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CN118497151B - 表达trail的重组溶瘤流感病毒及应用 - Google Patents

表达trail的重组溶瘤流感病毒及应用 Download PDF

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CN118497151B CN202410924690.3A CN202410924690A CN118497151B CN 118497151 B CN118497151 B CN 118497151B CN 202410924690 A CN202410924690 A CN 202410924690A CN 118497151 B CN118497151 B CN 118497151B
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Abstract

本发明公开了表达TRAIL的重组溶瘤流感病毒及应用。属于生物医药技术领域。该病毒是通过将TRAIL基因插入流感病毒HA基因片段中，然后利用流感病毒反向遗传学8质粒系统操作技术拯救得到具有复制能力和感染能力的重组流感病毒，该病毒在肿瘤细胞内能够稳定表达TRAIL蛋白，TRAIL蛋白借助HA三聚体结构形成具有生物学活性的同源三聚体形式，能够与肿瘤细胞表面受体DR4，DR5结合，从而启动死亡受体途径，特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。本发明的重组溶瘤流感病毒具有杀伤肿瘤靶向性高、安全性好的优点，可用于对肿瘤的治疗。

Description

表达TRAIL的重组溶瘤流感病毒及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及表达TRAIL的重组溶瘤流感病毒及应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。目前恶性肿瘤的治疗方式以手术切除和化疗为主，辅以放疗和靶向治疗。尽管这些治疗方法已经大大改善了患者的预后，但是仍然存在严重的毒副作用、耐药性等问题，因此，亟需探寻一种新的更为有效和安全的治疗方法。溶瘤病毒疗法近年来被证明是一种很有希望的肿瘤免疫疗法，具有靶向性好、安全性高、复制性好、杀伤效果好和毒副作用小等优点，因此越来越受到人们的关注和重视，成为肿瘤治疗研究领域的热点。
流感病毒（Influenza virus）是一种RNA病毒，其基因组由8个分节段、负链单股RNA组成。早在1904年，就有报道称：部分肿瘤患者在感染甲型流感病毒后，肿瘤出现消退。近年来，随着反向遗传学操作技术的迅猛发展，溶瘤流感病毒的研究越来越多。其原因主要有四点：1、流感病毒颗粒免疫原性强，能够诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫，引起机体的抗肿瘤免疫；2、流感病毒为负链RNA病毒，没有逆转录酶活性和DNA整合活性，其基因不会整合到宿主细胞基因组中，相对于DNA病毒来说，其安全性更高；3、流感病毒基因组为分节段的独立的8个RNA片段，可利用反向遗传学的方法分别对不同的基因片段进行改造，操作简单；4、流感病毒的HA、NA、NS、PA等基因均可携带外源基因，表达外源蛋白，可诱导机体产生强烈的、特异性抗肿瘤免疫。
血凝素（hemagglutinin, HA）是流感病毒表面含量最多的膜蛋白，介导病毒与宿主细胞的吸附，也是病毒最重要的表面抗原。成熟病毒颗粒的HA蛋白为同源三聚体形式，每个单体由近膜端的颈状结构（stem，HA2）和球状的头部结构（head，HA1）组成，流感病毒通过HA1蛋白上的受体结合位点（Receptor Binding sites，RBS）与宿主细胞表面的唾液酸受体结合进入细胞，在HA2介导下，再与细胞中的内吞体发生膜融合从而释放病毒基因组进入宿主细胞中。作为流感病毒颗粒表面含量最多的抗原分子，通过对HA基因进行修饰改造，可将外源基因呈递在病毒颗粒的表面。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL），也称为Apo-2L，是TNF家族的成员。TRAIL属于跨膜蛋白，编码281个aa，主要以活性三聚体形式与肿瘤细胞表面的死亡受体DR4，DR5结合，激活受体相关死亡结构域（FADD）并募集pro-caspase 8和pro-caspase 10，形成死亡诱导信号传导复合体（death inducing signal complex，DISC），之后pro-caspase 8和pro-caspase 10经泛素化等作用后形成活性caspase 8和caspase 10，并激活下游的效应因子caspase 3、caspase6和caspase 7，启动死亡受体途径的凋亡信号。同时，活化的caspase 8还可切割Bid形成tBid，使线粒体释放细胞色素C参与形成凋亡小体，激活caspase 9，启动线粒体途径的凋亡信号。研究表明：TRAIL不仅可以诱导多种肿瘤细胞死亡，而且对正常细胞不会产生毒副作用，通过与其他药物联合作用后还能产生更好的协同作用，此外，TRAIL以非常低的程度激活NF-κB，因此，TRAIL作为一种新型抗肿瘤药物受到广泛关注，在肿瘤的临床治疗和研究中都具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高肿瘤的免疫治疗效果，尤其是对结直肠癌的治疗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种表达TRAIL蛋白的重组溶瘤流感病毒，名称为rFlu-TRAIL。所述重组溶瘤流感病毒为①或②：
