CN118524848A - 粘膜疫苗、其应用和给药方法 - Google Patents

Abstract

一种对受试者进行疫苗接种以抵抗呼吸道病毒感染的方法，包括同时或分别向有需要的受试者施用编码呼吸道病毒抗原的一种或多种多核苷酸载体和一种或多种雾化呼吸道病毒抗原，以在受试者中诱导针对呼吸道病毒感染的粘膜免疫反应。另一方面，本申请提供了一种粘膜疫苗试剂盒，其包含编码呼吸道病毒抗原的一种或多种多核苷酸载体、以及一种或多种雾化呼吸道病毒抗原。

Description

粘膜疫苗、其应用和给药方法

发明领域

本申请涉及用于疫苗免疫的药物组合物，尤其涉及用于诱导对病原体的粘膜免疫反应的组合物和方法。

发明背景

粘膜表面是巨大的表面区域，容易受到病原微生物的感染。诱导粘膜免疫反应最有效的方式是将疫苗施用到粘膜表面来最有效地诱导粘膜免疫反应，而注射疫苗对粘膜免疫的诱导效果通常较差，因此对抗粘膜表面感染的效果较差。由于粘膜分泌物中的抗体难以捕获和定量，同时粘膜T细胞的回收和功能测试工作量较大、并且技术上具有挑战性，导致无法对粘膜疫苗实际进入体内的剂量进行准确测量。因此，在美国或其他地方，只有少数粘膜疫苗获批用于人类。

对新的粘膜疫苗及其使用方法的需求仍然存在。

发明概述

本申请的一个方面是用于治疗或预防受试者呼吸道病原体感染症状的方法，包括步骤(1)向受试者施用有效量的初免组合物，所述初免组合物包含编码呼吸道病原体蛋白抗原的基于核酸的表达系统；(2)向受试者施用有效量的包含呼吸道病原体蛋白抗原的加强组合物，其中所述初免组合物通过非粘膜途径施用至受试者，并且其中所述加强组合物通过粘膜途径施用。在某些实施方案中，呼吸道病原体是呼吸道合胞病毒(RSV)。

本申请的另一个方面是粘膜疫苗试剂盒，其包含：(a)包含呼吸道病毒基因的多核苷酸载体，该基因可操作地连接一个用于表达由所述基因编码的呼吸道病原体蛋白的启动子，其中所述初免组合物被配制用于肌肉注射，并且其中所述呼吸道病毒是RSV，所述呼吸道病原体蛋白是RSV蛋白；(b)一种或多种加强组合物，其中所述一种或多种加强组合物中的每一种包含呼吸道病原体蛋白和一种或多种佐剂，其中所述加强组合物被配制用于鼻内给药，并且所述呼吸道病原体蛋白是RSV蛋白；和(c)一种或多种药学上可接受的载体，其中所述初免组合物中的多核苷酸载体编码与所述一种或多种加强组合物中相同RSV蛋白。

本申请的另一方面是RSV粘膜疫苗，其包含：(a)有效量的RSV pre-F蛋白；和(b)粘膜疫苗佐剂，其包含一种或多种CpG、含或不含MPL，其中所述疫苗被配制用于鼻内给药。

本申请的另一个方面涉及RSV的疫苗接种试剂盒，其包含疫苗组合物，所述疫苗组合物包含(a)RSV pre-F蛋白和(b)佐剂，其中所述疫苗(a)任选地配制成用于鼻内递送的加强组合物；(c)单独的CpG 7909或CpG 7909和单磷酰脂质A(MPL)，和(d)一种或多种药学上可接受的载体。

附图简要说明

图1显示了示例性RSV疫苗研究中动物组的总结。

图2是RSV疫苗研究中的免疫和攻毒研究设计的汇总表。

图3显示了RSV攻毒前RSV疫苗的免疫原性。图A显示各组动物的血清IgG抗体水平。图B显示各组动物的IgG应答峰值。

图4显示RSV活病毒经鼻攻击后5天的RSV病毒滴度。图A显示各组动物的肺部病毒滴度。图B显示了每个动物组中的鼻病毒滴度。

图5显示各组动物第0天、第28天和第49天的中和抗体(Nab)滴度。

图6显示了各组动物鼻内RSV攻击后5天的组织病理学评分，包括毛细支气管周围炎(图A)、血管周围炎(图B)、间质性肺炎(图C)和肺泡炎(图D)的组织学评分。

图7显示了另一角度的组织病理学评分，关于图6中各组动物关于细支气管周围炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎的组织病理学评分。

图8显示了鼻内RSV攻毒后鼻腔和肺部IgA和IgG应答。图A显示各组动物的鼻腔IgA水平。图B显示各组动物的肺部IgA水平。图C显示各组动物的鼻腔IgG水平。图D显示各组动物的肺部IgG水平。

图9显示了RSV攻毒后肺部RSV NS1的mRNA表达水平。

图10显示了NTV8385-VA1-RSV-F-A2，DS-Cav1的载体图谱。

图11显示了NTV8385-VA1-RSV-F-A2，DS-Cav1的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。

图12显示了密码子优化的RSV-F-A2核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。

虽然现在将结合示例性实施例详细描述本公开，但是本公开不限于附图和所附权利要求中所示的特定实施例。

发明详述

将详细参考本申请的某些方面和示例性实施例，在所附结构和附图中举例说明。将结合示例性实施例来描述本申请的各方面，包括方法、材料和实例，这样的描述是非限制性的，并且本申请的范围旨在包括所有等价物、替代物和修改，这些等价物、替换物和修改或者是公知的，或者被并入本文。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本领域技术人员将认识到许多与此处描述的技术和材料相似或等效的技术和物质，这些技术和物质可用于本申请的各方面和实施例的实践中。本申请的所描述的方面和实施例不限于所描述的方法和材料。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非内容另有额外规定。

申请人出乎意料地发现，上述方案对于在具有或不具有对呼吸道病原体(如RSV)的预先存在的免疫力的受试者中诱导预防性免疫应答特别有效。

本申请的粘膜疫苗诱导由体液免疫、T细胞免疫和粘膜免疫组成的协同免疫应答。具体来说，该疫苗可刺激高滴度的鼻腔和肺部抗原特异性IgG和IgA抗体、Th1型免疫应答以及高滴度的血清抗原特异性IgG。因此，本申请提供了用于在受试者(例如哺乳动物或人)中引发针对呼吸道病原体(例如RSV)的预防性和/或治疗性免疫应答的方法。

本申请的疫苗组合物和方法提供了一种特异性靶向微生物最常见的入口——身体粘膜表面的手段。本发明通过将蛋白抗原等免疫原性成分直接递送至粘膜表面来提供更有效的疫苗组合物。通过采用本文所述的适当的免疫方案，可以调整免疫应答，以提供更有效和特异性的疫苗。在优选的实施方案中，疫苗组合物的施用产生平衡的或辅助性T细胞1(Th1)偏向性免疫应答，其还包括强大的抗体应答、CTL产生和Th1型细胞因子产生、以及粘膜部位的局部免疫。

如实施例中所示，施用本申请的初免和加强组合物不仅导致CTL应答的诱导，而且导致强烈的粘膜免疫反应。具体地，与感染呼吸道病原体的未治疗受试者或接种非粘膜疫苗的感染受试者相比，在施用初免和加强组合物后，感染呼吸道病原体受试者中可以减少或完全阻止病毒脱落减少。与感染呼吸道病原体的未治疗受试者或接种非粘膜疫苗的感染受试者相比，在施用初免和加强组合物后，感染呼吸道病原体的受试者中抗原特异性IgAs和IgGs增加。

此外，与感染呼吸道病原体的未治疗受试者或接种可诱导明显肺部病理的非粘膜疫苗或福尔马林灭活疫苗的感染受试者相比，在施用初免和加强组合物之后感染呼吸道病原体的受试者中组织病理学评分降低。组织病理学评分可以基于许多示例性病理学状况，包括但不限于细支气管周围炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎。

定义和术语

本文中使用的下列术语应具有以下含义：

术语“空气传播的病原体”是指能够通过空气传播的任何病原体，并且包括通过载体材料在空气中传播的病原体和人工雾化的或自然存在于空气中的病原体。

如本文所用，短语“呼吸道病原体感染”是指由空气传播的病原体例如病毒、细菌、真菌或原生动物传播的感染。

如本文所用，术语“预防性”是指预防感染、延迟感染、抑制感染和/或降低病原体感染的风险，并且包括暴露于病原体之前和之后。所述预防作用尤其可以涉及降低病原体进入身体的能力，或者可以涉及在病原体引发或引起感染或疾病之前从身体去除到达体内气道和气道表面的全部或部分病原体。可全部或部分去除病原体的气道包括所有身体气道和具有粘膜表面的气道表面，包括肺部的气道表面。

术语“免疫应答”是指B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN)等免疫系统的细胞对刺激例如抗原或疫苗的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御反应的机体的任何细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性和/或适应性免疫应答。测量免疫应答的方法是本领域众所周知的，包括例如测量淋巴细胞(例如B或T细胞)的增殖和/或活性、测量细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。

如本文所用，“预防性免疫”和“预防性免疫应答”是指针对感染原的免疫状况或引发免疫应答(例如，预防性地)，从而减少、消除或减少感染的严重程度或至少一种由传染源引起的疾病症状的持续时间。

术语“粘膜免疫应答”是指脊椎动物受试者的粘膜组织中的免疫应答。粘膜免疫应答可以包括在脊椎动物受试者的粘膜施用部位或远离根据本申请的抗原或抗原-佐剂组合物的粘膜施用部位的远端粘膜部位的粘膜组织中产生IgAs，特别是分泌性IgAs。

术语“保护性免疫反应”和“保护性免疫力”是指受试者的免疫系统可以促进受试者免受感染(例如，防止感染或防止与感染相关的疾病发展)或疾病状态或病原体脱落的免疫反应或免疫状态，其特征是存在一种或多种通常对宿主外来的抗原。

术语“抗原”是指能够引发免疫应答并产生针对其的特异性抗体(体液应答)或细胞毒性T淋巴细胞(细胞介导的应答)的物质或分子。因此，抗原能够被免疫系统的组分(例如抗体或淋巴细胞)识别。抗原可以小至单个表位，也可以更大，并且可以包括多个表位。因此，抗原的大小可以小至约5-12个氨基酸(例如，肽)，大至：部分蛋白、全长蛋白，包括多聚体和融合蛋白、嵌合蛋白、或激动剂蛋白或肽。此外，抗原可以包括碳水化合物。

术语“免疫原性”是指由抗原或免疫原的表位的存在触发的反应。术语“表位”是指足以引发免疫应答的抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，从而引发特异性免疫应答，例如，表位是B和/或T细胞应答的抗原区域。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。本领域技术人员将认识到，T细胞表位在大小和组成上不同于B细胞表位，并且通过I类MHC途径呈递的表位不同于通过II类MHC途径呈递的表位。

术语“疫苗”是指在疫苗的接受者或宿主中诱导免疫应答的组合物。本申请披露的疫苗是包含一种或多种蛋白抗原或其免疫原性表位与编码一种或多种蛋白抗原或其免疫原性表位的一种或多种核酸表达载体以及一种或多种佐剂的组合物。因此，疫苗包括与蛋白质(或亚基)疫苗和一种或多种佐剂组合的DNA疫苗。疫苗可以作为单一剂型或以一系列制剂共同施用。疫苗可以在接受者中诱导针对一种或多种抗原的体液(例如中和抗体)应答、针对一种或多种抗原的细胞介导的免疫反应(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTLj))反应、或两者，从而提供针对例如当前或随后的微生物感染或疾病状况的部分或完全保护，所述疾病状况的特征在于存在例如由于感染而在受试者中表达的一种或多种抗原。

术语“粘膜疫苗”是指针对呼吸道病原体并通过粘膜途径施用于受试者的疫苗或其组分。

术语“非粘膜疫苗”是指针对呼吸道病原体并通过粘膜途径以外的途径施用给受试者的疫苗或其组分。

术语“疫苗接种”是指给予抗原性物质以刺激个体的免疫系统以产生针对宿主中含有非天然抗原的病原体或宿主细胞的适应性免疫。疫苗接种可以预防或改善与微生物感染或与疾病(例如癌症)相关的抗原或表位特异性细胞相关的一种或多种症状；和/或减轻与前述疾病状况相关的一种或多种症状的严重程度或频率。

