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CN114555809A - 组合癌症免疫疗法 - Google Patents

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CN114555809A
CN114555809A CN202080072385.6A CN202080072385A CN114555809A CN 114555809 A CN114555809 A CN 114555809A CN 202080072385 A CN202080072385 A CN 202080072385A CN 114555809 A CN114555809 A CN 114555809A
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CN202080072385.6A
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T·K-T·陆
R·M·戈德利
J·T-C·林
B·S·加里逊
P·J·李
A·冈萨雷斯-容卡
D-H·王
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Original Assignee
Senti Biosciences Inc
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Abstract

本文提供了用于动态控制和靶向癌症的多种免疫抑制机制的方法和组合物。一些方面提供了被工程化用于产生多种各自调节肿瘤的不同免疫抑制机制的效应分子的细胞，以及使用所述细胞治疗例如卵巢癌、乳腺癌或结肠癌的癌症的方法。

Description

组合癌症免疫疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月28日提出的美国临时申请No.62/893,060的权益，所述临时申请在此以引用的方式整体并入以达成所有目的。
序列表
本申请含有序列表，其已经由EFS-Web提交并在此以引用的方式整体并入本文中。所述ASCII拷贝于2020年8月28日创建，名称为STB_017WO_sequencelisting.txt，并且大小为142,438个字节。
背景技术
每年美国有超过22,000例新卵巢癌病例和超过14,000例死亡(Siegel RL等人(2016)CA Cancer J Clin 66(1):7-30)，据估计每年医疗负担超过$600M(Dizon D MJ(2010)Gynecol Oncol 116(3))。例如化学疗法(例如卡铂(carboplatin)/顺铂(cisplatin)和/或太平洋紫杉醇(paclitaxel))的常规方法常常无法治愈卵巢癌。大约70％患者在进行第一线化学疗法后未实现症状缓解，并且40％-50％症状缓解的患者会在三年内复发。
例如乳腺癌和结肠癌的其它癌症的治疗分别产生85％和65％的五年生存率。疗法常常包括侵入性手术与化学疗法的组合。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供了一种基于细胞的组合免疫疗法，其用于靶向治疗癌症，例如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌。这种组合免疫疗法依赖于能够在肿瘤内和/或附近(“肿瘤微环境(TME)”)进行多因子调节的工程化细胞回路。尽管组合免疫疗法的进展令人兴奋，但部分因为以下的挑战，它的抗癌功效已受到限制。难以同时递送多种疗法来实现最大功效且不引起显著副作用。在临床试验中也难以确定多个全身施用和/或局部注射的疗法的适当给药和时间选择。
然而，本文提供的组合免疫疗法是肿瘤特异性且有效的，但限制全身毒性。这种组合免疫疗法将多个免疫调节效应分子从单一递送媒介物递送至肿瘤微环境。对递送媒介物的设计进行优化，以提高在癌症疗法中的整体功能，包括(但不限于)优化启动子、接头、信号肽以及多个免疫调节效应分子的次序。
已经日益认识到，肿瘤是肿瘤细胞与周围基质之间复杂的相互作用，周围基质包括细胞外基质、癌症相关的基质细胞(MSC和成纤维细胞)、肿瘤血管和免疫系统。TME通过靶向患者的先天性和适应性免疫系统的多种机制抑制抗肿瘤免疫应答。举例来说，肿瘤可补充和诱导调节T细胞，调节T细胞通过加工例如CCL22的特定趋化因子而抑制常规T细胞的抗肿瘤活性。肿瘤还可以表达抑制T细胞和NK细胞活性的分子，例如免疫检查点，例如PD-L1。因此，靶向单一通路可能不足以实现稳固的针对实体瘤的功效。
本公开涵盖的效应分子的非限制性实例包括细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和溶瘤病毒。举例来说，细胞可被工程化用于表达(且通常分泌)以下效应分子中的至少一种、两种、三种或更多种：IL-12、IL-16、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、IL-21、OX40-配体、CD40L、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TGFβ抗体、抗TNFR2、MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、CCL21、CpG寡脱氧核苷酸和抗肿瘤肽(例如具有抗肿瘤活性的抗微生物肽，参见例如Gaspar,D.等人Front Microbiol.2013；4:294；Chu,H.等人PLoS One.2015；10(5):e0126390，以及网站：aps.unmc.edu/AP/main.php)。
本文提供了一种肿瘤细胞，所述肿瘤细胞被工程化用于产生两种或更多种效应分子。在一些方面，肿瘤细胞选自由以下组成的组：膀胱肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、宫颈肿瘤细胞、结肠直肠肿瘤细胞、食管肿瘤细胞、胶质瘤细胞、肾脏肿瘤细胞、肝脏肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、皮肤肿瘤细胞、甲状腺肿瘤细胞和子宫肿瘤细胞。在一些方面，细胞经由用溶瘤病毒转导进行工程化。在一些方面，溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒(Indiana vesiculovirus)、溶瘤新城疫病毒(Newcastle disease virus)、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒(Maraba virus)、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒(dengue virus)、溶瘤基孔肯雅病毒(chikungunya virus)、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus)、溶瘤辛德毕斯病毒(sindbis virus)以及它们的任何变体或衍生物。在一些方面，溶瘤病毒为包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的一种或多种转基因的重组溶瘤病毒。
本文还提供了一种红血球，所述红血球被工程化用于产生两种或更多种效应分子。
本文还提供了一种血小板细胞，所述血小板细胞被工程化用于产生两种或更多种效应分子。
本文还提供了一种细菌细胞，所述细菌细胞被工程化用于产生两种或更多种哺乳动物效应分子。在一些方面，细菌细胞选自由以下组成的组：拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。在一些方面，两种或更多种效应分子中的每一种是从细胞分泌的。在一些方面，细胞经由用分离的核酸转染进行工程化。在一些方面，分离的核酸为包含编码两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的cDNA。在一些方面，分离的核酸为包含编码两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的mRNA。在一些方面，分离的核酸为包含编码两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的裸质粒。
在一些方面，两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码。在一些方面，多核苷酸序列包含启动子。在一些方面，启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。在一些方面，启动子包含内源性启动子。在一些方面，多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
在一些方面，接头多核苷酸序列与两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶(furin)多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码额外启动子。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，其中额外启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和额外启动子是相同的。在一些方面，启动子和额外启动子是不同的。
在一些方面，工程化细胞为人类细胞。在一些方面，人类细胞为从受试者分离的细胞。在一些方面，工程化细胞为培养细胞。
在一些方面，启动子和/或额外启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子和/或额外启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。在一些方面，非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶(Gaussialuciferase)、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)E1、GROα和CXCL12。在一些方面，每种分泌信号肽是相同的。
在一些方面，第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。在一些方面，一种效应分子包含IL12。在一些方面，第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
