CN113481176B

CN113481176B - GA3ox1蛋白在调控苜蓿株型中的应用

Info

Publication number: CN113481176B
Application number: CN202110885132.7A
Authority: CN
Inventors: 王涛; 董江丽; 刘金玲; 郑丽华
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113481176A

Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑技术培育矮化株型和/或紧凑株型和/或匍匐株型苜蓿的方法。本发明提供了GA3ox1蛋白或其编码基因在调控苜蓿株型中的应用。在苜蓿中敲除GA3ox1蛋白编码基因，其蛋白表达量和/或活性降低或失活，苜蓿中赤霉素含量降低。实验证明，苜蓿GA3ox1基因敲除植株与野生型相比株高和节间长度显著降低，呈矮化和/或紧凑和/或匍匐状株型。利用基因编辑技术靶向GA3ox1，快速且高效地获得紫花苜蓿新株型，对于苜蓿套种、间作等应用具有重要意义。

Description

GA3ox1蛋白在调控苜蓿株型中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及GA3ox1蛋白在调控苜蓿株型中的应用。

背景技术

紫花苜蓿是多年生豆科植物，具有产量高、品质优、营养价值丰富和适应性强等特性，被誉为“牧草之王”。紫花苜蓿具有重要的农业生产价值，除了作为优质饲用作物，还能与青贮玉米套种，以增强土壤固氮微生物活性，提高根际土壤营养元素利用效率，增进土壤肥力，促进植物生长发育；果园套种紫花苜蓿，有利于果园形成良性循环的生态系统，提高果树种植产生的经济效应，推动饲料生产，进而推进畜牧业发展；紫花苜蓿与其它主栽作物间作，能够有效提高地表覆盖率，减少水分的散失，同时抑制杂草的生长。但是，大多数紫花苜蓿栽培种呈现直立性状，株高较高，在很大程度上限制了以上农事活动的有效性和便利性；而匍匐性状在保持其它生产优势的基础上，更有利于套种、间作应用。目前，天然匍匐型紫花苜蓿材料极少，综合农艺表现差，难以通过传统的育种方式进行遗传改良；利用生物技术，尤其是基因编辑技术，能够以栽培紫花苜蓿为遗传背景，高效地构建综合表现优良的匍匐型紫花苜蓿。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何快速、高效的获得矮化和/或紧凑和/或匍匐型株型的苜蓿。

为解决上述技术问题，本发明提供蛋白质或调控基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控苜蓿株型中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质为MsGA3ox1或MtGA3ox1；

所述MsGA3ox1是如下a1)-a3)任一种蛋白质：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有60％以上同一性，且与苜蓿株型相关的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述MtGA3ox1是如下b1)-b3)任一种蛋白质：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)将b1)所示的氨基酸序列经过一个或几个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的氨基酸序列具有60％以上同一性，且与苜蓿株型相关的蛋白质；

b3)在b1)或b2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

进一步地，所述的应用中，a2)所述的蛋白质包括MsGA3ox1/-8bp-L3、MsGA3ox1/-36bp、MsGA3ox1/-9bp、MsGA3ox1/+1bp、MsGA3ox1/-8bp-L15、MsGA3ox1/-7bp、MsGA3ox1/-72bp，

所述MsGA3ox1/-8bp-L3为由MsGA3ox1/-8bp-L3基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/-8bp-L3基因是将序列表中序列3的第350-357位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-36bp为由MsGA3ox1/-36bp基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/-36bp基因是将序列表中序列3的第320-355位的核苷酸共36个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-9bp为由MsGA3ox1/-9bp基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/-9bp基因是将序列表中序列3的第351-359位的核苷酸共9个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/+1bp为由MsGA3ox1/+1bp基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/+1bp基因是将序列表中序列3的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-8bp-L15为由MsGA3ox1/-8bp-L15基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/-8bp-L15基因是将序列表中序列3的第351-358位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-7bp为由MsGA3ox1/-7bp基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/-7bp基因是将序列表中序列3的第351-357位的核苷酸共7个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-72bp为由MsGA3ox1/-72bp基因编码的蛋白质，所述MsGA3ox1/-72bp基因是将序列表中序列3的第351-422位的核苷酸共72个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

b2)所述的蛋白质包括MtGA3ox1/+1bp-L4、MtGA3ox1/-10bp、MtGA3ox1/-19bp、MtGA3ox1/+2bp、MtGA3ox1/-216bp、MtGA3ox1/+1bp-L11，

所述MtGA3ox1/+1bp-L4为由MtGA3ox1/+1bp-L4基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/+1bp-L4基因是将序列表中序列4第255-256位的核苷酸之间增加一个碱基C、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/-10bp为由MtGA3ox1/-10bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/-10bp基因是将序列表中序列4第330-339位的核苷酸共10个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/-19bp为由MtGA3ox1/-19bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/-19bp基因是将序列表中序列4第329-347位的核苷酸共19个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/+2bp为由MtGA3ox1/+2bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/+2bp基因是将序列表中序列4第331-332的核苷酸之间插入两个碱基GA、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/-216bp为由MtGA3ox1/-216bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/-216bp基因是将序列表中序列4第169-384位的核苷酸共216个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/+1bp-L11为由MtGA3ox1/+1bp-L11基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/+1bp-L11基因是将序列表中序列4第331-332位的核苷酸之间增加一个碱基G、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。

进一步地，上述蛋白质可来源于苜蓿。

进一步地，所述苜蓿可为紫花苜蓿或蒺藜苜蓿。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

本发明提供与所述蛋白质相关的生物材料在调控苜蓿株型中的应用，所述生物材料可为下述任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；

A4)含有A1)所述核酸分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A5)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A6)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A7)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A8)抑制或降低上述蛋白质的编码基因的表达或上述蛋白质的活性的核酸分子；

A9)含有A8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，所述调控苜蓿株型可为降低苜蓿株高和/或节间长度和/或节间数量，从而使苜蓿矮化和/或紧凑和/或匍匐形态。

上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

进一步地，所述的应用中，A1)所述核酸分子可为如下g1)-g4)任一项所示的DNA分子：

g1)编码链的编码序列为序列表中序列3的DNA分子；

g2)与g1)所述DNA分子具有60％以上的同一性，且编码调控苜蓿株型相关蛋白质的DNA分子；

g3)编码链的编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子；

g4)与g3)所述DNA分子具有60％以上的同一性，且编码调控苜蓿株型相关蛋白质的DNA分子；

进一步地，所述的应用中，g2)所述的DNA分子包括MsGA3ox1/-8bp-L3基因、MsGA3ox1/-36bp基因、MsGA3ox1/-9bp基因、MsGA3ox1/+1bp基因、MsGA3ox1/-8bp-L15基因、MsGA3ox1/-7bp基因、MsGA3ox1/-72bp基因，