①含有名称为TRAIL蛋白质的流感病毒；
②表达所述TRAIL的流感病毒；
所述TRAIL为下述1）或2）或3）的蛋白质：
1)氨基酸序列是SEQ ID NO：1的蛋白质，由序列SEQ ID NO：2的第193-756位核苷酸编码；
2)在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由1）衍生的蛋白质；
3)在1）或2）的C端和/或N端连接标签和/或其他基因得到的融合蛋白质。
上述重组溶瘤流感病毒的基因组为8个单股负链、分节段的RNA，所述重组溶瘤流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB2-RNA、PA-RNA、PB1-RNA、NP-RNA、NA-RNA、HA-TRAIL-RNA、M-RNA和NS-RNA；
所述PB2-RNA为编码流感病毒毒株中PB2基因的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA基因的RNA；
所述PB1-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB1基因的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP基因的RNA；
所述NA-RNA为编码所述流感病毒毒株中NA基因的RNA；
所述HA-TRAIL-RNA为编码所述重组基因HA-TRAIL的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M基因的RNA；
所述NS-RNA为编码所述流感病毒毒株中NS基因的RNA。
上述重组溶瘤流感病毒中，所述成套正链RNA也可仅由所述PB2-RNA、所述PA-RNA、所述PB1-RNA、所述NP-RNA、所述NA-RNA、所述HA-TRAIL-RNA、所述M-RNA和所述NS-RNA组成。
上述重组溶瘤流感病毒中，所述重组基因HA-TRAIL-RNA的序列为在所述流感病毒毒株HA基因的SS和HA1之间依次插入（G4S）3 linker基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第148-192位核苷酸；TRAIL蛋白的第95-281aa对应的基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第193-756位核苷酸；（G4S）2 linker基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第757-801位核苷酸，其他核苷酸均不变得到的序列。
所述流感病毒毒株为甲型流感病毒任一亚型或乙型流感病毒任一谱系。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述重组溶瘤流感病毒的构建方法，所述方法包括将含有编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NS-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、将含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组溶瘤流感病毒。
在上述方法中，所述载体为pHW2000质粒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
（1）所述的重组溶瘤流感病毒的基因组；
（2）用于治疗肿瘤的成套载体，即含有所述TRAIL的编码基因的载体；
（3）用于治疗肿瘤的成套表达盒，即含有所述TRAIL的编码基因的表达盒；
（4）用于治疗肿瘤的成套基因，即所述TRAIL的编码基因；
（5）用于治疗肿瘤的成套蛋白质，即所述TRAIL蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述重组溶瘤流感病毒相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：
（1）编码所述重组溶瘤流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子；所述成套DNA分子由编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子、编码所述NA-RNA的DNA分子、编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子、编码所述M-RNA的DNA分子和编码所述NS-RNA的DNA分子组成；
（2）成套载体；所述成套载体由含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NS-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体组成；
