CN111278462A - 抗egfr抗体药物结合物(adc)和其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供抗体‑药物结合物(ADC)，其包含通过连接子与抗EGFR抗体连接的细胞毒性剂或细胞抑制剂；包含所述ADC的组合物；制造所述ADC的方法；和治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用所述ADC。本公开提供特异性结合EGFR，且尤其是人类EGFR(hEGFR)的ADC。本文所述的抗EGFR Ab在重链恒定区中包含S239C突变，其中编号是根据Kabat。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月2日提交的美国临时申请第62/553,840号的权益，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开尤其涉及人类表皮生长因子受体(EGFR，也称为HER-1或Erb-B1)抗体药物结合物(ADC)、包含此类ADC的组合物、制造ADC的方法和其用途。
背景技术
癌症疗法包含大范围的治疗方法，包括手术、放射线和化学疗法。尽管通常互补的方法允许执业医师可以有广泛的选择来治疗癌症，但现有的治疗方法受许多缺点困扰，例如对靶向癌细胞的选择性没有超过对正常、健康细胞，以及癌症对治疗产生抗性。
与例如放射治疗的非靶向疗法相比，基于靶向治疗剂(例如抗体)治疗癌症的最新方法已产生具有较少副作用的化学治疗方案。增强抗体的抗肿瘤效力的一种有效方法涉及将细胞毒性药物或毒素与能够被靶细胞内化的单克隆抗体连接。这些药剂被称为抗体-药物结合物(ADC)。在向患者施用后，ADC经由其抗体部分结合于靶细胞且变得内化，从而允许药物或毒素发挥其作用(参见例如美国专利申请公开案第US2005/0180972号和第US2005/0123536号)。
人类表皮生长因子受体是由c-erbB原癌基因编码的170kDa跨膜受体，且展现内在酪氨酸激酶活性(Modjtahedi等人，《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》73：228-235(1996)；Herbst和Shin，《癌症(Cancer)》94：1593-1611(2002))。SwissProt数据库条目P00533提供人类EGFR的序列。
EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导路径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、细胞凋亡、血管生成、有丝分裂发生和癌转移的信号转导路径(Atalay等人，《肿瘤学年鉴(Ann.Oncology)》14：1346-1363(2003)；Tsao和Herbst，《信号(Signal)》4：4-9(2003)；Herbst和Shin，《癌症》94：1593-1611(2002)；Modjtahedi等人，《英国癌症杂志》73：228-235(1996))。
已知的EGFR配体包括EGF、TGFA/TGF-α、双调蛋白、epigen/EPGN、BTC/β细胞调节素、表皮调节素/EREG和HBEGF/肝素结合EGF。通过EGFR的配体结合触发关键细胞质残基的受体同型和/或异型二聚化和自身磷酸化。磷酸化的EGFR募集衔接子蛋白(如GRB2)，转而激活复杂的下游信号级联，至少包括以下主要下游信号级联：RAS-RAF-MEK-ERK、PI3激酶-AKT、PLCγ-PKC和STATs模块。此自身磷酸化还通过若干其它蛋白质引发了下游活化和信号传导，所述蛋白质经由其自身的磷酸酪氨酸结合SH2域与磷酸化酪氨酸结合。这些下游信号传导蛋白起始若干信号转导级联，主要是MAPK、Akt和JNK路径，从而引起细胞增殖。通过EGFR的配体结合还可激活NF-κ-B信号级联。配体结合还直接使其它蛋白质(如RGS16)磷酸化，激活其GTP酶活性，并可能将EGF受体信号传导与G蛋白结合受体信号传导结合。配体结合还使MUC1磷酸化且增加其与SRC和CTNNB 1/β-连环蛋白的相互作用。
已在许多人类恶性病况，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌中报道了EGFR的过表达。(Atalay等人，《肿瘤学年鉴(Ann.Oncology)》14：1346-1363(2003)；Herbst和Shin，《癌症》94：1593-1611(2002)；和Modjtahedi等人，《英国癌症杂志》73：228-235(1996))。在许多这些病况中，EGFR的过表达与患者的不良预后相关或有关联。(Herbst和Shin，《癌症》94：1593-1611(2002)；和Modjtahedi等人，《英国癌症杂志》73：228-235(1996))。EGFR还表达于正常组织的细胞中，尤其是皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织中，尽管其水平通常低于恶性细胞中的水平(Herbst和Shin，《癌症》94：1593-1611(2002))。
含有EGFR基因扩增(即，EGFR基因的多个拷贝)的很大一部分肿瘤还共表达受体的截短形式(Wikstrand等人(1998)《神经病毒学杂志(J.Neurovirol.)》4，148-158)，其称为de2-7EGFR、ΔEGFR、EGFRvIII或A2-7(术语在本文中可互换使用)(Olapade-Olaopa等人(2000)《英国癌症杂志》82，186-94)。de2-7 EGFR中所见的重排导致框内成熟mRNA缺少跨外显子2-7的801个核苷酸(Wong等人(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》89，2965-9；Yamazaki等人(1990)《日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)》81，773-9；Yamazaki等人(1988)《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》8，1816-20；和Sugawa等人(1990)《美国国家科学院院刊》87，8602-6)。对应EGFR蛋白具有包含细胞外域的残基6-273的267个氨基酸的缺失，和在融合连接部的新的甘氨酸残基(Sugawa等人，1990)。
此缺失与甘氨酸残基的插入一起在缺失界面处产生了独特的连接肽(Sugawa等人，1990)。已在多种肿瘤类型中报道了EGFRvIII，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrand等人(1997)《癌症研究(Cancer Res.)》57，4130-40；Olapade-Olaopa等人(2000)《英国癌症杂志》82，186-94；Wikstrand等人(1995)《癌症研究》55，3140-8；Garcia de Palazzo等人(1993)《癌症研究》53，3217-20)。尽管此截短的受体不结合配体，但其具有低组成活性且赋予神经胶质瘤细胞作为裸小鼠中的肿瘤异种移植物生长的显著生长优势(Nishikawa等人(1994)《美国国家科学院院刊》91，7727-31)，且能够转化NIH3T3细胞(Batra等人(1995)《细胞生长与分化(Cell Growth Differ.)》6，1251-9)和MCF-7细胞。de2-7 EGFR在神经胶质瘤细胞中利用的细胞机制尚未完全确定，但据报道包括细胞凋亡减少(Nagane等人(1996)《癌症研究》56，5079-86)和增殖的少量增强(Nagane等人，1996)。由于此截短受体的表达局限于肿瘤细胞，因此其表示抗体疗法的高度特异性标靶。
因此，在本领域中仍需要可用于癌症治疗中的治疗目的的抗EGFR抗体和ADC。
发明内容
本公开提供抗体-药物结合物(ADC)，其包含通过连接子与抗EGFR抗体连接的细胞毒性剂或细胞抑制剂；包含ADC的组合物；制造ADC的方法；和治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用ADC。如实例中更详细描述，且不希望被任何特定操作理论束缚，本文中包括的数据展示包含特定连接子和特定细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(即，吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体)的抗EGFR ADC发挥强力的抗肿瘤活性。此外，本公开的抗EGFR ADC的特征在于固定的低单种载药量，其中低载药量出人意料地提供高度有效的ADC。
因此，在实施例中，本公开提供了特异性结合EGFR，且尤其是人类EGFR(hEGFR)的ADC。
在实施例中，本公开提供了抗体药物结合物(ADC)，其包含通过连接子与抗体连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，其中ADC为根据结构式(I)的化合物：
[D-L-XY]n-Ab
(I)，
或其盐，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体，L为连接子，且Ab为抗人类表皮生长因子受体抗体。在实施例中，抗EGFR Ab包含(i)包含SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列的重链CDRH1域；包含SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列的重链CDRH2域，和包含SEQID NO：5中所阐述的氨基酸序列的重链CDRH3域；(ii)包含SEQ ID NO：8中所阐述的氨基酸序列的轻链CDRL1域；包含SEQ ID NO：9中所阐述的氨基酸序列的轻链CDRL2域；包含SEQ IDNO：10中所阐述的氨基酸序列的轻链CDRL3域；和(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat。XY表示通过S239C突变将连接子L与抗体Ab连接的共价键。在实施例中，n为任何整数。在实施例中，n为2。在实施例中，抗体Ab具有包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区。在实施例中，抗体Ab具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链。在实施例中，XY为顺丁烯二酰亚胺-巯基键。在实施例中，L包含如式III、IV、V、VI、VII、VIII或IX中所述的连接子。举例来说，在实施例中，L包含如式IX中所述的连接子。在实施例中，连接子为顺丁烯二酰亚胺基己酰基-缬氨酸-丙氨酸(mc-Val-Ala)连接子。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在某些实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开提供了抗体药物结合物(ADC)，其包含通过连接子与抗体连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，其中抗体药物结合物为根据结构式(I)的化合物
[D-L-XY]n-Ab
(I)，
或其盐，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体；L为连接子；Ab为包含以下的抗EGFR抗体：(i)包含SEQ ID NO：2的重链可变区，(ii)包含SEQ ID NO：7的轻链可变区；和(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；XY表示将连接子L与抗体Ab连接的共价键；且n为任何整数。在实施例中，n为2或4。在实施例中，n为2。在实施例中，XY是与抗体Ab上的巯基形成的键。在实施例中，XY为顺丁烯二酰亚胺-巯基键。在实施例中，L包含如式III、IV、V、VI、VII、VIII或IX中所述的连接子。在实施例中，L包含如式IX中所述的连接子。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开提供了抗体药物结合物，其包含通过连接子与抗体连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，其中抗体药物结合物为根据结构式(I)的化合物：
[D-L-XY]n-Ab
(I)，