在一些方面，多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中
S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中SFFV启动子可操作地连接于多核苷酸，第一分泌信号肽可操作地连接于第一效应分子，并且第二分泌信号肽可操作地连接于第二效应分子。在一些方面，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
在一些方面，多核苷酸序列被整合到工程化细胞的基因组中。在一些方面，多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。在一些方面，一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子、腺病毒或腺相关病毒多核苷酸序列。
本文还提供了一种细胞群体，所述细胞群体包含一种或多种本文所述的工程化细胞。
本文还提供了一种组合物，所述组合物包含一种或多种本文所述的工程化细胞或任一种本文所述的细胞群体和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的任一种或多种本文所述的工程化细胞、任一种本文所述的细胞群体或包含药学上可接受的载体的任一种或多种本文所述的工程化细胞或本文所述的细胞群体。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含任一种或多种本文所述的工程化细胞、任一种本文所述的细胞群体或包含药学上可接受的载体的任一种或多种本文所述的工程化细胞或本文所述的细胞群体的组合物。
在一些方面，施用包括全身施用。在一些方面，施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。在一些方面，工程化细胞源自于所述受试者。在一些方面，工程化细胞对于受试者为同种异体的。
在一些方面，方法还包括施用检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，方法还包括施用抗CD40抗体。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。在一些方面，肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
本文还提供了一种脂质结构递送系统，所述脂质结构递送系统包括包含两种或更多种效应分子的基于脂质的结构。在一些方面，两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码。
本文还提供了一种包含工程化核酸的基于脂质的结构，其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。在一些方面，工程化核酸为cDNA。在一些方面，工程化核酸为mRNA。在一些方面，工程化核酸为裸质粒。
在一些方面，多核苷酸序列包含启动子。在一些方面，启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。在一些方面，启动子包含内源性启动子。
在一些方面，多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
在一些方面，接头多核苷酸序列与两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码额外启动子。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，其中额外启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和额外启动子是相同的。在一些方面，启动子和额外启动子是不同的。
在一些方面，启动子和/或额外启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子和/或额外启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。在一些方面，非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。在一些方面，每种分泌信号肽是相同的。
在一些方面，第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。
在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。在一些方面，一种效应分子包含IL12。在一些方面，第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
在一些方面，多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中SFFV启动子可操作地连接于多核苷酸，第一分泌信号肽可操作地连接于第一效应分子，并且第二分泌信号肽可操作地连接于第二效应分子。在一些方面，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
在一些方面，基于脂质的结构包含细胞外囊泡。在一些方面，细胞外囊泡选自由以下组成的组：纳米泡囊和外泌体。在一些方面，基于脂质的结构包含脂质纳米颗粒或胶束。在一些方面，基于脂质的结构包含脂质体。
本文还提供了一种组合物，所述组合物包含任一种本文所述的基于脂质的结构的基于脂质的结构和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的任一种本文所述的基于脂质的结构或任一种本文所述的基于脂质的结构和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含任一种本文所述的基于脂质的结构和药学上可接受的载体的组合物。
在一些方面，施用包括全身施用。在一些方面，施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。在一些方面，基于脂质的结构能够将受试者中的细胞工程化以产生两种或更多种调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。在一些方面，细胞为肿瘤细胞、免疫细胞、红血球或血小板细胞。
在一些方面，方法还包括施用检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，方法还包括施用抗CD40抗体。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。在一些方面，肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
本文还提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含两种或更多种效应分子。在一些方面，两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码。
本文还提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含工程化核酸，其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。在一些方面，工程化核酸为cDNA。在一些方面，工程化核酸为mRNA。在一些方面，工程化核酸为裸质粒。
在一些方面，多核苷酸序列包含启动子。在一些方面，启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。在一些方面，启动子包含内源性启动子。在一些方面，多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
在一些方面，接头多核苷酸序列与两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码额外启动子。
在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，其中额外启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和额外启动子是相同的。在一些方面，启动子和额外启动子是不同的。
在一些方面，启动子和/或额外启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子和/或额外启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。在一些方面，非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。在一些方面，每种分泌信号肽是相同的。
在一些方面，第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。
在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。在一些方面，一种效应分子包含IL12。在一些方面，第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。在一些方面，多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中SFFV启动子可操作地连接于多核苷酸，第一分泌信号肽可操作地连接于第一效应分子，并且第二分泌信号肽可操作地连接于第二效应分子。在一些方面，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
在一些方面，纳米颗粒包含无机材料。
本文还提供了一种组合物，所述组合物包含任何本文所述的纳米颗粒和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的任何本文所述的纳米颗粒或任何本文所述的纳米颗粒和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含任何本文所述的纳米颗粒和药学上可接受的载体的组合物。
在一些方面，施用包括全身施用。在一些方面，施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。在一些方面，纳米颗粒能够将受试者中的细胞工程化以产生两种或更多种调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。在一些方面，细胞为肿瘤细胞、免疫细胞、红血球或血小板细胞。
