CN118530322A - 调控大豆株型和提高产量的蛋白质及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控大豆株型和提高产量的蛋白质及其编码基因与应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及调控大豆株型和提高产量的蛋白质及其编码基因与应用。本发明的蛋白质是氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质和/或氨基酸序列是SEQ IDNo.6的蛋白质组成的组合物；或将上述蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有调控植物株型或/和产量相关功能的蛋白质；或在上述蛋白质N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。通过调控上述蛋白质活性或含量，可获得株型改变和产量提高的大豆品种。

Description

调控大豆株型和提高产量的蛋白质及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及调控大豆株型和提高产量的蛋白质及其编码基因与应用。

背景技术

大豆作为重要的粮油饲兼用作物，在保障我国粮食安全和农产品贸易领域扮演着举足轻重的角色。随着人民生活水平的不断提高，对植物油及饲料蛋白的需求急剧增加，与世界大豆主产国美国、巴西、阿根廷等国家相比，我国大豆产量偏低，无法满足日常生产生活需要，进口大豆依赖性强。在大豆种植面积有限的现实条件下，如何通过现代生物育种技术手段快速有效改良大豆品种，提高大豆单产水平，是亟需解决的重要生产问题和亟待突破的育种技术瓶颈。

作株型对于作物单株和群体的形态建成发挥决定性作用，是影响植株产量、作物生产水平和经济效益的重要因子。作物株型包括株高、分枝(分蘖)、叶形和穗型(结荚习性)等。作物株型驯化或改良在实现作物产量重大突破中发挥着至关重要的作用。但目前对于大豆株型调控机理以及大豆株型调控关键基因的研究仍处于探索阶段，相关研究报道较少；对于影响大豆株型调控的分子机理、关键基因和作用网络尚不清晰明确。特别是由于受研究材料的限制，在大田生产条件下，何种株型更有利于提高大豆单产水平，更是缺少相关研究。因此，进一步挖掘更多株型调控基因，不但对于发现优良大豆株型调控基因和培育高产理想株型具有重要的理论价值；而且通过特异材料的创制，可以在生产条件下对大豆理想株型进行系统评价和优选，对于最终实现育种应用、提升大豆产量具有重要实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的株型和提高产量。

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质可为如下任一种的蛋白质：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质和氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质组成的组合物；

G2)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质或/和氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；

G3)将G1)和G2)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物株型或/和产量相关功能的蛋白质；例如本领域技术人员可根据如SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白突变体；

G4)在G1)或G2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

上述氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质为GmMBR1蛋白。

上述氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质为GmMBRL1蛋白。

为了使G1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.3或SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GmMBR1或GmMBRL1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GmMBR1或GmMBRL1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GmMBR1或GmMBRL1且具有蛋白质GmMBR1或GmMBRL1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列或或核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上文中，所述蛋白质来源于大豆(Glycine max(L.)Merr.)。

本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：B1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

C1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；

C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；

C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；

C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下E1)或E2)所示的基因：

E1)编码序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.5的cDNA分子或DNA分子；

E2)核苷酸是SEQ ID No.1或SEQ ID No.4的cDNA分子或DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物株型和产量性状的GmMBR1基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质GmMBR1。

SEQ ID No.5所示的DNA分子(调控植物株型和产量性状的GmMBRL1基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质GmMBRL1。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体cas9/gRNA。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在一个具体的实施例中，所述重组载体为GmMBROLO-sgRNA。

所述重组载体GmMBROLO-sgRNA的结构描述如下：将线性载体cas9/gRNA(VK005-15,唯尚立德)通过同源重组分别插入sgRNA1和sgRNA2，并保持cas9/gRNA载体其他序列不变，分别形成重组载体cas9-sgRNA1和cas9-sgRNA2。cas9-sgRNA1用AscI和SpeI酶切，回收590bp的片段，cas9-sgRNA2用AscI和AvrII酶切，回收14000bp的片段，用T4连接酶链接590bp和14000bp片段，形成双基因靶点重组载体cas9-sgRNA1sgRNA1，将重组载体命名为GmMBROLO-sgRNA。所述sgRNA1的靶序列为序列1第1775-1794位的DNA片段或序列2的第258-277位的DNA片段，所述sgRNA2的靶序列为序列4第243-262位的DNA片段或序列5的第29-48位的DNA片段。

重组载体GmMBROLO-sgRNA含有可以表达所述sgRNA1和sgRNA2的表达盒序列，所述表达盒的核苷酸序列为序列表中序列7。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。

