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CN118526602B - 一种新型多肽药物及制备方法和应用 - Google Patents

一种新型多肽药物及制备方法和应用 Download PDF

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CN118526602B CN202410418339.7A CN202410418339A CN118526602B CN 118526602 B CN118526602 B CN 118526602B CN 202410418339 A CN202410418339 A CN 202410418339A CN 118526602 B CN118526602 B CN 118526602B
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Abstract

本发明公开了一种新型多肽药物及制备方法和应用，属于生物医药技术领域，所述多肽药物包括通过酰胺键依次连接的靶向模块R4、长滞留模块R3、自组装模块R2和疏水模块R1；其中，R4来自于PCSK9靶向肽；R3来自于聚乙二醇酯二硬脂酸酯；R2来自于多重氢键多肽序列；R1来自于C10‑C20烷基羧酸。本发明利用新型多肽药物特异性识别PCSK9蛋白的特点，在多重氢键的作用下，在PCSK9蛋白表面形成纳米纤维网络，通过多价键协同作用更好地结合PCSK9蛋白，竞争性地抑制PCSK9蛋白与LDLR的结合，减少LDLR的降解，从而起到防治高胆固醇血症的作用，这为改善或治疗高胆固醇血症提供了新思路和新方法。

Description

一种新型多肽药物及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型多肽药物及制备方法和应用。
背景技术
大量的遗传学和临床研究证实，高水平的循环低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的发生和发展有关，而动脉粥样硬化性心血管疾病是全球所有死亡的主要原因。因此，学术界和工业界的科学家非常重视开发降低低密度脂蛋白胆固醇水平的治疗方法来治疗高胆固醇血症。多年来，他汀类药物一直是降低低密度脂蛋白水平和心血管事件的一线治疗药物。虽然它们非常有效，但由于肌肉毒性、胃肠道症状和肝酶升高等副作用，并且他汀类药物往往不能将很大一部分患者的胆固醇水平降低到预期水平(～50％)，所以具有一定局限性。在本世纪头十年，原蛋白转换酶枯草杆菌/kexin 9型(PCSK9)已成为降低低密度脂蛋白水平的新靶点，对他汀类不耐受、禁忌者或接受最大耐受剂量后LDL-C水平仍控制不佳者，PCSK9抑制剂使血脂达标成为可能，无疑为这些人群带来福音，因其良好的降脂作用及较低的用药频率成为治疗高胆固醇血症的新选择。
公布号为CN104529910B的一种可以降低PCSK9蛋白量的化合物及其制备方法，提供了光学活性二苄胺衍生物，可降低PCSK9蛋白量、增加LDL受体量，还显示出优异的血中LDL胆固醇降低作用，因此可以用于降低血脂药物的有效成分。
公布号CN105431447A的一种PCSK9的小分子调节剂和其使用方法，该申请中的小分子可以抑制PCSK9，并且评估了其与增加PCSK9表达的他汀类药物联用的效应，结果显示出他汀+PCSK9抑制剂对高LDL-C有着更佳的治疗效果。
然而综合来看，目前抑制PCSK9治疗高胆固醇血症的多肽药物依旧较少。因此，开发一种成本以及安全性等方面具有更大优势的PCSK9靶向药物是非常有意义的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型多肽药物及制备方法和应用，以解决目前治疗高胆固醇血症、高胆固醇症的多肽药物较少的问题。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型多肽药物，所述多肽药物包括通过酰胺键依次连接的靶向模块R4、长滞留模块R3、自组装模块R2和疏水模块R1；
其中，R4来自于PCSK9靶向肽；R3来自于聚乙二醇酯二硬脂酸酯；R2来自于多重氢键多肽序列；R1来自于C10-C20烷基羧酸。
进一步地，所述烷基羧酸的烷基链为直链，且烷基羧酸的烷基链的碳数为16，所述R1为正十六烷酸。
进一步地，所述多重氢键多肽序列包括FFVLK或DFFPL。
进一步地，所述聚乙二醇酯二硬脂酸酯为二硬脂酸酯PEG-4。
进一步地，所述PCSK9靶向肽为小肽段Pep2-8：TVFTSWEEYLDWV。
进一步地，一种新型多肽药物的制备方法，所述方法为：以末端氨基和侧链氨基均得到保护的氨基酸，及C10-C20烷基羧酸为原料，通过固相合成法，合成治疗高胆固醇血症的多肽药物。
进一步地，所述药物的活性成分为通过酰胺键依次连接的正十六烷酸、多肽序列FFVLK、PEG4和多肽序列TVFTSWEEYLDWV。
进一步地，所述药物的剂型为药剂学上可接受的任意一种剂型；所述药物还包括药剂学上可接受的药用辅料，所述药用辅料包括填充剂、赋形剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