在一些方面，方法还包括施用检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，方法还包括施用抗CD40抗体。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。在一些方面，肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
本文还提供了一种病毒，所述病毒被工程化成包含异源核酸，其中所述异源核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。在一些方面，病毒选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)。
本文还提供了一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒被工程化成包含异源核酸，其中所述异源核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。在一些方面，工程化核酸包含DNA。在一些方面，工程化核酸包含RNA。
在一些方面，多核苷酸序列包含启动子。在一些方面，启动子包含外源性启动子。在一些方面，多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
在一些方面，接头多核苷酸序列与两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码额外启动子。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，其中额外启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和额外启动子是相同的。在一些方面，启动子和额外启动子是不同的。
在一些方面，启动子和/或额外启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子和/或额外启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。在一些方面，非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。在一些方面，每种分泌信号肽是相同的。
在一些方面，第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。
在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。在一些方面，一种效应分子包含IL12。在一些方面，第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。在一些方面，多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中SFFV启动子可操作地连接于多核苷酸，第一分泌信号肽可操作地连接于第一效应分子，并且第二分泌信号肽可操作地连接于第二效应分子。在一些方面，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
在一些方面，两种或更多种效应分子能够在肿瘤细胞中得以转录和/或翻译。在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
在一些方面，溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。
本文还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任何本文所述的工程化病毒和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的任何本文所述的工程化病毒或任何本文所述的工程化病毒和药学上可接受的载体。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含任何本文所述的工程化病毒和药学上可接受的载体的组合物。
在一些方面，施用包括全身施用。在一些方面，施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。在一些方面，工程化病毒感染受试者中的细胞并产生两种或更多种调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。在一些方面，细胞为肿瘤细胞。
在一些方面，方法还包括施用检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，方法还包括施用抗CD40抗体。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。在一些方面，肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含两种或更多种效应分子。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含两种或更多种效应分子。
本文还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含工程化核酸，并且其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
本文还提供了一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含工程化核酸，并且其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
在一些方面，施用包括一次或多次腹膜内注射。在一些方面，施用包括一次或多次肿瘤内注射。在一些方面，施用包括全身施用。
在一些方面，工程化核酸为mRNA。在一些方面，工程化核酸为cDNA。在一些方面，组合物包含裸mRNA。在一些方面，组合物包含裸质粒。
在一些方面，组合物包含选自由以下组成的组的递送系统：病毒系统、转座子系统和核酸酶基因组编辑系统。在一些方面，病毒系统选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)。在一些方面，溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。在一些方面，核酸酶基因组编辑系统选自由以下组成的组：锌指系统、TALEN系统和CRISPR系统。
在一些方面，组合物包含红血球或血小板细胞。
在一些方面，组合物包括包含基于脂质的结构的脂质结构递送系统。在一些方面，基于脂质的结构选自由以下组成的组：细胞外囊泡、脂质纳米颗粒、胶束、纳米泡囊、外泌体和脂质体。
在一些方面，组合物包含纳米颗粒。在一些方面，纳米颗粒包含无机材料。在一些方面，纳米颗粒封装工程化核酸或封装两种或更多种效应分子。
在一些方面，多核苷酸序列包含启动子。在一些方面，启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。在一些方面，启动子包含内源性启动子。在一些方面，多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
在一些方面，接头多核苷酸序列与两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。在一些方面，接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。在一些方面，2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。在一些方面，接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。在一些方面，可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。在一些方面，接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。在一些方面，接头多核苷酸序列编码额外启动子。在一些方面，启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，其中额外启动子可操作地连接于多核苷酸序列，以使得编码两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸为不同的多核苷酸。在一些方面，启动子和额外启动子是相同的。在一些方面，启动子和额外启动子是不同的。
在一些方面，启动子和/或额外启动子包含组成型启动子。在一些方面，组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。在一些方面，启动子和/或额外启动子包含诱导型启动子。在一些方面，诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。在一些方面，一种分泌信号肽包含对两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。在一些方面，非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。在一些方面，每种分泌信号肽是相同的。
在一些方面，第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。在一些方面，第一效应分子和第二效应分子的治疗类别是不同的。
在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。在一些方面，IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。在一些方面，趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。在一些方面，生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。在一些方面，共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。在一些方面，肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。在一些方面，TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。在一些方面，VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