所述MsGA3ox1/-8bp-L3基因是将序列表中序列3的第350-357位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-36bp基因是将序列表中序列3的第320-355位的核苷酸共36个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-9bp基因是将序列表中序列3的第351-359位的核苷酸共9个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/+1bp基因是将序列表中序列3的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-8bp-L15基因是将序列表中序列3的第351-358位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-7bp基因是将序列表中序列3的第351-357位的核苷酸共7个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MsGA3ox1/-72bp基因是将序列表中序列3的第351-422位的核苷酸共72个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

g4)所述的DNA分子包括MtGA3ox1/+1bp-L4基因、MtGA3ox1/-10bp基因、MtGA3ox1/-19bp基因、MtGA3ox1/+2bp基因、MtGA3ox1/-216bp基因、MtGA3ox1/+1bp-L11基因，

所述MtGA3ox1/+1bp-L4基因是将序列表中序列4第255-256位的核苷酸之间增加一个碱基C、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/-10bp基因是将序列表中序列4第330-339位的核苷酸共10个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/-19bp基因是将序列表中序列4第329-347位的核苷酸共19个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/+2bp基因是将序列表中序列4第331-332的核苷酸之间插入两个碱基GA、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/-216bp基因是将序列表中序列4第169-384位的核苷酸共216个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

所述MtGA3ox1/+1bp-L11基因是将序列表中序列4第331-332位的核苷酸之间增加一个碱基G、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。

进一步地，所述的应用中，A8)所述核酸分子为：表达靶向上述a1)或b1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向上述中a1)或b1)所述蛋白编码基因的gRNA；

所述gRNA包括sgRNA1和sgRNA2。

进一步地，B1)、所述sgRNA1的靶标序列序列表中序列3的第347-365位所示核苷酸的反向互补序列(即5′-ACACCATCCGGGGAACGAA-3′)，所述sgRNA2的靶标序列如序列表中序列3的第341-359位所示核苷酸序列(即5′-AAGCCATTCGTTCCCCGGA-3′)；

B2)、所述sgRNA1的靶标序列序列表中序列4的第329-347位所示核苷酸的反向互补序列(即5′-ACACCATCTGGGGAACGAA-3′)，所述sgRNA2的靶标序列如序列表中序列4的第323-341位所示核苷酸序列(即5′-AAGCCATTCGTTCCCCAGA-3′)。

上述应用中，同一性是指核苷酸序列或氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸或氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastn/blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gapcost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸或氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述60％以上的同一性可为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

本发明提供产生苜蓿矮化株型和/或紧凑株型和/或匍匐株型的方法，其特征在于：包括通过抑制或降低苜蓿基因组中上述的蛋白质的活性或上述基因的表达来产生苜蓿矮化株型和/或紧凑株型和/或匍匐株型。

进一步地，所述苜蓿可为紫花苜蓿或蒺藜苜蓿。

进一步地，所述的方法中，所述抑制或降低苜蓿基因组中上述的蛋白质的活性或上述基因的表达可为M1或M2：

M1、将序列表中的序列3所示的MsGA3ox1基因进行下述至少一种突变：

1)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-8bp-L3基因，所述MsGA3ox1/-8bp-L3基因是将序列表中序列3的第350-357位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

2)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-36bp基因，所述MsGA3ox1/-36bp基因是将序列表中序列3的第320-355位的核苷酸共36个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

3)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-9bp基因，所述MsGA3ox1/-9bp基因是将序列表中序列3的第351-359位的核苷酸共9个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

4)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/+1bp基因，所述MsGA3ox1/+1bp基因是将序列表中序列3的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

5)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-8bp-L15基因，所述MsGA3ox1/-8bp-L15基因是将序列表中序列3的第351-358位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

6)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-7bp基因，所述MsGA3ox1/-7bp基因是将序列表中序列3的第351-357位的核苷酸共7个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

7)将序列表中序列3所示的MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-72bp基因，所述MsGA3ox1/-72bp基因是将序列表中序列3的第351-422位的核苷酸共72个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

M2、将序列表中的序列4所示的MtGA3ox1基因进行下述至少一种突变：

8)将序列表中序列4所示的MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/+1bp-L4基因，所述MtGA3ox1/+1bp-L4为由MtGA3ox1/+1bp-L4基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/+1bp-L4基因是将序列表中序列4第255-256位的核苷酸之间增加一个碱基C、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

9)将序列表中序列4所示的MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/-10bp基因，所述MtGA3ox1/-10bp为由MtGA3ox1/-10bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/-10bp基因是将序列表中序列4第330-339位的核苷酸共10个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

10)将序列表中序列4所示的MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/-19bp基因，所述MtGA3ox1/-19bp为由MtGA3ox1/-19bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/-19bp基因是将序列表中序列4第329-347位的核苷酸共19个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

11)将序列表中序列4所示的MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/+2bp基因，所述MtGA3ox1/+2bp为由MtGA3ox1/+2bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/+2bp基因是将序列表中序列4第331-332的核苷酸之间插入两个碱基GA、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

12)将序列表中序列4所示的MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/-216bp基因，所述MtGA3ox1/-216bp为由MtGA3ox1/-216bp基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/-216bp基因是将序列表中序列4第169-384位的核苷酸共216个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；

13)将序列表中序列4所示的MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/+1bp-L11基因，所述MtGA3ox1/+1bp-L11为由MtGA3ox1/+1bp-L11基因编码的蛋白质，所述MtGA3ox1/+1bp-L11基因是将序列表中序列4第331-332位的核苷酸之间增加一个碱基G、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。

本发明提供蛋白质或其相关的生物材料，所述蛋白质为上述的蛋白质，所述生物材料为上述的生物材料。

本发明旨在提供一种利用基因编辑技术培育矮化株型和/或紧凑株型和/或匍匐株型苜蓿的方法。将携带靶向GA3ox1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，通过农杆菌介导的方式进行遗传转化，导入所述受体植物，获得转基因阳性株，并在其中鉴定到GA3ox1所有等位基因均发生突变的材料，且表型呈现为矮化和/或紧凑和/或匍匐状。实验证明，在蒺藜苜蓿中，MtGA3ox1基因敲除植株与野生型相比株型匍匐，株高、主根长度、地上部和根部干重降低，每株平均根瘤数目减少，但是固氮酶活无显著差异；在紫花苜蓿中，MsGA3ox1基因敲除植株与野生型相比株高降低，节间长度降低。

附图说明

图1为蒺藜苜蓿表达载体p6401-MtGA3ox1的载体结构图。

图2为Mtga3ox1突变体鉴定结果；图a为p6401-MtGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入蒺藜苜蓿所获得转基因植株鉴定结果，其中M示DNA标准分子量，WT示野生型材料，阳性对照“+”为质粒p6401-MtGA3ox1，阴性对照“-”为ddH₂O，序号1-4为遗传转化再生植株，结果表明：1-4样品为转入p6401-MtGA3ox1载体的再生植株；图b为p6401-MtGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入蒺藜苜蓿所获得转基因植株靶标基因MtGA3ox1基因型鉴定结果，其中M表示DNA标准分子量，WT示野生型材料，阴性对照“-”为ddH₂O，序号1-4为遗传转化再生植株，结果表明：1-4样品均有扩增条带，均为p6401-MtGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入蒺藜苜蓿所获得阳性转基因植株。

图3为p6401-MtGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入蒺藜苜蓿所获得阳性转基因植株Mtga3ox1突变体突变方式示例性分析结果。