进一步地，一种新型多肽药物，用于治疗高胆固醇血症。
进一步地，一种新型多肽药物，用于治疗高胆固醇症。
本发明的有益效果在于：
本发明利用新型多肽药物特异性识别PCSK9蛋白的特点，在多重氢键的作用下，在PCSK9蛋白表面形成纳米纤维网络，通过多价键协同作用更好地结合PCSK9蛋白，竞争性地抑制PCSK9蛋白与LDLR的结合，减少LDLR的降解，从而起到防治高胆固醇血症的作用，这为改善或治疗高胆固醇血症提供了新思路和新方法。
本发明的其他优点、目标和特征将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上对本领域技术人员而言是显而易见的，或者本领域技术人员可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例1制得的治疗高胆固醇血症的多肽药物的化学结构式；
图2为实施例1制得的治疗高胆固醇血症的多肽药物的质谱表征图；
图3为实施例2中NSP与PCSK9蛋白共孵育后的扫描电子显微镜表征图；
图4为实施例2中NSP与PCSK9蛋白共孵育后的荧光发射光谱表征图；
图5为实施例3中NSP被Cy5标记后与FITC标记的PCSK9蛋白结合的激光共聚焦结果图；
图6为实施例4中NSP和Pep2-8与分别与HepG2细胞共孵育后LDLR的蛋白质印记结果图；
图7为实施例5中C57BL/6小鼠分别接受PBS和NSP处理后肝脏LDLR的蛋白质印记结果图。
具体实施方式
实施例1
实施例1用于构建一种新型多肽药物(以下可简称为NSP)，用于治疗高胆固醇血症，所述防治高胆固醇血症的自组装成材料化学式为：
CH3(CH2)14CO-FFVLK-PEG4-TVFTSWEEYLDWV
所述多肽药物的制备方法为：采用多肽固相合成法，选用Wang树脂的修饰密度为0.33的Fmoc保护的缬氨酸作为起始原料，按序列逐个添加氨基酸的方式合成所述的NSP多肽。
对制得的多肽用质谱进行表征，质谱表征结果如图2所示，由图2可知：通过质谱图的主峰可以看出和设计时的多肽材料分子量一致，由此表明如上式结构的多肽成功合成。
实施例2
实施例2用于制备多肽溶液：
将NSP多肽溶于DMSO溶剂中(浓度为20mM)，取10μL上述溶液于990μL去离子水中，吹打混匀并斡旋30秒，得多肽溶液。
将多肽溶液用去离子水稀释成浓度为30μM后，加入PCSK9蛋白(蛋白浓度为1×10-7M)，并分别在0h、4h、8h、12h、24h时用扫描电镜对多肽的形貌转化进行表征，结果如图3所示，由图3可以看出多肽随时间的变化由颗粒状变为纤维状。
分别在0h、0.5h、2h、4h、6h与硫磺素T荧光探针共孵育2h后进行荧光表征，表征结果如图4所示，随着时间的增加482nm左右荧光信号的增强，表明THT结合多肽形成的反平行β-折叠原纤维增多，证明纳米纤维的存在。
实施例3
实施例3用于探究多肽药物与PCSK9的结合情况：
采用Cy5标记实施例1制得的NSP，然后与FITC标记的PCSK9蛋白共孵育。
在共孵育12h后进行激光共聚焦拍摄，观察两种材料的共定位的情况。
测试结果如图5所示，二者的皮尔逊相关系数为0.7974，表明多肽药物可以靶向结合PCSK9蛋白。
实施例4
实施例4用于探究多肽药物对LDL受体的增加作用：
采用HepG2细胞为模型，在含10％的胎牛血清和100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，CO2的浓度为5％。
将HepG2细胞接种于六孔板，过夜培养；次日细胞贴壁后，弃去旧培养基，更换为加入了NSP或Pep2-8(50μM)的新鲜培养基。
细胞与材料分别孵育4h、8h、12h、24h后将细胞裂解后提取蛋白进行凝胶电泳实验，转膜封闭后与一抗(LDLR)在4℃下过夜孵育，TBST清洗3次，二抗常温孵育1h，TBST清洗三次后显色。
印记结果如图6所示，NSP可以增加LDL受体并且比Pep2-8有更好的时间持续性。
实施例5
实施例5用于探究多肽药物体内对LDL受体的增加作用：
将6周龄雌性C57BL/6健康小鼠分为PBS组和NSP组，小鼠按照10mg/kg剂量尾静脉注射给药，每天2次，连续3天。
最后一次给药后两小时处死小鼠，取出肝脏后加裂解液研磨提取蛋白进行Western Blot实验。
印记结果如图7所示，NSP可显著增加小鼠肝脏LDL受体的表达。
本发明通过实施例1-实施例5的设计、合成和表征新型多肽药物，发现NSP可以特异性识别PCSK9蛋白并通过多价键协同作用更好地结合PCSK9蛋白，竞争性地抑制PCSK9蛋白与LDLR的结合。NSP在体外和体内都能增加LDLR的恢复，以实现PCSK9的高效抑制和血清LDLC的下调，因此可以用作于治疗高胆固醇血症的多肽药物。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种多肽药物，其特征在于：所述药物的活性成分为通过酰胺键依次连接的正十六烷酸、多肽序列FFVLK、PEG4和多肽序列TVFTSWEEYLDWV。
2.根据权利要求1所述的一种多肽药物，在制备治疗高胆固醇血症药物中的应用。
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