或其盐，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体；L为连接子；Ab为包含以下的抗EGFR抗体：(i)包含SEQ ID NO：1中所阐述的氨基酸序列的重链，(ii)包含SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列的轻链；XY表示将连接子L与抗体Ab连接的共价键；且n为任何整数。在实施例中，n为2或4。在实施例中，n为2。在实施例中，XY是与抗体Ab上的巯基形成的键。在实施例中，XY为顺丁烯二酰亚胺-巯基键。在实施例中，L包含如式III、IV、V、VI、VII、VIII或IX中所述的连接子。在实施例中，L包含如式IX中所述的连接子。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开的特征在于包含式(X)的结构的ADC：
或其盐，其中Ab含有包含以下的抗EGFR抗体：(i)重链可变区，其含有包含SEQ IDNO：3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：4的CDRH2序列和包含SEQ ID NO：5的CDRH3序列；(ii)轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO：8的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：9的CDRL2序列和包含SEQID NO：10的CDRL3序列；(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；其中n为2。在实施例中，重链可变区包含SEQ ID NO：2，且轻链可变区包含SEQ ID NO：7。在实施例中，ADC含有包含SEQ ID NO：1的全重链，和包含SEQ ID NO：6的全轻链。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开的特征在于包含式(X)的结构的ADC：
或其盐，其中Ab含有包含以下的抗EGFR抗体：(i)包含SEQ ID NO：2的重链可变区；(ii)包含SEQ ID NO：7的轻链可变区；(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；其中n为2。在实施例中，重链可变区包含SEQ ID NO：2，且轻链可变区包含SEQID NO：7。在实施例中，ADC含有包含SEQ ID NO：1的全重链，和包含SEQ ID NO：6的全轻链。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开的特征在于包含式(X)的结构的ADC：
或其盐，其中Ab含有包含以下的抗EGFR抗体：(i)包含SEQ ID NO：1的重链；(ii)包含SEQ ID NO：6的轻链；其中n为2。
在实施例中，本公开提供包含本文所述的ADC的组合物。在实施例中，组合物进一步包含至少一种赋形剂、载剂和/或稀释剂。在实施例中，本公开的组合物被调配成用于人体的药物用途。
在实施例中，本公开提供一种制造ADC的方法，其包含使抗EGFR抗体与根据结构式(Ia)D-L-Rx的合成子接触，其中D为能够穿过细胞膜的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，L为能够被溶酶体酶裂解的连接子，且Rx包含能够在合成子将合成子共价连接至抗体的条件下将合成子共价连接至抗体的官能团，其中D为PBD二聚体，且其中抗体含有包含SEQ ID NO：1中所阐述的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列的轻链。
在实施例中，本公开提供一种制造ADC的方法，其包含使抗EGFR抗体与根据结构式(Ia)D-L-Rx的合成子接触，其中D为能够穿过细胞膜的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，L为能够被溶酶体酶裂解的连接子，且Rx包含能够在合成子将合成子共价连接至抗体的条件下将合成子共价连接至抗体的官能团，其中D为PBD二聚体，且其中抗体包含(i)重链可变区，其含有包含SEQ ID NO：3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：4的CDRH2序列和包含SEQ ID NO：5的CDRH3序列；(ii)轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO：8的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：9的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：10的CDRL3序列；和(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开提供一种制造ADC的方法，其包含使抗EGFR抗体与根据结构式(Ia)D-L-Rx的合成子接触，其中D为能够穿过细胞膜的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，L为能够被溶酶体酶裂解的连接子，且Rx包含能够在合成子将合成子共价连接至抗体的条件下将合成子共价连接至抗体的官能团，其中D为PBD二聚体，且其中抗体包含(i)重链可变区，其含有包含SEQ ID NO：3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：4的CDRH2序列和包含SEQ ID NO：5的CDRH3序列；(ii)轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO：8的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：9的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：10的CDRL3序列；和(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；且其中Rx为巯基或顺丁烯二酰亚胺-巯基。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开提供一种制造ADC的方法，其包含使抗EGFR抗体与根据结构式(Ia)D-L-Rx的合成子接触，其中D为能够穿过细胞膜的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，L为能够被溶酶体酶裂解的连接子，且Rx包含能够将合成子连接至抗体的官能团，其中D为PBD二聚体；其中L包含如式III、IV、V、VI、VII、VIII或IX中所述的连接子；且其中抗体包含(i)重链可变区，其含有包含SEQ ID NO：3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：4的CDRH2序列和包含SEQID NO：5的CDRH3序列；(ii)轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO：8的CDRL1序列、包含SEQ IDNO：9的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：10的CDRL3序列；和(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；且其中Rx为巯基或顺丁烯二酰亚胺-巯基。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
在实施例中，本公开提供一种制造ADC的方法，其包含使抗EGFR抗体与根据结构式(Ia)D-L-Rx的合成子接触，其中D为能够穿过细胞膜的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，L为能够被溶酶体酶裂解的连接子，且Rx包含能够将合成子连接至抗体的官能团，其中D为PBD二聚体；其中L包含如式IX中所述的连接子；且其中抗体包含(i)重链可变区，其含有包含SEQID NO：3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO：4的CDRH2序列和包含SEQ ID NO：5的CDRH3序列；(ii)轻链可变区，其含有包含SEQ ID NO：8的CDRL1序列、包含SEQ ID NO：9的CDRL2序列和包含SEQ ID NO：10的CDRL3序列；和(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；且其中Rx为巯基或顺丁烯二酰亚胺-巯基。在实施例中，抗EGFR抗体包含IgG1同型。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。在实施例中，抗EGFR抗体为人类化抗体。
附图说明
图1展示EGFR以及与Ab1和Ab2(具有西妥昔单抗的六个相同CDR氨基酸序列的抗体)结合的区域的示意图。
图2展示Ab1(S239C)-PBD的制备方法。结合过程由还原链间二硫化物、定量氧化和与过量PBD药物连接子结合组成，如实例2中所述。
图3提供Ab1和AbA的可变重(VH)链和可变轻(VL)链区氨基酸序列。VH和VL区内的CDR序列为加框的，且Ab1 VH序列与AbA VH序列之间的差异为加底纹的。
图4描述Ab1和AbA的全长轻链和重链。突出显示重链中的Ab1序列与AbA序列之间的差异。
图5展示Ab1和AbA、S239C突变形式Ab1(S239C)和AbA(S239C)以及PBD结合物Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD针对人类细胞的流式细胞测量术分析。将增加浓度的抗体添加至过表达野生型EGFR(图5A)和过表达EGFR CA突变体(图5B)的NR6细胞，其中暴露了由Ab1和AbA识别的EGFR表位。如实例3中所示和所述，相比于亲本抗体Ab1(S239C)或Ab1，Cys工程改造的Ab1(S239C)与PBD的结合不改变结合特性。
图6展示相比于多种其它过表达EGFR的细胞系，SW-48(表达EGFR的结肠直肠腺癌细胞系，每个细胞＞200,000个受体，IHC H评分228)、NCI-H441(具有中等至低EGFR表达的肺腺瘤异种移植物模型，每个细胞约100,000个受体；IHC H评分150)和LoVo(具有较低EGFR表达的KRAS突变型结肠直肠腺癌，每个细胞＜100,000个受体，IHC H评分140)的EGFR数目。通过经培养细胞上的细胞表面抗原的FACS分析，使用QIFIT分析用西妥昔单抗来确定细胞表面密度(每个细胞的抗原结合能力)。
图7展示相比于对应奥瑞他汀结合物(Ab1-MMAE)，Ab1(S239C)-PBD针对表达不同水平的表面EGFR(即，EGFR的低、中等和高表达)的一组肿瘤细胞系的改进的细胞毒性活性。将SW-48(图7A)、NCI-H441(图7B)、LoVo(图7C)和A431(图7D)肿瘤细胞接种于96孔板中，并以所示浓度添加ADC。在37℃下72小时之后，使用ATPlite发光分析来评估细胞活力。如图7A-D中所示，对于每个EGFR表达水平，相比于对应奥瑞他汀结合物(Ab1-MMAE ADC)，在用PBD结合物Ab1(S239C)-PBD处理后，所有四个细胞系中的细胞毒性活性均得到改进。
图8A是展示Ab1(S239C)-PBD在NCI-H441肺腺癌异种移植物模型中的体内功效的图示。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量。箭头表示给药天数。如图8A中所示和实例5中所述，以0.3mg/kg施用的Ab1(S239C)-PBD在100％的动物中诱发完全且持久的消退，而以高10倍的剂量(3mg/kg)施用的对应奥瑞他汀ADC Ab1-MMAF(即，与单甲基奥瑞他汀F结合的Ab1)仅在40％的动物中诱发完全反应。
图8B是展示Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD在LoVo结肠直肠腺癌异种移植物肿瘤模型中的体内功效的图示。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量。箭头表示给药天数。如图8B中所示和实例5中所述，相比于阴性对照结合物Ab095 PBD增加的反应持久性证明了抗EGFR结合物的特异性。
图9A和图9B展示Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD在SW-48结肠直肠癌异种移植物肿瘤模型中的功效。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量。箭头表示给药天数。
图10A展示Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD在源自患者的异种移植物模型CTG-0162(NSCLC)中的体内功效。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量，且箭头表示给药天数。如图10A中所示和实例5中所述，在CTG-0162模型中，Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD有效地抑制肿瘤生长，而剂量高十倍的奥瑞他汀ADC AbA-MMAE效果较差，且Ab1在此模型中无效。