图4为蒺藜苜蓿WT，Mtga3ox1突变体材料在1/2MS培养条件下生长五周的生长状况；整体形态如图a，植株株高(图b)、主根长度(图c)、地上部干重(图d)和根部干重(图e)检测，结果表明：1/2MS培养条件下，Mtga3ox1突变体植株株高、主根长度、地上部干重和根部干重均显著低于野生型。

图5为蒺藜苜蓿WT，Mtga3ox1突变体材料在无氮培养条件下，接种中华根瘤菌21d后的生长状况，植株形态如图a，统计植株株高(图b)、主根长度(图c)、地上部干重(图d)、根部干重(图e)、每株平均根瘤菌数目(图f)和固氮酶活(图g)。

图6为紫花苜蓿p6401-MsGA3ox1载体结构图。

图7为p6401-MsGA3ox1载体转入紫花苜蓿所获得转基因植株电泳检测结果。

图8为p6401-MsGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入紫花苜蓿所获得阳性转基因植株MsGA3ox1突变体突变方式示例性分析结果。

图9为紫花苜蓿WT、Msga3ox1突变体材料表型。在1/2MS培养条件下生长六周，植株形态如图a和图b，统计植株株高(图c)和节间长度(图d)；外源施加0.1mM GA₄后，Msga3ox1突变体表型如图e。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

蒺藜苜蓿R108为本实验室保存的野生型材料，蒺藜苜蓿R108、p6401载体和p5CBC：记载于“ZHU,F.,YE,Q.,CHEN,H.,DONG,J.&WANG,T.2021.Multigene editing revealsthat MtCEP1/2/12redundantly regulate lateral root and nodule number inMedicago truncatula.J Exp Bot.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

无氮培养基配方为(1L)：MgSO₄·7H₂O(0.25M)2mL，KH₂PO₄·2H₂O(0.7M)1mL，NaH₂PO₄·2H₂O(0.2M)4mL，Fe-EDTA·2Na(10mM)5mL，MnSO₄(1mg/mL)100μL，CuSO₄(1mg/mL)100μL，ZnSO₄(1mg/mL)100μL，H₃BO₃(1mg/mL)100μL，NaMoO₄(1mg/mL)100μL。121℃灭菌22min，待温度降至50℃时加入1mL过滤除菌的CaCl₂溶液(1M)。

1/2MS培养基配方为(1L)：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM(M519)(PhytoTechnology Laboratories^TM)2.2g。固体培养基中加入20g蔗糖,8g琼脂，pH调整至5.85。

10×N6大量母液(1L)：MgSO₄·7H₂O 1.85g，KNO₃ 28.3g，(NH₄)₂SO₄ 4.63g，CaCl₂·2H₂O 1.66g，KH₂PO₄ 4g。

1000×SH微量母液(100mL)：MnSO₄·H₂O 1g，H₃BO₃ 500mg，ZnSO₄·7H₂O 100mg，KI100mg，Na₂MoO₄·2H₂O 10mg，CuSO₄·5H₂O 20mg，CoCl₂·6H₂O 10mg。

1000×SH有机母液(100mL)：烟酸500mg，盐酸吡哆醇500mg，盐酸硫胺素500mg。

50×EDFS铁盐母液(500mL)：NaFe·EDTA 3.487g。

SH3α培养基(1L)的配方为：10×N6大量母液100mL，1000×SH微量母液1mL，1000×SH有机母液1mL，50×EDFS铁盐母液20mL，2，4-D储存液(10mg/mL)0.4mL，6-BAP储存液(1mg/mL)0.5mL，肌醇100mg，蔗糖30g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。

SH9培养基(1L)的配方为：10×N6大量母液100mL，1000×SH微量母液1mL，1000×SH有机母液1mL，50×EDFS铁盐母液20mL，肌醇100mg，蔗糖20g，pH调整至5.85。固体培养基中加入8g琼脂。

SM4培养基(1L)的配方为：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM(M519)(PhytoTechnology Laboratories^TM)4.43g，2，4-D储存液(10mg/mL)0.4mL，6-BAP储存液(1mg/mL)0.2mL，蔗糖30g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。

MSBK培养基(1L)的配方为：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM(M519)(PhytoTechnology Laboratories^TM)4.43g，激动素(1mg/mL)1mL，6-BAP储存液(1mg/mL)0.5mL，蔗糖30g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。

下述实施例采用SPSS16.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Kruskal-Wallis，nonparametric test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

表1.引物

实施例1、蒺藜苜蓿MtGA3ox1基因敲除突变体的获得及表型检测

1、载体p6401-MtGA3ox1构建

1.a、基因编辑靶点设计

蒺藜苜蓿R108含有编码序列(CDS)是序列表中序列4所示的MtGA3ox1编码基因，编码氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质MtGA3ox1。

通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表，选择靶点1为5′-ACACCATCTGGGGAACGAA-3′，靶点2为5′-AAGCCATTCGTTCCCCAGA-3′，如图1所示。

1.b、sgRNA模块构建

如表1所示，由华大基因公司合成引物MtGA3ox1-BsF，MtGA3ox1-F0，MtGA3ox1-R0，MtGA3ox1-BsF和MtGA3ox1-BsR。

通过搭桥PCR进行p5CBC-Target扩增反应，扩增得到带有靶点序列的sgRNA模块p5CBC-MtGA3ox1，反应体系如下：

反应程序为：第一轮：94℃变性2min；第二轮：94℃变性15sec，60℃退火30sec，68℃延伸1min，30个循环；第三轮：68℃延伸5min。反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，切取目的片段所在胶块，通过胶回收试剂盒进行片段回收。

将胶回收片段送样测序，p5CBC-MtGA3ox1的序列如序列表中序列6所示。SEQIDNo.6的第18-36位为MtGA3ox1的靶标1序列，第806-824位为MtGA3ox1的靶标2序列。

1.c、基因编辑双元载体构建

Golden Gate酶切连接反应：将带有靶点序列的p5CBC-MtGA3ox1片段和p6401载体通过Bsa I进行酶切，同时通过T4 DNA Ligase进行连接，构成p6401-MtGA3ox1(如图1)。具体反应体系如下：

反应程序为：第一步：37℃，5h；第二步：50℃，5min；第三步：80℃，10min。

反应完成后将产物加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃ 150rpm摇瓶培养45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。挑取单克隆至400μL含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB液体培养基中37℃230rpm摇瓶培养6～8h，随后进行菌液PCR鉴定，引物为MtGA3ox1-BsF和MtGA3ox1-BsR进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序验证。

测序结果表明p6401-MtGA3ox1是用片段p5CBC-MtGA3ox1第14-824位所示的碱基序列替换载体p6401的BsaI酶切割位点之间的片段，保持载体p6401的其他序列不变，得到的重组表达载体。p6401-MtGA3ox1表达靶向于MtGA3ox1基因的sgRNA1(靶标为靶点1)和sgRNA2(靶标为靶点2)的两个sgRNA。