（3）含有所述重组溶瘤流感病毒的微生物；
（4）含有所述重组溶瘤流感病毒的动物细胞系；
（5）含有所述重组溶瘤流感病毒的动物组织；
（6）含有所述重组溶瘤流感病毒的动物器官。
上述生物材料中，所述动物细胞系，所述动物组织和所述动物器官均不包括繁殖材料。
上述生物材料中，所述微生物、所述动物细胞系、所述动物组织和所述动物器官均可作为流感病毒的寄主。
在本发明的一个实施例中，（2）中所述含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-PB2，所述含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-PA，所述含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-PB1，所述含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-NP，所述含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-NA，所述含有编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-HA-TRAIL，所述含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-M，所述含有编码所述NS-RNA的DNA分子的重组载体为pHW2000-NS。所述pHW2000-HA-TRAIL可表达SEQ ID NO：1所示的TRAIL蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗肿瘤的药物，所述药物的活性成分为所述重组溶瘤流感病毒。
上述药物的活性成分还可为将所述重组溶瘤流感病毒和其它治疗肿瘤药物进行组合得到的组合物作为活性成分。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
（1）所述重组溶瘤流感病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用；
（2）所述产品在制备治疗肿瘤药物中的应用；
（3）所述生物材料在制备治疗肿瘤药物中的应用；
（4）所述治疗肿瘤的药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明中所述肿瘤可为实体肿瘤。所述肿瘤具体可为结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌或神经胶质瘤。
实验证明，本发明的重组溶瘤流感病毒（rFlu-TRAIL）表达的TRAIL蛋白为嵌合在病毒HA上的融合蛋白，能够借助HA三聚体的结构形成具有活性的同源三聚体形式，可特异性的与肿瘤细胞表面表达的DR4，DR5受体结合，启动肿瘤细胞凋亡途径，达到特异性杀伤肿瘤的目的。体内外实验证实该溶瘤病毒能够特异性抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织的生长，治疗后小鼠体重没有明显下降，且延长了小鼠生存期，该重组溶瘤流感病毒具有较好的肿瘤生长抑制效果和生物安全性，可用于肿瘤的治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的溶瘤机制模式图；
图2为本发明实施例1中重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的重组基因HA-TRAIL结构改造策略；
图3为本发明实施例2中鉴定鸡胚中P1代重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的HA血凝效价；
图4 为本发明实施例2中RT-PCR鉴定重组溶瘤流感病毒基因组中目的基因HA-TRAIL，上样顺序依次为（1：5000 DNA Marker；2：重组基因HA-TRAIL；3：重组基因HA-TRAIL；4：野生型病毒的HA）；
图5为本发明实施例2中重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL在电镜下的形态结构图；
图6为本发明实施例3中流式细胞术检测肿瘤细胞CT26凋亡结果，其中，A为流式细胞仪结果；B为统计结果；
图7为本发明实施例3中重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的复制动力结果；
图8为本发明实施例4中肿瘤组织生长曲线图；
图9为本发明实施例4中小鼠肺组织HE病理切片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
重组溶瘤流感病毒的拯救
本发明提供了一种重组溶瘤流感病毒，名称为rFlu-TRAIL，该重组溶瘤流感病毒表达名称为TRAIL的蛋白质，TRAIL为氨基酸序列是SEQ ID NO：1的蛋白质，由SEQ ID NO：2中的第193-756位核苷酸编码。
TSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG，SEQ ID NO：1。