图10B展示Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD在源自患者的异种移植物CTG-0786头颈癌(HNC)模型中的体内功效。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量，且箭头表示给药天数。如图10B中所示和实例5中所述，Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD有效地抑制肿瘤生长，而基于奥瑞他汀的ADC AbA-MMAE需要高得多的剂量来获得功效。
图11展示Ab1(S239C)-PBD与替莫唑胺(temozolomide)和放射的组合在多形性胶质母细胞瘤的U-87MGde2-7模型中的功效。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量，且箭头表示给药天数。如图11中所示和实例6中所述，将Ab1(S239C)-PBD添加至替莫唑胺或分次放射或三重组合使得肿瘤生长抑制显著增加。
图12A是展示Ab1(S239C)的蛋白质聚集和片段化的图示。在时间“0”(t0)处显示了聚集体百分比(％)和片段％，且显示为每日的片段增加％和每日的聚集体增加％。如实例6中所示和所述，Ab1(S239C)mAb和Ab1(239C)-PBD DAR2的体外血浆稳定性与Ab1-MMAF类似。
图12B是展示Ab1(S239C)-PBD DAR2的蛋白质聚集和片段化的图示。在时间“0”(t0)处显示了聚集体百分比(％)和片段％，且显示为每日的片段增加％和每日的聚集体增加％。如实例6中所示和所述，Ab1(S239C)mAb和Ab1(S239C)-PBD DAR2的体外血浆稳定性与Ab1-MMAF类似。
具体实施方式
本公开涉及靶向EGFR的抗体药物结合物(ADC)和其用途。本公开的ADC具有有利的属性，其提供优于现有技术中公开的其它ADC的明显优势。例如，本公开的ADC比使用基本上相同的抗体主链的基于奥瑞他汀(auristatin)的ADC强力得多，如以下实例3-6中所示。也就是说，本公开的ADC(1)当以相同剂量施用时显示比对应奥瑞他汀ADC更大的效力，和(2)当以显著较低(即，低10倍)剂量投与时显示与对应奥瑞他汀ADC类似的效力。本公开的抗体还具有约2的低单种载药量(或约2的平均药物与抗体比)，同时保留高度的效力。
因此，本公开涉及抗体药物结合物，其包含通过连接子与抗EGFR抗体连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(例如PBD)；包含本公开的ADC的组合物；制造本公开的ADC的方法；和使用ADC治疗癌症，如与EGFR的过表达或扩增相关的癌症的方法。
在实施例中，本公开的特征在于包含式(X)的结构的ADC：
或其盐，其中Ab含有包含以下的抗EGFR抗体：(i)重链可变区，其含有包含SEQ IDNO：3中所阐述的氨基酸序列的重链CDRH1域；包含SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列的重链CDRH2域，和包含SEQ ID NO：5中所阐述的氨基酸序列的重链CDRH3域；(ii)包含SEQ IDNO：8中所阐述的氨基酸序列的轻链CDRL1域；包含SEQ ID NO：9中所阐述的氨基酸序列的轻链CDRL2域；包含SEQ ID NO：10中所阐述的氨基酸序列的轻链CDRL3域，(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；且(iv)其中n为2。
在实施例中，本公开的特征在于包含式(X)的结构的ADC：
或其盐，其中Ab含有包含以下的抗EGFR抗体：(i)包含SEQ ID NO：2的重链可变区，(ii)包含SEQ ID NO：7的轻链可变区，(iii)在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；且(iv)其中n为2。
在实施例中，本公开的特征在于包含式(X)的结构的ADC：
或其盐，其中Ab含有包含以下的抗EGFR抗体：(i)包含SEQ ID NO：1的重链，(ii)包含SEQ ID NO：6的轻链；且(iii)其中n为2。
在实施例中，本公开的特征在于ADC，其包含通过连接子与抗EGFR抗体连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，其中ADC为根据结构式(I)的化合物：
[D-L-XY]nAb
(I)，
或其盐，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体；L为连接子；Ab为抗EGFR抗体，其含有包含SEQ ID NO：1中所阐述的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：6的轻链；XY表示将连接子L连接至抗体Ab的共价键，且n为整数。确切地说，包含本文所述的特定连接子和特定细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(例如PBD二聚体)的抗EGFR ADC发挥出人意料的强力抗肿瘤活性，尤其在相比于包含与奥瑞他汀连接的基本上相同抗体的ADC时。此外，本公开的抗EGFR ADC的特征在于低单种载药量，其出人意料地在例如治疗与EGFR的高或低表达水平相关的癌症中产生高度有效的ADC。如本文实例中所述，Ab1(S239C)-PBD是比对应Ab1-奥瑞他汀ADC(例如Ab1-MMAF)更强力的结合物。如本文所用，“Ab1”是指具有包含SEQ ID NO：11的重链和包含SEQ ID NO：6的轻链的抗体。“Ab1(S239C)”是指具有包含SEQ ID NO：1的重链和包含SEQ ID NO：6的轻链的抗体。Ab1具有与Ab1(S239C)相同的重链序列，但在239位(Kabat编号)具有丝氨酸。
如本领域技术人员将了解，抗体和/或结合片段在本质上为“模块化的”。在整个本公开中，描述包含抗体和/或结合片段的各种“模块”的各种特定实施例。作为特定的非限制性实例，描述可变重链(VH)CDR、VH链、可变轻链(VL)CDR和VL链的各种特定实施例。本文公开的ADC在本质上也是“模块化的”。在整个本公开中，描述包含ADC的各种“模块”的各种特定实施例。作为特定的非限制性实例，描述可构成ADC的抗体、连接子和细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的特定实施例。
本文所述的ADC可呈盐形式，且在一些特定实施例中为药学上可接受的盐。具有足够酸性、足够碱性或两种官能团的本公开的ADC可与多种无机碱以及无机和有机酸中的任一种反应以形成盐。
除非本文中另外定义，否则结合本公开使用的科学与技术术语将具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。
在本文中可互换使用的术语“抗表皮生长因子(EGF)受体抗体”或“抗EGFR抗体”是指特异性结合于EGFR的抗体。“结合”所关注的抗原(即，EGFR)的抗体为如下抗体：能够以足够亲和力结合抗原以使得抗体可用于靶向表达抗原的细胞。在优选实施例中，抗体特异性结合于人类EGFR(hEGFR)。抗EGFR抗体的实例公开于以下实例1中。除非另外指明，否则术语“抗EGFR抗体”打算指结合于野生型EGFR或EGFR的任何变异体，如EGFRvIII的抗体。
野生型人类EGFR的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO：12，其中信号肽(氨基酸残基1-24)为加下划线的，且细胞外域(ECD，氨基酸残基25-645)的氨基酸残基用粗体突出显示。EGFR的截短野生型ECD(在本文中也称为EGFR(1-525))等同于SEQ ID NO：12的氨基酸1-525。野生型EGFR的成熟形式对应于无信号肽的蛋白质，即，SEQ ID NO：12的氨基酸残基25至1210。
(SEQ ID NO：12)
人类EGFR的ECD的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO：13，且包括信号序列(加下划线的)。
(SEQ ID NO：13)
EGFR的总体结构描述于图1中。EGFR的ECD具有四个域(Cochran等人(2004)《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》，287，147-158)。已表明域I和III促进形成配体的高亲和力结合位点。域II和IV是富含半胱氨酸的层粘连蛋白样区域，其使蛋白质折叠稳定且含有可能的EGFR二聚化界面。图示进一步展示与Ab1和Ab2结合的区域。Ab1为人类化EGFR抗体，具有如SEQ ID NO：15中所提供的重链可变区(VH)序列(具有分别如SEQ ID NO：16、17和18中所阐述的CDRH1、CDRH2和CDRH3组)和如SEQ ID NO：7中所提供的轻链可变区(VL)氨基酸序列(具有分别如SEQ ID NO：8、9和10中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3组)。Ab2为具有西妥昔单抗(cetuximab)的六个相同CDR氨基酸序列的抗体。
EGFR变异体可由伴以EGFR基因扩增的基因重排产生。EGFRvIII是人类癌症中最常见的EGFR变异体(Kuan等人《内分泌相关癌症(Endocr Relat Cancer.)》8(2)：83-96(2001))。在基因扩增过程中，在EGFR的细胞外域中出现267个氨基酸的缺失，其中在融合连接部插入了甘氨酸残基。因此，EGFRvIII缺乏野生型EGFR的细胞外域的氨基酸6-273且在连接部包括甘氨酸残基插入。EGFR的EGFRvIII变异体在细胞外域中含有267个氨基酸残基的缺失，其中在缺失连接部插入了甘氨酸。EGFRvIII氨基酸序列如下所示为SEQ ID NO：14(ECD以粗体突出显示且信号序列为加下划线的)。
(SEQ ID NO：14)
EGFRvIII通过配体独立方式的组成型信号传导促进肿瘤进展。尚未知晓EGFRvIII表达于正常组织中(Wikstrand等人《癌症研究》55(14)：3140-3148(1995)；Olapade-Olaopa等人《英国癌症杂志》82(1)：186-94(2000))，但在肿瘤细胞，尤其是多形性胶质母细胞瘤中显示显著表达(Wikstrand等人《癌症研究》55(14)：3140-3148(1995)；Ge等人《国际癌症杂志》98(3)：357-61(2002)；Wikstrand等人《癌症研究》55(14)：3140-3148(1995)；Moscatello等人《癌症研究》55(23)：5536-9(1995)；Garcia de Palazzo等人《癌症研究》53(14)：3217-20(1993)；Moscatello等人《癌症研究》55(23)：5536-9(1995)；和Olapade-Olaopa等人2(1)：186-94(2000))。
如本文所用，术语“抗体"(Ab)是指特异性结合于特定抗原(即，hEGFR)或与其免疫反应的免疫球蛋白分子。抗体在轻链和重链可变域中均包含互补决定区(CDR)，也称为高变区。可变域的更高度保守的部分称为构架(FR)。如本领域中已知，描绘抗体的高变区的氨基酸位置/边界可变化，这取决于上下文和本领域中已知的各种定义。可变域内的一些位置可被视为混合高变位置，因为在一组标准下可将这些位置视为在高变区内，而在不同组的标准下可将其视为在高变区之外。这些位置中的一个或多个也可在扩展的高变区中找到。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR区，FR区主要采用β-折叠构型，由三个或四个CDR连接，形成连接且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过FR区极为接近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。参见Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest)》(美国国立卫生研究院(National Institute of Health)，Bethesda，Md.1987)。除非另外指明，否则如本文所用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。
如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域中可用或已知的任何方式衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可使用本领域中已知的多种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合。在本公开的许多用途，包括在人体中体内使用包括抗EGFR抗体的ADC中，可适当地使用嵌合、灵长类化、人类化或人类抗体。在实施例中，本公开的抗EGFR抗体为人类化的。