2、蒺藜苜蓿MtGA3ox1基因敲除突变体的获得

2.1、转化农杆菌EHA105

挑取农杆菌EHA105单克隆菌落，接种于5mL YEP培养液，于28℃培养箱230rpm振荡培养过夜。将菌液按1:100比例转移至200mL YEP培养液，28℃，230rpm振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.6。菌液分别转移至2个已灭菌的250mL离心瓶，24℃，4000rpm离心10min，在超净台中弃去上清液，各加入150mL预冷的灭菌MilliQ水重悬沉淀，此步骤重复2-3次。4℃，5000rpm离心5min，在超净台弃去上清液，各加入2mL预冷的含10％甘油的MilliQ水，轻轻悬浮沉淀。每管200μl农杆菌悬浮液分装于1.5mL无菌eppendorf管中，液氮速冻后，冻存于-80℃。

在冰上融化的200μL EHA105感受态细胞中加入0.5μL(100ng/μL)p6401-MtGA3ox1质粒，轻轻吹打混匀。感受态转移至预冷的电击杯，经2100V电击后，立即加入500μL预冷的空白YEP液体培养基，吹打混匀后，将电击杯中的溶液转移至1.5mL离心管，28℃，200rpm振荡培养45min。移液枪吸取50μL菌液涂布于含50μg/mL Kan和75μg/mL利福平的YEP固体培养基，28℃培养约48h。挑取YEP固体培养基上的单克隆菌落，接种于含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，230rpm振荡过夜培养。挑取克隆进行菌液PCR鉴定，引物为MtGA3ox1-BsF和MtGA3ox1-BsR，阳性克隆具有大小为841bp的特异性条带，检测结果表明，p6401-MtGA3ox1载体已经成功转化农杆菌EHA105，将重组根癌农杆菌命名为EHA105/p6401-MtGA3ox1用于下一步侵染。

2.2、EHA105/p6401-MtGA3ox1农杆菌侵染蒺藜苜蓿

取蒺藜苜蓿R108种子置于2mL离心管中，1mL浓硫酸处理8min，无菌水冲洗6次，加入1mL 0.5％次氯酸钠溶液消毒12min，在超净台利用无菌去离子水清洗7次后，接种于无菌0.8％水琼脂培养基上，4℃黑暗陪养3d，24℃黑暗培养1d后，转移至1/2MS培养基培养四周。利用刀片切取蒺藜苜蓿叶片，用无菌镊子与刀将叶片切成方形置于玻璃皿中。

按1：50比例将EHA105/p6401-MtGA3ox1菌液转接至20ml含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃，230rpm振荡培养至OD_600nm为0.6-0.8。24℃，3000rpm，离心10min，在超净台弃去上清液，用100mL SH3α(含100μM乙酰丁香酮)悬浮沉淀，制成侵染液。

将切好的叶片浸泡于侵染液中，充分混匀，抽真空，-0.1pka，30min。24℃，80rpm，避光处理1.5h。在超净台中取出叶片，在灭菌滤纸上沾去多余的侵染液，转移至含100μM乙酰丁香酮的表面覆盖滤纸的SH3α固体培养基，黑暗培养3d。用镊子将叶片转移至新的SH3α固体培养基(含200mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素)，暗培养6周，每2周转移至新的含相应抗生素的SH3α固体培养基。培养6周后，愈伤组织转移至SH9固体培养基(含200mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素)，光照条件下培养9周，期间每3周转移至新的含相应抗生素的SH9培养基。生长成型的植株转移至1/2MS培养基，期间每3周转移至新的1/2MS培养基，植株生根后，转移至温室培养，鉴定阳性苗后收取种子。

2.3、MtGA3ox1基因敲除突变体植株的检测

DNA水平检测MtGA3ox1基因敲除突变体阳性植株。提取敲除突变体植株基因组DNA，以其作为模板，MtGA3ox1-BsF和MtGA3ox1-BsR作为引物进行扩增反应。野生型植株基因组DNA和ddH₂O为阴性对照。反应体系如下：

扩增反应程序为：第一轮：95℃变性5min；第二轮：94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；第三轮：72℃延伸10min。程序结束后，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

如图2中a所示，可扩增出特异的p6401-MtGA3ox1载体片段(841bp)的植株即为转基因阳性植株。

以T1代植株为模板，MtGA3ox1-F和MtGA3ox1-R为引物，进行扩增反应，切取扩增条带(如图2中b)，送华大基因公司进行测序，确定Mtga3ox1突变体突变方式(如图3所示)。

3、MtGA3ox1基因敲除突变体表型检测

Mtga3ox1-1突变体T₁代阳性植株(图3)进行全营养条件下表型检测。野生型(R108)和T₁代阳性植株种子置于2mL离心管中，1mL浓硫酸处理8min，无菌水冲洗6次，加入1mL 0.5％次氯酸钠溶液消毒12min，在超净台利用无菌去离子水清洗7次后，接种于无菌0.8％水琼脂培养基上，4℃黑暗培养3d，24℃黑暗培养1d后，转移至1/2MS培养基培养五周，检测野生型和突变体植株株高、主根长度、地上部和根部干重。结果如图4所示，突变体植株株高、主根长度、地上部和根部干重均显著低于野生型植株。

T₁代阳性植株进行无氮条件下表型检测。野生型(R108)和Mtga3ox1-1突变体T₁代阳性植株种子置于2mL离心管中，1mL浓硫酸处理8min，无菌水冲洗6次，加入1mL 0.5％次氯酸钠溶液消毒12min，在超净台利用无菌去离子水清洗7次后，接种于无菌0.8％水琼脂培养基上，4℃黑暗陪养3d，24℃黑暗培养1d后，转移至缺氮培养基培养一周。活化中华根瘤菌菌株Sm1021，挑取单克隆菌落于5mL TY培养液中，28℃，230rpm振荡培养2d，1：50比例转接至100mL TY培养液，28℃，230rpm振荡培养至OD_600nm达到1.0。室温4000rpm离心10min，弃去上清液后，无菌去离子水重悬菌体至OD_600nm达到0.05。每株植株接种15mL重悬液，21d后，检测野生型和突变体植株株高、主根长度、地上部干重、根部干重、每株平均根瘤菌数目和固氮酶活。结果如图5所示，Mtga3ox1-1突变体植株株高、主根长度、地上部干重、根部干重和株平均根瘤菌数目均显著低于野生型植株，但是固氮酶活无显著差异。与野生型植物相比，Mtga3ox1-1突变体植株平均株高降低约70％，地上部生物量降低约20％，主根长度及地下生物量降低约40％。

匍匐型表型的突变体植株对应的基因突变型如下：

基因型为MtGA3ox1/+1bp的双等位纯合突变体植株与野生型蒺藜苜蓿R108相比，对于MtGA3ox1基因，两条染色体中MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/+1bp基因，MtGA3ox1/+1bp基因是将MtGA3ox1编码序列(序列表中序列4)的第255-256位的核苷酸之间增加一个碱基C、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，命名为MtGA3ox1/+1bp-L4；MtGA3ox1/+1bp-L4基因的编码序列是将序列表中序列4的第255-256位的核苷酸之间增加一个碱基C、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MtGA3ox1/+1bp-L4【图3中Mt GA3ox1-4】。