在一些方面，两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。在一些方面，一种效应分子包含IL12。在一些方面，第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。在一些方面，多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中SFFV启动子可操作地连接于表达盒，第一分泌信号肽可操作地连接于第一效应分子，并且第二分泌信号肽可操作地连接于第二效应分子。在一些方面，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
在一些方面，肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
附图说明
图1展示在CT26模型中使用表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC进行的处理。
图2A展示用先前在CT26模型中使用表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC处理的CT26肿瘤对无肿瘤小鼠再次激发。图2A展示处理示意图。
图2B展示用先前在CT26模型中使用表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC处理的CT26肿瘤对无肿瘤小鼠再次激发。图2B展示注射肿瘤植入物的无肿瘤小鼠，其与已经建立肿瘤的未处理的对照小鼠形成对比。
图3展示表明腹膜内注射的鼠类BM来源MSC(BM-MSC)在体内归巢至4T1乳腺癌细胞的肿瘤部位的数据。将荧光标记的BM-MSC(治疗细胞)注射至负载4T1乳腺肿瘤细胞的小鼠中。乳腺肿瘤细胞表达荧光素酶报告体。左边顶部前两个图展示如所指示，在注射后第1天和第7天负载肿瘤的小鼠中的治疗细胞(BM-MSC)的成像。左边顶部第三个图展示在注射后第7天负载肿瘤的小鼠中的肿瘤细胞的成像。左边底部两个图展示如所指示，在注射后第1天和第7天未负载肿瘤的正常小鼠中的治疗细胞的成像。在最右边提供展示肿瘤对治疗细胞归巢的作用的示意图。
图4展示表明在原位乳腺癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著肿瘤生长延迟的数据。左图展示在小鼠(n＝8)中工程化MSC对4T1乳腺肿瘤生长的作用。图中的每条线表示在第0天和第7天接受对照MSC生长培养基或工程化MSC的腹膜内注射的小鼠中的肿瘤体积。小鼠接受表达IL-12的工程化MSC和表达CCL21a的工程化MSC的腹膜内注射。通过用测径规每隔一天测量来确定肿瘤体积。数据表示平均值±SEM。与对照培养基组相比，*p<0.05，**p<0.005。右边示意图展示处理时间线和表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC对所处理小鼠中的肿瘤负荷的作用。
图5A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IFN-β、IFN-γ、IL-12、CCL21a或它们的组合的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图5A的每条线表示个别的小鼠。
图5B包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IFN-β、IFN-γ、IL-12、CCL21a或它们的组合的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图5B的左图展示在第14天，各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。图5B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的肿瘤体积，表示为平均值±SEM。
图6A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图6A的每条线表示个别的小鼠。
图6B包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图6B的左图展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。图6B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的肿瘤体积，表示为平均值±SEM。
图7A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，添加抗CD40抗体不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图7A的每条线表示个别的小鼠。
图7B包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中的表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，添加抗CD40抗体不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图7B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图8A包括表明在皮下乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图8A的每条线表示个别的小鼠。
图8B包括表明在皮下乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图8B的左图展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。图8B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的体重，表示为平均值±SEM。
图9A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。然而，一些测试的效应子组合可能引起毒性。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图9A的每条线表示个别的小鼠。
图9B包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。然而，一些测试的效应子组合可能引起毒性。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图9B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图10A包括来自针对毒性和筛选的GFP剂量扩大研究的数据。图10A展示表达GFP的工程化MSC未引起毒性。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图10A的每条线表示个别的小鼠。
图10B包括来自针对毒性和筛选的GFP剂量扩大研究的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图10B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图11A展示工程化的人MSC未归巢至小鼠4T1肿瘤。图11A的每条线表示个别的小鼠。
图11B展示工程化的人MSC未归巢至小鼠4T1肿瘤。图11B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图12包括展示IL-12和CCL21a可减缓肿瘤扩大的数据。图12的每条线表示个别的小鼠。
图13A包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21的工程化MSC充分抑制肿瘤生长，并且添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不增加功效的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理，并且检查点抑制剂单独注射。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图13A的每条线表示个别的小鼠。
图13B包括表明在原位乳腺癌(4T1三阴性乳腺癌)小鼠模型中表达IL-12和CCL21的工程化MSC充分抑制肿瘤生长，并且添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不增加功效的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理，并且检查点抑制剂单独注射。图13B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图14展示表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著肿瘤生长延迟的数据。左图展示在小鼠(n＝8)中工程化MSC对CT26结肠直肠肿瘤生长的作用。图中的每条线表示在第0天和第7天接受对照MSC生长培养基或工程化MSC的腹膜内注射的小鼠中的肿瘤体积。小鼠接受表达IL-12的工程化MSC和表达CCL21a的工程化MSC的腹膜内注射。通过用测径规每隔一天测量来确定肿瘤体积。数据表示平均值±SEM。与对照培养基组相比，*p<0.05，**p<0.005。右边示意图展示处理时间线和表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC对所处理小鼠中的肿瘤负荷的作用。
图15为展示CT26小鼠模型中肿瘤生长动力学以确定给与工程化MSC细胞的最佳时间的图。
图16A包括表明在结肠癌的同基因小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC与抗CD40或抗CTLA4抗体组合对平均肿瘤生长的作用的数据。负载CT26结肠肿瘤的小鼠用七种处理中的一种处理(每个处理组n＝5-6)。MSC-IL-12+MSC-CCL21a表示用表达IL-12的工程化细胞和表达CCL21a的工程化细胞(1:1比率)处理，用于组合处理。图16A的每条线表示个别的小鼠。
图16B包括表明在结肠癌的同基因小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC与抗CD40或抗CTLA4抗体组合对平均肿瘤生长的作用的数据。负载CT26结肠肿瘤的小鼠用七种处理中的一种处理(每个处理组n＝5-6)。MSC-IL-12+MSC-CCL21a表示用表达IL-12的工程化细胞和表达CCL21a的工程化细胞(1:1比率)处理，用于组合处理。图16B的左图展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。图16B的右图展示接受各处理的小鼠随时间的肿瘤体积，表示为平均值±SEM。