非人类(例如鼠类)抗体的“人类化”形式为含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。一般来说，人类化抗体将包含基本上所有的至少一个并且通常两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人类免疫球蛋白序列的FR区。人类化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白共同序列的至少一部分。抗体人类化的方法是本领域中已知的。
本公开的抗EGFR ADC可包含能够特异性结合EGFR的全长(完整)抗体分子。在实施例中，本公开的ADC包含全长Ab1(S239C)抗体。如本文所用，术语“细胞毒性剂和/或细胞抑制剂”打算指已知抑制细胞生长和/或复制，和/或杀死细胞的任何药剂或药物。在一个实施例中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂是细胞渗透性DNA小沟结合剂，如吡咯并苯并二氮呯(“PBD")和PBD二聚体。
术语“抗体药物结合物”或“ADC”是指与一种或多种细胞毒性剂和/或细胞抑制剂化学连接的抗体。在实施例中，ADC包括抗体、细胞毒性剂和/或细胞抑制剂和连接子，所述连接子能够将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂连接或结合至抗体。本公开的ADC通常具有1至3种与抗体结合的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，包括1、2或3个载药物种。
本文公开的ADC可包含各种化学计量摩尔比的药物分子和抗体部分，这取决于抗体的构型并且至少部分取决于用于实现结合的方法。
出于本公开的目的，本领域技术人员将理解“载药量”和“药物与抗体的比”(也称为DAR)是不同的。DAR是指至少两个ADC分子的群体中每个抗体的药物分子的平均摩尔比，而载药量是指个别ADC分子中每个抗体的药物分子的摩尔比。载药量主要与ADC的结构和设计有关，而DAR主要与将向患者施用的治疗性ADC组合物有关。
术语“载药量(drug load/drug loading)”是指个别ADC分子中每个抗体的药物分子的摩尔比。在某些实施例中，载药量可包含1至2、1至4个药物分子、2-4个药物分子、1-3个药物分子或2-3个药物分子(即，其中对于前述中的每一个，ADC分子的通式为A(-L-D)n，且其中n为表示所述药物分子的范围的整数或整数范围)。
术语“药物与抗体的比”或“DAR”是指至少两个ADC分子的群体中每个抗体的药物分子的加权平均摩尔比。尽管通过例如经工程改造的抗体构筑体、选择性半胱氨酸还原和制造后纯化的技术提供了相对的结合物特异性，但给定的ADC群体可包含具有不同载药量的ADC分子(例如在IgG1抗体的情况下，在1至8的范围内)。也就是说，在结合之后，本发明的ADC组合物可包含具有不同载药量的ADC的混合物。此类群体可由于多种原因而出现，但可尤其包括批次变化性和化学结合反应未能继续至完全完成的情况。因此，DAR表示整个ADC群体(即，所有的ADC分子合计)的载药量的加权平均值。ADC群体可含有单一的主要或优选ADC物种(例如载药量为2的ADC)与相对较低水平的非主要或非优选的ADC物种(例如载药量为1、2、3或4等的ADC)，或其可含有载药量比例不同(例如DAR为2.0±0.1、±0.2、±0.3、±0.4、±0.5等)的任何种类的物种。
在实施例中，本公开的ADC包含与载药量为2的细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如PBD)结合的抗EGFR抗体，例如Ab1(S239C)。在实施例中，本公开的ADC组合物包含与细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如PBD)结合的抗EGFR抗体，例如Ab1(S239C)，其中DAR为约2。
在实施例中，本公开的ADC包含一种抗EGFR抗体，其含有包含如SEQ ID NO：3、4和5中所阐述的CDR组(CDRH1、CDRH2、CDRH3)的重链可变区，和包含如SEQ ID NO：8、9和10中所阐述的CDR组(CDRL1、CDRL2、CDRL3)的轻链可变区。在实施例中，抗EGFR抗体为具有重链恒定区的IgG1同型，所述重链恒定区具有被工程改造以提供PBD的结合位点的半胱氨酸突变。在实施例中，半胱氨酸突变在重链的239位处。在实施例中，突变为根据Kabat编号的S239C。如本文所述的抗EGFR抗体Ab1(S239C)具有包含分别如SEQ ID NO：3、4和5中所阐述的CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，和包含分别如SEQ ID NO：8、9和10中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区。在实施例中，抗EGFR抗体缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
在实施例中，本公开的ADC包含抗EGFR抗体，其含有包含SEQ ID NO：2的重链可变区，和包含SEQ ID NO：7的轻链可变区。在实施例中，抗EGFR抗体为具有重链恒定区的IgG1同型，所述重链恒定区具有被工程改造以提供PBD的结合位点的半胱氨酸突变。在实施例中，半胱氨酸突变在重链的239位处。在实施例中，半胱氨酸突变为根据Kabat编号的S239C。如本文所述的抗EGFR抗体Ab1(S239C)具有包含SEQ ID NO：2的重链可变区，和包含SEQ IDNO：7的轻链可变区。在实施例中，本公开的抗EGFR抗体缺乏C端赖氨酸或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
在实施例中，本公开的ADC包含抗EGFR抗体，其含有包含SEQ ID NO：1的重链，和包含SEQ ID NO：6的轻链。如本文所述的抗EGFR抗体Ab1(S239C)具有包含SEQ ID NO：1中所阐述的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列的轻链。SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：11的不同之处仅在于SEQ ID NO：1含有S239C突变。
本文所述的抗EGFR ADC的实施例可为其序列已经修饰以改变至少一种恒定区介导的生物效应功能的抗体或片段。例如，在实施例中，抗EGFR ADC可经修饰以相对于未修饰的抗体降低至少一种恒定区介导的生物效应功能，例如降低与Fc受体(FcγR)的结合。FcγR结合可通过在FcγR相互作用所需的特定区域使抗体的免疫球蛋白恒定区片段突变来降低(参见例如Canfield和Morrison，1991，《实验医学杂志》173：1483-1491；和Lund等人，1991，《免疫学杂志(J.Immunol.)》147：2657-2662)。降低FcγR结合还可降低依赖于FcγR相互作用的其它效应功能，如调理作用、吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。
抗EGFR ADC中包括的抗体可具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与增强的ADCC活性相关，尤其在低抗体剂量下。参见Shields等人，2002，《生物化学杂志》277：26733-26740；Shinkawa等人，2003，《生物化学杂志》278：3466-73。制备岩藻糖较少的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中生长。YB2/0细胞表达低水平的FUT8 mRNA，其编码α-1，6-岩藻糖基转移酶，一种多肽岩藻糖基化所需的酶。
抗EGFR ADC中包括的抗体可包括修饰，所述修饰提高或降低其与新生儿Fc受体FcRn的结合亲和力，例如通过使FcRn相互作用所涉及的特定区域的免疫球蛋白恒定区片段突变(参见例如WO 2005/123780)。抗EGFR抗体和/或结合片段可具有插入至其一个或多个高变区中的一个或多个氨基酸，例如如以下各者中所述：Jung和Plückthun，1997，《蛋白质工程(Protein Engineering)》10：9，959-966；Yazaki等人，2004，《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng.Des Sel.)》17(5)：481-9；和美国专利申请第2007/0280931号。
抗体可通过多种技术中的任一种产生，如例如以全文引用的方式并入本文中的国际公开案第WO2015/143382号和第WO2010/096434号中所述。
对EGFR，例如人类EGFR具有高亲和力的抗EGFR抗体和/或结合片段对于治疗用途可能是合乎需要的。因此，本公开涵盖了包含对EGFR，且尤其是人类EGFR具有高结合亲和力的抗EGFR抗体和/或结合片段的ADC。在特定实施例中，抗体和/或结合片段以至少约100nM的亲和力结合EGFR，但可展现更高亲和力，例如至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或甚至更高。在一些实施例中，抗体以约1pM至约100nM的范围内的亲和力，或在前述值中的任一个之间的范围内的亲和力结合EGFR。
抗体和/或结合片段对EGFR的亲和力可使用本领域中熟知或本文描述的技术确定，例如但不限于ELISA、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子共振、流式细胞测量术或荧光偏振分析。
抗EGFR抗体可通过使用本领域中已知的标准重组DNA方法在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备，所述技术如《分子克隆；实验室手册(MolecularCloning；A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook，Fritsch和Maniatis(编)，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)中所述的那些。例如，将编码部分或全长轻链和重链的DNA插入至表达载体中，使得基因以可操作方式连接于转录和翻译控制序列且转型至宿主细胞中。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入至独立载体中，或更通常地，将两种基因插入至相同表达载体中，其通过本领域中已知的方法完成。抗体还可通过化学合成产生(例如通过《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》，第2版，1984The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL中所描述的方法)。
本公开的抗EGFR ADC一般包含抗EGFR抗体(例如Ab1(S239C))，其具有通过一种或多种连接子(可相同或不同)与其连接的一种或多种细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(也可相同或不同)。在实施例中，抗EGFR ADC为根据结构式I的化合物：
[D-L-XY]n-Ab
(I)
或其盐，其中每个“D"彼此独立地表示细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(“药物”)；每个“L”彼此独立地表示连接子；“Ab”表示抗EGFR抗体；每个“XY”表示在连接子上的官能团Rx与抗原结合部分上的“互补”官能团Ry之间形成的键；且n表示与Ab连接的药物数量(即，单种载药量)。上文描述了可构成根据结构式(I)的ADC的各种抗EGFR抗体的特定实施例。
在结构式(I)的ADC或盐的实施例中，每个D是相同的和/或每个L是相同的。
可构成抗EGFR ADC的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(D)和连接子(L)的特定实施例更详细地描述于下文。
在实施例中，ADC具有式(I)的结构，或其盐，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体；L为连接子；Ab为包含SEQ ID NO：1的抗体；XY表示将连接子L与抗体Ab连接的共价键；且n为任何整数。在实施例中，n为2或4。在实施例中，n为2。