术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的、但在不存在抗原的情况下施用时本身不具有抗原性的物质。佐剂可以通过多种机制增强免疫应答，包括例如淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞、刺激树突细胞和/或刺激巨噬细胞。

术语“免疫”是指例如通过疫苗接种为受试者提供免受感染性疾病或疾病状态的保护。

术语“保护”、“免疫保护”和“保护性反应”可互换使用，以表达对宿主中的后续感染、活动性感染或某些疾病状况的部分或完全抗性。接种疫苗的宿主中产生的中和抗体可以提供这种保护。在其他情况下，CTL反应可以提供这种保护。在某些情况下，中和抗体和细胞介导的免疫(例如CTL)应答都提供了这种保护。

术语“对照受试者”是指与接种疫苗的个体年龄大致相同的未免疫个体(以确保接种疫苗的个体和对照个体中的疫苗接种效果是可比较的)。受试者可以是非人类动物、哺乳动物或人类。接受疫苗接种的人类受试者(也称为“患者”或“个体”)可以是胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人。非人类哺乳动物受试者包括例如家养动物、实验动物、农场动物、圈养野生动物和最优选的人类。

术语“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，否则这些术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语“多核苷酸”或“多核苷酸序列”也可以与基因、开放阅读框(ORF)、cDNA、基因编码的mRNA和表达蛋白质的mRNA互换使用。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，是指20种蛋白质氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，无论其大小或功能如何。尽管“蛋白质”通常用于指代相对较大的多肽，并且“肽”通常用于指代较小的多肽，但本领域中这些术语的用法是交叠和变化的。除非另有说明，否则本文所用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质。当提及基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其他等同物、变体和类似物。

术语“变体”是指与参考蛋白质或多肽有一个或多个氨基酸不同，例如一个或多个氨基酸取代，但基本上保持参比蛋白或多肽的生物学功能的蛋白质或多肽。术语“变体”还包括保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指包含通过一个或多个保守氨基酸取代与参考肽不同的氨基酸残基序列的肽，并且保留了本文所述的参考肽的一些或全部活性。“保守氨基酸取代”是用功能相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包括用一个非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个残基；一个带电荷或极性(亲水性)残基替换为另一种残基，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、苏氨酸和丝氨酸之间；用一种碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)取代另一种碱性残基；或用一种酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一种酸性残基；或用一个芳香族残基(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代另一种。短语“保守取代的变体”还包括其中残基被化学衍生的残基取代的肽，条件是所得肽保持本文所述的参比肽的一些或全部活性。在一些实施方案中，肽的功能变体与参考肽具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。例如，蛋白质的功能变体可以与参比蛋白具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且融合蛋白的功能变体可以与参比融合蛋白具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。

多肽的变体可以是原始多肽的片段。当用于参考多肽时，术语“片段”是指与参考多肽本身相比氨基酸残基缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同。这种缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或者两者都发生。片段通常为至少3、5、6、8或10个氨基酸长，至少14个氨基酸长、至少20、30、40或50个氨基酸长或至少75个氨基酸长或者至少100、150、200或更多个氨基酸长。

除非本文另有说明，本说明书中使用的术语“同源氨基酸序列”是指源自多肽氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代的氨基酸序列。此外，本说明书中使用的术语“同源多肽”，除非本文另有说明，是指衍生自多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代的多肽同源物。

本文使用的术语“序列同一性”是指两个肽序列在比较窗口内是相同的(即，在逐个氨基酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过在比较窗口内比较两个最佳排列的序列来计算的，确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一率。参考序列可以是较大序列的子集，例如作为本发明所要求保护的组合物的全长序列的片段。

如本文所用，术语“表达盒”是指含有与编码本申请的融合蛋白的核苷酸序列可操作地连接的一个或多个转录调控元件的DNA或RNA构建体。表达盒可以另外含有积极影响mRNA稳定性的一种或多种元件和/或相邻蛋白质编码区之间的内部核糖体进入位点(IRES)以促进来自共同mRNA的两种或更多种蛋白质的表达。

如本文所用，术语“基于核酸的表达系统”涵盖多核苷酸载体、DNA或RNA疫苗、或其他基于DNA或RNA的表达或递送系统。

当一个核酸序列与另一个核酸序列形成功能关系时，即为二者“可操作地连接”。例如，如果前序列或信号肽的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或信号肽的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则该位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指所连接的DNA序列是连续的，并且在信号肽的情况下，是连续的并且处于读取阶段。然而，增强子不一定是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接来实现的。如果不存在这样的位点，则可以根据常规实践使用合成寡核苷酸适配器或连接体。

术语“调节元件”是指在一种或多种宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA/RNA序列。术语“调节元件”意指包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调节元件包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些或指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织特异性调节元件)。表达盒通常含有用于转录终止的序列，并且可以另外含有一种或多种积极影响mRNA稳定性的元件。

如本文所用，术语“启动子”应在其最广泛的背景下理解，并且包括来自基因组基因的转录调控元件(TREs)或来自其的嵌合TREs，包括用于精确转录启动的TATA盒或启动子元件，具有或不具有额外的TREs(即，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，其调节响应于发育和/或外部刺激可操作地与其连接的基因的激活或抑制，以及反式作用的调控蛋白或核酸。启动子可以包含基因组片段，或者它可以包含一个或多个TREs结合在一起的嵌合体。

本文使用的术语“表达载体”是指包含编码本文公开的融合蛋白的核酸分子的重组表达载体。特别有用的载体被认为是包含本申请的表达盒的那些载体或其中DNA片段的编码部分位于调控元件的控制下的那些载体。本申请的表达载体能够在被该表达载体转染或感染的细胞中表达本申请的融合蛋白。表达载体包括非病毒载体和病毒载体。

本文所用的术语“非病毒载体”是指与正常基因组不同的自主复制的染色体外环状DNA或RNA分子。例如，DNA质粒或RNA表达盒是非病毒载体。

术语“病毒载体”和“重组病毒”在本文中可互换使用，指任何不具有蛋白质合成或能量产生机制的任何专性细胞内寄生物。病毒基因组可以是包含有脂质膜的蛋白质包被结构的RNA或DNA。可用于实施本发明的病毒包括重组修饰的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒，优先选自杆状病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科或腺病毒科。病毒基因组可以通过重组DNA技术进行修饰以包括外源转基因的表达，并且可以被工程化为复制缺陷型、条件复制型或有复制能力。利用每个亲本载体特性的有利元件的嵌合病毒载体也可用于本申请的实践。也可以根据本申请的实践来产生最小载体系统，其中病毒主链仅含有包装病毒载体所需的序列并且可以任选地包括转基因表达盒。虽然通常优选使用来自待治疗物种的病毒，但在某些情况下，使用源自具有有利致病特征的不同物种的载体可能是有利的。病毒载体可源自腺相关病毒(AAV)、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒(包括慢病毒，例如HIV-1和HIV-2)、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒、甲病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、披膜病毒等。

术语“逆转录病毒”是指双链RNA包膜病毒，其主要特征在于能够将其基因组从RNA“逆转录”为DNA。病毒体直径为100-120nm，包含与核衣壳蛋白复合的相同加RNA链的二聚体基因组。基因组被封装在蛋白质衣壳中，衣壳中还含有病毒感染所需的酶蛋白，即逆转录酶、整合酶和蛋白酶。基质蛋白形成衣壳核心的外层，包围病毒核颗粒并与包膜(源自宿主细胞膜的脂质双层)相互作用。固定在该双层中的是病毒包膜糖蛋白，负责识别宿主细胞上的特定受体并启动感染过程。

本文使用的术语“慢病毒”或“慢病毒载体”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，它能够感染非分裂细胞。它们可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

术语“腺相关病毒(AAV)”或“重组AAV(rAAV)”是指一组复制缺陷型、无包膜病毒，其依赖于第二种病毒(例如腺病毒或腺病毒)的存在。疱疹病毒或合适的辅助功能，用于在细胞中复制。目前尚不清楚AAV会引起疾病，但会引起非常轻微的免疫反应。AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞，并可能将其基因组整合到宿主细胞的基因组中。现有30多种天然存在的AAV血清型。AAV衣壳中存在许多天然变体，允许识别和使用具有特别适合递送细胞靶标的特性的AAV载体。AAV载体相对无毒，提供有效的基因转移，并且可以轻松针对特定目的进行优化。AAV病毒可以使用常规分子生物学技术进行工程改造，以优化重组AAV颗粒的产生，用于融合蛋白的细胞特异性递送、最小化免疫原性、增强稳定性、递送至细胞核等。

本文使用的术语“治疗”是指减轻或消除病症和/或其伴随症状的方法。如本文所用，术语“预防”、“防止”或“预防”是指阻止受试者罹患病症和/或其伴随症状的方法。在某些实施方案中，术语“预防”、“预防”或“预防”是指降低罹患病症和/或其伴随症状的风险的方法。

术语“抑制”是相对术语，与参考制剂相比，如果在给予制剂后反应或状况在数量上减少，或者在给予制剂后反应或状况减少，则制剂抑制反应或症状。类似地，术语“预防”不一定意味着制剂完全消除反应或状况，只要消除反应或状况的至少一个特征即可。因此，减少或预防感染或反应(如病理反应)的组合物可以但不一定完全消除这种感染或反应，只要在不存在试剂的情况下或与参考试剂相比，感染或反应可测量地减少，例如至少约50％，如至少约70％，或约80％，或甚至约90％(即10％或更低)感染或反应。

本文所用的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。表达载体的治疗有效量可以根据待治疗的病状、病状的严重性和病程、施用模式、施用药剂是出于预防还是治疗目的、特定药剂的生物利用度、融合蛋白或载体在个体中引发期望的应答的能力、先前的治疗、患者的年龄、体重和性别、患者的临床病史和对抗体的应答、所用融合蛋白或表达载体的类型、主治医师的判断等而变化。治疗有效量也是其中表达载体的治疗有益作用超过任何毒性或有害作用的量。“预防或治疗有效量”是指在必要的剂量和时间内达到所需预防或治疗效果的有效量。

本文中使用的术语“改善”、“增加”或“降低”表示相对于基线测量的值或参数，例如在开始本文所述的治疗之前在同一个体中的测量，或在没有本文所述的治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物组合物可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。示例性载体或赋形剂包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇、脂质体和外来体。示例性的药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强治疗剂的保质期或有效性。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当适当时给予动物或人时不产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体或组合物。

如本文所用，术语“受试者”包括人类和动物受试者。因此，根据本发明公开的主题提供了兽医治疗用途。

此类动物的实例包括但不限于：食肉动物，例如猫和狗；猪科动物，包括家猪、阉公猪和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物，例如黄牛、阉公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼和马。还提供了鸟类的治疗，包括濒临灭绝的和/或饲养在动物园中的那些种类的鸟类以及家禽的治疗，特别是驯养的家禽，例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了对家畜的治疗，包括但不限于鱼、驯养猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)、家禽等。

术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、非人类灵长类动物、家养动物和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人类。

如本文所用，“呼吸道病原体”是指通过空气传播并通过呼吸道进入细胞的微生物病原体。呼吸道病原体可以是病毒、细菌、真菌或原生动物。本申请的呼吸道病原体包括用于本申请的疫苗组合物中的靶蛋白抗原。

如本文所用，术语“蛋白质抗原”旨在涵盖能够在相关动物内诱导免疫应答的所有肽或蛋白质序列。术语“蛋白质抗原”涵盖已知或野生型抗原的肽或蛋白质类似物、比野生型抗原更可溶或更稳定的变体抗原，或者含有使抗原更具免疫学活性或针对在某些细胞中的表达进行优化(例如，通过密码子优化)的突变或修饰的变体抗原。抗原还可以是肽，其中已经对天然存在的抗原进行了改变蛋白质结构的特定氨基酸取代、包括已知保护性表位(即CTL表位)的天然存在抗原的一部分、或合成衍生的一串已知表位，其可以仅限于也可能不限于一种病原体(多价疫苗)。

具有与所需抗原的氨基酸序列同源的序列的其他肽或蛋白质也是有用的，其中同源抗原诱导针对相应病原体的免疫应答。与所需抗原编码序列同源的基因应当被理解为包括在本发明中，只要它们编码具有与靶抗原的生物活性基本相似的生物活性的蛋白质或多肽。