基因型为MtGA3ox1/-10bp/-19bp的等位基因的杂合体突变体植株与野生型蒺藜苜蓿R108相比，对于MtGA3ox1基因，一条染色体中MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/-10bp基因，MtGA3ox1/-10bp基因是将MtGA3ox1编码序列(序列表中序列4)的第330-339位的核苷酸共10个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MtGA3ox1/-10bp基因的编码序列是将序列表中序列4的第330-339位的核苷酸共10个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MtGA3ox1/-10bp；一条染色体中MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/-19bp基因，MtGA3ox1/-19bp基因是将MtGA3ox1编码序列(序列表中序列4)的第329-347位的核苷酸共19个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MtGA3ox1/-19bp基因的编码序列是将序列表中序列4的第329-347位的核苷酸共19个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MtGA3ox1/-19bp【图3中MtGA3ox1-1】。

基因型为MtGA3ox1/+2bp/-216bp的等位基因的杂合体突变体植株，与野生型蒺藜苜蓿R108相比，对于MtGA3ox1基因，一条染色体中MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/+2bp基因，MtGA3ox1/+2bp基因是将MtGA3ox1编码序列(序列表中序列4)的第331-332的核苷酸之间插入两个碱基GA、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MtGA3ox1/+2bp基因的编码序列是将序列表中序列4的第331-332的核苷酸之间插入两个碱基GA、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MtGA3ox1/+2bp；一条染色体中MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/-216bp基因，MtGA3ox1/-216bp基因是将MtGA3ox1编码序列(序列表中序列4)的第169-384位的核苷酸共216个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MtGA3ox1/-216bp基因的编码序列是将序列表中序列4的第169-384位的核苷酸共216个碱基缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MtGA3ox1/-216bp【图3中Mt GA3ox1-10】。

基因型为MtGA3ox1/+1bp的双等位纯合突变体植株与野生型蒺藜苜蓿R108相比，对于MtGA3ox1基因，两条染色体中MtGA3ox1基因突变为MtGA3ox1/+1bp基因，MtGA3ox1/+1bp基因是将MtGA3ox1编码序列(序列表中序列4)的第331-332位的核苷酸之间增加一个碱基G、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，命名为MtGA3ox1/+1bp-L11；MtGA3ox1/+1bp-L11基因的编码序列是将序列表中序列4的第331-332位的核苷酸之间增加一个碱基G、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MtGA3ox1/+1bp-L11【图3中Mt GA3ox1-11】。

实施例2、紫花苜蓿MsGA3ox1基因敲除突变体的获得及表型检测

1、紫花苜蓿MsGA3ox1基因CRISPR/Cas9系统载体构建

1.a、基因编辑靶点设计

紫花苜蓿含有编码序列(CDS)是序列表中序列3所示的MsGA3ox1编码基因，编码氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质MsGA3ox1。

通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表，选择靶点1为5′-ACACCATCCGGGGAACGAA-3，靶点2为5′-AAGCCATTCGTTCCCCGGA-3′。

1.b、sgRNA模块构建

由华大基因公司合成引物MsGA3ox1-BsF，MsGA3ox1-F0，MsGA3ox1-R0和MsGA3ox1-BsR。

通过搭桥PCR进行p5CBC-Target扩增反应，扩增得到带有靶点序列的sgRNA模块p5CBC-MsGA3ox1，反应体系如下：

将胶回收片段送样测序，p5CBC-MsGA3ox1的序列如序列表中序列5所示。SEQIDNo.5的第18-36位为MsGA3ox1的靶标1序列，第806-824位为MsGA3ox1的靶标2序列。

1.c、基因编辑双元载体构建

Golden Gate酶切连接反应：将带有靶点序列的p5CBC-MsGA3ox1片段和p6401载体通过Bsa I进行酶切，同时通过T4 DNALigase进行连接，构成p6401-MsGA3ox1(如图6)。具体反应体系如下：

反应完成后将产物加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃ 150rpm摇瓶培养45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。挑取单克隆至400μL含有Kanamycin(卡那霉素，50mg/L)的LB液体培养基中37℃ 230rpm摇瓶培养6～8h，随后进行菌液PCR鉴定，引物为MsGA3ox1-BsF和MsGA3ox1-BsR进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序验证。

测序结果表明p6401-MsGA3ox1是用片段p5CBC-MsGA3ox1第14-824位所示的碱基序列替换载体p6401的BsaI酶切割位点之间的片段，保持载体p6401的其他序列不变，得到的重组表达载体。p6401-MsGA3ox1表达靶向于MsGA3ox1基因的sgRNA1(靶标为靶点1)和sgRNA2(靶标为靶点2)的两个sgRNA。SEQID No.5的第18-36位为sgRNA1的编码序列，第806-824位为sgRNA2的编码序列。

2、紫花苜蓿MsGA3ox1基因敲除突变体的获得

2.1、转化农杆菌EHA105

挑取农杆菌EHA105单克隆菌落，接种于5mL YEP培养液，于28℃培养箱230rpm振荡培养过夜。将菌液按1:100比例转移至200mL YEP培养液，28℃，230rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6。菌液分别转移至2个已灭菌的250mL离心瓶，24℃，4000rpm离心10min，在超净台中弃去上清液，各加入150mL预冷的灭菌MilliQ水重悬沉淀，此步骤重复2-3次。4℃，5000rpm离心5min，在超净台弃去上清液，各加入2mL预冷的含10％甘油的MilliQ水，轻轻悬浮沉淀。每管200μl农杆菌悬浮液分装于1.5mL无菌eppendorf管中，液氮速冻后，冻存于-80℃。

在冰上融化的200μL EHA105感受态细胞中加入0.5μL(100ng/μL)p6401-MsGA3ox1质粒，轻轻吹打混匀。感受态转移至预冷的电击杯，经2100V电击后，立即加入500μL预冷的空白YEP液体培养基，吹打混匀后，将电击杯中的溶液转移至1.5mL离心管，28℃，200rpm振荡培养45min。移液枪吸取50μL菌液涂布于含50μg/mL Kan和75μg/mL利福平的YEP固体培养基上，28℃培养约48h。挑取YEP固体培养基上的单克隆菌落，接种于含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，230rpm振荡过夜培养。挑取克隆进行菌液PCR鉴定，引物为MsGA3ox1-BsF和MsGA3ox1-BsR，阳性克隆具有大小为841bp的特异性条带，检测结果表明，p6401-MsGA3ox1载体已经成功转化农杆菌EHA105，将重组根癌农杆菌命名为EHA105/p6401-MsGA3ox1用于下一步侵染。

2.2、EHA105/p6401-MsGA3ox1农杆菌侵染紫花苜蓿

按1:1000比例接种EHA105/p6401-MsGA3ox1至200mL YEP培养液(50μg/mL Kan和75μg/mL利福平)中，28℃，230rpm培养至OD_600nm为0.4。EHA105/p6401-MsGA3ox1菌液转移至无菌250mL离心瓶，24℃，4000g，离心10min，在超净台中弃去上清液，SM4(含100μM乙酰丁香酮)液体培养基重悬菌体，调整OD_600nm至0.2-0.4，作为侵染液。

将前一天采集的叶片浸泡于0.1％吐温20溶液，处理5min，转移至无菌空玻璃瓶，在超净台中用去离子水冲洗3次，转移至蓝盖瓶中。75％乙醇漂洗15s，弃去多余液体，加入30％漂白水，处理10min，去离子水漂洗3次。