本发明中，所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA/GmMBROLO-sgRNA。

所述重组农杆菌EHA/GmMBROLO-sgRNA是将所述重组载体GmMBROLO-sgRNA转化农杆菌EHA105获得的重组菌EHA/GmMBROLO-sgRNA。

本发明还提供了一种调控植物株型或/和产量的方法，包括调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和调控前文所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物株型或/和产量。

本发明还提供了培育株型或/和产量改变的植物的育种方法，包括调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和调控前文所述蛋白质的编码基因的表达量，得到植物株型或/和产量改变的植物。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GmMBR1或GmMBRL1。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：

1)在所述基因转录水平上进行的调控；

2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；

3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；

4)对所述基因的翻译进行的调控；

5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；

6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述方法中，所述调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，前文所述蛋白质的编码基因的表达量，包括向受体植物中导入包含抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子的重组表达载体，得到植物株型或/和产量改变的目的植物；所述编码基因编码前文所述蛋白质GmMBR1或GmMBRL1。

所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

上述应用及方法中，所述调控可为提高、增强或上调。

上述应用及方法中，所述调控可为抑制、降低或沉默。

本文中，所述调控所述蛋白质的编码基因的表达可为抑制或降低或下调所述编码基因表达。抑制或降低或下调所述编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。

所述基因敲除(gene knockout)是指通过基因编辑技术使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的用于敲除蛋白质GmMBR1或GmMBRL1的编码基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物株型或/和产量改变的转基因细胞系及转基因植株。携带敲除蛋白质GmMBR1或GmMBRL1的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明还提供了如下应用中的任一种：

U1)前文所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物株型和产量中的应用；

U2)前文所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物株型和产量的产品中的应用；

U3)前文所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育植物株型和产量改变的植物中的应用；

U4)前文所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育植物株型改变和产量提高的植物的产品中的应用；

U5)前文所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。

上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：

C1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；

C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；

C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；

C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。

本发明中，所述植物株型可包括分枝数、或/和单株荚数、或/和单株粒数、或/和株高。

本发明中，所述植物育种的目的可包括培育分枝数、或/和单株荚数或/和单株粒数提高或/和产量提高的植物。

本文中，所述植物可为如下任一种：

N1)双子叶植物

N2)豆目植物；

N3)豆科植物；

N4)大豆属植物；

N5)大豆。

本发明通过对调控植物株型和产量性状的GmMBR1基因和GmMBRL1基因进行敲除验证，获得双敲基因编辑植株gmmbrolo纯合突变体。与野生型大豆相比，gmmbrolo纯合突变体株高显著降低，分枝数显著增加，单株荚数和粒数显著增加，对于大豆育种具有指导意义，对提高大豆产量具有应用前景。

附图说明

图1为gmmbrolo纯合突变体的GmMBR1基因和GmMBRL1基因突变类型。其中A为gmmbrolo纯合突变体的GmMBR1基因的突变类型测序结果；B为gmmbrolo纯合突变体的GmMBRL1基因的突变类型测序结果。

图2为gmmbrolo纯合突变体及野生型大豆的株型比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。

下述实施例中的栽培大豆Jack已记载于：Chen L,Cai Y,Liu X,Yao W,Guo C,SunS,Wu C,Jiang B,Han T,Hou W(2018),Improvement of soybean Agrobacterium-mediated transformation efficiency by adding glutamine and asparagine intothe culture media.International Journal of Molecular Sciences 19,3039。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105，记载在如下文献中：Cai Y,Chen L,Liu X,Guo C,Sun S,Wu C,Jiang B,Han T and Hou W(2018a),CRISPR/Cas9-mediated targetedmutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean.Plant Biotechnol J16,176-185。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

MS盐：PhytoTech，目录号：M524。

MS有机：PhytoTech，目录号：M533。

B5有机：Phytotech公司，目录号：G219。

B5盐：Phytotech公司，目录号：G768。

下述实施例中的线性cas9/gRNA载体购于北京唯尚立德生物科技有限公司，目录号：VK005-15。

YEP固体培养基由溶剂和溶剂组成；各溶质及其在YEP固体培养基中的浓度为：NaCl 5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，15g/L琼脂；溶剂为水。YEP固体培养基的pH为7.0。

发芽培养基(pH5.8)：3.12g/L B5盐、1ml/L B5有机、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，余量为水。

液体培养基(pH5.4)：0.43g/L MS盐、1ml/L B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L蔗糖、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。