在实施例中，其中ADC的DAR是指至少两个ADC分子的群体中每个抗体的药物分子的平均摩尔比，DAR为约2。在此上下文中，术语“约”意指在实际值的±7.5％内的量。也就是说，“约2”意指1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99、2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09、2.10、2.11、2.12、2.13、2.14、2.15，和任何中间范围。
下文描述了关于可用于本公开的ADC以及替代ADC结构的药物(式I的D)和连接子(式I的L)的额外细节。在实施例中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂为吡咯并苯并二氮呯(PBD)，例如PBD二聚体。
PBD的结构可见于例如美国专利申请公开案第2013/0028917号和第2013/0028919号以及WO 2011/130598 A1中，其各自以全文引用的方式并入本文中。PBD的通式结构在下文提供为式(II)。
PBD的不同之处为取代基的数目、类型和位置、其芳族A环和吡咯并C环和C环的饱和度。在B环中，通常在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，所述位置为负责将DNA烷基化的亲电中心。所有已知的天然产物在手性C11a位置处具有(S)-构型，其在从C环朝向A环观察时提供右旋扭曲。本文提供的PBD实例可与本公开的抗EGFR抗体结合。可与本公开的抗EGFR抗体结合的PBD的另外的实例可见于例如美国专利申请公开案第2013/0028917 A1号和第2013/0028919 A1号、美国专利第7,741,319 B2号以及WO 2011/130598 A1和WO 2006/111759 A1中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在本文所述的抗EGFR ADC中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂通过连接子与抗体连接。连接子可为短的、长的、疏水性的、亲水性的、柔性的或刚性的，且可由独立地具有上文所提及的特性中的一种或多种的链段构成，使得连接子可包括具有不同特性的链段。连接子可为多价的，以使其将超过一种药剂共价连接至抗体上的单一位点，或为单价的，以使其将单一药剂共价连接至抗体上的单一位点。
在某些实施例中，所选的连接子在体内是可裂解的。可裂解连接子可包括化学或酶不稳定或可降解的键。可裂解连接子一般依赖于细胞内的过程来释放药物，如细胞质的减少、在溶酶体中暴露于酸性条件或被细胞内的特定蛋白酶或其它酶裂解。可裂解连接子一般并有一个或多个化学键，其为化学或酶可裂解的，而连接子的其余部分为不可裂解的。在某些实施例中，连接子包含化学不稳定基团，如腙和/或二硫化物基团。包含化学不稳定基团的连接子利用血浆与一些细胞质区室之间的差异特性。促进含有腙的连接子释放药物的细胞内条件为内体和溶酶体的酸性环境，而含有二硫化物的连接子在细胞溶质中被还原，细胞溶质含有高硫醇浓度，例如谷胱甘肽。在某些实施例中，可通过使用靠近化学不稳定基团的取代基引入位阻来增加包含化学不稳定基团的连接子的血浆稳定性。
酸不稳定基团，如腙在血液的中性pH环境(pH 7.3-7.5)中的体循环期间保持完整，且在ADC被内化至细胞的弱酸性内体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)区室中后经历水解并释放药物。此pH依赖性释放机制与药物的非特异性释放相关。为恶劣增加连接子的腙基团的稳定性，连接子可通过化学修饰(例如取代)改变，从而允许调节以在溶酶体中实现更高效释放，同时使循环中的损失最小化。
含腙连接子可含有额外裂解位点，如额外酸不稳定裂解位点和/或酶不稳定裂解位点。包括例示性含腙连接子的ADC包括以下式(III)、(IV)和(V)的结构：
或其盐，其中D和Ab分别表示细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(药物)和抗体，且n表示与抗体连接的药物-连接子的数目。在某些连接子，如(式(III))的连接子中，连接子包含两个可裂解基团-二硫化物和腙部分。对于此类连接子，未修饰的游离药物的有效释放需要酸性pH或二硫化物还原和酸性pH。已显示连接子，如式(IV)和(V)的连接子对于单一腙裂解位点是有效的。
可包括于连接子中的其它酸不稳定基团包括含顺式-乌头酰基的连接子。顺式-乌头酰基化学使用与酰胺键并置的羧酸来加速酸性条件下的酰胺水解。
可裂解连接子还可包括二硫化物基团。二硫化物在生理pH下为热力学稳定的且经设计以在细胞内部内化后释放药物，其中细胞溶质提供与细胞外环境相比显著更还原的环境。切断二硫键通常需要存在细胞质硫醇辅因子，如(还原的)谷胱甘肽(GSH)，以使含二硫化物的连接子在循环中相当稳定，从而选择性地将药物释放至细胞溶质中。细胞内酶蛋白二硫键异构酶或能够裂解二硫键的类似酶还可促进细胞内二硫键的优先裂解。据报道，相比于以大致5μM循环的显著较低浓度的GSH或半胱氨酸(最丰富的低分子量硫醇)，GSH以0.5-10mM的浓度范围存在于细胞中。
不规则血流导致低氧状态的肿瘤细胞使得还原酶的活性增强，并且因此谷胱甘肽浓度甚至更高。在某些实施例中，含二硫化物的连接子的体内稳定性可通过化学修饰连接子，例如使用邻近于二硫键的空间位阻来增强。
包括例示性含二硫化物的连接子的ADC包括式(VI)、(VII)和(VIII)的以下结构：
或其盐，其中D和Ab分别表示药物和抗体，n表示与抗体连接的药物-连接子的数目，且R在每次出现时独立地选自例如氢或烷基。在某些实施例中，增加邻近于二硫键的空间位阻会增加连接子的稳定性。当一个或多个R基团选自低碳烷基，如甲基时，如(VI)和(VIII)的结构展示增加的体内稳定性。
可使用的另一类型的可裂解连接子是被酶特异性裂解的连接子。此类连接子通常为基于肽的或包括充当酶底物的肽区域。与化学不稳定的连接子相比，基于肽的连接子在血浆和细胞外环境中往往更稳定。肽键通常具有良好的血清稳定性，因为与溶酶体相比，溶酶体蛋白水解酶由于内源抑制剂和血液的不利的高pH值而在血液中具有极低活性。药物从抗体释放特别是由于溶酶体蛋白酶，例如组织蛋白酶和纤维蛋白溶酶的作用而发生。这些蛋白酶可在某些肿瘤细胞中以升高的水平存在。
在例示性实施例中，可裂解肽选白四肽，如Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu，或二肽，如Val-Cit、Val-Ala、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、Phe-Lys、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys。在实施例中，可裂解肽为Val-Ala。在实施例中，连接子为顺丁烯二酰亚胺基己酰基-缬氨酸-丙氨酸(mc-Val-Ala)连接子。在某些实施例中，由于较长肽的疏水性，二肽优于较长多肽。
已描述适用于将药物(如多柔比星(doxorubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、喜树碱(campotothecin)、他利霉素(tallysomycin)和奥瑞他汀/奥瑞他汀家族成员)连接至抗体的多种基于二肽的可裂解连接子(参见Dubowchik等人，1998，《有机化学杂志(J.Org.Chem)》.67：1866-1872；Dubowchik等人，1998，《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》8(21)：3341-3346；Walker等人，2002，《生物有机化学与医药化学通讯》12：217-219；Walker等人，2004，《生物有机化学与医药化学通讯》14：4323-4327；和Francisco等人，2003，《血液(Blood)》102：1458-1465，Dornina等人，2008，《生物结合物化学(Bioconjugate Chemistry)》19：1960-1963，其各自以引用的方式并入本文中)。所有这些二肽连接子，或这些二肽连接子的修饰形式均可用于本文所述的ADC。可使用的其它二肽连接子包括ADC中发现的那些，如Seattle Genetics的本妥昔单抗(Brentuximab)VendotinSGN-35(AdcetrisTM)、Seattle Genetics SGN-75(抗CD-70，Val-Cit-MMAF)、CelldexTherapeutics格雷巴土木单抗(glembatumumab，CDX-011)(抗NMB，Val-Cit-MMAE)和Cytogen PSMA-ADC(PSMA-ADC-1301)(抗PSMA，Val-Cit-MMAE)。
酶可裂解的连接子可包括自我牺牲型间隔子，以使药物与酶裂解位点在空间上分离。药物与肽连接子直接连接可导致药物的氨基酸加合物的蛋白水解释放，从而削弱其活性。使用自我牺牲型间隔子允许在酰胺键水解后消除完全活性的、未经化学修饰的药物。
一种自我牺牲型间隔子为双官能对氨基苯甲醇基，其通过氨基与肽连接，形成酰胺键，而含胺的药物可通过氨基甲酸酯官能团与连接子的苯甲基羟基(PABC)连接。所得前药在蛋白酶介导的裂解后活化，从而产生1，6-消除反应，释放未修饰的药物、二氧化碳和残余的连接基团。以下方案描绘了对酰胺基苯甲基醚的片段化和药物的释放：
其中X-D表示未修饰的药物。
还描述了此自我牺牲型基团的杂环变异体。参见例如，以引用的方式并入本文中的US 7,989,434。
在一些实施例中，酶可裂解的连接子为基于β-葡糖醛酸的连接子。可通过用溶酶体酶β-葡糖醛酸酶裂解β-葡萄糖苷酸糖苷键来实现药物的轻松释放。此酶大量存在于溶酶体内且在一些肿瘤类型中过表达，而酶活性在细胞外部较低。基于β-葡糖醛酸的连接子可用于避免由于β-葡萄糖苷酸的亲水性质而使ADC经历聚集的趋势。在一些实施例中，基于β-葡糖醛酸的连接子优选作为与疏水性药物连接的ADC的连接子。以下方案描绘了从和含有基于β-葡糖醛酸的连接子的ADC释放药物：
已描述了多种基于β-葡糖醛酸的可裂解连接子，其适用于将例如奥瑞他汀、喜树碱和多柔比星类似物、CBI小沟结合剂和赛博素(psymberin)的药物连接至抗体(参见Nolting，第5章“抗体-药物结合物中的连接子技术(Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates)，”《抗体-药物结合物：分子生物学方法(Antibody-Drug Conjugates：Methods in Molecular Biology)》，第1045卷，第71-100页，Laurent Ducry(编)，SpringerScience&Business Medica，LLC，2013；Jeffrey等人，2006，《生物结合物化学(Bioconjug.Chem.17：831-840；Jeffrey等人，2007，《生物有机化学与医药化学通讯》17：2278-2280；和Jiang等人，2005，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.127：11254-11255)，其各自以引用的方式并入本文中)。所有这些基于B-葡糖醛酸的连接子均可用于本文所述的抗EGFR ADC。
在一个实施例中，用于本公开的ADC的连接子如下显示为式(IX)，其中Y为Val，Z为Ala，D为药物(例如PBD二聚体)，且q为1、2、3、4、5、6、7或8：
或其盐。在实施例中，q为5。
在一个方面，本公开描述一种ADC，其包含通过连接子连接至抗体的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，其中抗体药物结合物为根据结构式(I)的化合物或其盐，其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体；L为连接子；Ab为包含SEQ ID NO：1的抗体；XY表示将连接子L连接至抗体Ab的共价键；且n为任何整数。在一个实施例中，XY表示将连接子L连接至抗体Ab的共价键，其中XY是与抗体Ab上的巯基形成的键。在另一实施例中，XY为顺丁烯二酰亚胺-巯基键。
在某些实施例中，本公开的ADC包含式(X)的结构：
或其盐，其中Ab为一种抗体，其含有包含如SEQ ID NO：3、4和5中所阐述的CDR组(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的重链可变区，和包含如SEQ ID NO：8、9和10中所阐述的CDR组(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的轻链可变区，且n为2或4。在实施例中，抗EGFR抗体为具有恒定区的IgG1同型，所述恒定区具有被工程改造以提供PBD的结合位点的半胱氨酸突变。在一个实施例中，半胱氨酸突变在重链的239位处。在实施例中，突变为S239C，其中编号是根据Kabat。在一个实施例中，n为约2或约4。在实施例中，n为约2。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