将消毒后的叶片转移至无菌空玻璃瓶中，加入侵染液。抽真空5min，超声处理3min；抽真空5min。在超净台中去除侵染液，在滤纸除去叶片多余的液体，叶片吹干后，用刀片切成小块，叶片平铺于SM4固体培养基，室温黑暗培养3d。转移至SM4固体培养基(含200mg/L头孢和10mg/L潮霉素)，24℃光照培养，每2周转移到新的SM4培养基上，长出愈伤后，将愈伤组织转移至MSBK再生培养基(含200mg/L特美汀和10mg/L潮霉素)上生长2-3周后，转移至SH9培养基(含200mg/L头孢和5mg/L潮霉素)。生长出的植株转移至1/2MS培养基上，生根后，转移至温室培养，鉴定阳性苗。

2.3、MsGA3ox1基因敲除突变体植株的检测

DNA水平检测MsGA3ox1基因敲除突变体阳性植株。提取敲除突变体植株基因组DNA，以其作为模板，MsGA3ox1-BsF和MsGA3ox1-BsR作为引物进行扩增反应。野生型植株基因组DNA和ddH₂O为阴性对照。反应体系如下：

扩增反应程序为：第一轮：95℃变性5min；第二轮：94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；第三轮：72℃延伸10min。程序结束后，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果(图7中a)。以再生植株基因组DNA为模板，MsGA3ox1-F和MsGA3ox1-R为引物，进行扩增反应，切取扩增条带(如图7中b所示)，送华大基因公司进行测序，确定突变体突变方式(如图8所示)。

电泳检测结果如图7所示，图7中a为p6401-MsGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入紫花苜蓿所获得转基因植株鉴定结果，其中M示DNA标准分子量，WT示野生型材料，阳性对照“+”为质粒p6401-MsGA3ox1，阴性对照“-”为ddH₂O，序号1-7为遗传转化再生植株；如图7中a所示，可扩增出特异的p6401-MsGA3ox1载体片段(841bp)的植株即为转基因阳性植株，结果表明：3-7样品为转入p6401-MsGA3ox1载体的再生植株，1和2样品为未转入p6401-MsGA3ox1载体的再生植株。

图7中b为p6401-MsGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入紫花苜蓿所获得转基因植株靶标基因MsGA3ox1基因型鉴定结果；其中M示DNA标准分子量，WT示野生型材料，阴性对照“-”为ddH₂O，序号1-7为遗传转化再生植株，1-7样品均有扩增条带，结果表明1-7样品均为p6401-MsGA3ox1载体通过农杆菌EHA105介导转入紫花苜蓿所获得阳性转基因植株。

以再生植株基因组DNA为模板，MsGA3ox1-F和MsGA3ox1-R为引物，进行扩增反应，切取扩增条带(如图7中b所示)，送华大基因公司进行测序，确定突变体突变方式(如图8所示)。

3、MsGA3ox1基因敲除突变体表型检测

野生型和Msga3ox1-3，Msga3ox1-12和Msga3ox1-15 T₀代阳性植株扦插后获得的15株突变体植株进行全营养条件下表型检测(图9)。紫花苜蓿WT，Msga3ox1突变体材料在1/2MS培养条件下生长六周，统计植株株高和节间长度。与对照组植株相比，Msga3ox1突变体植株(图9中a和图9中b)株高降低(图9中c)，节间长度降低(图9中d)。野生型平均株高为28.9cm，突变株平均株高为3.0cm，平均株高降低了89.6％；野生型第一节间平均长度为0.9cm，突变体第一节间平均长度为0.4cm，降低了55.5％；野生型第二节间平均长度为2.6cm，突变体第二节间平均长度为0.7cm，降低了73.1％；野生型第三节间平均长度为4.6cm，突变体第三节间平均长度为0.8cm，降低了82.6％；野生型第四节间平均长度为5.6cm，突变体第四节间平均长度为0.5cm，降低了91.1％；野生型第五节间平均长度为6.1cm，突变体第五节间平均长度为0.4cm，降低了93.4％；野生型第六节间平均长度为5.6cm；野生型第七节间平均长度为3.6cm；野生型第八节间平均长度为1.7cm。突变体植株由于株高及节间长度较野生型降低，无第六、第七及第八节间。

外源施加0.1mM植物赤霉素4(GA₄)可使Msga3ox1突变体植株平均株高及平均节间长度恢复至野生型植株水平(图9中e)。

突变后的基因序列如下：

基因型为MsGA3ox1/-8bp/-8bp/-8bp/-36bp的四等位杂合突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，有三条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-8bp基因，MsGA3ox1/-8bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第350-357位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，命名为MsGA3ox1/-8bp-L3；MsGA3ox1/-8bp-L3基因的编码序列是将序列表中序列3的第350-357位的核苷酸共8个碱基缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/-8bp-L3；一条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-36bp基因，MsGA3ox1/-36bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第320-355位的核苷酸共36个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MsGA3ox1/-36bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第320-355位的核苷酸共36个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/-36bp【图8中MsGA3ox1-3】。

基因型为MsGA3ox1/-9bp/+1bp/+1bp/+1bp的四等位杂合突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，一条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-9bp基因，MsGA3ox1/-9bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第351-359位的核苷酸共9个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MsGA3ox1/-9bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第351-359位的核苷酸共9个碱基缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/-9bp；三条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/+1bp基因，MsGA3ox1/+1bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MsGA3ox1/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/+1bp【图8中MsGA3ox1-12】。

基因型为MsGA3ox1/+1bp/-8bp/-7bp/+1bp的四等位杂合突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，两条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/+1bp基因，MsGA3ox1/+1bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MsGA3ox1/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第350-351之间的核苷酸插入了一个碱基G、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/+1bp；一条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-8bp基因，MsGA3ox1/-8bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第351-358位的核苷酸共8个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，命名为MsGA3ox1/-8bp-L15；MsGA3ox1/-8bp-L15基因的编码序列是将序列表中序列3的第351-358位的核苷酸共8个碱基缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/-8bp-L15；一条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-7bp基因，MsGA3ox1/-7bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第351-357位的核苷酸共7个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MsGA3ox1/-7bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第351-357位的核苷酸共7个碱基缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/-7bp【图8中MsGA3ox1-15】。

基因型为MsGA3ox1/-72bp/-72bp/WT/WT的杂合体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，有两条染色体中MsGA3ox1基因突变为MsGA3ox1/-72bp基因，MsGA3ox1/-72bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)的第351-422位的核苷酸共72个碱基缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；MsGA3ox1/-72bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第351-422位的核苷酸共72个碱基缺失，保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，其编码的蛋白质为MsGA3ox1/-72bp；其它两条染色体在了紫花苜蓿基因组中MsGA3ox1编码序列(序列表中序列3)核苷酸序列不变，产生的MsGA3ox1/WT基因。需要说明的是，杂合突变体的表型与野生型没有明显差异，说明紫花苜蓿中MsGA3ox1的四等位突变对于其矮化表型是必须的。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> GA3ox1蛋白在调控苜蓿株型中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 377