共培养培养基(pH5.4)：0.43g/L MS盐、1ml/L B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。

恢复培养基(pH5.4)：3.1g/L B5盐、1ml/L B5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L 6-BA、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。

筛选培养基(pH5.4)：3.1g/L B5盐、1ml/L B5有机、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L 6-BA、6mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。

伸长培养基(pH5.6)：4.0g/L MS盐、1ml/L B5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA、1mg/L 6-BA、6mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。

生根培养基(pH5.7)：2.165g/L MS盐、1ml/L B5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。

下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、GmMBR1和GmMBRL1双基因编辑CRISPR载体的构建

一、sgRNA靶点设计

从Phytozome数据库获得大豆GmMBR1基因组序列。GmMBR1位于14号染色体。大豆品种Jack基因组DNA中的GmMBR1基因如序列表的SEQ ID No.1所示，GmMBR1基因的编码序列(CDS)如序列表的SEQ ID No.2所示，编码氨基酸序列如序列表的SEQ ID No.3所示的蛋白质GmMBR1。

从Phytozome数据库获得大豆GmMBRL1基因组序列。GmMBRL1位于10号染色体。大豆品种Jack基因组DNA中的GmMBRL1基因如序列表的SEQ ID No.4所示，GmMBRL1基因的编码序列(CDS)如序列表的SEQ ID No.5所示，编码氨基酸序列如序列表的SEQ ID No.6所示的蛋白质GmMBRL1。

利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线网页工具进行GmMBR1sgRNA靶位点序列的选择。

靶点1位于GmMBR1的第三外显子区，sgRNA1的靶序列1为5’-AATAGGGAAACTTCACAGTT-3’(序列1第1775-1794位)；靶点2位于GmMBRL1的第一外显子区，sgRNA2的靶序列2为5’-TCTATCCTGGCCGTCACAAG-3’(序列4第243-262位)。

靶点设计好后，需要整合到载体上。首先，合成sgRNA1和sgRNA2的靶点引物，合成sgRNA1的引物序列为：

GmMBR1-F：5’-TTGAATAGGGAAACTTCACAGTT-3’

GmMBR1-R：5’-AACAACTGTGAAGTTTCCCTATT-3’

(下划线所示序列为20bp的sgRNA)

在25ul体系中各加入GmMBR1-F及GmMBR1-R引物5ul，水15ul，95℃3min，0.1℃/s退火至16℃，16℃保持10min，完成退火，得到带有粘性末端的sgRNA1退火产物。

合成sgRNA2的引物序列为：

GmMBRL1-F：5’-TTGTCTATCCTGGCCGTCACAAG-3’

GmMBRL1-R：5’-AACCTTGTGACGGCCAGGATAGA-3’

(下划线所示序列为20bp的sgRNA)

在25ul体系中各加入GmMBRL1-F及GmMBRL1-R引物5ul，水15ul，95℃3min，0.1℃/s退火至16℃，16℃保持10min，完成退火，得到带有粘性末端的sgRNA2退火产物。

二、表达sgRNA1和sgRNA2的重组载体制备

取步骤一得到的得到的带有粘性末端的sgRNA1退火产物1μL与cas9/gRNA载体(北京唯尚立德生物科技有限公司，货号：VK005-15，该载体含有Cas9蛋白表达单元)进行同源重组连接，得到重组载体Cas9-GmMBR1-sgRNA，该载体可表达sgRNA1，sgRNA1中的靶序列结合区的编码序列为序列1第1775-1794位(即SEQ ID No.2的第258-277位)。

取步骤一得到的得到的带有粘性末端的sgRNA2退火产物1μL与cas9/gRNA载体(北京唯尚立德生物科技有限公司，货号：VK005-15，该载体含有Cas9蛋白表达单元)进行T4连接，得到重组载体Cas9-GmMBRL1-sgRNA，该载体可表达sgRNA2，sgRNA2中的靶序列结合区的编码序列为序列4第243-262位(即SEQ ID No.5的第29-48位)。

用Asc1和Spe1双酶切Cas9-GmMBR1-sgRNA质粒，回收570bp小片段。用Asc1和Avr11酶切Cas9-GmMBRL1-sgRNA质粒，回收14000bp大片段，再用T4连接酶连接两个片段，得到双敲靶点重组载体Cas9-GmMBROLO-sgRNA。