图17A包括来自剂量依赖性长期生存研究的数据。图17A展示个别的组的肿瘤体积。图17A的每条线表示个别的小鼠。
图17B包括来自剂量依赖性长期生存研究的数据。图17B展示体重(表示为平均值±SEM，左上)、肿瘤体积(表示为平均值±SEM，左下)和生存率(右边)。
图18A包括表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中CT26结肠直肠肿瘤的生长的作用。图18A的每条线表示个别的小鼠。
图18B包括表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图18B展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图18C包括表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图18C为各处理中个别的小鼠的肿瘤微环境内浸润免疫群体的代表图，以及每个处理组的平均值±SEM。
图18D包括表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图18D展示各处理中个别的小鼠的总CD3群体中调节T细胞(Treg)的百分比，以及每个处理组的平均值±SEM。用工程化MSC-IL2和CCL21a处理的肿瘤微环境中Treg的数目显著下降。
图18E包括表明在结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制肿瘤生长的数据。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图18E使免疫浸润百分比与肿瘤重量相关。发现具有高淋巴细胞(CD3+)的样品与低肿瘤重量相关，而具有高骨髓(CD11b+)浸润的样品与较高肿瘤负荷相关。
图19展示各处理中个别的小鼠的肿瘤体积。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。
图20展示各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。通过肿瘤重量来确定功效。
图21A展示腹膜内间隙中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并且在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长动力学。利用IVIS成像器监测肿瘤负荷，图21A第一行测量小鼠体重(左图)和ROI(右图)。第二行监测每个组中个别的小鼠的肿瘤的肿瘤重量(左图)和ROI(右图)。第三行将肿瘤重量与整体ROI(左图)或肿瘤ROI(右图)相关。
图21B展示腹膜内间隙中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并且在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长动力学。图21B展示第18天组中三(3)只小鼠的免疫概况以更好地表征肿瘤微环境。
图22A包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中CT26结肠肿瘤的生长的作用。图22A的每条线表示个别的小鼠。
图22B包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图22B展示每个处理组中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图23A包括来自由图22A-22B表示的实验的肿瘤免疫浸润统计数据。三只小鼠选自PBS、未处理MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(组合)组，以针对免疫概况肿瘤微环境进行流式细胞术。图23A展示与给与未处理MSC的组相比，组合组中浸润CD3和CD8细胞毒性T群体显著增加。
图23B包括来自由图22A-22B表示的实验的肿瘤免疫浸润统计数据。三只小鼠选自PBS、未处理MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(组合)组，以针对免疫概况肿瘤微环境进行流式细胞术。图23B展示与用未处理MSC处理的组相比，组合组中粒细胞骨髓来源抑制性细胞(gMDSC)和巨噬细胞群体显著减少。
图24A包括与由图22A-22B表示的实验相关的关于免疫百分比和肿瘤重量的数据。图24A展示具有较多CD3+和CD8+T细胞的样品(左上和左中图)与肿瘤重量下降强烈相关。这些图还展示具有较少CD11b骨髓细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和MDSC的样品显示较低肿瘤负荷(中下图和右下图)。
图24B包括与由图22A-22B表示的实验相关的关于免疫百分比和肿瘤重量的数据。图24B展示具有较少CD11b骨髓细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和MDSC的样品显示较低肿瘤负荷(上排)。
图25A包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试三批不同的经慢病毒转导的细胞系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL编号表示一批)。图25A展示在皮下与腹膜内模型中MSC-IL12+MSC-CCL21a所有三批均可降低肿瘤负荷(前5图来自SC模型并且后3图来自IP模型)。在第11天收集来自所有小鼠的肿瘤。图25A的每条线表示个别的小鼠。
图25B包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试三批不同的经慢病毒转导的细胞系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL编号表示一批)。图25B展示来自每个组的平均肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM。
图26A包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中工程化的组合处理MSC-IL-12+MSC-CCL21a或MSC-CCL21a+MSC-IFN-β抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中CT26肿瘤的生长的作用。图26A的每条线表示个别的小鼠。
图26B包括表明在皮下结肠直肠癌小鼠模型中工程化的组合处理MSC-IL-12+MSC-CCL21a或MSC-CCL21a+MSC-IFN-β抑制肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。图26B展示每个处理组中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值。MSC-IL12+MSC-CCL21a展示与注射未处理MSC的小鼠相比功效更佳。在用MSC-IFNb+MSC-CCL21a处理的组中还观察到处理功效。
图27A提供了来自由图26A-26B表示的实验的额外数据。图27A为展示用所指示的工程化MSC处理的每个组的免疫概况的图。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理之后观察到巨噬细胞群体一致下降。相对于未处理MSC，与用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组相比，还观察到CD3+群体的浸润增加和CD11b+群体的浸润减少的总趋势。
图27B提供了来自由图26A-26B表示的实验的额外数据。图27B为展示用所指示的工程化MSC处理的每个组的免疫概况的图。相对于未处理MSC，与用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组相比，还观察到CD3+群体的浸润增加和CD11b+群体的浸润减少的总趋势。
图28A还提供了来自由图26A-26B表示的实验的额外数据。图28A展示免疫浸润与肿瘤重量相关。
图28B还提供了来自由图26A-26B表示的实验的额外数据。图28B展示免疫浸润与肿瘤重量相关。具有低巨噬细胞和树突状细胞的样品具有较低肿瘤负荷(中上和右上)。
图29展示将以上来自结肠直肠癌症模型的体内数据(图22A和图26A)组合的图。来自图22A和图26A的组合CT26数据记录三组：仅仅肿瘤(PBS)、用未处理MSC处理和用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理。
图30A还展示来自图22A和图26A的组合数据。所述图展示来自流式细胞术实验数据的免疫浸润平均数。观察到CD8+T的统计显著性，这证实MSC-IL12+MSC-CCL21a能够使肿瘤微环境恢复极化，并且允许更多细胞毒性T细胞浸润。
图30B还展示来自图22A和图26A的组合数据。所述图展示来自流式细胞术实验数据的免疫浸润平均数。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组中CD11b+骨髓群体浸润减少。所收集的数据显示树突状细胞和巨噬细胞群体具有统计显著性。
图31展示pL17D的载体图。
图32展示单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC和如通过BLI水平所评定，其在IP肿瘤模型中降低CT26肿瘤负荷的功效。
图33展示单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC和如通过BLI水平所评定，其在IP肿瘤模型中降低B16F10肿瘤负荷的功效。
图34展示用于从单一慢病毒表达载体表达人IL12(p70)和人CCL21a的慢病毒表达载体图。
图35A展示如通过细胞因子ELISA所评定，工程化的hMSC的hIL12产生。
图35B展示如通过细胞因子ELISA所评定，工程化的hMSC的hCCL21a产生。
图36A展示用于评估由MSC产生的hIL12对T细胞的功能性调节的transwell测定法示意图。
图36B展示transwell测定法，如通过IFNγ产生所评定，所述测定法显示由MSC产生的hIL12对T细胞的功能性调节。
图37A展示如通过生物发光成像所评定，在负载IP肿瘤的小鼠的肿瘤中MSC归巢至肿瘤。图37A展示CT26肿瘤模型中的归巢(所示的影像)。
图37B展示如通过生物发光成像所评定，在负载IP肿瘤的小鼠的肿瘤中MSC归巢至肿瘤。图37B展示各处理中个别的小鼠的CT26肿瘤模型中的归巢，以及每个处理组的平均值±SEM(图37A中所示的影像的定量概述)。