本文描述的抗原的变体或类似物可以通过保守氨基酸、序列差异或通过不影响序列的修饰或两者来与天然存在的蛋白质或肽不同。例如，可以进行保守氨基酸改变，虽然它们改变了蛋白质或肽的一级序列，但通常不会改变其功能。修饰(通常不改变一级序列)包括多肽的体内或体外化学衍生化，例如乙酰化或羧化。抗原还包括通过糖基化修饰的蛋白质，例如通过在多肽的合成和加工过程中或在进一步加工步骤中修饰多肽的糖基化模式而制备的蛋白质，例如通过将多肽暴露于影响糖基化的酶，例如哺乳动物糖基化或去糖基酶。作为根据本发明的抗原，还包括具有磷酸化氨基酸残基的蛋白质，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。还包括作为抗原的是已使用普通分子生物学技术修饰的多肽，以提高其对蛋白水解降解的抗性或优化溶解特性。此类多肽的类似物包括含有除天然存在的L-氨基酸之外的残基的那些，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。本发明的抗原不限于本文列出的任何具体示例性方法的产物。

抗原可以是全长或截短的抗原、其免疫原性片段、或源自抗原的表位。在某些实施方案中，加强组合物中的病原体特异性抗原可以是减毒或灭活的病原体的形式。有效抗原还包括这些病原体的表面抗原。

本文使用的术语“表位”是指至少约3至5个、优选约5至10或15个且不超过约1,000个氨基酸(或其间的任何整数)的序列，其本身定义了这样的序列，其本身或作为较大序列的一部分，与响应该序列而产生的抗体结合或刺激细胞免疫反应。术语“表位”涵盖与天然序列相同的序列，以及对天然序列的修饰，例如删除、添加和取代(通常本质上是保守的)。本发明中使用的抗原可以仅包含单个表位，例如单个CTL表位。

用于诱导针对呼吸道病原体的粘膜免疫应答的组合物

本文描述的方法可以应用于多种呼吸道病原体。在本申请的粘膜疫苗组合物中，呼吸道病原体蛋白和编码其的多核苷酸载体源自呼吸道病原体。本申请的一个方面涉及包含本文所述的初免和加强组合物的药物组合物。除了本文所述的编码抗原的多核苷酸载体、抗原蛋白和佐剂之外，本申请的药物组合物将不包含一种或多种药学上可接受的载体。

初免组合物或加强组合物中的核酸编码的抗原和加强组合物中的蛋白质抗原优选具有重叠的表位。在某些实施方案中，两种抗原可以彼此相同。或者，两种抗原可以具有重叠但不同的表位组。作为示例，在RSV的疫苗接种方案中，编码RSV全长糖蛋白的DNA可以用于初免组合物中，并且加强组合物可以是糖蛋白的胞外域。作为另一个说明性实例，初免组合物可以是编码RSV抗原的载体，并且加强组合物可以包含全长或部分抗原的蛋白质形式，或反之亦然。

在某些优选的实施方案中，呼吸道病原体是病毒。根据本申请使用的示例性呼吸道病毒包括但不限于肺病毒，例如呼吸道合胞病毒(RSV)；人类冠状病毒，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)、SARS-CoV-1、MERS-CoV、OC43、229E、NL(NH)和HKUI；非人冠状病毒，如传染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(猪)、猫传染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)；流感病毒，包括A型、B型和C型流感病毒，包括其各种亚型或血清型；副流感病毒，例如人副流感病毒(HPIV)、副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、风疹病毒(流行性腮腺炎病毒、副流感病毒2型、副流感病毒4型)；副粘病毒，包括新城疫病毒(鸡)、牛瘟、麻疹病毒，例如已知会引起麻疹的麻疹麻疹病毒，以及已知会引起犬瘟热的犬瘟热病毒(CDV)；偏肺病毒，例如人类偏肺病毒(HMNV)，包括埃可病毒和埃可病毒；鼻病毒，例如人鼻病毒(HRV)，已知会引起普通感冒；博卡病毒，例如人博卡病毒(HBoV)；以及水痘带状疱疹病毒(VZV)，已知其可引起水痘。

其他空气传播的呼吸道病毒包括沙粒病毒(包括弗宁病毒、马丘波病毒和拉沙病毒)、丝状病毒(包括马尔堡病毒和埃博拉病毒)、汉坦病毒；副粘病毒、麻疹病毒、披膜病毒、柯萨奇病毒、细小病毒Bl 9、呼肠孤病毒、天花(大天花或普通天花)、猴痘病毒和痘病毒，包括例如引起牛痘的牛痘病毒。

病毒性出血热由沙粒病毒家族(拉沙热)(该家族也与淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)有关)、丝状病毒(埃博拉病毒)和汉坦病毒(普马拉病毒)引起。细小病毒家族包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒和猪细小病毒。腺病毒家族包括已知引起呼吸道疾病的病毒。

在某些优选的实施方案中，呼吸道病原体是选自由呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、MERS-CoV、A型流感病毒、人鼻病毒或水痘带状疱疹病毒组成的组的病毒。在某些优选的实施方案中，病毒是RSV或SARS-CoV-2加上新出现的突变体或流感病毒。

在优选的实施方案中，呼吸道病原体是RSV。在更具体的实施方案中，抗原是选自由融合(F)蛋白、融合前-F(pre-F)蛋白、糖蛋白G、小疏水蛋白(SH)、蛋白磷蛋白(P)、核蛋白(P)、核蛋白(N)蛋白、基质(M)蛋白、大(L)蛋白、M2-1调节蛋白、M2-2调节蛋白、非结构蛋白NS1和非结构蛋白NS2组成的组的RSV抗原。在优选的实施方案中，RSV抗原是全长F蛋白或融合前F(pre-F)蛋白。在其他实施方案中，RSV抗原是加工形式的F、截短的F蛋白、pre-F的胞外结构域、其免疫原性片段或其分泌形式。在一些实施方案中，本文描述的F蛋白的形式可以包括信号肽和/或本领域已知的各种纯化标签(例如，组氨酸标签等)。

还可以使用F蛋白或pre-F蛋白的全长或截短形式的变体和突变体，并且在美国专利号9,675,685、9,950,058、10,017,543和10,022,437中进行了描述，其公开内容通过引用整体并入本文。

在另一个实施方案中，呼吸道病原体是SARS-CoV-2或其突变体。在具体实施方案中，用于疫苗接种的抗原靶标是SARS-CoV-2抗原，可以包括刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白、orf1a、orf1b、orf3a、E、M、orf6、orf7a、orf8、M、orf10及其免疫原性片段及其共有蛋白，源自任何变体SARS-CoV-2分离株的多核苷酸或蛋白序列。在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2或突变体是刺突(S)蛋白或S蛋白的一部分。

在另一个具体实施方案中，呼吸道病原体是I型流感病毒或其组合。来自正粘病毒科的流感病毒包括：A型流感亚型、B型流感亚型和C型流感亚型。A型流感病毒是毒性最强的人类病原体。A型流感病毒根据病毒表面的两种蛋白质分为亚型：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。有18种已知的HA亚型和11种已知的NA亚型。HA和NA蛋白的许多不同组合都是可能的。例如，“H7N2病毒”指具有HA7蛋白和NA2蛋白的甲型流感病毒亚型。

同理，“H5N1”病毒具有HA5蛋白和NA1蛋白。A型流感病毒包括多种亚型或血清型，包括与大流行相关的亚型或血清型，包括引起1918年西班牙流感和2009年猪流感的HINI；导致1957年亚洲流感的H2N2；H3N2；以及2004年引起禽流感的H5N1。

在某些具体实施方案中，A型流感病毒是选自H1N1、H3N2、H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4，H7N5、H7N6、H7N7、H7N8和H7N9、H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9、H17N10、H18N11或其组合的亚型。在某些具体实施方案中，初免组合物包含A型流感病毒编码的多核苷酸，其中第一次加强、第二次加强或两者的每种多核苷酸包含A型流感抗原血凝素抗原(HA)、神经氨酸酶(NA)抗原或两者。

在一些实施方案中，呼吸道病原体是细菌。已知引起疾病的示例性空气传播细菌包括但不限于链球菌属，例如肺炎链球菌(肺炎)(包括其23种血清型)、化脓性链球菌(猩红热)、口链球菌和轻链球菌；嗜血杆菌属，例如流感嗜血杆菌(流感)(例如，a、b、c、d、e、f型)、副流感嗜血杆菌和睡眠嗜血杆菌；分枝杆菌属，例如结核分枝杆菌(结核分枝杆菌(TB))、堪萨斯分枝杆菌(TB)、鸟氨酸分枝杆菌(肺炎)；金黄色葡萄球菌(肺炎)；百日咳博德特氏菌(百日咳)；炭疽芽孢杆菌(炭疽)；衣原体属，例如鹦鹉热衣原体(肺炎衣原体)和肺炎衣原体(肺炎)；奈瑟菌属，例如脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎)；肺炎克雷伯菌(肺炎)；假单胞菌属，例如铜绿假单胞菌(肺炎)、鼻疽假单胞菌(肺炎)和鼻疽假单胞菌(肺炎)；不动杆菌属(肺炎)，支原体属，例如肺炎支原体(肺炎)；布鲁氏菌属(布鲁氏菌病)，例如猪布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌和犬布鲁氏菌、弗朗西斯氏菌土拉热菌(肺炎/发烧)、军团菌肺炎(军团病)、星形诺卡氏菌(肺炎)、白喉棒状杆菌(白喉)；放线杆菌属伴放线菌；莫拉氏菌属，例如卡他莫拉菌和腔隙莫拉菌；产碱菌属、心杆菌属；具核梭杆菌；放线菌属；发酵支原体和肺炎支原体；伯克霍尔德氏菌属，例如类鼻疽伯克霍尔德氏菌；柯克斯体伯内特氏菌(Q热)；和立克次体属，例如普瓦泽基立克次体、立氏立克次体、康氏立克次体和伤寒立克次体。

在某些具体实施方案中，细菌是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、百日咳博德特氏菌或炭疽杆菌。

可以用本申请的组合物进行疫苗接种的目标细菌抗原可以包括来自上述细菌的任何细菌抗原。结核分枝杆菌的特异性抗原包括例如Rv2557、Rv2558、RPFs:Rv0837c、Rvl884c、Rv2389c、Rv2450、Rvl009、aceA(Rv0467)、PstS1(Rv0932)、SodA(Rv3846)、Rv203lc 16kDal.、Tb Ral2、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCCl(WO99/51748)。结核分枝杆菌抗原还包括融合蛋白及其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个、优选三个多肽融合成更大的蛋白。

优选的融合体包括Ral2-TbH9-Ra35、Erd 14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPVMTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。

衍生自链球菌属的特异性抗原，包括衍生自肺炎链球菌的那些抗原(例如，PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)、蛋白抗原肺炎链球菌溶血素、及其突变体解毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。

衍生自嗜血杆菌属的特定抗原包括例如流感嗜血杆菌抗原PRP、OMP26、高分子量粘附素、PS、P6、蛋白D和脂蛋白D、菌毛蛋白和菌毛蛋白衍生肽(美国专利号5,843,464)或多拷贝其变体或其融合蛋白。

使用的具体衣原体抗原包括例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP366 412)和推定的膜蛋白(Pmps)。其他可用的衣原体抗原描述于WO 99/28475。

在一些实施方案中，呼吸道病原体是真菌。示例性的传染病可以由空气传播的真菌引起，包括例如曲霉属物种、小白霉属、斯托诺立克氏菌、李氏毛霉、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、无限球孢子菌、青霉属物种、法尼小多孢菌。普通嗜热放线菌、交替链格孢、枝孢属种、蠕虫孢属和水苏孢属种。其他呼吸道病原体及其抗原描述于美国专利申请公开号2019/0216841中。

佐剂

针对病毒和其他病原体的治疗性疫苗的开发重点是激活CTL和/或NAbs，以识别和破坏受感染的细胞和/或控制病毒传播。本发明的方法可有效增强细胞免疫应答，使其适合提供治疗性疫苗接种。优选通过包含细胞因子佐剂和CpG基序来增强所公开方法的有效性。

因此，初免或加强组合物通常包含一种或多种佐剂以进一步加强免疫应答。佐剂可以在施用疫苗组合物之前、同时或之后施用。佐剂是通过调节免疫细胞的活性来增强对抗原的特异性免疫反应的物质或程序。