实施例2、gmmbr1和gmmbrl1双基因突变体gmmbrolo的获得及表型鉴定

一、重组菌的制备

将实施例1制备的双敲靶点重组载体Cas9-GmMBROLO-sgRNA转入大肠杆菌DH5α，涂于LB+Kan的固体培养基上。挑取单克隆提取质粒，送测序。

测序引物SQ：5’-TGAAGTGGACGGAAGGAAGGAGG-3’，确定插入正确的片段的质粒命名为重组质粒GmMBROLO-sgRNA。

将线性载体cas9/gRNA(VK005-15,北京唯尚立德生物科技有限公司)通过同源重组分别插入sgRNA1和sgRNA2，保持cas9/gRNA载体其他序列不变，分别形成重组载体cas9-sgRNA1和cas9-sgRNA2。cas9-sgRNA1用AscI和SpeI酶切，回收590bp的片段，cas9-sgRNA2用AscI和AvrII酶切，回收14000bp的片段，用T4连接酶链接590bp和14000bp片段，形成双基因靶点重组载体cas9-sgRNA1sgRNA2，将重组载体命名为GmMBROLO-sgRNA，其中sgRNA1的靶序列为序列1第1775-1794位的DNA片段或序列2的第258-277位的DNA片段，sgRNA2的靶序列为序列4第243-262位的DNA片段或序列5的第29-48位的DNA片段。重组载体GmMBROLO-sgRNA含有可以表达所述sgRNA1和sgRNA2的表达盒序列，其中表达盒的核苷酸序列为序列表中序列7。

用电转法将重组质粒GmMBROLO-sgRNA转化农杆菌EHA105，提取质粒进行测序验证，将测序验证正确的重组菌株命名EHA/GmMBROLO-sgRNA。

二、农杆菌介导转化

利用农杆菌介导法将构建好的EHA/GmMBROLO-sgRNA转化大豆品种Jack(以下称为野生型大豆)，具体方法为：

1、种子灭菌

1)取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的大豆品种Jack种子，完全平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中。

2)完成步骤1)后，在所述干燥器中放入100ml容量的烧杯，在烧杯中倒入80ml 12M次氯酸钠水溶液，再慢慢加入4ml浓盐酸，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置16h，进行氯气灭菌。

2、制备侵染菌液

1)28℃，培养上述一得到的EHA/GmMBROLO-sgRNA菌液，用液体培养基重悬，得到OD_600nm＝0.6的侵染菌液。

2)将1处理后的种子放入超净台中，在显微镜下，剥去种皮，沿长轴将两个子叶分开，保留带完整胚轴的那片子叶，在其胚轴和子叶连接处进行划伤，一般一个子叶划伤3-5刀，然后在28℃培养箱中，浸染2h。

3)将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，温度22℃，暗培养5d。

4)共培养5d后，外植体胚轴伸长到2cm，切掉部分胚轴，使其保留0.5cm。将处理后的外植体放到恢复培养基中，28℃，16h光照/8h黑暗条件下，培养7d。

5)从恢复培养基中取出外植体，去除新芽，切除部分胚轴，保留0.5cm的胚轴，再将修整后外植体转入到筛选培养基中，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养21d。

6)经过21d的筛选诱导，外植体产生大量不定芽，剥除子叶和棕色的叶子，将剩余的部分转入伸长培养基中培养，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。

7)在伸长培养基中，当丛生芽抽出5-8cm幼茎时，从不定芽基部剪下来；茎基部在1mg/LIBA溶液中沾1min，然后转入生根培养基中培养，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养一周，在茎基部产生大量根后，移栽到盆中，长成的植株为T0代转化大豆。

三、编辑植株的分子检测

提取T0代转化大豆叶片的DNA作为模板进行PCR分子检测，以野生型大豆为对照。

在GmMBR1基因和GmMBRL1基因靶位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增并测序。其中，引物MBR1-F：5′-GTGCCTGGAGAGGGATAGCA-3′和MBR1-R：5′-CTGGAGAGCATTTTCCAGGAGT-3′扩增GmMBR1基因。引物MBRL1-F：5′-GGTGACCGCAATGGAAGACA-3′和MBRL1-R：5′-TGTCGTGGTGAAGAAAAACGA-3′扩增GmMBRL1基因。

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 12.5μL，dNTP Mix(10mM)0.5μL，DNA(200ng/μL)1μL，F(10pmol/μL)1μL，R(10pmol/μL)1μL，Super-Fidelity DNA Polymerase0.5μL，ddH₂O 8.5μL，总体积25μL。扩增反应体系：95℃3min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。PCR产物送公司测序验证。