在实施例中，本公开的ADC包含式(X)的结构，
或其盐，其中Ab为一种抗体，其含有包含SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：7中所阐述的氨基酸序列的轻链可变区。在实施例中，抗EGFR抗体为具有恒定区的IgG1同型，所述恒定区具有被工程改造以提供PBD的结合位点的半胱氨酸突变。在实施例中，半胱氨酸突变在重链的239位处。在实施例中，半胱氨酸突变为S239C，其中编号是根据Kabat。在一个实施例中，n为约2或约4。在另一实施例中，n为约2。在实施例中，抗EGFR抗体的重链恒定区缺乏C端赖氨酸，或在重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
在实施例中，本公开的ADC包含式(X)的结构：
或其盐，其中Ab为一种抗体，其含有包含SEQ ID NO：1中所阐述的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列的轻链。在实施例中，n为约2至约4。在实施例中，n为约2或约4。在实施例中，n为约2。
本公开的ADC可使用本领域中已知的化学方法合成。选择的化学方法将尤其取决于细胞毒性剂和/或细胞抑制剂、连接子和用于将连接子连接至抗体的基团的身份标识。一般来说，根据式(I)的ADC可根据以下方案制备：
其中D、L、Ab、XY和n如先前在上文所定义，且Rx和Ry表示能够彼此形成共价键的互补基团，如上文所论述。
基团Rx和Ry的身份标识将取决于用于将合成子D-L-Rx连接至抗体的化学方法。一般来说，所用化学方法不应改变抗体的完整性，例如其结合标靶的能力。优选地，结合抗体的结合特性将与非结合抗体的结合特性非常相似。用于将分子结合至例如抗体的生物分子的多种化学方法和技术是本领域中已知的，并且尤其对于抗体是众所周知的。参见例如Amon等人，“用于癌症疗法中药物免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy)"，《单克隆抗体和癌症疗法(MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy)》，Reisfeld等人编，Alan R.Liss，Inc.，1985；Hellstrom等人，“用于药物递送的抗体(Antibodies For Drug Delivery)”，《受控药物递送(Controlled Drug Delivery)》，Robinson等人编，Marcel Dekker，Inc.，第2版1987；Thorpe，“癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载剂：综述(Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review)”，《单克隆抗体′84：生物学和临床应用(Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications)》，Pinchera等人编，1985；“放射性标记抗体在癌症疗法中的治疗用途的分析、结果和未来展望(Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy)"，《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy)》，Baldwin等人编，Academic Press，1985；Thorpe等人，1982，《免疫学综述(Immunol.Rev.)》62：119-58；PCT公开案WO 89/12624。这些化学方法中的任一种可用于将合成子连接至抗体。
适用于将合成子连接至可接近的赖氨酸残基的多种官能团Rx和化学物质是已知的，且包括例如但不限于NHS-酯和异硫氰酸酯。
适用于将合成子连接至半胱氨酸残基的可接近的游离巯基的多种官能团Rx和化学物质是已知的，且包括例如但不限于卤乙酰基和顺丁烯二酰亚胺。
但是，结合化学物质不限于可用的侧链基团。通过将适当小分子连接至胺，例如胺的侧链可转化为其它适用的基团，如羟基。此策略可用于通过将多官能性小分子结合至抗体的可接近的氨基酸残基的侧链而增加抗体上可用的连接位点的数目。接着将适合于将合成子共价连接至这些“转化的”官能团的官能团Rx包括于合成子中。
抗体也可被工程改造以包括用于结合的氨基酸残基。工程改造抗体以包括在ADC的情况下适用于结合药物的非基因编码的氨基酸残基的方法描述于Axup等人，2012，《美国国家科学院院刊》109(40)：16101-16106中，以及适用于将合成子连接至未编码氨基酸的化学物质和官能团。
通常，合成子连接至抗体的氨基酸残基的侧链，包括例如可接近的赖氨酸残基的伯氨基或可接近的半胱氨酸残基的巯基。游离巯基可通过还原链间二硫键获得。
对于其中Ry为巯基的键(例如当Rx为顺丁烯二酰亚胺时)，一般首先将抗体完全或部分还原以破坏半胱氨酸残基之间的链间二硫桥键。如果存在于抗体重链中，则特定半胱氨酸残基和链间二硫桥键可以被还原以连接药物-连接子合成子(包括适合于与巯基结合的基团)，且包括例如但不限于：人类IgG1重链上的残基C233、C239和C242(Kabat编号系统；对应于Eu编号的残基C220、C226和C229)，和人类Ig κ轻链上的残基C214(Kabat编号系统)。但是，在抗体重链在连接位点处不含半胱氨酸残基的情况下，抗体可被工程改造以在给定位置(例如239位)含有半胱氨酸。
不参与二硫桥键的用于合成子连接的半胱氨酸残基可通过一个或多个密码子的突变而被工程改造为抗体。还原这些不成对的半胱氨酸产生适合于结合的巯基。用于并入工程改造的半胱氨酸的优选位置包括例如但不限于人类IgG1重链上的位置S112C、S113C、A114C、S115C、A176C、S180C、S239C、S252C、V286C、V292C、S357C、A359C、S398C、S428C(Kabat编号)和人类Ig κ轻链上的位置V110C、S114C、S121C、S127C、S168C、V205C(Kabat编号)(参见例如美国专利第7,521,541号、美国专利第7,855,275号和美国专利第8,455,622号)。在一个实施例中，残基S239(Kabat编号系统)突变为半胱氨酸以允许PBD与抗体Ab1结合。此突变在本文中称为“S239C”。
在某些实施例中，本公开的ADC通过工程改造的半胱氨酸具有2的载药量。
在某些实施例中，本公开的特征在于一种制备ADC的方法，其包含使分别在SEQ IDNO：1和6中阐述的抗体重链和轻链与根据结构式(Ia)的合成子接触，其中D为能够穿过细胞膜的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂，L为能够被溶酶体酶裂解的连接子，且Rx包含能够在合成子将合成子共价连接至抗体的条件下将合成子共价连接至抗体的官能团，其中D为例如PBD二聚体。
如本领域技术人员将了解，与抗体分子连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的数目可变化，以使得ADC制剂在本质上可以是异质的，其中制剂中的一些抗体含有一个连接剂，一些含有两个、一些含有三个等(且一些不含连接剂)。异质性的程度将尤其取决于用于连接细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的化学方法。例如，在抗体被还原以产生用于连接的巯基的情况下，通常产生每分子具有0、2、4、6或8个连接剂的抗体的异质混合物。
此外，通过限制连接化合物的摩尔比，通常产生每分子具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个连接剂的抗体。因此，应理解，取决于上下文，所述药物抗体比(DAR)可为抗体集合的平均值。例如，“DAR4"是指一种ADC制剂，其尚未经受纯化以分离特定DAR峰且包含每个抗体具有不同数目的连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的ADC分子的异质混合物(例如每个抗体的单种载药量为0、2、4、6、8个药剂)，但平均药物：抗体比为4。
异质ADC制剂可例如通过疏水相互作用色谱(“HIC”)进行处理，以产生富含具有指定所关注的DAR(或两种或更多种指定DAR的混合物)的ADC的制剂。此类富集制剂在本文中被设计为“EX"，其中“E"指示已经处理且富含具有特定载药量的ADC的ADC制剂，且“X”表示每个ADC分子连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的数目。富含具有两种特定DAR的ADC的混合物的制剂称为“EX/EY”，三种特定DAR称为“EX/EY/EZ”等，其中“E”指示已经处理以富集指定载药量的ADC制剂且“X”、“Y”和“Z”表示富集的载药量物种。作为特定实例，“E2"是指一种ADC制剂，其已经富集以主要含有每个ADC分子具有两个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的ADC。“E4”是指一种ADC制剂，其已经富集以主要含有每个ADC分子具有四个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的ADC。“E2/E4”是指一种ADC制剂，其已经富集以主要含有两个ADC群体，一个群体的每个ADC分子具有两个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂，且另一个群体的每个ADC分子具有四个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂。
如本文所用，富集的“E”制剂在所述ADC物种中一般将为至少约80％纯，尽管可能获得或需要更高的纯度水平，如至少约85％、90％、95％、98％或甚至更高的纯度。例如，“EX”制剂在每个ADC分子具有X个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的ADC中一般将为至少约80％纯。对于“高阶”富集制剂，例如“EX/EY”制剂，每个ADC分子具有X和Y个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的ADC的总和一般将占制剂中的总ADC的至少约80％。类似地，在富集的“EX/EY/EZ”制剂中，每个ADC分子具有X、Y和Z个连接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂的ADC的总和将占制剂中的总ADC的至少约80％。
可通过本领域中已知的多种方法来评估纯度。作为一个特定实例，可通过HPLC或其它色谱法来分析ADC制剂，且通过分析所得峰的曲线下面积来评估纯度。
在实施例中，本公开包含异质组合物，其包含载药量为2的Ab1(S239C)-PBD ADC，其中DAR E2物种存在于组合物中＞80％(＞80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％)的所有ADC中。例如，在实施例中，本申请包含异质组合物，其包含DAR为2(DAR E2)的Ab1(S239C)-PBD ADC，其中DAR E2物种存在于组合物中＞85％(85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％)的所有ADC的群体中。在实施例中，本申请包含异质组合物，其包含DAR为2(DAR E2)的Ab1(S239C)-PBD ADC，其中DAR E2物种存在于组合物中＞90％(90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％)的所有ADC的群体中。
在某些实施例中，本公开的ADC的DAR为约2或约4。在其它实施例中，本公开的ADC的DAR为约2。
本文所述的ADC可呈药物组合物的形式，所述药物组合物包含ADC和一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂。组合物可被调配成用于特定用途，如用于兽医用途或人体内的药物用途。
序列表简要说明
以全文引用的方式并入本文中的是名称为Sequence_Listing_12390的序列表，包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：20，其包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列。序列表已特此以ASCII文本格式提交。所述序列表首次创建于2018年9月4日，且大小为45.1KB。
实例
出于说明的目的提供了以下实例，且不加限制，所述实例强调抗EGFR ADC的例示性实施例的某些特征和特性。
应注意，除非另有描述，否则实例中描述的PBD ADC的近似DAR为约2。
实例1：产生抗EGFR Ab1(S239C)