最近，开发新的、更安全的佐剂的重点是刺激特定的免疫反应途径。在一些实施方案中，可以包括细胞因子例如干扰素-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的共同施用以刺激细胞免疫应答(综述于(Petrovsky和Aguilar，Immunol.Cell Biol.82:488-496(2004))，然而，高水平的细胞因子可能导致毒性，这可能需要仔细测试和监测多种给药方案，细胞因子或细胞因子编码表达载体的施用可以包含在初免组合物中的多核苷酸载体中。在表达载体中共表达编码呼吸道病原体蛋白和细胞因子的基因，以便通过同一载体同时表达。

示例性的佐剂包括但不限于CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、包含单磷酰脂质A(MPL)或其衍生物的佐剂，例如3脱-O-酰化的单磷酰脂质A、3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A、AS01、AS02和AS04；油包水或水包油乳剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、MONTANIDE^TMISA 51、MONTANIDE^TMISA 720VG MONTANIDE^TMISA 50V、MONTANIDE^TMISA 206、MONTANIDE^TMIMS1312、和AS03)；细菌衍生的佐剂，例如脂多糖(LPS)和细菌毒素；佐剂乳液能够缓慢释放抗原；共刺激分子的激动性抗体；胞壁酰二肽、重组/合成佐剂、明矾基盐、铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(也称为明矾))、脂质体、病毒体、外泌体、皂苷基佐剂，包括皂苷基佐剂佐剂(例如，Iscoms、Iscom基质、ISCOMATRIX^TM佐剂、MATRIX-M^TM佐剂、MATRIX-C^TM佐剂、Matrix Q^TM佐剂、ABISCO^TM-100佐剂和ABISCO^TM-300佐剂；ISCOPREP^TM佐剂和衍生物，包括QS-21和QS-21衍生物；来自例如皂树的皂苷衍生物；皂角、人参、三七、西洋参、桔梗、远志、细叶远志、巴西皂树、膜荚黄芪和二齿牛膝的皂苷衍生物；聚氨基酸、氨基酸共聚物、石蜡油、Regressin(Vetrepharm，Athens GA)、Avridine、脂质体、油、小棒杆菌、卡介苗、氧化铁、海藻酸钠、葡聚糖、MF59(诺华)和硫酸葡聚糖。此外，CTL反应可以通过将蛋白质抗原与脂质缀合来引发，例如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)。在某些实施方案中，疫苗组合物包含50μg/剂/受试者的QS-21。

在某些具体实施方案中，佐剂是Toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR-9。示例性TLR-9佐剂包括(除其他外)那些含有细菌DNA中常见的CpG DNA基序的佐剂。CpG寡核苷酸(ODN)是细胞免疫应答的有效激活剂。特别地，CpG ODN可以改善专职抗原呈递细胞的功能，促进体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。这些效果可以通过保持ODN和疫苗紧密相连来优化。因此，CpG ODN可以包含在本申请的疫苗制剂中。示例性的CpG ODN包括CpG 7909、CpG1080、ODN 2216、ODN 21798、ODN 2007、ODN D-SL01、MGN 1703、K3-SPG、DYNAVAX 1018及其组合。在某些优选的实施方案中，本申请的组合物可包含单独的CpG 7909或CpG 7909与单磷酰脂质A(MPL)的组合。

在其他实施方案中，佐剂是TLR-4配体，例如单磷酰脂质A(MPL)，或TLR-7配体，例如R837。据报道，TLR-4和TLR-7配体与纳米颗粒制剂的组合可以在免疫后与抗原一起施用时增强和延长抗体应答(Kasturi et al.(2011)Nature，Vol.470:543-560)。

在一些实施方案中，在本申请的药物组合物中使用表面活性剂可能是有利的，其中那些表面活性剂不会破坏所施用的药物组合物。被证明有用的表面活性剂或抗吸附剂包括聚氧乙烯山梨糖醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚山梨酯-20，例如Tween-20^TM、聚山梨酯-80、聚山梨酯-20、羟基纤维素、genapol和BRIJ表面活性剂。举例来说，当在本公开中使用任何表面活性剂来生产可胃肠外施用的组合物时，以约0.01至约0.5mg/ml的浓度使用较为有利。

编码抗原的多核苷酸表达载体

用于初免组合物或加强组合物中的多核苷酸表达载体可以是RNA例如mRNA，或DNA例如基因组DNA、合成DNA或cDNA。为了获得抗原肽在哺乳动物细胞内的表达，编码抗原肽的核苷酸序列必须存在于适当的载体系统中。“适当的载体”是指各种递送载体中的任何DNA载体或任何mRNA制剂，其能够使抗原肽在哺乳动物内以足够的量表达以引发免疫应答。

例如，所选择的多核苷酸表达载体可以是质粒、噬菌体或病毒载体。通常，载体包括启动子/增强子序列和多聚腺苷酸化/转录终止序列，它们被适当地排列以提供本文所述的抗原蛋白的表达。包括这些和其他组分的多核苷酸表达载体的构建和使用是本领域技术人员公知的。

一般而言，初免或加强组合物中的多核苷酸表达载体处于合适的启动子的控制下以进行有效表达。如本文所用，“在……的控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于编码抗原的多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶转录的起始和多核苷酸的表达。用于多核苷酸表达载体的合适的启动子/增强子元件包括但不限于人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒长末端重复序列、RNA pol I、polⅡ和polⅢ启动子。在某些实施方案中，启动子是CMV启动子，优选CMV立即早期基因启动子。

含有编码用于疫苗接种的呼吸道病原体抗原的多核苷酸表达载体的初免组合物可以多种方式施用。多核苷酸表达载体可以以裸露形式(单独)施用、并入病毒载体、封装在脂质体中、或与一种或多种转染促进剂或微针组合。多核苷酸表达载体可以悬浮在适当的介质中，例如缓冲盐溶液，例如PBS，然后肌内、皮下、皮内或粘膜注射或使用基因枪或其他电子(例如，电穿孔)装置、微针施用等等。在某些优选的实施方案中，编码呼吸道病原体抗原例如RSV预融合F(pre-F)蛋白的多核苷酸表达载体以裸露形式通过肌内注射施用。

在另一个实施方案中，多核苷酸表达载体通过皮内施用来施用，优选通过使用基因枪(特别是粒子轰击)施用技术。此类技术可涉及将载体包被到金珠上，然后将其在高压下施用到表皮中，例如Hayneset al.,J.Biotechnology 44:37-42(1996)中所描述的。

在一些实施方案中，病毒载体可用于递送多核苷酸表达载体。这种方法可以在多种细胞类型中提供DNA编码蛋白的丰富表达、CTL和抗体应答的强烈增强以及病毒编码多个基因的能力。用于递送和表达蛋白抗原的示例性病毒载体包括复制缺陷型腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和牛痘病毒。

在其他实施方案中，载体可被封装在例如脂质体中或聚丙交酯共乙交酯(PLG)颗粒内，用于通过鼻或肺途径施用。

在某些实施方案中，本申请的多核苷酸载体可被进一步修饰以促进增加的表达、确保正确折叠、提供适合于增加mRNA稳定性或减少二级结构的GC含量、最小化可能损害基因构建的串联重复密码子或碱基运行或表达，插入或去除蛋白质运输序列，去除/添加编码蛋白质中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)，添加、去除或改组蛋白质结构域，插入或删除限制性位点，修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点，调整翻译速率以允许蛋白质的各个结构域正确折叠，或减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。

在某些优选的实施方案中，编码呼吸道病原体蛋白抗原的多核苷酸表达载体中的多核苷酸序列针对在人和非人哺乳动物中的表达进行密码子优化。此类多核苷酸序列可以使用本领域已知的优化算法进行密码子优化。例如，在某些实施方案中，抗原编码序列针对在人类中表达进行密码子优化，其中密码子序列被例如“人源化”密码子(例如，在高度表达的人类基因中频繁出现的密码子)替换。

在一些实施方案中，密码子优化的多核苷酸序列与天然存在或野生型序列(例如，编码感兴趣的呼吸道病毒感染多肽的天然存在的或野生型DNA或mRNA序列(例如，抗原蛋白或多肽))具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％的序列一致性。

在一些实施方案中，密码子优化的多核苷酸序列与编码感兴趣的呼吸道病原体蛋白(即抗原蛋白)的天然存在或野生型序列具有50％至95％之间、50％至90％之间、50％至85％之间、50％至80％之间、50％至75％之间、50％至70％之间、50％至65％之间、50％至60％之间、50％至55％之间、55％至95％之间、55％至90％之间、55％至85％之间、55％至80％之间、55％至75％之间、55％至70％之间、55％至65％之间、55％至60％之间、60％至95％之间、60％至90％之间、60％至85％之间，60％至80％之间、60％至75％之间、60％至70％之间、60％至65％之间、65％至95％之间、65％至90％之间、65％至85％之间、65％至80％之间、65％至75％之间、65％至70％之间、70％至95％之间、70％至90％之间、70％至85％之间、70％至80％之间、70％至75％之间、75％至95％之间、75％至90％之间、75％至85％之间、75％至80％之间、80％至95％之间、80％至90％之间、80％至85％之间、85％至95％之间、85％至90％之间、或90％与95％之间的序列一致性。

在一个优选的实施方案中，多核苷酸载体编码包含图12中所示的核苷酸序列的密码子优化的pre-F。

在一些实施方案中，用于表达呼吸道病原体蛋白抗原的多核苷酸载体被优化为包括、消除、增加或减少顺式作用基序，例如内部TATA-盒、chi-位点、核糖体进入位点、富含AT或富含GC的序列段、ARE、INS、CRS序列元件、隐性剪接供体和受体位点和/或分支点。

在其他实施方案中，可以在本申请的多核苷酸载体中表达两种或更多种抗原。例如，在具有编码抗原的多核苷酸载体的初免加强组合物中，两种或更多种抗原可以是融合蛋白，其中全长抗原蛋白或其免疫原性片段由单个开放阅读框表达(例如，表达作为单个转录物)。在其他实施方案中，两种或更多种抗原可以在单个启动子或具有或不具有技术人员已知的内部核糖体进入位点(IRES)的不同启动子的控制下从不同的开放阅读框(例如，表达为单独的转录物)表达。相应地，在加强组合物中，两种或更多种蛋白抗原可以作为抗原混合物或作为一种或多种融合蛋白存在。所述两种或更多种抗原可以来自单一病原体或多种病原体。

表达盒

本申请的另一个方面涉及表达盒，其包含与本申请的蛋白抗原的编码序列可操作地连接的一个或多个调控序列。

在一些实施方案中，一个或多个调控序列包括启动子和'3UTR序列。优选的启动子是那些能够在感兴趣的靶细胞中指导高水平表达的启动子。启动子可以包括组成型启动子(例如，HCMV、SV40、延伸因子-1α(EF-1α))或在感兴趣的特定细胞类型中表现出优先表达的启动子。在一些实施方案中，普遍存在的启动子例如CMV启动子或CMV-鸡β-肌动蛋白杂合(CAG)启动子控制本申请的融合蛋白的表达。在其他实施方案中，使用组织特异性启动子，例如皮肤特异性启动子、神经元特异性启动子、肌肉特异性启动子和肝脏特异性启动子来控制融合蛋白在特定组织中的表达。组织特异性启动子是本领域公知的。

在一些实施方案中，预期通过将编码序列置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优点。如本文所用，重组或异源启动子意指通常与其天然环境中的蛋白质基因不相关的启动子。此类启动子可包括从植物、昆虫、细菌、病毒、真核、鱼、禽类或哺乳动物细胞分离的启动子。当然，重要的是使用能够有效指导DNA片段在选择表达的细胞类型中表达的启动子。使用启动子和细胞类型组合进行蛋白质表达是分子生物学领域技术人员公知的。

在一些实施方案中，一种或多种调控序列还包含增强子。增强子通常是指远离转录起始位点起作用的DNA序列，并且可以位于转录单位的5或3'。此外，增强子可以在内含子内以及编码序列内。它们的长度通常在10到300bp之间，并且以顺式方式发挥作用。增强子的作用是增加和/或调节附近启动子的转录。优选的增强子是那些指导抗体产生细胞中高水平表达的增强子。