atgaaggcaaacctactggtcctgttatgtgcacttgcagctgcagatgcagacacaatatgtataggctaccatgcgaacaattcaaccgacactgttgacacagtactcgagaagaatgtgacagtgacacactctgttaacctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgcagaaagacccaaagtaagagatcaagctgggaggatgaactattactggaccttgctaaaacccggagacacaataatatttgaggcaaatggaaatctaatagcaccaatgtatgctttcgcactgagtagaggctttgggtccggcatcatcacctcaaacgcatcaatgcatgagtgtaacacgaagtgtcaaacacccctgggagctataaacagcagtctcccttaccagaatatacacccagtcacaataggagagtgcccaaaatacgtcaggagtgccaaattgaggatggttacaggactaaggaacattccgtccattcaatccagaggtctatttggagccattgccggttttattgaagggggatggactggaatgatagatggatggtatggttatcatcatcagaatgaacagggatcaggctatgcagcggatcaaaaaagcacacaaaatgccattaacgggattacaaacaaggtgaacactgttatcgagaaaatgaacattcaattcacagctgtgggtaaagaattcaacaaattagaaaaaaggatggaaaatttaaataaaaaagttgatgatggatttctggacatttggacatataatgcagaattgttagttctactggaaaatgaaaggactctggatttccatgactcaaatgtgaagaatctgtatgagaaagtaaaaagccaattaaagaataatgccaaagaaatcggaaatggatgttttgagttctaccacaagtgtgacaatgaatgcatggaaagtgtaagaaatgggacttatgattatcccaaatattcagaagagtcaaagttgaacagggaaaaggtagatggagtgaaattggaatcaatggggatctatcagattctggcgatctactcaactgtcgccagttcactggtgcttttggtctccctgggggcaatcagtttctggatgtgttctaatggatctttgcagtgcagaatatgcatctga，SEQ IDNO：2。
（1）构建重组载体pHW2000-HA-TRAIL
在所述流感病毒毒株HA基因的SS和HA1之间依次插入（G4S）3 linker基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第148-192位核苷酸；TRAIL蛋白的第95-281aa对应的基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第193-756位核苷酸；（G4S）2 linker基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第757-801位核苷酸，其他核苷酸均不变得到的序列，得到重组基因HA-TRAIL，具体如图2所示。
TRAIL蛋白的第95-281aa对应的基因序列如SEQ ID NO：3所示。
acctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaa，SEQ ID NO：3。
经过双酶切、酶切连接、常规PCR、重叠延伸PCR、转化、筛选等技术构建重组载体pHW2000-HA-TRAIL，均按成熟的分子克隆技术进行。
（2）包装重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL
依照Effectene转染试剂盒说明书，用293T和MDCK细胞混合后（细胞数量比例为1:1）铺六孔板，3×105个细胞/孔，2ml/孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜，待细胞长到单层后即可用于转染。用重组载体pHW2000-HA-TRAIL与流感病毒其他基因的七个载体pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NA、pHW2000-PB1、pHW2000-PB2、pHW2000-NS等量混合，各载体浓度均稀释为250 ng/µl，转染至MDCK和293T混合细胞中，培养72h。
实施例2
重组溶瘤流感病毒鉴定、扩增和纯化
（1）血凝试验：将转染的6孔板置于-20 ℃和室温冻融3次，细胞裂解液经0.22μm膜过滤后接种9日龄SPF鸡胚，200 µl/枚，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养72h，将鸡胚放于-20 ℃ 1 h，收集尿囊液并测定血凝效价，结果如图3所示。