图37C展示如通过生物发光成像所评定，在负载IP肿瘤的小鼠的肿瘤中MSC归巢至肿瘤。图37C展示各处理中个别的小鼠的定量实时PCR，以及每个处理组的平均值±SEM。
图37D展示如通过生物发光成像所评定，在负载IP肿瘤的小鼠的肿瘤中MSC归巢至肿瘤。图37D展示针对萤火虫荧光素酶的荧光显微术。
图37E展示如通过生物发光成像所评定，在负载IP肿瘤的小鼠的肿瘤中MSC归巢至肿瘤。图37E展示各处理中个别的小鼠的B16F10肿瘤模型中的归巢，以及每个处理组的平均值±SEM(影像的定量概述)。
图38展示在CT26 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图-影像；和左下图-各处理中个别的小鼠，以及每个处理组的平均值±SEM)，以及通过各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
图39展示在B16F10 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图-影像；和左下图-各处理中个别的小鼠，以及每个处理组的平均值±SEM)，以及通过各处理中个别的小鼠的肿瘤重量，以及每个处理组的平均值±SEM，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
图40A展示在CT26 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的MSC引起肿瘤负荷减少。图40A展示如通过BLI所评定，PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”正方形)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(三角形)的平均肿瘤负荷。
图40B展示在CT26 IP模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的MSC引起肿瘤负荷减少。图40B展示如通过BLI所评定，个别的小鼠中PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”正方形)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(分别为左图、中图和右图)的平均肿瘤负荷。图40B的每条线表示个别的小鼠。
图40C展示用表达IL12p70/CCL21a的MSC处理延长生存(100％生存超过90天)，而对照物处理的小鼠至第20天均死亡或处死。
图41展示用表达IL12p70的MSC处理延长生存。
图42A展示供体1中不同MOI(95000、9500、950或未感染)间基因工程化的MSC的相对生长。
图42B展示供体2中不同MOI(95000、9500、950或未感染)间基因工程化的MSC的相对生长。
图42C展示供体3中不同MOI(95000、9500、950或未感染)间基因工程化的MSC的相对生长。
图43展示来自2种不同供体的两种独立的人类BM-MSC细胞系(分别为顶行和底行)，所述细胞系经含有各种驱动EGFP表达的启动子的构建体转导。展示转导后第25天工程化细胞的GFP百分比(左图)和MFI(右图)。
图44展示来自2种不同供体的两种独立的人类BM-MSC细胞系，所述细胞系经含有各种驱动EGFP表达的启动子的构建体转导。展示针对两种独立的人类BM-MSC细胞系单独情况下(左图)或在来自两种独立人类BM-MSC细胞系组合的数据下(右图)，随时间追踪的EGFPMFI(转导后第7天至第28天)。
图45展示如通过ELISA所评定，工程化MSC的IL-12p70分泌。
图46展示如通过ELISA所评定，工程化MSC的IL-21分泌。
图47展示如通过ELISA所评定，工程化MSC分泌的IL-12p70与IL-21的比率。
图48展示利用STAT4-SEAP报告体，使用HEK-293T细胞，针对IL-12p70的功能报告体测定法的结果，以评定工程化MSC的细胞因子产生和分泌。
图49展示在NK-92人类自然杀伤细胞中，使用细胞内磷酸流动定量磷酸化STAT1(左图)和磷酸化STAT3(右图)的针对IL-21的功能报告体测定法的结果，以评定工程化MSC的细胞因子产生和分泌。
图50展示使用IL21R-U2OS IL21R/IL2RG二聚报告体，针对IL-12的功能报告体测定法的结果，以评定工程化MSC的细胞因子产生和分泌。
具体实施方式
本文提供了通过产生效应分子旨在调节肿瘤内部和/或附近(“肿瘤微环境(TME)”)的不同的肿瘤介导的免疫抑制机制的组合免疫疗法组合物和方法。
“效应分子”是指一种分子(例如核酸，例如DNA或RNA，或蛋白质(多肽)或肽)，其结合于另一分子并且调节其结合的这个分子的生物活性。举例来说，效应分子可充当配体以增加或减少酶活性、基因表达或细胞信号传导。因此，在一些实施方案中，效应分子调节(活化或抑制)不同免疫调节机制。通过直接结合于分子并且调节其，效应分子还可以间接地调节第二下游分子。在一些实施方案中，效应分子为分泌的分子，而在其它实施方案中，效应分子结合于细胞表面或保持在细胞内。举例来说，效应分子包括改变内部细胞状态以例如增强细胞的免疫调节活性、归巢特性或持久性的细胞内转录因子、微型RNA和shRNA。效应分子的非限制性实例包括细胞因子、趋化因子、调节代谢物水平的酶、调节细胞因子的抗体或诱饵分子(decoy molecule)、归巢分子和/或整合素。
术语“调节”涵盖生物活性的维持、生物活性的抑制(部分或完全)和生物活性的刺激/活化(部分或完全)。所述术语还涵盖降低或增加(例如增强)生物活性。当一种效应分子调节与另一效应分子调节的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如刺激抗原呈递和/或加工)不同的肿瘤介导的免疫抑制机制(例如刺激T细胞信号传导)时，两种不同效应分子视为“调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制”。
效应分子进行的调节可以是直接或间接的。当效应分子结合于另一分子并且调节所述分子的活性时，发生直接调节。当效应分子结合于另一分子，调节所述分子的活性并且作为所述调节的结果，调节又一分子(效应分子未结合的分子)的活性时，发生间接调节。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答(例如全身或肿瘤微环境中)增加至少10％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应了解，例如全身或肿瘤微环境中免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答的“增加”是相对于缺少效应分子时将发生的免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答来说的。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答(例如全身或肿瘤微环境中)增加至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫刺激和/或抗肿瘤免疫应答增加2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫刺激和/或抗肿瘤免疫机制的非限制性实例包括T细胞信号传导、活性和/或募集、抗原呈递和/或加工、自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集、树突状细胞分化和/或成熟、免疫细胞募集、促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集、基质降解、免疫刺激代谢物产生、干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene，STING)信号传导(其增加IFN的分泌和Th1极化，促进抗肿瘤免疫应答)和/或I型干扰素信号传导。效应分子可刺激上述免疫刺激机制中的至少一种(一种或多种)，因此引起免疫刺激反应增加。上述免疫刺激和/或抗肿瘤免疫机制的变化可例如使用T细胞增殖或细胞毒性的体外测定法、体外抗原呈递测定法、表达测定法(例如特定标志物)和/或细胞分泌二测定法(例如细胞因子)评定。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应(例如全身或肿瘤微环境中)减少至少10％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫抑制反应减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应减少10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。应了解，例如全身或肿瘤微环境中免疫抑制反应的“减少”是相对于缺少效应分子时将发生的免疫抑制反应来说的。
在一些实施方案中，至少一种效应分子对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应(例如全身或肿瘤微环境中)减少至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。举例来说，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节可引起免疫抑制反应减少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，对肿瘤介导的免疫抑制机制的调节引起免疫抑制反应减少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
免疫抑制机制的非限制性实例包括负共刺激信号传导、细胞毒细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的促细胞凋亡信号传导、调节T(Treg)细胞信号传导、肿瘤检查点分子产生/维持、骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集、免疫抑制因子/代谢物产生和/或血管内皮生长因子信号传导。效应分子可抑制上述免疫抑制机制中的至少一种(一种或多种)，因此引起免疫抑制反应减少。上述免疫抑制机制的变化可例如通过以下来评定：测定T细胞增殖的增加和/或IFNγ产生的增加(负共刺激信号传导、Treg细胞信号传导和/或MDSC)；膜联蛋白V/PI流动染色(促细胞凋亡信号传导)；表达、例如PDL1表达的流动染色(肿瘤检查点分子产生/维持)；ELISA、
Figure BDA0003596748340000451
