01	1.07E+05	3.24E-04	3.02E-09

动力学模型＝1:1结合，分析物为hGPC3-His标记的，捕获溶液为2至5μg/ml mAb

图2显示通过ELISA测定的ARD-103的5个前导IgG变体(P1-B9、P1-D6、P1-G5、P3-F7和P6-D11)与重组hGPC3的结合。如图和表所示，5种前导抗体与hGPC3的结合与ARD-103所示类似。在这些条件下，EC50为约0.1nM。

表1提供了在HEK293细胞中表达的IgG形式的前导ARD103变体的HCDRs1-3、LCDRs1-3、VH、VL和恒定区序列。

实施例2：ARD103和变体MAB-VCMMAE在体外细胞毒性测定中的活性

在针对HepG2细胞的体外细胞毒性测定中，评估与vcMMAE缀合的ARD-103抗体或前导抗体变体的缀合物的活性。将细胞与ADC一起孵育96h。如图3中所示，变体的IC50值范围为0.3至0.43nM，其中P6-D11、P1-B9和P1-D6的活性与ARD-103的活性相当。在这些条件下，P6-D11和P1-B9缀合物的最大细胞杀伤类似于亲本ARD103-vcMMAE的最大细胞杀伤(30-31％)(图3)。

实施例3：与CL2A-SN38缀合的ARD103和变体MAB的体内活性

在HepG2-C3A肝癌异种移植模型中测试ARD103-CL2A-SN38和3种mAb变体(P1-B9、P1-D6和P6-D11)的CL2A-SN38缀合物和对照hIgG的抗肿瘤作用。将荷瘤小鼠(8只小鼠/组)每4天一次静脉内给予12mg/kg ADC，持续4次给药(图4中所示的箭头)。在该模型中，与介质或对照ADC组相比，ARD103-CL2A-SN38和3种mAb变体(P1-B9、P1-D6和P6-D11)的CL2A-SN38缀合物在减少肿瘤生长方面是有效的(p<0.001)。用对照hIgG-CL2A-SN38ADC治疗的小鼠在第36天显示37％的肿瘤生长延迟，但是此后肿瘤继续稳定生长，并且在实验结束时肿瘤大小与介质组相当。在用ARD103-CL2A-SN38或P6-D11-CL2A-SN38治疗的8只小鼠中，8只都持久完全消退。相比之下，P1-D6-CL2A-SN38组中的8只小鼠中，有7只在实验结束时无肿瘤。在用P1-B9-CL2A-SN38治疗的小鼠中，肿瘤生长显著降低，但是这种作用不是持续的；肿瘤在所有8只小鼠中稳定地再生长。3种mAb变体(P1-B9、P1-D6和P6-D11)显示相当的K_D值，但在本实验中作为CL2A-SN38缀合物，P6-D11的抗肿瘤作用优于P1-D6的抗肿瘤作用，并且这两种变体均优于P1-B9。[362]本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员根据前面的描述和附图将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

本文引用了各种出版物，包括专利、专利申请出版物和科学文献，其公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入。

序列

SEQ ID NO:85人GPC3,同种型1NP_001158089.1

SEQ ID NO:86人GPC3,同种型3NP_001158090.1

SEQ ID NO:87人GPC3,同种型4NP_001158091.1

SEQ ID NO:88人GPC3,同种型2NP_004475.1

SEQ ID NO:89–Gly₄Ser合成的接头

GGGGS

SEQ ID NO:90–(Gly₄Ser)₂合成的接头

GGGGSGGGGS

SEQ ID NO:91-(Gly₄Ser)₃合成的接头

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:92-(Gly₄Ser)₄合成的接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:93-(Gly₄Ser)₅合成的接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:94–六组氨酰基标签

His His His His His His

SEQ ID NO:95–可切割的肽接头

Gly-Phe-Leu-Gly

SEQ ID NO:96–可切割的肽接头

Gly-Gly-Phe-Gly

SEQ ID NO:97–可切割的肽接头

Ala-Leu-Ala-Leu

可以组合上述各种实施方案以提供进一步的实施方案。在本说明书中提及和/或在申请数据表(包括但不限于2021年11月19日提交的美国专利申请第63/281,454号和2022年3月31日提交的美国专利申请第63/326,061号)中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用以其整体并入本文中。如果需要使用各种专利、申请和出版物的概念来提供进一步的实施方案，则可以修改实施方案的方面。

根据以上详述，可以对实施方案进行这些和其它改变。通常，在所附权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所授权的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。

Claims

1.缀合物，其包含：

结合剂；

与所述结合剂连接的至少一个接头；和

与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂；

其中所述结合剂包含：

(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，

其中所述结合剂特异性地结合人GPC3。

2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述结合剂包含：

(viii)具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区。

3.缀合物，其包含：

结合剂；

与所述结合剂连接的至少一个接头；和

与每个接头连接的至少一种细胞毒性剂；

4.如权利要求3所述的缀合物，其中所述框架区是鼠框架区。

5.如权利要求3所述的结合物，其中所述框架区是人框架区。

6.如权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合部分。

7.如权利要求6所述的缀合物，其中所述结合剂是单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、二硫化物连接的Fc、scFv、单域抗体、双链抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