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 1

Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Tyr Arg Ala His Pro Val His Val Asn

1 5 10 15

His Lys His Pro Asp Phe Asn Ser Leu Gln Glu Leu Pro Glu Ser Tyr

20 25 30

Thr Trp Thr His Leu Asp Asp His Thr Leu Ile Asn Ser Asn Asn Thr

35 40 45

Met Lys Glu Ser Ala Asn Ser Ser Ser Val Pro Ile Ile Asp Leu Asn

50 55 60

Asp Pro Asn Ala Ser Lys Leu Ile Gly His Ala Cys Lys Thr Trp Gly

65 70 75 80

Val Tyr Gln Val Val Asn His Gly Ile Pro Ile Ser Leu Leu Asp Glu

85 90 95

Ile Gln Trp Leu Gly Gln Thr Leu Phe Thr Leu Pro Ser His Gln Lys

100 105 110

Leu Lys Ala Ile Arg Ser Pro Asp Gly Val Ser Gly Tyr Gly Leu Ala

115 120 125

Arg Ile Ser Ser Phe Phe Pro Lys Leu Met Trp Ser Glu Gly Phe Thr

130 135 140

Ile Val Gly Ser Pro Leu Asp His Phe Arg Gln Leu Trp Pro Gln Asp

145 150 155 160

Tyr Ala Lys His Cys Asp Thr Val Leu Gln Tyr Asp Glu Ala Met Lys

165 170 175

Lys Leu Ala Gly Lys Leu Met Trp Leu Met Leu Asp Ser Leu Gly Ile

180 185 190

Thr Met Glu Asp Ile Glu Trp Ala Gly Ser Lys Ala Gln Phe Asp Glu

195 200 205

Lys Ala Cys Ala Ala Met Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Ser Cys Pro Asp

210 215 220

Pro Asp His Ala Met Gly Leu Ala Pro His Thr Asp Ser Thr Phe Leu

225 230 235 240

Thr Ile Leu Ser Gln Asn Asp Ile Ser Gly Leu Gln Val Gln Arg Glu

245 250 255

Gly Ser Gly Trp Val Asn Val Pro Pro Leu His Gly Gly Leu Val Val

260 265 270

Asn Val Gly Asp Leu Phe His Ile Leu Ser Asn Gly Leu Tyr Thr Ser

275 280 285

Val Leu His Arg Val Leu Val Asn Arg Thr Arg Gln Arg Phe Ser Val

290 295 300

Ala Tyr Leu Tyr Gly Pro Pro Ser Asn Val Glu Ile Cys Pro His Glu

305 310 315 320

Lys Leu Val Gly Pro Thr Gln Pro Pro Leu Tyr Arg Ser Val Thr Trp

325 330 335

Asn Glu Tyr Leu Gly Thr Lys Ala Lys His Phe Asn Lys Ala Leu Ser

340 345 350

Ser Val Ser Leu Cys Ala Pro Ile Asn Gly Leu Phe Asp Val Asn Asp

355 360 365

Ser Asn Lys Ser Ser Val Gln Val Gly

370 375

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 2

Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Tyr Arg Ala His Pro Val His Val Asn

1 5 10 15

His Lys His Pro Asp Phe Asn Ser Leu Gln Glu Leu Pro Glu Ser Tyr

20 25 30

Thr Trp Asn His Leu Asp Asp His Thr Leu Ile Lys Glu Gly Thr Thr

35 40 45

Ser Ser Ile Val Pro Val Ile Asp Leu Asn Asp Pro Asn Ala Ser Lys

50 55 60

Leu Ile Gly His Ala Cys Lys Thr Trp Gly Val Tyr Gln Val Val Asn

65 70 75 80

His Gly Ile Pro Ile Ser Leu Leu Asp Glu Ile Gln Trp Leu Gly Gln

85 90 95

Thr Leu Phe Thr Leu Pro Ser His Gln Lys Leu Lys Ala Ile Arg Ser

100 105 110

Pro Asp Gly Val Ser Gly Tyr Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Phe Phe

115 120 125

Pro Lys Leu Met Trp Ser Glu Gly Phe Thr Ile Val Gly Ser Pro Leu

130 135 140

Asp His Phe Gln Gln Leu Trp Pro Gln Asp Tyr Ala Lys His Cys Asp

145 150 155 160

Thr Val Leu Gln Tyr Asp Glu Ala Met Lys Lys Leu Ala Gly Lys Leu

165 170 175

Met Trp Leu Met Leu Asp Ser Leu Gly Ile Thr Met Glu Asp Ile Lys

180 185 190

Trp Ala Gly Ser Lys Ala Gln Phe Asp Glu Lys Ala Cys Ala Ala Met

195 200 205

Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Ser Cys Pro Asp Pro Asp His Ala Met Gly