经由qPCR的RNA、酶测定法，例如IDO色氨酸分解代谢(免疫抑制因子/代谢物产生)；和PI3K、Akt、p38的磷酸化(VEGF信号传导)。
在一些实施方案中，效应分子以累加方式起作用：例如两种效应分子的作用可等于单独起作用的两种效应分子的作用的总和。在其它实施方案中，效应分子以协同方式起作用：例如两种效应分子的作用可超过两种效应分子的组合功能。
调节肿瘤介导的免疫抑制机制和/或改变肿瘤微环境的效应分子可为例如分泌的因子(例如调节与免疫系统相关的细胞外机制的细胞因子、趋化因子、抗体和/或诱饵受体)、抑制剂(例如抗体、抗体片段、配体TRAP和/或小型阻断肽)、控制细胞状态的细胞内因子(例如调节细胞状态以增强促炎性的微型RNA和/或转录因子)、包装成外来体的因子(例如微型RNA、胞浆因子和/或细胞外因子)、表面展示因子(例如检查点抑制剂、TRAIL)和/或代谢基因(例如产生/调节或降解代谢物或氨基酸的酶)。
在一些实施方案中，效应分子中的至少一种刺激肿瘤微环境中的免疫刺激机制和/或抑制肿瘤微环境中的免疫抑制机制。
在一些实施方案中，效应分子中的至少一种(a)刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，(b)刺激抗原呈递和/或加工，(c)刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，(d)刺激树突状细胞分化和/或成熟，(e)刺激免疫细胞募集，(f)刺激促炎性巨噬细胞信号传导、活性和/或募集或抑制消炎巨噬细胞信号传导、活性和/或募集，(g)刺激基质降解，(h)刺激免疫刺激代谢物产生，(i)刺激I型干扰素信号传导，(j)抑制负共刺激信号传导，(k)抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导，(l)抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，(m)抑制肿瘤检查点分子，(n)刺激干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导，(o)抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集，(p)降解免疫抑制因子/代谢物，(q)抑制血管内皮生长因子信号传导，和/或(r)直接杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，效应分子可选自分子的以下非限制性类别：细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽和酶。上述类别效应分子的非限制性实例在表1中列出并且编码例示性效应分子的特定序列在表6中列出。效应分子可为人类效应分子，例如表1或表6中列出的那些人类效应分子，或表1或表6中列出的鼠类效应分子的人类同等物。效应分子可来源于人类效应分子，例如内源人类效应分子或进行修饰和/或功能优化，例如密码子优化以改善表达、进行修饰以提高稳定性或在其信号序列上进行修饰的效应分子(见下文)。本领域的技术人员已知用于优化功能的各种程序和算法，并且可基于所需改善，例如针对特定物种(例如人类、小鼠、细菌等)进行密码子优化来选择。
表1.例示性效应分子
Figure BDA0003596748340000471
Figure BDA0003596748340000481
Figure BDA0003596748340000491
工程化核酸
本文提供了编码至少一种效应分子的工程化核酸。本文提供了编码两种或更多种效应分子的工程化核酸。
“工程化核酸”是在自然界中不存在的核酸。然而，应了解虽然总体上工程化核酸是非天然存在的，但其可以包括在自然界中存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化核酸包含来自不同生物体(例如来自不同物种)的核苷酸序列。举例来说，在一些实施方案中，工程化核酸包括鼠类核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人类核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是指通过将核酸分子接合而构建的分子且在一些实施方案中，在活细胞中可重复。“合成核酸”是指被扩增或以化学方式或用其它方式合成的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其它方式修饰，但可以与天然存在的核酸分子进行碱基配对的核酸。修饰包括(但不限于)一种或多种修饰核苷酸间键联和非天然核酸。修饰进一步详细地描述于美国专利No.6,673,611和美国申请公布2004/0019001中，每一者以引用的方式整体并入本文中。修饰核苷酸间键联可为二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键联。非天然核酸可为锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO或“吗啉代”)和苏糖核酸(TNA)。非天然核酸进一步详细地描述于国际申请WO 1998/039352、美国申请公布No.2013/0156849和美国专利No.6,670,461、5,539,082、5,185,444，每一者以引用的方式整体并入本文中。重组核酸和合成核酸还包括由上述任一种核酸复制所产生的那些分子。本公开的工程化核酸可以由单一分子(例如包括在相同质粒或其它载体中)或由多种不同分子(例如多种不同的独立复制的分子)编码。工程化核酸可为分离的核酸。分离的核酸包括(但不限于)cDNA多核苷酸、RNA多核苷酸、RNAi寡核苷酸(例如siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、shRNA等)、mRNA多核苷酸、环型质粒、线性DNA片段、载体、微环(minicircle)、ssDNA和寡核苷酸。
本公开的工程化核酸可以使用标准分子生物学方法产生(参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2012,Cold Spring HarborPress)。在一些实施方案中，工程化核酸构建体使用GIBSON
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克隆产生(参见例如Gibson,D.G.等人Nature Methods,343-345,2009；和Gibson,D.G.等人NatureMethods,901-903,2010，各以引用的方式并入本文中)。GIBSON
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通常在单管反应中使用三种酶活性：5'外切核酸酶、DNA聚合酶的'Y扩展活性和DNA连接酶活性。5'外切核酸酶活性咀嚼掉5'末端序列并暴露互补序列，以进行退火。接着聚合酶活性填充退火区域上的间隙中。接着DNA连接酶将切口密封并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比用于金门装配中的序列更长，因此产生更高百分比的恰当装配。在一些实施方案中，工程化核酸构建体使用
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克隆(Clontech)产生。
启动子
在一些实施方案中，工程化核酸包含可操作地连接于编码效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸包含可操作地连接于编码至少2种效应分子的核苷酸序列的启动子。举例来说，工程化核酸可包含可操作地连接于编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸包含可操作地连接于编码1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种效应分子的核苷酸序列的启动子。
“启动子”是指控制核酸序列的其余部分转录的开始和速率的核酸序列控制区。启动子还可以含有例如RNA聚合酶和其它转录因子的调控蛋白和分子可结合的子区域。启动子可为组成型、诱导型、阻抑型、组织特异型或其任何组合。启动子驱动其调控的核酸序列的表达或驱动其转录。本文中，当启动子相对于其调控的核酸序列处于恰当功能位置和取向，从而控制(“驱动”)所述序列转录开始和/或表达时，认为所述启动子“可操作地连接”。
启动子可为与基因或序列天生相关的启动子，可通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5'非编码序列获得。这类启动子可称为“内源性的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可位于重组或异源启动子的控制下，重组或异源启动子是指通常在自然环境中不与编码序列相关的启动子。这类启动子可包括其它基因的启动子；从任何其它细胞分离的启动子；和非“天然存在”的合成启动子或强化子，例如含有不同转录调控区的不同元件和/或通过本领域中已知的基因工程方法改变表达的突变的启动子。除以合成方式产生启动子和强化子的核酸序列外，可使用包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的重组克隆和/或核酸扩增技术产生序列(参见例如美国专利第4,683,202号和美国专利第5,928,906号)。
工程化核酸的启动子可为“诱导型启动子”，诱导型启动子是指特征在于当存在信号、受信号影响或接触信号时调控(例如起始或活化)转录活性的启动子。信号可为以有效调控从诱导型启动子转录的活性的方式接触诱导型启动子的内源性或通常外源性条件(例如光)、化合物(例如化学或非化学化合物)或蛋白质(例如细胞因子)。转录激活可涉及直接作用于启动子来驱动转录，或通过使防止启动子驱动转录的阻抑子失活而间接作用于启动子。相反地，转录失活可涉及直接作用于启动子来驱动转录，或通过使之后作用于启动子的阻抑子活化而间接作用于启动子。