由图3可知：鸡胚扩增的P1代重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的HA血凝效价可以达到1:25，具有较好的复制动力。
（2）RT-PCR鉴定外源基因：用Trizol提取重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的RNA后，以设计的序列及插入的基因片段为参考，设计引物，扩增HA基因，进行琼脂糖凝胶电泳，比对片段大小进行初步鉴定，然后进行胶回收，测序后序列比对分析。结果如图4所示。
扩增HA的引物序列：
F: atgaaggcaaacctactgg，SEQ ID NO：4；
R: gcagtgcagaatatgcatctga，SEQ ID NO：5。
由图4可知：PCR鉴定野生型PR8流感病毒的HA基因条带大小约为2000bp，而重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL的重组基因HA-TRAIL条带大小约为2500bp，与预期条带大小一致。结果证实我们成功构建了重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL。
（3）电镜观察：收集重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL，经负染处理后，透射电镜对重组溶瘤流感病毒的颗粒形态和大小进行鉴定。结果如图5所示。
由图5可知：透射电镜观察rFlu-TRAIL形态，显示病毒多成圆球形，表面HA和NA等刺突蛋白清晰可见，病毒粒径多分布于80-120nm之间，与野生型甲型流感病毒形态大小一致。
实施例3 体外研究rFlu-TRAIL的溶瘤作用
（1）流式细胞术检测细胞凋亡：选用CT26细胞系铺24孔板，7×104个/孔，500 μl/孔，置37℃、5%CO2 培养箱培养过夜，待细胞长至单层后将24孔板内的培养基弃去后，用PBS 洗涤 3 次，加入MOI为0.1的重组溶瘤流感病毒 rFlu-TRAIL，并设立阴性对照，吸附 1h 后弃液，换新鲜 DMEM 培养基。按上述感染条件感染 24 h、48h、72 h 后，收集细胞，加入FITC- Annexin V/PI 室温下避光孵育，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，研究细胞凋亡机制在重组溶瘤病毒的溶瘤过程中所起的作用。结果如图6所示。
由图6可知：重组溶瘤流感病毒 rFlu-TRAIL感染CT26细胞24h后，细胞即出现明显的凋亡，凋亡比例达到约70%，在随后的48h及72h，细胞凋亡比例没有出现明显的变化，但是早期凋亡比例呈现时间依赖性减少，而晚期凋亡比例呈现时间依赖性增加；wtPR8组及对照组的细胞凋亡比例呈时间依赖性增加，二者之间没有明显差异，但两者凋亡细胞比例均远低于rFlu-TRAIL组，且具有显著性差异。证实重组溶瘤流感病毒 rFlu-TRAIL能够显著诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用。
（2）重组溶瘤流感病毒复制效率检测：选用人源结直肠癌HT29细胞系,以及鼠源结直肠癌CT26细胞系分别铺24孔板，7×104个/孔，500 μl/孔，置37℃、5%CO2培养箱培养过夜，待细胞长至单层后将24孔板内的培养基弃去后，用PBS洗涤3次，加入MOI依次为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10的重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL，并设立阴性对照，吸附1 h后弃液，换新鲜DMEM培养基。按上述感染条件感染72h后，收集细胞培养液，测定HA血凝效价，评价重组溶瘤流感病毒在肿瘤细胞中的感染和复制效率。结果如图7所示。
由图7可知：重组溶瘤流感病毒rFlu-TRAIL在CT26和HT29细胞中均能有效感染和复制，与wtPR8病毒相比，无显著性差异。证实重组溶瘤流感病毒在肿瘤细胞中具有较好的感染和复制效率。
实施例4 体内研究rFlu-TRAIL的溶瘤作用
（1）Balb/C小鼠CT26结直肠癌移植瘤模型的建立：选择雌性Balb/c小鼠，建立小鼠结直肠癌CT26移植瘤模型。采用70%乙醇碘伏溶液于右下腹手术部位进行清洁，在该部位皮下注射100µl小鼠结直肠癌CT26（5×105个）。隔天观察肿瘤生长情况，游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(S)，计算肿瘤体积(V)，公式为V=4/3×π×S2/2×L/2。
（2）裸鼠模型分组及治疗方案：肿瘤体积生长至70至100mm3时，根据肿瘤体积大小对小鼠进行随机分组实验，每组6只，共四组：PBS组（空白对照组），wtPR8组（野生型甲型流感病毒组），rFlu-TRAIL组，重组TRAIL蛋白组（直接瘤内注射重组的TRAIL蛋白，注射的剂量是0.2µg/mouse）。每次每只裸鼠的病毒注射量为2×106pfu，体积为10ul，间隔48h注射一次，共3次。注射方式为：瘤内注射。
（3）裸鼠模型中rFlu-TRAIL的抗肿瘤效果评价：
（3.1）隔天用游标卡尺测量肿瘤体积的大小，绘制肿瘤生长曲线。结果如图8所示。
由图8可知，跟其他三组比较，rFlu-TRAIL能够显著抑制肿瘤生长。