在一些实施方案中，可以将细胞或组织特异性转录调节元件(TRE)掺入表达盒中以将表达限制于期望的细胞类型。可以设计表达载体以促进本文的融合蛋白在一种或多种细胞类型中的表达。

非病毒载体

在一些实施方案中，表达载体是非病毒表达载体。在一些实施方案中，所述非病毒表达载体是能够在体外和/或体内环境中表达本申请的融合蛋白的质粒。

在一些实施方案中，通过将本申请的非病毒表达载体封装在脂质体、微粒、微囊、病毒样颗粒、或红细胞血影或外来体中，将表达载体引入细胞或组织中。此类组合物可以通过化学缀合进一步连接至例如微生物易位结构域和/或靶向结构域，以促进核酸靶向递送和/或进入所需细胞的细胞核以促进基因表达。此外，质粒载体可以与合成基因转移分子(例如聚合DNA-结合阳离子，如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)一起孵育，并连接至细胞靶向配体，如脱唾液酸类乳清蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或转铁蛋白。

在一些实施方案中，通过直接注射或电穿孔将非病毒表达载体作为裸DNA或作为mRNA疫苗制剂引入细胞或组织中。裸DNA的摄取效率可以通过压实或使用可生物降解的乳胶珠来提高。这种递送可以通过处理珠粒以增加疏水性来进一步改进，从而促进内体的破坏和DNA释放到细胞质中。

病毒载体

在一些实施方案中，本申请的表达载体是病毒表达载体。在某些实施方案中，病毒表达载体可通过使用病毒载体固有的靶向特征或被工程化到病毒载体中而被工程化以靶向某些疾病和细胞群体。可以“靶向”特定细胞以递送多核苷酸以及表达。病毒载体可能优选充当本文讨论的方法中的引物。

在一些实施方案中，病毒表达载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体和疱疹病毒载体。

在一些实施方案中，病毒表达载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是非灵长类慢病毒载体，例如马传染性贫血病毒(EIAV)。

在一些实施方案中，病毒表达载体在病毒包膜中包含促有丝分裂T细胞激活跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞激活跨膜蛋白。在一些实施方案中，病毒表达载体是在病毒包膜中包含促有丝分裂T细胞激活跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞激活跨膜蛋白的慢病毒载体。

在一些实施方案中，病毒表达载体是重组AAV载体(rAAV)。在例如通过鞘内和/或脑内注射直接施用到脑脊液(CSF)中后，rAAV可以在整个CNS组织中扩散。在一些实施方案中，rAAV(例如AAV-9和AAV-10)穿过血脑屏障并在静脉内施用后在受试者的整个CNS组织中实现广泛分布。在一些情况下，血管内(例如，静脉内)施用比其他形式的施用(例如，鞘内、脑内)有利于使用更大的体积。因此，大剂量的rAAV(例如，高达1015个rAAV基因组拷贝(GC)/受试者)可以通过血管内(例如，静脉内)施用一次性递送。血管内施用的方法是本领域公知的，并且包括例如使用皮下注射针、外周插管、中心静脉管等。

任何合适的AAV血清型可用于重组AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及其假型组合。假型(或嵌合)AAV载体包括来自多于一种血清型的部分，例如，来自一种AAV血清型的衣壳的一部分可以融合至不同AAV血清型衣壳的第二部分，从而产生编码假型AAV2/AAV5衣壳的载体。或者，假型AAV载体可以在另一种AAV血清型的背景结构中含有来自一种AAV血清型的衣壳。例如，假型AAV载体可以包括来自一种血清型的衣壳和来自另一种AAV血清型的反向末端重复序列(ITRs)。示例性AAV载体包括重组假型AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9血清型载体。除非另有说明，本文描述的AAV ITRs和其他选择的AAV组分可以容易地选自任何AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其他已知或未知的AAV血清型。使用本领域技术人员可用的技术，可以容易地从AAV血清型中分离这些ITRs或其他AAV成分。此外，AAV序列可以从学术、商业或公共来源(例如，美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州)分离或获得，或者可以通过合成或其他合适的方式参考已公开的序列获得，所述公开的序列例如可在文献或数据库例如GenBank、PubMed等中获得。

本领域技术人员应当理解，本申请的表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。

诱导针对呼吸道病原体的粘膜免疫应答的方法

本申请的一个方面是一种用于治疗或预防受试者呼吸道病原体感染症状的方法。该方法包括以下步骤：(1)向受试者施用有效量的初免组合物，该初免组合物包含编码呼吸道病原体的抗原性肽(或蛋白抗原)的多核苷酸载体，和(2)向受试者施用有效量的加强组合物，该加强组合物包含呼吸道病原体的抗原性肽(或蛋白抗原)，其中所述初免组合物皮下或肌内施用，并且所述加强组合物通过粘膜途径施用。

在一些实施方案中，初免组合物通过非粘膜途径(例如，肌内、静脉内、腹膜内、皮内或皮下)施用，而加强组合物(也称为“粘膜疫苗”)通过鼻内或通过吸入施用。在一些实施方案中，加强组合物多次施用，剂量之间的间隔为1至26周。在一些实施方案中，加强组合物还包含一种或多种佐剂。在一些实施方案中，在受试者暴露于呼吸道病原体之前施用初免和/或加强组合物。在一些实施方案中，在受试者暴露于呼吸道病原体之后施用初免和/或加强组合物。

本申请的另一个方面是用于预防或改善受试者中呼吸道合胞病毒(RSV)感染的症状的方法，包括预防性或治疗性地向哺乳动物施用：初免组合物，其包含在启动子控制下编码RSV抗原的多核苷酸表达载体；第一加强免疫，其包含一种或多种雾化制剂，所述雾化制剂包含单独的RSV抗原或与多核苷酸表达载体组合的RSV抗原；和一种或多种佐剂，其中初免组合物中的多核苷酸表达载体编码与第一加强中存在的相同的RSV抗原，其中第一加强中的一种或多种雾化制剂包含单独的CpG寡核苷酸或CpG寡核苷酸和单磷酰脂质A(MPL)，其中多核苷酸表达载体皮下施用并且病毒抗原鼻内施用，并且其中多核苷酸表达载体和病毒抗原以足以减轻受试者中RSV感染的症状和病毒载量的量施用。在一些实施方案中，RSV抗原是融合前F蛋白(pre-F)。

在一些实施方案中，在受试者暴露于RSV之前施用初免和/或加强组合物。在一些实施方案中，在受试者暴露于RSV之后施用初免和/或加强组合物。

在一些实施方案中，该方法进一步包括施用含有一种或多种雾化制剂的第二加强剂量的步骤，所述雾化制剂包含单独的呼吸道病原体抗原或与多核苷酸表达载体的组合。在第一次加强中施用多核苷酸表达载体和呼吸道病原体蛋白(例如RSV pre-F蛋白)的步骤可以在单一制剂中同时或一起进行。在一些实施方案中，在第一次加强后2周至2个月之间向受试者施用第二次加强。在某些具体实施方案中，在第一次加强后约2周、3周或4周之间向受试者施用第二次加强。

本申请的另一个方面涉及增强受试者中对呼吸道病原体的现有免疫力的方法，所述受试者已经用编码或包含呼吸道病原体的靶抗原的疫苗针对呼吸道病原体免疫。

该方法包括通过粘膜施用，例如鼻内施用，向受试者施用有效量的包含靶抗原的加强组合物的步骤，其中加强组合物增强针对呼吸道病原体的预先存在的免疫力。在一些实施方案中，加强组合物多次施用。

可以使用与施用初免组合物和加强组合物不同的频率和间隔。第一加强组合物可以在施用初免组合物后2-8周、优选4-6周，或更优选约2-4周施用。在一个实施方案中，第一加强组合物在初免组合物后约7至约18天施用。在另一个实施方案中，第一加强组合物在初免组合物后约10至约16天施用。

还可以使用加强组合物(例如第一加强组合物和第二加强组合物)之间的不同间隔，并且它们可以与施用初免组合物和第一加强组合物之间的间隔相同或不同。例如，第二加强组合物(或随后的加强组合物)可以在施用第一加强组合物或先前加强组合物后2-8周、优选4-6周、或更优选约2-4周施用。在一个实施方案中，第二加强组合物在第一加强组合物(或先前加强组合物)后约7至约18天施用。在另一个实施方案中，第二加强组合物在第一加强组合物(或先前加强组合物)后约10至约16天施用。

本申请的组合物和方法可用于预防性疫苗接种(即在受试者中诱导保护性免疫应答)。如本文所用，“保护性免疫应答”或“保护性免疫”是指由脊椎动物(例如人)表现出的针对感染原的免疫或引发免疫应答，其预防或防止感染和疾病。预防或防止疾病症状出现的保护性免疫反应将通过减少病毒脱落来减少或阻止传染源在人群中的传播。在一些实施方案中，由本发明的疫苗诱导的保护性免疫是灭菌性免疫。“灭菌免疫”是一种消除或预防感染或迅速清除而不留下可检测痕迹的免疫反应。本申请的初免和加强组合物的预防性施用用于预防或改善任何随后的感染。本申请的初免和加强组合物应当以预防有效量施用，以诱导广泛中和抗体的产生并提供针对呼吸道病原体感染攻击的细胞、体液应答和保护性免疫。

本申请的组合物和方法提供了用于调节免疫应答的手段，使得可以在动物中引发偏向辅助性T细胞1型(Th1)应答的所需免疫应答。短语“偏向”是指与免疫前的反应相比，观察到的免疫应答更接近Th1而非辅助性T细胞2型(Th2)应答的情况。在其他实施方案中，免疫可以导致混合的或平衡的Th1和Th2应答或较弱的Th1应答。

大多数免疫应答由T淋巴细胞调节，T淋巴细胞启动并塑造应答的性质。随着免疫应答的成熟，CD4+T淋巴细胞可能会分化为辅助性T细胞1型(Th1)或辅助性T细胞2型(Th2)免疫应答。如本文所用，短语“辅助性T细胞1型应答”和“Th1应答”可互换使用，指一系列宿主动物反应，包括一个或多个、通常是表I中间栏中列出的所有特征。这些特征包括IgG1:IgG2a的比率不大于0.5；辅助T细胞I细胞分泌IFN-y(和其他Th1细胞因子)增加，辅助T细胞2细胞分泌IL-10和IL4(和其他Th2细胞因子)减少；以及高CTL活性。类似地，如本文所用，短语“辅助性T细胞2型应答”和“Th2应答”可互换使用，指一系列宿主动物应答，包括一种或多种，通常是下表I右栏中列出的所有特征。这些特征包括IgG1:IgG2a的比率不小于2.0；减少辅助T细胞1细胞的IFN-y(和其他Th1细胞因子)分泌，增加辅助T细胞2细胞的IL-10和IL-4(和其他Th2细胞因子)分泌；以及CTL活性低或缺失。

Th1和Th2型反应的标志是存在的细胞因子的主要模式。Th1应答的特点是高水平的IFN-γ和低水平的IL-4和IL-10，而Th2应答的特点是低水平的IFN-γ和高水平的IL-4和IL-10。这些细胞因子在确定T细胞的功能方面发挥着重要作用。Th2型反应导致优先产生IgG1亚类抗体，而很少或不产生CTL。Th1型反应导致优先产生IgG2a亚类抗体并诱导CTL，从而有效杀死被病毒或其他生物体感染的细胞。

下表1总结了Th1和Th2极化免疫应答的免疫学特征。Th1极化应答通常在病毒或细菌感染期间产生。相比之下，Th2极化应答经常在寄生虫感染、过敏反应以及人类使用的传统明矾肌肉注射蛋白疫苗中观察到。遗传学还可以确定产生的免疫反应的类型。例如，Th1应答在C57BL/6品系小鼠中占主导地位，而Th2应答在BALB/c品系小鼠中占主导地位。免疫反应也可能由Th1和Th2组分组成，通过体液和细胞介导的免疫应答臂提供保护。可以使用ELISPOT(酶联免疫吸附SPOT测定)或通过免疫荧光染色来直接测定细胞因子产生细胞的频率，以揭示细胞内细胞因子的产生。血清IgG1:IgG2a比率也被广泛接受并遵循确定T辅助细胞类型的标准(表1)。平衡Th1和Th2应答的IgG1与IgG2a的比率将在0.5和2.0之间。