8.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述重链可变区还包含重链恒定区。

9.如权利要求8所述的缀合物，其中重链恒定区是IgG同种型的。

10.如权利要求9所述的缀合物，其中所述重链恒定区是IgG1恒定区。

11.如权利要求10所述的缀合物，其中所述IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:57或59所示的氨基酸序列。

12.如权利要求9所述的缀合物，其中所述重链恒定区是IgG4恒定区。

13.如权利要求10或11所述的缀合物，其中所述重链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:65、66、68、69、72、73、76、77、79、80、82、83、130和131中任一个所示的氨基酸序列。

14.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述轻链可变区还包含轻链恒定区。

15.如权利要求14所述的缀合物，其中所述轻链恒定区为κ同种型。

16.如权利要求15所述的缀合物，其中所述κ轻链恒定区具有SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。

17.如权利要求15或16所述的缀合物，其中所述轻链可变区和恒定区具有SEQ ID NO:67、70、71、74、75、78、81和84中任一个所示的氨基酸序列。

18.如权利要求13或15所述的缀合物，其中：

19.如权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中所述接头经由以下与所述结合剂连接：链间二硫化物残基、工程改造的半胱氨酸、聚糖或经修饰的聚糖、结合剂的N-末端残基、或与结合剂连接的聚组氨酸残基。

20.如权利要求1至19中任一项所述的缀合物、其中所述缀合物的平均载药量为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。

21.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是单特异性的。

22.如权利要求1至21中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂是二价的。

23.如权利要求1至20中任一项所述的缀合物，其中所述结合剂包含第二结合结构域，并且所述结合剂是双特异性的。

24.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂选自澳瑞他汀、喜树碱、多卡霉素和加利车霉素。

25.如权利要求24所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是澳瑞他汀。

26.如权利要求25所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是MMAE。

27.如权利要求24所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是喜树碱。

28.如权利要求25所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是依喜替康。

29.如权利要求24所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是加利车霉素。

30.如权利要求29所述的缀合物，其中所述细胞毒性剂是SN-38。

31.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述接头选自：mc-VC-PAB、CL2、CL2A和(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_n ²-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)，其中n²代表2至8的整数。

32.如权利要求31所述的缀合物，其中所述接头是mc-VC-PAB。

33.如权利要求32所述的缀合物，其中所述接头与至少一个分子的MMAE连接。

34.如权利要求31所述的缀合物，其中所述接头是CL2A。

35.如权利要求34所述的缀合物，其中所述接头与至少一个分子的SN-38连接。

36.如权利要求31所述的缀合物，其中所述接头是CL2。

37.如权利要求36所述的缀合物，其中所述接头与至少一个分子的SN-38连接。

38.如权利要求31所述的缀合物，其中所述接头是(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_n ²-C(＝O)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH₂-O-CH₂-(C＝O)-，其中n²代表2至8的整数。

39.如权利要求38所述的缀合物，其中所述接头与至少一个分子的依喜替康连接。

40.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。

41.核酸，其编码权利要求1至23中任一项所述的结合剂。

42.载体，其包含权利要求41所述的核酸。

43.细胞系，其包含权利要求41所述的核酸。

44.治疗GPC3+癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至39中任一项所述的缀合物或者权利要求40所述的药物组合物。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述GPC3+癌症是癌或恶性肿瘤。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述GPC3+癌症选自：肝细胞癌，肺癌如小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌，结肠直肠癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，卵巢癌，肾细胞癌，乳腺癌，黑色素瘤，生殖细胞癌(例如睾丸生殖细胞癌)，外阴癌，胃癌，肉瘤和膀胱癌。

47.如权利要求44至46中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用免疫疗法。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自特异性地结合人PD-1、人PD-L1或人CTLA4的抗体。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或伊匹木单抗。

51.如权利要求44至50中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用化学疗法。

52.如权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过静脉内施用。

53.如权利要求44至52中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约12mg/kg的剂量施用。

54.改善接受针对GPC3+癌症的免疫疗法和/或化学疗法的对象的治疗结果的方法，其包括：

向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至39中任一项所述的缀合物或者权利要求40所述的药物组合物；

55.如权利要求54所述的方法，其中所述改善的治疗结果为选自稳定病情、部分反应或完全反应的客观反应。

56.如权利要求54所述的方法，其中所述改善的治疗结果为降低的肿瘤负荷。

57.如权利要求54所述的方法，其中所述改善的治疗结果为无进展存活或无疾病存活。

58.如权利要求54至57中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括特异性地结合人PD-1、人PD-L1或CTLA4的抗体。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或伊匹木单抗。

61.如权利要求54至60中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过静脉内施用。

62.如权利要求54至61中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。

63.权利要求1至39中任一项所述的缀合物或者权利要求40所述的药物组合物在治疗对象的GPC3+癌症中的用途。

64.权利要求1至39中任一项所述的缀合物或者权利要求40所述的药物组合物在治疗接受免疫疗法或化学疗法的对象的GPC3+癌症中的用途。