（3.2）取小鼠肺组织，制备HE染色的组织病理切片，镜下观测肿瘤在肺组织中的转移和生长情况，评价rFlu-TRAIL对肿瘤转移生长的抑制效果。同时观察肺组织的损伤情况以及炎细胞浸润情况，评价rFlu-TRAIL对正常组织的损伤作用。结果如图9所示。
由图9可知，wtPR8组和rTRAIL组，小鼠肺组织出现中度炎症反应，而rFlu-TRAIL组小鼠肺组织与PBS组一致，没出现明显的炎症反应，说明rFlu-TRAIL具有较高的减毒性和安全性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.重组溶瘤流感病毒，其特征在于：所述重组溶瘤流感病毒为表达TRAIL蛋白的重组流感病毒，其HA基因被改造为重组基因HA-TRAIL；
所述TRAIL蛋白为氨基酸序列是SEQ ID NO：1的蛋白质；
所述重组基因HA-TRAIL为核苷酸序列是SEQ ID NO：2的重组基因；
所述重组溶瘤流感病毒的基因组为8个单股负链、分节段的RNA，所述重组溶瘤流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB2-RNA、PA-RNA、PB1-RNA、NP-RNA、NA-RNA、HA-TRAIL-RNA、M-RNA和NS-RNA；
所述PB2-RNA为编码流感病毒毒株中PB2基因的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA基因的RNA；
所述PB1-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB1基因的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP基因的RNA；
所述NA-RNA为编码所述流感病毒毒株中NA基因的RNA；
所述HA-TRAIL-RNA为编码所述重组基因HA-TRAIL的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M基因的RNA；
所述NS-RNA为编码所述流感病毒毒株中NS基因的RNA；
所述重组基因HA-TRAIL的序列为在所述流感病毒毒株HA基因的SS和HA1之间依次插入（G4S）3 linker基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第148-192位核苷酸；TRAIL蛋白的第95-281aa基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第193-756位核苷酸；（G4S）2 linker基因序列，序列SEQ ID NO：2中的第757-801位核苷酸，其他核苷酸均不变得到的序列；
所述流感病毒毒株为甲型流感病毒。
2.权利要求1所述的重组溶瘤流感病毒的构建方法，其特征在于：将含有编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NS-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组溶瘤流感病毒。
3.权利要求1所述的重组溶瘤流感病毒的基因组。
4.与权利要求1所述的重组溶瘤流感病毒相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述任一种：
（1）编码权利要求1中所述重组溶瘤流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子；所述成套DNA分子由编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子、编码所述NA-RNA的DNA分子、编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子、编码所述M-RNA的DNA分子和编码所述NS-RNA的DNA分子组成；
（2）成套载体；所述成套载体由含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HA-TRAIL-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NS-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体组成；
（3）含有权利要求1中所述重组溶瘤流感病毒的微生物；
（4）含有权利要求1中所述重组溶瘤流感病毒的动物细胞系；
（5）含有权利要求1中所述重组溶瘤流感病毒的动物组织；
（6）含有权利要求1中所述重组溶瘤流感病毒的动物器官；
所述动物细胞系、所述动物组织和所述动物器官均不包括繁殖材料。
5.治疗肿瘤的药物，其特征在于：其活性成分为权利要求1所述的重组溶瘤流感病毒；
所述肿瘤为结直肠癌。
6.下述任一应用，其特征在于：
（1）权利要求1中所述的重组溶瘤流感病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用；
（2）权利要求4所述的生物材料在制备治疗肿瘤药物中的应用；
所述肿瘤为结直肠癌。
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