表1

施用方法

用于人类和非人类哺乳动物的合适剂量可由本领域普通技术人员确定。精确的剂量可以取决于所用载体的类型、启动子、抗原的表达水平、施用方法以及抗原核苷酸序列的密码子优化的类型和水平。

初始加强施用和随后的加强施用可以使用相同或不同量的蛋白抗原。此外，加强施用可以通过相同或不同的途径进行。在一些实施方案中，加强组合物还包含初免组合物的编码抗原的多核苷酸载体。

本申请的初免组合物中的多核苷酸表达载体和加强组合物中的蛋白抗原的具体剂量可以通过它们在实验动物模型中的功效、个体患者的具体情况(包括体型、体重、年龄、性别、疾病的性质和阶段、疾病的侵袭性以及组合物的施用途径)来确定。本文所用的“单位剂量”是指在给定时间点对要接种的受试者施用的物理上离散的疫苗的量，其中每个单位剂量单独或共同含有预定量的蛋白抗原编码多核苷酸或蛋白质抗原，以产生所需水平的保护性免疫或治疗功效。在给定时间点给予的单位剂量可以包括多次注射(例如2、3、4、5、6次等)，总计单位剂量。

初免和加强组合物以足以预防或治疗有效的量施用。特别有利的是将本申请的药物组合物配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的均匀性。确切的量可以显著地变化，具体取决于所免疫动物的物种和体重、施用途径、初免和加强组合物的效力和剂量、所治疗或预防的疾病状态的性质、受试者免疫系统产生免疫反应的能力以及所需的保护程度或治疗效果。基于这些变量，医学或兽医从业者可以很容易地以确定适当的剂量水平。

作为一般建议，初免组合物中的多核苷酸表达载体和加强组合物中的蛋白抗原的量可以配制为范围为约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的单位剂量，无论是通过一次或多次施用。在更具体的实施方案中，初免组合物中的多核苷酸表达载体和/或加强组合物中的蛋白抗原以约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天以及10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的重量范围施用。

在其他实施方案中，初免组合物中的多核苷酸表达载体和/或加强组合物中的蛋白抗原以每次注射1ng-10ng、每次注射10ng-100ng、每次注射100ng-1μg、每次注射1μg-10μg、每次注射10μg-100μg、每次注射100μg-1mg、每次注射1mg-10mg、每次注射10mg-100mg、每次注射100mg-1000mg的剂量范围施用。

在一些实施方案中，初免组合物中的多核苷酸表达载体和/或加强组合物中的蛋白抗原在约1ng/kg至约100mg/kg的范围施用。在更具体的实施方案中，这些组分中的每一种可以以约1ng/kg至约10ng/kg、约10ng/kg至约100ng/kg、约100ng/kg至约1μg/kg、约1μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约100μg/kg、约100μg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg，约10mg/kg至约100mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、以及约1mg/kg至约15mg/kg的范围施用。

在某些具体实施方案中，初免组合物中的多核苷酸表达载体和/或加强组合物中的蛋白抗原以约0.0006、0.001、0.003、0.006、0.01、0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600和1000mg/天施用。

在一些实施方案中，单位剂量中初免组合物中的多核苷酸表达载体和/或加强组合物中的蛋白抗原的总量在1μg/kg至1mg/kg之间的范围内，例如5μg/kg-500mg/kg、10μg/kg-250μg/kg、或10μg/kg-170μg/kg。此外，在一些实施方案中，加强组合物中的蛋白抗原以5μg/kg-500μg/kg，例如10-100μg/kg的范围存在于组合物的单位剂量中。

为了提高本申请的加强组合物的有效性，可以使用多次注射来进行长时间的治疗或预防。在一些实施方案中，以间隔1-26周的多次施用向受试者施用加强组合物。在一些实施方案中，在施用初免组合物后约1至12周施用第一加强组合物，并且在第一次加强后约1至12周施用第二加强组合物。

在一些实施方案中，多次施用加强组合物，例如二至六次，例如三、四或五次。此外，加强组合物可以在初次施用后的不同时间施用。例如，在一个实施方案中，每3周、每4周、每6周、每8周或其组合施用加强组合物。在另一个实施方案中，在第0、4和12周施用加强组合物。治疗医师可以根据患者的反应(包括例如免疫应答、病毒载量等的评估)来确定是否增加或减少疫苗接种。

本申请的组合物的毒性和功效可以通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如用于测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，可以用LD50/ED50的比值表示。优选具有大治疗指数的组合物。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，但应注意设计将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以尽量减少对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。

施用途径

可以采用任何合适的施用途径或模式来通过粘膜途径(例如鼻、舌下、颊、直肠、阴道)向受试者提供治疗或预防有效剂量。通过本文所述的施用途径施用组合物可涉及使用多种电子/机械装置来分配本文所述的初免和加强组合物。例如，对于其中通过注射施用初免组合物的实施例，可以使用装置，例如配备有针头的注射器、自动注射器或笔式注射器来施用初免组合物。该装置可以通过被动方式递送加强组合物，需要受试者将制剂吸入鼻腔、上呼吸道和下呼吸道。或者，装置可以通过将剂量泵入或喷雾到鼻腔中来主动递送加强组合物。加强组合物可以通过一个或多个这样的装置递送至一个或两个鼻孔中，例如每个受试者使用一个装置或两个装置(每个鼻孔一个装置)。

本申请的组合物可以具有多种施用模式和途径。在优选的实施方案中，多核苷酸载体组合物通过肌内(IM)或皮内(ID)施用。通过任一途径，它们可以通过针注射、基因枪或无针喷射注射(例如，Biojector^TM(Bioject Inc.，波特兰，俄勒冈州)和/或微针贴片来施用。在一些情况下，也可以通过电转移(例如，免疫后立即向肌肉施加一系列电脉冲)来实现IM递送。其他施用方式包括口服、静脉内、腹膜内、肺内、玻璃体内和皮下接种。

在优选的实施方案中，蛋白质免疫原通过粘膜途径施用。粘膜施用途径包括例如鼻内、眼部、口腔、阴道或直肠以及局部途径。通过粘膜途径通过粘膜表面进入的施用可以通过多种方法进行，包括使用吸入剂、鼻喷雾剂、滴鼻剂、栓剂、微球体和微粒。在一些实施方案中，可以通过溶剂提取技术将免疫原封装在聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒中，例如Jones et al.,Infect.Immun.,64:489,1996和Jones et al.,Vaccine,15:814,1997中描述的技术。例如，可以用溶解在二氯甲烷中的PLG乳化免疫原，并且用含水聚乙烯醇(乳化稳定剂)乳化该油包水乳液以形成(油包水)水包双乳液。将这种双乳液添加到大量水中以消散二氯甲烷，从而导致微滴硬化形成微粒。通过离心收集这些微滴或微粒，洗涤数次以除去聚乙烯醇和残留溶剂，最后冻干。

制剂

示例性载体或赋形剂包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶、聚合物例如聚乙二醇、水、盐水、等渗水溶液、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、0.3％水溶液甘氨酸、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠，或用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白和球蛋白。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强治疗剂的保质期或有效性。在某些实施方案中，药学上可接受的载体包含血清白蛋白。

可以修改的制剂特性包括例如pH和重量克分子渗透压浓度。例如，可能希望获得具有与人体血液或组织相似的pH和渗透压的制剂，以促进该制剂在非肠道给药时的有效性。

缓冲剂在本公开中可用于控制药物制剂的总pH(特别是肠胃外施用所需要的)等目的。本领域已知的多种缓冲剂可用于本发明的制剂中，例如有机或无机酸、碱或氨基酸的各种盐，并且包括柠檬酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、马来酸盐、乳酸盐的各种形式、乙酸根、碳酸氢根或碳酸根离子。用于本公开组合物的肠胃外施用形式的特别有利的缓冲剂包括钠或钾缓冲剂，包括磷酸钠、磷酸钾、琥珀酸钠和柠檬酸钠。

氯化钠可用于调节溶液的张力，浓度为0-300mM(液体剂型最佳为150mM)。冻干剂型可包含冷冻保护剂，主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。

其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可包含填充剂，主要是1-10％甘露醇(最佳2-4％)。稳定剂可用于液体和冻干剂型，主要是1-50mM L-蛋氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸，可添加0-0.05％聚山梨醇酯-80(最佳为0.005-0.01％)。

在一个实施方案中，使用浓度约为20mM的磷酸钠以实现约7.0的pH。特别有效的磷酸钠缓冲系统包含一水合磷酸二氢钠和七水合磷酸氢二钠。当使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的这种组合时，各自的有利浓度为约0.5至约1.5mg/ml磷酸二氢钠和约2.0至约4.0mg/ml磷酸氢二钠，优选浓度为约0.9mg/ml磷酸二氢钠和约3.4mg/ml磷酸氢二钠。制剂的pH值根据缓冲液的用量而变化。

根据剂型和预期的施用途径，使用不同浓度的缓冲剂或使用其他添加剂来调节组合物的pH以涵盖其他范围可能是有利的。本公开的组合物的有用的pH范围包括约2.0的pH至约12.0的pH。

在一些实施方案中，本申请的药物组合物在无菌条件下作为冻干粉末储存并在施用前与无菌水溶液混合。所述水溶液可以根据需要含有接近物理条件的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，如上所述。或者，本申请的药物组合物可以在施用前以混悬剂、优选水性混悬剂的形式储存。

本公开的药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如鞘内、动脉内、静脉内、皮内、皮下、口服、经皮(局部)和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。pH值可以用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外组合物可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。可注射组合物应该是无菌的，并且应该是流动性达到易于注射的程度。该组合物在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该保存以免受微生物例如细菌和真菌的污染作用。

载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。适当的流动性可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持。预防微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。

无菌注射溶液可通过将所需量的核酸/蛋白质免疫原与上文列举的成分中的一种或其组合掺入适当的溶剂中来制备，根据需要，随后过滤灭菌。一般而言，通过将核酸/蛋白质免疫原掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基本分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌的过滤溶液中产生活性核酸和/或蛋白质免疫原的粉末加上任何额外的所需成分。

全身施用可以通过经粘膜或经皮方式。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。

经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮给药，将药物组合物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。

试剂盒

另一方面，本申请提供了用于在受试者(例如哺乳动物或人)中引发针对呼吸道病原体的预防性或治疗性免疫应答的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含(a)初免组合物，其包含编码呼吸道病原体的抗原肽的多核苷酸载体，配制用于皮下或肌内注射；(b)包含呼吸道病原体的抗原肽的加强组合物，其配制用于粘膜递送。

在一个实施方案中，本申请提供了一种粘膜疫苗试剂盒，其包含：(a)含有呼吸道病毒基因的多核苷酸载体，该基因可操作地连接至用于表达由该基因编码的呼吸道病原体蛋白的启动子，任选地，其中初免组合物被配制用于皮下注射注射；(b)一种或多种加强组合物，各自含有呼吸道病原体蛋白和一种或多种佐剂，任选地，其中加强组合物被配制用于鼻内施用，和(c)一种或多种药学上可接受的载体，其中所述初免组合物中的多核苷酸载体编码存在于一种或多种加强组合物中的相同病毒蛋白。

在一个实施方案中，本申请提供了一种RSV粘膜疫苗试剂盒，其包含：(a)多核苷酸载体，其包含可操作地连接到用于表达全长、膜结合的RSV pre-F蛋白的启动子的RSV pre-F基因，任选地配制在用于肌内注射的初免组合物中；(b)(a)中的RSV pre-F蛋白的胞外结构域，任选地配制在用于鼻内递送的加强组合物中；(c)单独的CpG 7909或CpG 7909和单磷酰脂质A(MPL)，和(d)无载体、一种或多种药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，第一免疫组分被配制用于肌内施用，而第二免疫组分被配制用于粘膜施用，例如鼻内、舌下、含服或通过吸入施用。

在一些实施方案中，试剂盒还包括监测受试者体内对免疫原性组合物的免疫应答的诊断试剂，包括免疫原性组合物中存在的多核苷酸和抗原及其检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括本文公开内容中描述的一种或多种佐剂。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括本文公开内容中描述的并且配制为与用于免疫的多核苷酸或蛋白质组合物一起使用的一种或多种载体和赋形剂，或者它们可以单独包装。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于施用如上所述的初免组合物和/或加强组合物的一种或多种递送装置。