抗体1(Ab1，也称为ABT-806或达妥昔单抗)是如WO2010/096434中所述开发的人类化抗EGFR抗体，所述申请的全部公开内容以全文引用的方式并入本文中。Ab1的轻链氨基酸序列在下文提供于SEQ ID NO：6中。轻链可变区为斜体的(SEQ ID NO：7)，且Ab1的VL CDR氨基酸序列为加下划线的且为如下：
HSSQDINSNIG(VL CDR1；SEQ ID NO：8)；HGTNLDD(VLCDR2；SEQ ID NO：9)；和VQYAQFPWT(VL CDR3；SEQ ID NO：10)。
SEQ ID NO：6
Ab1的轻链可变区在下文提供为SEQ ID NO：7。
SEQ ID NO：7
Ab1的重链氨基酸序列描述于SEQ ID NO：11中。重链可变区为斜体的(SEQ ID NO：2)，且VH CDR氨基酸序列为加下划线的且为如下：GYSISSDFAWN(VH CDR1；SEQ ID NO：3；YISYSGNTRYQPSLKS(VH CDR2；SEQ ID NO：4)；和AGRGFPY(VH CDR3；SEQ ID NO：5)。
SEQ ID NO：11
Ab1的重链可变区在下文提供为SEQ ID NO：2。
SEQ ID NO：2
Ab1被修饰以工程改造弹头PBD的位点特异性结合位点。具体地，使用本领域中已知的常用技术产生工程改造的半胱氨酸抗体(C239)以准许PBD二聚体以2的载药量位点特异性结合。此突变抗体在本文中称为Ab1(S239C)且包括Ab1轻链和修饰的Ab1(C239)重链序列。Ab1(S239C)的重链氨基酸序列描述于下文的SEQ ID NO：1中。可变区(SEQ ID NO：2)为斜体的，且CDR(CDR1、CDR2和CDR3)(SEQ ID NO：3至5)为加下划线的且为如下：GYSISSDFAWN(VH CDR1；SEQ ID NO：3；YISYSGNTRYQPSLKS(VH CDR2；SEQ ID NO：4)；和AGRGFPY(VH CDR3；SEQ ID NO：5)。
SEQ ID NO：1
Ab1(S239C)的重链恒定区相对于其亲本抗体Ab1含有修饰的残基。具体地，相对于Ab1的重链，残基239(Kabat编号)从S突变为C。
此残基在上文的SEQ ID NO：1中加下划线/加粗。应注意，S239C(Kabat编号)对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基238(S238C)。
Ab1(S239C)的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：6)提供于下文，其中CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NO.8、9和10)为加下划线的，且可变区(SEQ ID NO：7)为斜体的。
SEQ ID NO：6
Ab1(S239C)进一步结合至PBD二聚体且作为ADC进行测试，如以下实例2中所述。
在针对Ab1变异体的筛选中鉴别另一抗体AbA，如例如美国专利第9,493,568号中所述，所述专利以全文引用的方式并入本文中。下文提供了Ab1变异体抗体AbA的VH区的氨基酸序列。CDR为加下划线的，且相对于Ab1的氨基酸变化以粗体突出显示。
AbA VH
(SEQ ID NO：15)
AbA具有与Ab1相同的轻链和可变轻链序列(分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)，包括相同CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：8至10)。
AbA的VH氨基酸序列提供于上文的SEQ ID NO：15中。AbA的VH CDR氨基酸序列为如下：GYSISRDFAWN(CDR1；SEQ ID NO：16)；YISYNGNTRYQPSLKS(CDR2；SEQ ID NO：17)；和ASRGFPY(CDR3；SEQ ID NO：18)。图3和图4提供Ab1和AbA的VH和VL区(图3)以及完整重链和轻链(图4)的的氨基酸序列的比对。AbA的重链氨基酸序列描述于SEQ ID NO：20中。CDR(CDR1、CDR2和CDR3)为加下划线的，且可变区为斜体的。
SEQ ID NO：20
在鉴别抗EGFR抗体AbA后，抗体经修饰以工程改造弹头PBD的位点特异性结合位点。具体地，使用本领域技术人员常用的技术产生工程改造的半胱氨酸抗体(C239)以准许PBD二聚体以2的载药量位点特异性结合。此突变抗体在本文中称为AbA(S239C)且包括AbA轻链和修饰的AbA(C239)重链序列。AbA(S239C)的重链氨基酸序列描述于下文的SEQ IDNO：19中。CDR(CDR1、CDR2和CDR3)为加下划线的，且可变区为斜体的。
SEQ ID NO：19
实例2：PBD结合物的产生和理化表征
Ab1(S239C)-PBD包含与Cys工程改造的抗EGFR抗体Ab1结合的两个PBD药物-连接子分子。PBD和连接子的结构描述于图2中。图2还描述制备Ab1(S239C)-PBD的方法。结合过程包括还原链间二硫化物、定量氧化和与过量PBD药物连接子结合。结合过程由工程改造的和链间二硫化物的定量还原组成。接着将还原混合物纯化，以去除过量的试剂和其副产物，接着定量氧化链间二硫化物且接着与过量的PBD药物-连接子结合。在淬灭后，将反应混合物纯化且进行缓冲液交换，以得到具有＞87％DAR2载药量的Ab1(S239C)-PBD。纯化后的Ab1(S239C)-PBD ADC的总产率为大致90％。结合过程需要使用大致2.5Wt％负载量(约2g)的PBD药物连接子。
还根据如上文所述且如图2中所示的方法制备AbA(S239C)-PBD，其包含与cys工程改造的抗EGFR抗体Ab1(S239C)结合的两个PBD药物-连接子分子。
实例3：流式细胞测量术分析
为了确认与亲本抗体Ab1相比，Cys工程改造的Ab1(S239C)与PBD的结合将不会改变结合特性，使用经工程改造以表达野生型EGFR或EGFR的CA突变型式(EGFRC271A，C283A)的NR6人类成纤维细胞进行基于流式细胞测量术的分析，所述突变型式是一种已知暴露由Ab1和AbA识别的隐秘表位的点突变体。
图5展示抗体Ab1和AbA、其对应S239C突变形式Ab1(S239C)和AbA(S239C)以及其PBD结合物Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD的流式细胞测量术分析。向过表达野生型EGFR(图5A)和过表达EGFR CA突变体(图5B)的NR6细胞中添加增加浓度的抗体。图5中所示的结果表明，相比于亲本抗体，Cys工程改造的Ab1与PBD的结合(或Cys工程改造的AbA与PBD的结合)不改变结合特性。
实例4：Ab1(S239C)-PBD ADC与Ab1-MMAF ADC的体外比较
在细胞杀死分析中，针对表达不同水平的表面EGFR的一组肿瘤细胞系评估Ab1(S239C)-PBD连同AbA(S239C)-PBD的细胞毒性活性。在图6中与多种其它过表达EGFR的细胞系比较，示出了此分析中所用的细胞的EGFR数目。A431是一种表皮样癌细胞系，具有扩增的EGFR(＞2×106个受体/细胞)。SW-48是表达EGFR的结肠直肠腺癌细胞系(每个细胞＞200,000个受体；IHC H评分228)；NCI-H441是具有中等至低EGFR表达的肺腺瘤异种移植物模型(每个细胞约100,000个受体；IHC H评分150)且LoVo是具有较低EGFR表达的KRAS突变型结肠直肠腺癌(每个细胞＜100,000个受体；IHC H评分140)(图6)。图7中的结果展示相比于对应奥瑞他汀结合物(Ab1-MMAF ADC，即，与微管破坏剂单甲基奥瑞他汀F偶联的Ab1)，在用PBD结合物Ab1(S239C)-PBD处理后，所有三个细胞系中的细胞毒性活性均得到改进。图7进一步展示AbA(S239C)-PBD和对应奥瑞他汀结合物AbA-MMAE的细胞毒性活性。
出于本公开的目的，“Ab1-MMAF”是指抗体-药物结合物(ADC)，其具有通过不可裂解的顺丁烯二酰亚胺基己酰基连接子与奥瑞他汀弹头单甲基奥瑞他汀F结合的人类化IgG1抗体Ab1。应注意，除非另有描述，否则本公开的实例中所用的Ab1-MMAF ADC的DAR为约3.8。出于本公开的目的，“AbA-MMAE”或(“AbA-vcMMAE”)是指基于奥瑞他汀的ADC，包含通过可裂解缬氨酸-瓜氨酸(VC)连接子与奥瑞他汀弹头单甲基奥瑞他汀E结合的AbA。应注意，除非另有描述，否则本公开的实例中所用的AbA-MMAE ADC的DAR为约3。
还评估了Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD抑制一组表达不同水平的EGFR的22种结肠直肠癌细胞系的生长的能力(表1)。细胞增殖分析中对ADC以及奥瑞他汀ADC Ab1-MMAF和AbA-MMAE的敏感性由IC50值指示。本研究中使用的AbA(S239C)-PBD和Ab1(S239C)-PBD结合物含有＞85％DAR 2载药量。
表1：使用Ab1-MMAF ADC、AbA-MMAE ADC、AbA(S239C)-PBD和Ab1(S239C)-PBD的结肠直肠癌细胞系EGFR表达和增殖分析概述
*通过微阵列分析确定RNA且呈现为线性值(来自Oncomine)。
**未测试。
微管蛋白抑制剂在包括EGFR阳性结肠直肠肿瘤的一些疾病环境中未展示显著功效。参见Perez EA。微管抑制剂：基于作用机理、临床活性和耐受性区分微管蛋白抑制剂。《分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther)》2009；8(8)：2086-95。IHC分析表明，＞25％的CRC表达EGFR，且CRC是若干基于EGFR的疗法的批准适应症。参见Mendelsohn J，Baselga J.癌症的表皮生长因子受体靶向(Epidermal growth factor receptor targeting in cancer.)《肿瘤学研讨(Semin Oncol)》2006；33(4)：369-85；Herbst RS，Kim ES，Harari PM.IMC-C225，一种用于治疗头颈癌的抗表皮生长因子受体单克隆抗体(IMC-C225，an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody，for treatment of headand neck cancer.)《生物疗法专家评论(Expert Opin Biol Ther)》2001；1(4)：719-32；Lynch DH，Yang XD.ABX-EGF：一种用于癌症治疗的全人类抗表皮生长因子受体单克隆抗体的治疗潜力(Therapeutic potential of ABX-EGF：a fully human anti-epidermalgrowth factor receptor monoclonal antibody for cancer treatment.)《肿瘤学研讨》2002；29(1增刊4)：47-50。
如表1中所示，尽管大部分细胞系在很大程度上对于对应奥瑞他汀结合物(Ab1-MMAF ADC和AbA-MMAE ADC)不敏感，IC50值一般为＞100nm(SW48和SK-CO-1除外)，但AbA(S239C)-PBD和Ab1(S239c)-PBD在抑制细胞生长中有效得多。细胞生长的抑制与EGFR表达水平不相关，表明本公开的PBD ADC可针对表达低EGFR的结肠直肠肿瘤细胞系有效。还可能的是EGF配体诱导的自分泌活化和相应增加的AbA表位暴露可促进这些肿瘤细胞系中的一些的敏感性。非靶向PBD ADC对照也对选择的肿瘤细胞系具有一些抑制活性，但总体来说，与在靶向EGFR的PBD的情况下的观察结果相比，活性显著降低。总之，这些结果表明EGFR-PBD ADC的活性可扩展至表达低水平和中等水平的EGFR的结肠直肠肿瘤，其在很大程度上对基于奥瑞他汀的ADC不敏感。
还针对一组人类神经胶母细胞瘤(GBM)肿瘤细胞系评估了EGFR-PBD ADC AbA(S239C)-PBD和Ab1(S239C)-PBD的活性。
表2.使用ABT-414、ABBV-221、ABT-806PBD和AM-1PBD ADC的脑癌细胞系EGFR表达和增殖分析概述
*蛋白质表达是迪过蛋白质印迹分析用抗EGFR抗体确定且标准化为U87MG
**未测试
如表2中所指示，AbA-MMAE和Ab-1MMAF在很大程度上在抑制这些肿瘤细胞系的增殖中无效，因为这组中包括的细胞系不具有扩增的EGFR(U87MGde2-7除外)。尽管在这些肿瘤细胞系上表达的EGFR的水平较低，但PBD结合物Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD具有改进的效力，这与EGFR-PBD结合物可在超出EGFR扩增或过表达的肿瘤的GBM中有活性的发现一致。
实例5：EGFR ADC的体内表征
在具有改变的EGFR表达水平的肿瘤模型中测定EGFR-PBD ADC Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD的体内功效。