210 215 220

Leu Ala Pro His Thr Asp Ser Thr Phe Leu Thr Ile Leu Ser Gln Asn

225 230 235 240

Asp Ile Ser Gly Leu Gln Val Gln Arg Glu Gly Ser Gly Trp Val Thr

245 250 255

Val Pro Pro Leu His Gly Gly Leu Val Val Asn Val Gly Asp Leu Phe

260 265 270

His Ile Leu Ser Asn Gly Leu Tyr Thr Ser Val Leu His Arg Val Leu

275 280 285

Val Asn Arg Thr Arg Gln Arg Phe Ser Val Ala Tyr Leu Tyr Gly Pro

290 295 300

Pro Ser Asn Val Glu Ile Cys Pro His Glu Lys Leu Val Gly Pro Thr

305 310 315 320

Gln Pro Pro Leu Tyr Arg Ser Val Thr Trp Asn Glu Tyr Leu Gly Thr

325 330 335

Lys Ala Lys Tyr Phe Asn Lys Ala Leu Ser Ser Val Ser Leu Cys Ala

340 345 350

Pro Ile Asn Gly Leu Phe Asp Val Asn Asp Ser Asn Lys Ser Ser Val

355 360 365

Gln Val Gly

370

<210> 3

<211> 1134

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 3

atgccttcac tctcagaagc ctatagagct catccggtgc atgttaacca caagcaccct 60

gatttcaact cactacaaga acttcctgaa tcatacactt ggacacacct tgatgatcac 120

acccttatta attccaataa tactatgaag gagagtgcta atagtagtag tgttcccata 180

attgatctca atgacccaaa tgcttcaaag ttaataggac atgcatgcaa aacatggggt 240

gtgtatcaag tggtgaacca tggcatccca ataagcctcc ttgatgaaat tcaatggctt 300

ggacaaactc tcttcaccct tccctctcac caaaaactca aagccattcg ttccccggat 360

ggtgtttcag gttatggcct cgctcgcatc tcctccttct tccccaaact catgtggtcc 420

gagggattta ccatcgttgg atcccctctt gatcattttc gacaactttg gcctcaagat 480

tatgccaaac actgtgatac tgtcttgcaa tatgatgaag ccatgaaaaa gttagcgggg 540

aaactaatgt ggctaatgtt ggactctctt ggtattacaa tggaagatat cgaatgggct 600

ggctcaaaag cccaatttga tgagaaagcc tgtgcagcca tgcaactcaa ctcctaccct 660

agttgtccgg atccggatca cgccatgggt ctcgccccgc acacggactc aacatttcta 720

acgatccttt cccaaaatga cataagcggg ttgcaagttc aacgagaagg ttccgggtgg 780

gtcaatgtac ccccactcca tggaggactc gtggtcaacg taggcgacct attccacatt 840

ttgtcgaacg gattgtacac aagtgtgctc catcgggttt tagtgaaccg aactcgtcag 900

aggttttcgg ttgcgtattt gtatgggccc ccatcaaatg tagagatttg tccacatgag 960

aaattagtag gcccaacaca acctcccctt tataggtcag tgacttggaa tgagtacctt 1020

ggcacaaaag caaagcattt caacaaagca ctctcatccg ttagtctttg tgcacctatt 1080

aacggtttgt ttgatgtaaa cgactctaac aaaagtagtg tgcaagtggg ttaa 1134

<210> 4

<211> 1116

<212> DNA

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 4

atgccttcac tctcagaagc ttatagagct caccctgtgc atgttaacca caagcaccct 60

gatttcaatt cactacaaga acttcctgaa tcttacactt ggaaccacct tgatgatcac 120

acccttatta aggagggtac tactagtagt attgttcccg ttattgatct caatgaccca 180

aatgcttcaa agttaatagg acatgcatgc aaaacatggg gtgtgtatca agtggtgaac 240

catggcatcc caataagcct ccttgatgaa attcaatggc ttggacaaac tctcttcacc 300

cttccctctc accaaaaact caaagccatt cgttccccag atggtgtttc gggctatggc 360

ctcgctcgca tatcctcctt cttccccaaa ctcatgtggt ccgagggatt taccatcgtt 420

ggatcccctc ttgatcattt tcaacaactt tggcctcaag attatgccaa acactgtgat 480

actgtcttgc aatatgatga agccatgaaa aagttagcag ggaaactaat gtggctaatg 540

ttggactctc ttggtattac aatggaagat atcaaatggg ctggctcaaa agcccaattt 600

gatgaaaaag cctgtgcagc catgcaactc aactcctacc caagttgtcc ggatccggat 660

cacgccatgg gtctcgcccc gcacacggac tcaacatttc taacgatcct ttctcaaaat 720

gacataagcg ggctgcaagt tcaacgagag ggttccgggt gggtcactgt gcccccgctc 780

cacggaggac tcgtggtcaa cgtaggcgac ctattccaca ttttgtcgaa cggattgtac 840

acaagtgtgc tccatcgggt tttagtgaac cgaacccgtc agaggttttc ggttgcttat 900

ttgtatgggc ccccttccaa tgtagagatt tgtccacatg agaaattagt aggcccaaca 960

caacctcccc tttataggtc agttacttgg aatgagtacc ttggcacaaa agcaaagtat 1020

ttcaacaaag cactctcatc cgttagtctt tgtgcaccta ttaacggttt gtttgatgta 1080

aacgactcta acaaaagtag tgtgcaagtg ggttaa 1116

<210> 5

<211> 841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatatggtc tcgcttgaca ccatccgggg aacgaagttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180

ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240

tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300

aatagagtgt cgttttagta aaaaaaatta ttttaaaatg aatatcatca cttttcaata 360

tagaattatt attttacttc caattatacc ctctaattaa tttccaaagc attataccaa 420

tagtaaataa agttagttta gtaaaattgt catatctttt aacattatta ttagatttct 480

taatttgtgt ttaaaagctt taaacgatga tcatttttaa acagagagta taaagtagta 540

aaatagtact attagaaatg aattgacgtg acatgctatg aaaagtctgg aagagtatcg 600

ataaaaggct acactagagg tagctactta tatgcgcagg aactgaaatc aaaaatgaaa 660

taaaggagaa ggaagatgca tgttgtgtta tataagtgaa ggagaaggac ttgcatgttg 720

tgttatattt gcttgtttta gtcccacatc gactgaaaca gaaagtatct cggcgtttat 780

atactacaag cgaaccatta aattgaagcc attcgttccc cggagtttcg agaccaataa 840

t 841

<210> 6

<211> 841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atatatggtc tcgcttgaca ccatctgggg aacgaagttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180

ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240

tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300

aatagagtgt cgttttagta aaaaaaatta ttttaaaatg aatatcatca cttttcaata 360

tagaattatt attttacttc caattatacc ctctaattaa tttccaaagc attataccaa 420

tagtaaataa agttagttta gtaaaattgt catatctttt aacattatta ttagatttct 480

taatttgtgt ttaaaagctt taaacgatga tcatttttaa acagagagta taaagtagta 540

aaatagtact attagaaatg aattgacgtg acatgctatg aaaagtctgg aagagtatcg 600

ataaaaggct acactagagg tagctactta tatgcgcagg aactgaaatc aaaaatgaaa 660

taaaggagaa ggaagatgca tgttgtgtta tataagtgaa ggagaaggac ttgcatgttg 720

tgttatattt gcttgtttta gtcccacatc gactgaaaca gaaagtatct cggcgtttat 780

atactacaag cgaaccatta aattgaagcc attcgttccc cagagtttcg agaccaataa 840

t 841

Claims

1.调控蛋白质活性或含量的物质或调控基因的表达的物质在调控苜蓿株型中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质为MsGA3ox1或MtGA3ox1；

所述MsGA3ox1是氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

所述MtGA3ox1是氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述MsGA3ox1的编码基因是编码链的编码序列为序列表中序列3的DNA分子；

所述MtGA3ox1的编码基因是编码链的编码序列为序列表中序列4的DNA分子；

所述调控蛋白质活性或含量的物质或调控基因的表达的物质为抑制或降低所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性的核酸分子；

所述核酸分子为表达靶向所述基因的gRNA的DNA分子或为靶向所述基因的gRNA；

所述gRNA包括sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1的靶标序列是序列表中序列3的第347-365位所示核苷酸的反向互补序列，所述sgRNA2的靶标序列是序列表中序列3的第341-359位所示核苷酸序列；

或，

所述sgRNA1的靶标序列是序列表中序列4的第329-347位所示核苷酸的反向互补序列，所述sgRNA2的靶标序列是序列表中序列4的第323-341位所示核苷酸序列。

2.表达权利要求1中所述sgRNA1和sgRNA2的表达盒在调控苜蓿株型中的应用。

3.表达权利要求1中所述sgRNA1和sgRNA2的重组载体或含有权利要求2中所述表达盒的重组载体在调控苜蓿株型中的应用。

4.表达权利要求1中所述sgRNA1和sgRNA2的重组微生物或含有权利要求2中所述表达盒的重组微生物或含有权利要求3中所述重组载体的重组微生物在调控苜蓿株型中的应用。

5.表达权利要求1中所述sgRNA1和sgRNA2的转基因植物细胞系或含有权利要求2中所述表达盒的转基因植物细胞系或含有权利要求3中所述重组载体的转基因植物细胞系在调控苜蓿株型中的应用。

6.一种权利要求2中所述的表达盒。

7.一种权利要求3中所述的重组载体。

8.一种权利要求4中所述的重组微生物。