另外，试剂盒可包括使用说明，包括预防性施用的说明(例如，无辅助疫苗接种和加强的DNA或蛋白质)，包括建议的剂量和/或施用模式，如本文所述。

通过以下实施例进一步说明本申请，但不应将其视为限制。本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图和表格均通过引用并入本文。

实施例

实施例1：在棉鼠模型中测试粘膜RSV疫苗的免疫原性、保护功效和安全性的研究设计

预计用定制和优化的DNA疫苗载体对动物进行初免将决定粘膜RSV疫苗制剂的最终安全结果，尽管各种给药制剂，例如单独应用pre-F+CpG疫苗，在RSV活病毒攻毒实验中单独应用时可能导致一些肺部病理学症状。MPL被认为能够减轻不良影响。

当使用优化的DNA载体时，可能不需要将MPL纳入在pre-F+CpG+MPL组中来避免诱导肺组织病理学。据推测，一次DNA初免和一轮CpG佐剂加强可能足以实现最佳中和抗体应答和鼻腔保护。

总体研究设计

本研究中的动物组的概要显示在图1中。图2总结了棉鼠模型中RSV疫苗免疫和攻毒研究的设计。

对RSV融合前F蛋白候选疫苗的有效性和安全性进行了评估，其中肌内pre-FLlfhDNA初免(SEQ ID NO:1)(其使用人源化密码子表达全长RSV A2毒株融合后F基因，其在NTC8385-VAIDNA载体(SEQ ID NO:4)中为565个氨基酸长(SEQ ID NO:2)，缺失9个氨基酸的融合肽(SEQ ID NO:3)，其中使用人源化密码子表达的全长RSV A2-毒株融合前F基因(DS-Cav1)为574个氨基酸(SEQ ID NO:5)，未删除9个aa的融合肽)，随后用辅有CpG和MPL的pre-sFfs蛋白(SEQ ID NO:6)(513个氨基酸长，截短的RSV融合前F蛋白，没有缺失9个氨基酸融合肽)制剂进行鼻内加强(第6组)或在棉鼠(Sigmodon.hispidus)RSV A/A2攻毒模型中单独使用CpG(第7、8组)。还提供了：RSV-F-A2密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。

pre-F/CpG加强在pre-F DNA初免后3周和6周给予两次(第8组)，或在初免后4周给予一次(第7组)。在初免后4周施用pre-F/CpG/MPL加强。参见图2。

如图2所示，对照组动物用pre-F DNA进行肌内免疫且不加强免疫(第5组)。原发感染对照组用PBS进行模拟免疫，然后用RSV A/A2进行感染(第2组)。正常大鼠对照用PBS进行模拟攻毒(第1组)。继发感染对照组感染RSV A/A2，并在七周后再次感染(第4组)。疫苗强化疾病对照组用FI-RSV免疫两次，间隔4周，并在第二次免疫后三周感染RSV(第3组)。

疫苗制剂和佐剂测试

本研究中使用的CpG佐剂7909是从NIH支持的BEI资源获得的。

RSV融合前F表达DNA：配制Pre-F DNA疫苗，并以50μg/100μ1/动物(25μg/50μ1/条腿，左右后腿，IM)对动物进行初免。加强剂配方：Pre-F+CpG(15μgpre-F+20μg CpG，25μl/动物；鼻内(IN)，pre-F+CpG+MPL(15μg pre-F+20μgCpG+5μg MPL/25μl/动物，IN)。

动物：

根据美国国立卫生研究院指南和Sigmovir机构动物护理和使用委员会批准的动物研究协议(IACUC协议#15)，在兽医监督下饲养和处理了50只同系繁殖的6～8周龄的雄性和雌性刚毛棉鼠(来源：Sigmovir Biosystems,Inc.,Rockville MD)。每组动物包括3只雌性(每组中的前3只动物)和2只雄性(每组中的最后2只动物)。将棉鼠饲养在透明的聚碳酸酯笼中，并提供标准啮齿动物饲料(Harlan#7004)和自来水。用耳标识别研究中的动物。

采血：眶后窦采血

感染/初免途径：鼻内(i.n.)接种

病毒：

呼吸道合胞病毒株A/A2(RSV A/A2)(ATCC,Manassas,VA)经过连续空斑纯化以减少缺陷干扰颗粒后在HEp-2细胞中繁殖。在该体内实验中使用了hRSV A/A2 Lot#092215SSM病毒库，其在蔗糖稳定介质中含量约3.0×10⁸pfu/mL。该病毒储存于-80℃，并已在棉鼠模型中进行了体内表征，并验证了上呼吸道和下呼吸道的复制能力。

终点测定设计：

终点测定方法

1.肺和鼻病毒滴定

肺和鼻匀浆通过离心澄清并在EMEM中稀释。在24孔板中用稀释的匀浆分别感染两组融合的HEp-2单层。在5％ CO₂培养箱中于37℃孵育一小时后，用0.75％甲基纤维素培养基覆盖孔。孵育4天后，除去覆盖物，用0.1％结晶紫染色剂固定细胞一小时，然后冲洗并风干。对空斑进行计数，病毒滴度以每克组织的空斑形成单位进行表示。病毒滴度计算为一组动物在给定时间的几何平均值±标准误差。

2.RSV中和抗体测定(降低60％)

热灭活血清样品用EMEM以1:10稀释，并进一步1:4连续稀释。将稀释的血清样品与RSV(25-50PFU)在室温下温育1小时，并分别接种到24孔板中两组融合的HEp-2单层上。在5％ CO₂培养箱中于37℃培养一小时后，用0.75％甲基纤维素培养基覆盖孔。孵育4天(RSVB为6天)后，除去覆盖物，用0.1％结晶紫染色剂固定细胞一小时，然后冲洗并风干。

使用统计程序“plqrd.manual.entry”，在病毒控制的60％降低终点测定相应的中和抗体滴度倒数。计算一组动物在给定时间的几何平均值±标准误差。

3.肺组织病理学

解剖肺并用10％中性缓冲福尔马林填充至其正常体积，然后浸入相同的固定液中。固定后，将肺包埋在石蜡中，切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。评估肺部炎症的四个参数：毛细支气管周围炎(毛细支气管周围的炎症细胞浸润)、血管周围炎(小血管周围的炎症细胞浸润)、间质性肺炎(炎症细胞浸润和肺泡壁增厚)和肺泡炎(肺泡腔内的细胞))。切片按0-4严重程度进行盲评分。随后将分数转换为0-100％组织病理学量表。

4.实时PCR

使用RNeasy纯化试剂盒(QIAGEN)从匀浆组织或细胞中提取总RNA。使用SuperScript II RT(Invitrogen)和寡聚dT引物(1μ1,Invitrogen)，使用1μg总RNA制备cDNA。按照最终体积25μ1、最终引物浓度0.5μM使用Bio-Rad iQTM SYBR Green Supermix进行实时PCR反应。反应在96孔托盘中平行进行两组。在Bio-Rad iCycler上按照95℃3分钟进行1个循环，然后按照95℃10秒、60℃10秒、72℃15秒进行40个循环。采用iQ5软件在PCR基线扣除曲线拟合模式下计算基线循环和循环阈值(Ct)。DNA的相对定量适用于所有样品。标准曲线是使用连续稀释的目标转录物最富集的cDNA样品(例如，FI-RSV免疫动物在RSV感染后6小时的肺)绘制的。Ct值根据log10 cDNA稀释因子绘制。这些曲线用于将不同样品获得的Ct值转换为相对表达单位。然后将这些相对表达单位归一化为相应样品中表达的肌动蛋白mRNA(“管家基因”)的水平。对于动物研究，mRNA水平表示为给定时间组中所有动物的几何平均值±SEM。

实施例2：粘膜RSV疫苗在棉鼠模型中的免疫原性、保护功效和安全性

1.攻毒前疫苗的免疫原性

如图3所示，Pre-F DNA初免仅引发低水平的抗RSV F蛋白特异性血清IgG。两轮FI-RSV给药提高了抗RSV F蛋白特异性血清IgG的水平。相比之下，三组用pre-F DNA初免并用三种不同的pre-F制剂/频率加强的动物产生高水平的抗RSV F蛋白特异性血清IgG，其效果与诱导的RSV A2活病毒感染的效果相同。三种初免和加强策略表现出了强大的协同免疫反应，这与血清中和抗体滴度的大幅提高和出色的鼻保护效果密切相关。

肺病毒滴度

鼻内RSV攻毒后5天后评估棉鼠肺部的RSV A/A2载量。如图4中的图A所示，用PBS模拟免疫的RSV感染的动物(第2组)肺部组织滴度为5.1Log10PFU/g，并被用作所有其他RSV感染组的对照。福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)免疫(第3组)温和但显著地将肺RSV滴度降低至3.7Log10 PFU/g组织。在两次感染RSV的动物(第4组)的肺部未检测到病毒。此外，在任何用pre-F DNA初免但未加强免疫的动物组(第5组)或用pre-F DNA初免并用各种疫苗组合加强的动物组(第6、7、8组；与第2组相比，p<0.05)的肺部均未检测到病毒。

鼻病毒滴度

鼻内RSV攻毒5天后评估棉鼠鼻中的RSV A/A2载量。该分析的结果如图4中的图B所示。用PBS模拟免疫的RSV感染的动物(第2组)在鼻中的病毒滴度为6.2Log10 PFU/g，并被用作所有其他RSV感染组的对照。FI-RSV免疫(第3组)对鼻中的RSV载量没有影响(5.99Log10PFU/g)。两次感染RSV的动物(第4组)鼻部未检测到病毒。单独用pre-F DNA免疫使鼻中RSV滴度降低2Log10PFU/g(第5组)。使用pre-F DNA进行免疫，然后施用一次辅以CpG/MPL(第6组)或CpG(第7组)的pre-F进行加强免疫，导致在鼻中近乎完全(每组1/5动物中可检测到单个斑块)的保护。用pre-F/CpG对Pre-F DNA免疫的动物进行两次加强，在鼻中产生灭菌免疫(第8组)。

血清RSV A/A2中和抗体

在实验开始前(第0天)、第一次免疫后4周(第28天)和三周后(第49天)测量所有动物的针对RSV A/A2的血清中和抗体(NA)。

如图5所示，用pre-F DNA免疫并分别在第21天和第42天用pre-F/CpG加强两次(第8组)的动物在第28天和第49天产生最高的NA滴度。用pre-F DNA免疫并模拟加强的动物在第28和第49天保持了相当的NA水平。用pre-FCpG/MPL(第6组)或用CpG(第7组)对pre-F DNA初免的动物进行一次加强后，第49天相对于第28天进一步提高了中和抗体滴度。

与单次加强相比，用添加CpG佐剂的pre-F进行两轮加强并没有显著增强Nab应答。第49天时，所有三种类型的加强均将中和抗体增加至高于RSV感染动物的水平。

血清RSV A/A2结合IgG抗体

在实验开始前(第0天)、第一次免疫后4周(第28天)和三周后(第49天)测量所有动物的针对RSV A/A2 F蛋白的血清结合IgG抗体。如图3所示，在接种FI-RSV的动物中可见结合IgG的增加。仅用pre-F DNA免疫的动物结合IgG的水平较低。使用pre-F DNA免疫并通过各种方法加强的动物在第49天时结合IgG的水平相当。鼻内施用pre-F/CpG显示出加强效果，在第21天和第28天以及第42天和第49天之间有所增加。第一次增长比第二次增长更为明显。

肺组织病理学

RSV A/A2鼻内攻毒5天后对所有动物进行肺组织病理学评估。该分析的结果显示在图6和图7中。用PBS模拟免疫(第2组)或用RSV攻毒两次(第4组)的RSV感染动物的病理学水平为中等。在用FI-RSV免疫的动物(第3组)中肺部组织病理学水平最高，表现出明显的间质炎症和肺泡炎。没有一种疫苗诱导肺部组织病理学达到FI-RSV免疫动物中所见的程度。与原发性或继发性RSV感染的动物(分别为第2组和第4组)相比，仅用pre-F DNA(第5组)进行免疫、或用pre-DNA/CpG进一步加强一次(第7组)或两次(第8组)的动物肺泡炎程度轻微升高(图6中图D和图7)。在所有评估的疫苗接种组中，用pre-F DNA免疫并用pre-F/CpG/MPL加强一次的动物的肺部病理学水平最低。