在靶点位置附近出现套峰为杂合编辑植株，命名为T0代转GmMBROLO大豆。

将T0代转GmMBROLO大豆播种后收获T1代转GmMBROLO大豆的种子，培育，得到T1代转GmMBROLO大豆。

采用上述步骤三中PCR分子检测方法检测T1代转GmMBROLO大豆，测序结果显示：在T1代转GmMBROLO大豆中，突变体植株(gmmbrolo)在靶位点附近产生如下突变，使蛋白翻译提前终止，突变体植株中GmMBR1基因突变类型包括1种：-14bp；GmMBRL1基因突变类型包括1种:+1bp(图1)。

T1代大豆gmmbrolo纯合突变体植株中GmMBR1基因突变类型-14bp为将序列表中序列1第1780-1793位中间删除，且保持其他核苷酸不变。gmmbrolo纯合突变体植株中GmMBRL1基因突变类型+1bp为将序列表中序列1第259和260位中间增加一个碱基，且保持其他核苷酸不变。

gmmbrolo纯合突变体与野生型相比，对于GmMBR1基因，在SEQ ID No.1的序列第1780-1793位有14个碱基缺失，即序列表中序列1的第1780-1793位的核苷酸“5’-GGAAACTTCACAGT-3’”缺失，引起了移码，导致翻译提前终止，造成GmMBR1蛋白功能缺失，从而将GmMBR1基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中A；对于GmMBRL1基因，在SEQ ID No.4的序列第259和260位插入核苷酸“C”，该核苷酸的插入引起了移码，导致翻译提前终止，造成GmMBRL1蛋白功能缺失，从而将GmMBRL1基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中B。

将上述T1代gmmbrolo纯合大豆突变体植株继续培育，筛选得到不含转基因元件的T2代大豆纯合突变体，并进行表型鉴定。

四、突变体株型鉴定

在北京夏季网室自然光照条件下种植，种植条件为：株距10cm，行距50cm。分别统计野生型对照植株、gmmbrolo纯合突变体的株型性状(株高、节数、分枝数、单株荚数、单株粒数)。每个材料至少统计6个单株数据。

表型研究结果见表1和图2：在株型方面，与对照植株株高148.3cm相比，gmmbrolo突变体植株株高平均为125.1cm，突变体株高比对照显著降低；在分枝表型方面，对照植株分枝数1.5个，突变体植株分枝平均为4.5个，突变植株分枝数显著增加；在植株节数方面，对照植株节数25.0个，突变体植株节数平均为24.4个，突变植株的植株节数与对照没有显著变化。

在单株产量方面，对照植株平均单株荚数106.5个，单株粒数257.8粒，突变体植株单株荚数152.3.0个，单株粒数359.6粒，突变体单株荚数和粒数比野生型增加。

综上所述，与野生型对照相比，gmmbrolo纯合突变体株高显著降低，分枝数显著增加，单株荚数和粒数显著增加。

表1、大豆株型数据统计

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质，所述蛋白质是如下任一种的蛋白质：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质和氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质组成的组合物；

G2)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质或氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；

G3)将G1)和G2)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物株型或/和产量相关功能的蛋白质；

G4)在G1)或G2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于大豆。

3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：

B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

C1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；

C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；

C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；

C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下E1)或E2)所示的基因：

E1)编码序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.5的cDNA分子或DNA分子；

E2)核苷酸是SEQ ID No.1或SEQ ID No.4的cDNA分子或DNA分子。

5.一种调控植物株型或/和产量的方法，其特征在于：包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和调控权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物株型或/和产量。

6.培育株型或/和产量改变的植物的育种方法，包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和调控权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到植物株型或/和产量改变的植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，包括向受体植物中导入包含抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子的重组表达载体，得到植物株型或/和产量改变的目的植物；所述编码基因编码权利要求1或2中所述蛋白质。

8.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

U1)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物株型和产量中的应用；

U2)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物株型和产量的产品中的应用；

U3)权利要求1或2所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育植物株型和产量改变的植物中的应用；

U4)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育植物株型改变和产量提高的植物的产品中的应用；

U5)权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：

C1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；

C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；

C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；

C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。

10.权利要求5-7任一所述的方法，或权利要求8或9任一所述的应用，其特征在于：所述植物为如下任一种：

N1)双子叶植物

N2)豆目植物；

N3)豆科植物；

N4)大豆属植物；

N5)大豆。