NCI-H441是具有中等至低EGFR表达的肺腺瘤异种移植物模型，如图6中所示。图8A展示Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD在肺腺癌NCI-H441中的功效。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量，而箭头表示给药天数。如图8中所示，每七天一次以0.3mg/kg施用，持续总共六个剂量(Q7Dx6)的AbA(S239C)-PBD和Ab1(S239C)-PBD在100％的动物中诱发完全且持久的消退，而以高10倍的剂量(3mg/kg)Q7Dx6施用的Ab1-MMAF在40％的动物中诱发完全反应，如图8A中所示。完全反应(CR)被定义为至少三次连续测量的肿瘤体积小于25mm3。所有肿瘤在Ab1-MMAF治疗后最终复发。阴性对照ADC，Ab095-PBD也在100％的动物中诱发持久且完全的反应。在其它ADC中观察到的这种敏感性可能是由于来自PBD敏感性和NCI-H441肿瘤中的抗体积聚的组合(而不是肿瘤相关抗原识别)的增强的通透性和滞留效应。根据IHC，EGFR在NCI-H441肿瘤细胞的细胞膜上的表达为3+。
图8B展示Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD在结肠直肠腺癌LoVo异种移植物中的功效。LoVo是一种KRAS突变型结肠直肠腺癌，其EGFR表达低于NCI-H441(每个细胞＜100,000个受体，IHC H评分140)。在结肠直肠腺癌模型中，LoVo的目标表达低于NCI-H441，AbA(S239C)-PBD诱发完全且持久的反应，而在停止Ab1(S239C)-PBD给药后肿瘤复发(图8B)。两种结合物均根据q7dx6方案0.5mg/kg施用(其中小鼠每7天给药一次，持续6周)。在此模型中，抗EGFR结合物的特异性通过相比于阴性对照结合物Ab095 PBD增加的反应持久性来展示。AbA-MMAE也在此模型中有活性，其中活性与对于Ab1(S239C)-PBD所观察的类似。但是，为了获得这些结果，AbA-MMAE必须以高得多施用
在第二结肠直肠腺癌模型SW-48(EGFR H评分：228)中评估Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD的功效。在0.1mg/kg的单次剂量后，AbA(S239C)-PBD诱发比Ab1(S239C)-PBD更持久的反应，如图9A中所示。在以0.2mg/kg给药后，Ab1(S239C)-PBD之后的反应持久性与对于0.1mg/kg的AbA(S239C)-PBD观察到的类似，表明在此模型中，AbA(S239C)-PBD的效力比Ab1(S239C)-PBD高至少两倍，如图9B中所示。在图9A和9B中，括号内的数字表示以mg/kg为单位的剂量。箭头表示给药天数。通过IHC测定的EGFR在SW48异种移植物中的表达为3+。
还相对于CTG-0162非小细胞肺癌模型中的Ab1和AbA-MMAE来评估Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD的功效。如图10A中所示，在CTG-0162NSCLC模型中，以q7x6给药的Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD极有效地抑制肿瘤生长，而AbA-MMAE的效果较差，尽管其剂量比AbA(S239C)-PBD或Ab1(S239C)-PBD高十倍。Ab1在此模型中也无效。
还相对于CTG-9786头颈癌模型中的Ab1和AbA-MMAE来评估AbA(S239C)-PBD和Ab1(S239C)-PBD的功效。如图10B中所示，在CTG-9786头颈癌模型中，以q7x6给药的Ab1(S239C)-PBD和AbA(S239C)-PBD极有效地抑制肿瘤生长。AbA-MMAE也有效，但需要高得多的剂量。
总之，这些体内结果表明在多种不同肿瘤类型(包括表达较低EGFR的结肠直肠肿瘤)中，PBD结合物比基于奥瑞他汀的结合物更强力且产生更持久的抗肿瘤反应。
实例6：多形性胶质母细胞瘤异种移植物中的功效
如表2中所指示，体外结果指示EGFR-PBD ADC有效地抑制GBM细胞系生长。为了进一步评估PBD结合物在GBM中的功效，使用具有扩增的突变型EGFRvIII的U-87MGde2-7异种移植物肿瘤模型(图6；IHC H评分230)。将Ab1(S239C)-PBD(0.05mg/kg，Q7Dx6)与护理标准替莫唑胺(1.5mg/kg，QDx14)和放射(XRT，2Gy，QDx5x2)组合给药，在两个周期之间休息两天。将Ab1(S239C)-PBD添加至替莫唑胺或分次放射或三重组合使得肿瘤生长抑制显著增加，表明此组合方案在GBM中增强功效的潜力，如图11中所示。括号中的数字表示以mg/kg为单位的剂量，且箭头表示给药天数。
实例7：体外血浆稳定性
在来自小鼠、大鼠、猕猴和人类的血浆中以及缓冲液中在37℃下持续6天体外评估荧光标记的Ab1(S239C)抗体和Ab1(S239C)-PBD DAR 2的稳定性。通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量蛋白质聚集和片段化。通过液相色谱-质谱(LC/MS/MS)测定未结合的PBD。
Ab1(S239C)单克隆抗体的体外血浆稳定性在图12A中示出。Ab1(S239C)单克隆抗体在t0时在缓冲液和血浆中显示1.5-2.8％的初始聚集体，且缓冲液和血浆中的每日聚集体增加较低(≤1.5％)。Ab1(S239C)抗体在t0时在缓冲液和血浆中具有0％初始片段，且缓冲液和血浆中的每日片段增加较低(≤2.4％)。
Ab1(S239C)PBD DAR 2ADC的体外血浆稳定性在图12B中示出。Ab1(S239C)-PBD在缓冲液和血浆中显示中等初始聚集体(5-11％)，且血浆的每日聚集体增加％更高(0.5-2.8％)，其中人类＞猕猴＞小鼠。Ab1(S239C-PBD DAR2ADC在缓冲液和血浆中具有0％初始片段，且缓冲液和血浆中的每日增加％极小(≤0.4％)。
测试PBD弹头自身且发现在所有血浆基质中，在37℃下在血浆中稳定6天。从Ab1(S239C)-PBD DAR 2ADC释放的结合的弹头在所有时间点和所有基质中均低于定量水平。这对应于给药的弹头当量的＜0.4％。
还在37℃下在来自小鼠、大鼠、猕猴和人类的血浆中以及缓冲液中持续6天体外评估荧光标记的Ab1-MMAF ADC的稳定性。通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量蛋白质聚集和片段化。Ab1-MMAF ADC在t0时在缓冲液和血浆中显示2.5-4.8％的初始聚集体，且血浆中聚集体的每日增加％在2.0-2.8％范围内。Ab1-MMAF ADC在t0时具有0-0.5％的初始片段，且缓冲液和血浆中的每日增加％为0-0.2％。
总体而言，Ab1(S239C)mAb和Ab1(S239C)PBD DAR2 ADC的体外血浆稳定性与Ab1-MMAF ADC类似。
表3：抗体序列表
本申请中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文献都以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的，其引用的程度就如同个别地指示将各个别出版物、专利、专利申请或其它文献以引用的方式并入以用于所有目的。
虽然已示出并描述了各种特定实施例，但应了解，可在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行各种改变。
Claims (20)
1.一种抗体-药物结合物(ADC)，包含式(X)的结构，或其盐：
其中式(X)包含与细胞毒性弹头结合的抗EGFR抗体(Ab)，
其中所述抗EGFR抗体包含：
含有包含SEQ ID NO:3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO:4的CDRH2序列和包含SEQ ID NO:5的CDRH3序列的重链可变区；
含有包含SEQ ID NO:8的CDRL1序列、包含SEQ ID NO:9的CDRL2序列和包含SEQ ID NO:10的CDRL3序列的轻链可变区；和
在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；
其中所述抗EGFR抗体通过所述包含S239C的突变与所述细胞毒性弹头结合，且
其中n为2。
2.根据权利要求1所述的ADC，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:2且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7。
3.根据权利要求1所述的ADC，其含有包含SEQ ID NO:1的全重链，和包含SEQ ID NO:6的全轻链。
4.根据权利要求1所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体包含IgG1同型。
5.根据权利要求2所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体包含IgG1同型。
6.根据权利要求1所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体的所述重链恒定区缺乏C端赖氨酸或在所述重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
7.根据权利要求2所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体的所述重链恒定区缺乏C端赖氨酸或在所述重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
8.根据权利要求3所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体的所述重链恒定区缺乏C端赖氨酸或在所述重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体为人类化抗体。
10.根据权利要求2所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体为人类化抗体。
11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的ADC与至少一种药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂的组合。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物的药物-抗体比为约2。
13.一种抗体-药物结合物(ADC)，包含式(IX)的结构，或其盐，
其中D包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体；Ab为抗EGFR抗体，Y为Val，Z为Ala，且q为1、2、3、4、5、6、7或8，且其中所述抗EGFR抗体包含
含有包含SEQ ID NO:3的CDRH1序列、包含SEQ ID NO:4的CDRH2序列和包含SEQ ID NO:5的CDRH3序列的重链可变区；
含有包含SEQ ID NO:8的CDRL1序列、包含SEQ ID NO:9的CDRL2序列和包含SEQ ID NO:10的CDRL3序列的轻链可变区；
在重链恒定区中包含S239C的突变，其中编号是根据Kabat；
其中所述抗EGFR抗体Ab通过所述包含S239C的突变与式(IX)的结构结合，且
n为2。
14.根据权利要求13所述的ADC，其中q为5。
15.根据权利要求13所述的ADC，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:2，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7。
16.根据权利要求13所述的ADC，其中重链包含SEQ ID NO:1，且轻链包含SEQ ID NO:6。
17.根据权利要求13所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体包含IgG1同型。
18.根据权利要求14所述的ADC，其中所述抗EGFR抗体的所述重链恒定区缺乏C端赖氨酸或在所述重链恒定区的C端包含除赖氨酸以外的氨基酸。
19.一种药物组合物，其包含根据权利要求13所述的ADC与至少一种药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂的组合。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述药物组合物的药物-抗体比为约2。
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