鼻内RSV攻毒后鼻和肺中IgA和IgG应答

使用收集的鼻和肺组织匀浆的上清液，在活RSV病毒攻毒5天后(第54天)测量针对RSV A/A2 F蛋白的鼻和肺结合IgA和IgG抗体。如图8中所示，图A：在navie组和PBS组中没有检测到鼻IgAs，表明在原发病毒感染后5天的时间不足以提高可检测到的IgA水平。所有感染前组和接种疫苗组的回忆性IgA应答均有所不同。通过评估鼻内病毒攻击后5天召回的鼻IgA，可以间接比较所有研究组中粘膜IgA应答的攻击前水平。在FI-RSV和pre-F DNA组中仅检测到低至中度的IgA应答。相比之下，最高的IgA应答出现在RSV A2感染的动物组以及这三个初免和加强疫苗组中。MPL似乎没有增强鼻腔IgA。两轮pre-F/CpG加强并未进一步提高总体IgA水平。一轮鼻内pre-F-CpG加强似乎足以提高鼻IgA的最佳水平，其效率与活RSV病毒感染相当。

如图8中图B所示，检测到肺部IgAs。在FI-RSV组中检测到最高的IgA应答，这可能与FI-RSV疫苗相关的保护性免疫力较低导致的活跃病毒感染有关。仅在单独的pre-F DNA组中检测到较低的IgA应答。在RSV A2感染组以及这三个初免和加强疫苗组中检测到相近的、中等水平的肺IgA水平。MPL未见增强肺部IgA的作用。两轮pre-F/CpG加强并未显著增加肺IgA的总体水平。

如图8中图C所示：在navie组和PBS组中没有检测到或检测到极少的鼻IgG，表明在原发病毒感染后5天的时间不足以提高IgG的可检测水平。鼻回忆性IgG应答模式与所有感染前和疫苗接种组的鼻IgA应答不同。通过评估鼻内病毒攻击后5天召回的鼻IgG，可以间接比较所有研究组中IgG应答的攻击前水平。在pre-F DNA组中检测到中等水平的IgG应答。在RSV A2感染的动物组、接种FI-RSV的动物组以及这三个初免和加强疫苗组中观察到高水平的鼻IgG应答。MPL似乎没有增强鼻IgG。两轮pre-F/CpG加强并没有进一步提高鼻IgG的整体水平。一轮鼻内pre-F-CpG加强似乎足以提高鼻IgG的最高水平，其效率与活RSV病毒感染相当。

如图8中图D所示：在初始病毒感染组和PBS组中未检测到或检测到极少的肺IgG，表明原发感染后5天的时间不足以提高肺IgG的可检测水平。肺部回忆性IgG应答模式与所有感染前和疫苗接种组的肺部IgA应答不同。肺IgG反应显示出与鼻IgG反应几乎相同。通过评估鼻内病毒攻击后5天召回的肺IgG，可以间接比较所有研究组中肺IgG应答的攻击前水平。在pre-F DNA组中检测到中等水平的IgG应答。在RSV A2感染组、FI-RSV疫苗接种组以及这三个初免和加强疫苗组中观察到高水平的肺部IgG应答。MPL似乎没有增强肺部IgG。两轮pre-F/CpG加强并未进一步提高总体肺IgG水平。一轮鼻内pre-F-CpG加强似乎足以提高肺部IgG的最高水平，其效率与活RSV病毒感染相当。

RSV攻毒后肺组织中RSV和细胞因子的mRNA表达

在RSV A/A2攻毒后第5天收集的肺样本中评估RSV NS1、IL-4、IL-2和IFN-γmRNA的表达，并通过每个样本中的β-肌动蛋白mRNA水平进行归一化。该分析的结果如图9所示。所有测试的疫苗组合均显著降低了NS-1mRNA的表达(不可检测)。与原发性(第2组)和继发性(第4组)RSV感染的动物相比，FI-RSV免疫(第3组)导致肺RSV NS1 mRNA水平一定程度降低，但IL-4mRNA水平显着增加(数据未显示)。在原发性RSV感染的动物(第2组)和RSV感染的FI-RSV免疫动物(第3组)中，IL-2的表达和IFN-γmRNA的表达一定程度升高(数据未显示)。此外，所有用测试疫苗免疫的动物中IL-4、IL-2和IFN-γmRNA水平均未超过模拟感染动物(第1组)或原发性RSV感染动物(第2组)中观察到的水平(数据未显示)。

结论

在RSV A/A2攻毒的棉鼠Sigmodon hispidus模型中评估了一种RSV融合前F蛋白候选疫苗的有效性和安全性，该疫苗基于肌肉注射pre-FLlfn DNA进行初免，然后用添加CpG和MPL或单独CpG佐剂的pre-sFfs制剂进行鼻内加强。分别在用pre-F DNA初免后3周和6周进行两次pre-F/CpG加强，或在初免后4周进行一次。初免后4周进行一次pre-F/CpG/MPL加强免疫。对照组动物用pre-FDNA进行肌内免疫，但不进行加强免疫。初次感染对照组用PBS模拟免疫，然后用RSV A/A2感染。继发感染对照组感染RSV A/A2，七周后再次感染。疫苗强化疾病对照组用FI-RSV免疫两次，间隔4周，并在第二次免疫后3周感染RSV。

在任何用pre-F DNA免疫(无论是否加强)的动物组的肺部均未检测到病毒。使用pre-F DNA进行免疫可使鼻中RSV滴度降低2Log10 PFU/g。用pre-F/CpG对pre-F DNA免疫的动物进行两次加强免疫，导致在动物鼻中产生灭菌免疫。其他加强策略显著改善了鼻部保护，仅可检测到单个斑块。

所有测试的疫苗接种策略均可诱导高水平的针对RSV的中和抗体(NA)和结合IgG。在接种FI-RSV的动物中可以看到结合IgG的增加。仅用pre-F DNA免疫的动物显示出低水平的结合IgG。使用pre-F DNA免疫并通过不同方法加强的动物在第49天时的结合IgG水平相当。鼻内施用pre-F/CpG显示出加强效果，在第21天和第28天以及第42天和第49天之间有所增加。第一次增长比第二次增长更明显。

对于使用含有CpG和/或MPL的pre-F进行加强，使用含CpG佐剂的pre-F进行两次加强比使用含CpG或CpG/MPL佐剂的pre-F进行一次加强可产生更好的NA应答。所有测试疫苗诱导的IL-4、IL-2或IFN-γmRNA表达均未超过原发性RSV感染表现出的水平。安全性或组织病理学特征非常重要，尤其是对于呼吸道感染和/或疫苗诱导的免疫。我们的数据集显示，优化后的pre-F DNA载体能诱导弱Thl偏向或平衡Thl/Th2应答，为这三种初免和加强疫苗方案的安全性奠定了基础，并最终确定了组织病理学结果。无论加强剂配方和鼻腔内给药频率如何，这三种初免和加强策略都无法改变初免疫苗最初建立的组织病理学/安全性特征。换言之，CpG佐剂化蛋白加强疫苗无法像以前单独接种时所报告的那样诱导显著的组织病理学。

总体而言，pre-F DNA免疫本身诱导了肺部的灭菌免疫，在仅评估肺部保护时掩盖了各种加强制剂的功效。然而，pre-F-DNA免疫后的加强对于改善鼻保护和增强抗体应答是必要且有益的。Pre-F/CpG施用两次在改善鼻保护方面效果最佳，并在Pre-F DNA初免后施用时在鼻中提供灭菌免疫。

增强粘膜保护和IgA的加强制剂可以是1)单独的蛋白质+CpG或2)蛋白质+CPG和MPL组合。单独使用CpG作为佐剂似乎足以提供最佳保护，且不会影响安全性。粘膜IgA是粘膜免疫的标志。通过使用本文定制的初免和加强策略，本申请克服了在没有MPL的情况下使用CpG作为佐剂的问题。这是本申请的一个令人惊讶的关键发现。

尽管上面已经描述了各种实施例，但是应当理解的是，这样的公开仅通过示例的方式呈现并且不是限制性的。因此，主题组合物和方法的广度和范围不应受到任何上述示例性实施例的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同物来定义。

上述描述的目的是教导本领域的普通技术人员如何实践本发明，并不旨在详细描述本发明的所有那些明显的修改和变型，这些修改和变型对于技术人员在阅读本说明书后将变得显而易见。然而，所有这些明显的修改和变化都旨在包括在由所附权利要求限定的本发明的范围内。除非上下文特别指出相反的情况，权利要求旨在覆盖有效满足其预期目标的任何顺序的组件和步骤。

Claims (22)

1.一种治疗或预防受试者的呼吸道和/或粘膜传播病原体感染的症状的方法，包括以下步骤：

(1)向所述受试者施用有效量的初免组合物，所述初免组合物包含编码所述呼吸道病原体的蛋白抗原的基于核酸的表达系统；和

(2)向所述受试者施用有效量的包含所述呼吸道病原体的蛋白抗原的加强组合物，

其中所述初免组合物经非粘膜施用于受试者，并且

其中所述加强组合物经粘膜施用。

2.根据权利要求1的方法，其中所述呼吸道或粘膜传播病原体是病毒。

3.根据权利要求2的方法，其中所述病毒选自呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、MERS-CoV、流感病毒、偏肺病毒、副流感病毒、人鼻病毒、单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒。

4.根据权利要求1的方法，其中所述呼吸道病原体是RSV。

5.根据权利要求4的方法，其中所述蛋白抗原是选自融合(F)蛋白、融合前-F(pre-F)蛋白、糖蛋白G、磷蛋白(P)、核衣壳(N)蛋白、基质(M)蛋白和小疏水(S H)蛋白的RSV抗原。

6.根据权利要求5的方法，其中所述RSV抗原是RSV pre-F蛋白。

7.根据权利要求5的方法，其中多核苷酸载体包含与启动子可操作连接的R SV pre-F基因，用于表达全长、膜结合的RSV pre-F蛋白。

8.根据权利要求6或7的方法，其中多核苷酸载体编码包含核苷酸序列SED ID NO：2的密码子优化的pre-F核苷酸序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述初免组合物通过选自肌内、静脉内、腹膜内、皮内和皮下途径之一的非粘膜途径施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述初免组合物经肌内施用。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述加强组合物通过选自鼻内和吸入途径之一的粘膜途径施用。

12.根据权利要求11的方法，其中所述加强组合物经鼻内施用。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述加强组合物包含一种或多种佐剂。

14.根据权利要求13的方法，其中所述一种或多种佐剂包含CpG寡核苷酸(C pG-ODN)。

15.根据权利要求14的方法，其中所述一种或多种佐剂包含CpG 7909。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种佐剂包含单磷酰脂质A(MPL)。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述加强组合物是雾化或喷雾制剂。

18.一种治疗或预防受试者的RSV感染的症状的方法，包括以下步骤：

(3)向所述受试者施用有效量的初免组合物，所述初免组合物包含在启动子控制下编码RSV抗原的多核苷酸表达载体；和

(4)向所述受试者施用有效量的加强组合物，所述加强组合物包含一种或多种雾化/喷雾制剂，所述制剂包含单独的RSV抗原或与多核苷酸表达载体组合的R SV抗原，以及一种或多种佐剂，

其中所述一种或多种佐剂包含CpG寡核苷酸和/或单磷酰脂质A(MPL)，并且

其中所述初免组合物经肌内(或皮下、皮内)施用，并且所述加强组合物经鼻内施用。

19.根据权利要求18的方法，其中所述RSV抗原是RSV pre-F蛋白。

20.一种RSV粘膜疫苗，包含：

有效量的RSV pre-F蛋白；和

包含CpG和/或MPL的佐剂，

其中所述疫苗被配制用于鼻内施用。

21.一种疫苗试剂盒，包括：

(a)包含多核苷酸载体的初免组合物，所述初免组合物包含编码呼吸道或粘膜传播病原体的蛋白抗原的多核苷酸载体；和

(b)包含所述呼吸道或粘膜传播病原体的蛋白抗原的加强组合物，

其中所述初免组合物被配制用于肌内或皮下或皮内施用，并且其中所述加强组合物被配制用于鼻内施用。

22.根据权利要求21的试剂盒，其中所述呼吸道病原体是RSV，其中所述蛋白抗原是RSVpre-F蛋白。