如果在局部肿瘤状态(例如炎症或缺氧)或信号存在下从启动子转录得到活化、失活、增加或减少，则启动子对所述状态或信号“起反应”或通过所述状态或信号“调节”。在一些实施方案中，启动子包含应答元件。“应答元件”是启动子区域内结合调节(调控)基因从启动子的表达的特定分子(例如转录因子)的DNA短序列。可根据本公开使用的应答元件包括不限于根皮素可调的控制元件(phloretin-adjustable control element，PEACE)、锌指DNA结合结构域(DBD)、干扰素-γ活化序列(interferon-gamma-activated sequence，GAS)(Decker,T.等人J Interferon Cytokine Res.1997年3月；17(3):121-34，以引用的方式并入本文中)、干扰素刺激的应答元件(ISRE)(Han,K.J.等人J Biol Chem.2004年4月9日；279(15):15652-61，以引用的方式并入本文中)、NF-κB应答元件(Wang,V.等人CellReports.2012；2(4):824-839，以引用的方式并入本文中)和STAT3应答元件(Zhang,D.等人J of Biol Chem.1996；271:9503-9509，以引用的方式并入本文中)。本文中涵盖其它应答元件。应答元件还可以含有串联重复序列(例如相同的编码应答元件的核苷酸序列的连续重复序列)以大体上增加应答元件对其同源结合分子的敏感性。串联重复序列可标记为2X、3X、4X、5X等，以表示存在的重复序列的数目。
反应启动子(又称“诱导型启动子”)(例如TGF-β反应启动子)的非限制性实例在表2中列出，其展示启动子和转录因子的设计，以及展示诱导分子对转录因子(TF)和转基因转录(T)的作用(B，结合；D，解离；n.d.，不确定)(A，活化；DA，失活；DR，去阻抑)(参见Horner,M.和Weber,W.FEBS Letters 586(2012)20784-2096m，和其中引用的参考文献)。诱导型启动子的其它非限制性实例包括表3中所呈现的启动子。
表2.反应启动子的实例
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表3.例示性诱导型启动子
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启动子的其它非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延长因子1-α(EF1a)启动子、延长因子(EFS)启动子、MND启动子(含有具有骨髓增生性肉瘤病毒强化子的修饰MoMuLV LTR的U3区的合成启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、形成脾脏病灶病毒(spleen focus-forming virus，SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子(参见表4)。
表4.例示性组成型启动子
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在一些实施方案中，本公开的启动子通过肿瘤微环境内的信号调节。如果在肿瘤微环境存在下启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少10％，则认为肿瘤微环境调节启动子。在一些实施方案中，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。举例来说，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少2倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、20倍、25倍、50倍或100倍)。举例来说，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，启动子的活性相对于缺少肿瘤微环境时启动子的活性增加或减少2-10倍、2-20倍、2-30倍、2-40倍、2-50倍、2-60倍、2-70倍、2-80倍、2-90倍或2-100倍。
在一些实施方案中，本公开的启动子在低氧状态下活化。“低氧状态”为在组织层面，身体或身体区域丧失适当供氧的状态。低氧状态可引起炎症(例如在低氧状态下炎性细胞因子的水平增加)。在一些实施方案中，在低氧状态下活化的启动子可操作地连接于编码减少炎性细胞因子活性的表达的效应分子的核苷酸，因此减少由低氧状态所引起的炎症。在一些实施方案中，在低氧状态下活化的启动子包含低氧应答元件(hypoxia responsiveelement，HRE)。“低氧应答元件(HRE)”为对低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)应答的应答元件。在一些实施方案中，HRE包含共有基序NCGTG(其中N为A或G)。
多顺反子和多个启动子系统
在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于生多种效应分子。举例来说，核酸可被配置用于产生2-20种不同效应分子。在一些实施方案中，核酸被配置用于产生2-20种、2-19种、2-18种、2-17种、2-16种、2-15种、2-14种、2-13种、2-12种、2-11种、2-10种、2-9种、2-8种、2-7种、2-6种、2-5种、2-4种、2-3种、3-20种、3-19种、3-18种、3-17种、3-16种、3-15种、3-14种、3-13种、3-12种、3-11种、3-10种、3-9种、3-8种、3-7种、3-6种、3-5种、3-4种、4-20种、4-19种、4-18种、4-17种、4-16种、4-15种、4-14种、4-13种、4-12种、4-11种、4-10种、4-9种、4-8种、4-7种、4-6种、4-5种、5-20种、5-19种、5-18种、5-17种、5-16种、5-15种、5-14种、5-13种、5-12种、5-11种、5-10种、5-9种、5-8种、5-7种、5-6种、6-20种、6-19种、6-18种、6-17种、6-16种、6-15种、6-14种、6-13种、6-12种、6-11种、6-10种、6-9种、6-8种、6-7种、7-20种、7-19种、7-18种、7-17种、7-16种、7-15种、7-14种、7-13种、7-12种、7-11种、7-10种、7-9种、7-8种、8-20种、8-19种、8-18种、8-17种、8-16种、8-15种、8-14种、8-13种、8-12种、8-11种、8-10种、8-9种、9-20种、9-19种、9-18种、9-17种、9-16种、9-15种、9-14种、9-13种、9-12种、9-11种、9-10种、10-20种、10-19种、10-18种、10-17种、10-16种、10-15种、10-14种、10-13种、10-12种、10-11种、11-20种、11-19种、11-18种、11-17种、11-16种、11-15种、11-14种、11-13种、11-12种、12-20种、12-19种、12-18种、12-17种、12-16种、12-15种、12-14种、12-13种、13-20种、13-19种、13-18种、13-17种、13-16种、13-15种、13-14种、14-20种、14-19种、14-18种、14-17种、14-16种、14-15种、15-20种、15-19种、15-18种、15-17种、15-16种、16-20种、16-19种、16-18种、16-17种、17-20种、17-19种、17-18种、18-20种、18-19种或19-20种不同效应分子。在一些实施方案中，核酸被配置用于产生1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种不同效应分子。
在一些实施方案中，工程化核酸可为多顺反子的，即可由单一mRNA转录本产生超过一个分开的多肽(例如多种效应分子)。经由使用各种接头，工程化核酸可为多顺反子的，例如编码第一效应分子的多核苷酸序列可连接于编码第二效应分子的核苷酸序列，例如呈第一基因:第二基因5’至3’取向。接头可编码2A核糖体跳跃元件，例如T2A。其它2A核糖体跳跃元件包括(但不限于)E2A、P2A和F2A。2A核糖体跳跃元件允许产生由第一基因和第二基因编码的分开的多肽，在翻译期间产生。接头可编码可裂解的接头多肽序列，例如弗林蛋白酶裂解位点或TEV裂解位点，其中在表达之后，可裂解的接头多肽裂解，从而产生由第一基因和第二基因编码的分开的多肽。可裂解接头可包括多肽序列，例如进一步促进裂解的柔性接头(例如Gly-Ser-Gly序列)。
接头可编码内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)，从而在翻译期间产生由第一基因和第二基因编码的分开的多肽。接头可编码剪接接受体，例如病毒剪接接受体。
接头可以是接头组合，例如弗林蛋白酶-2A接头，其可通过2A核糖体跳跃产生分开的多肽，接着进一步裂解弗林蛋白酶位点，从而完全去除2A残余物。在一些实施方案中，接头组合可包括弗林蛋白酶序列、柔性接头和2A接头。因此，在一些实施方案中，接头为弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-2A融合多肽。在一些实施方案中，本公开的接头为弗林蛋白酶-Gly-Ser-Gly-T2A融合多肽。
一般来说，多顺反子系统可使用任何数目的接头或接头组合，以表达任何数目的基因或其部分(例如工程化核酸可编码第一、第二和第三效应分子，各由接头分开，从而产生由第一、第二和第三效应分子编码的分开的多肽)。
工程化核酸可使用多个启动子从多个ORF表达基因，即可由单个工程化核酸产生超过一个分开的mRNA转录本。举例来说，第一启动子可操作地连接于编码第一效应分子的多核苷酸序列，并且第二启动子可操作地连接于编码第二效应分子的多核苷酸序列。一般来说，任何数目的启动子可用于表达任何数目的效应分子。在一些实施方案中，从多个启动子表达的至少一个ORF可为多顺反子的。
如本文所用，“接头”可指连接第一多肽序列与第二多肽序列的多肽、上述多顺反子接头或上述可操作地连接于额外ORF的额外启动子。
归巢分子
“肿瘤微环境”为其中存在肿瘤的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)(参见例如Pattabiraman,D.R.和Weinberg,R.A.Nature Reviews Drug Discovery13,497-512(2014)；Balkwill,F.R.等人J Cell Sci 125,5591-5596,2012；和Li,H.等人JCell Biochem 101(4),805-15,2007)。
在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生至少一种归巢分子。“归巢”是指细胞主动导航(迁移)至靶位点(例如细胞、组织(例如肿瘤)或器官)。“归巢分子”是指将细胞引导至靶位点的分子。在一些实施方案中，归巢分子用于识别和/或起始工程化细胞与靶位点的相互作用。归巢分子的非限制性实例包括CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7和PDGFR。
在一些实施方案中，归巢分子是趋化因子受体(结合于趋化因子的细胞表面分子)。趋化因子是由细胞分泌的可诱导细胞中的定向趋化性的小细胞因子或信号传导蛋白。趋化因子可分为四个主要亚科：CXC、CC、CX3C和XC，均通过选择性地结合于位于靶细胞表面的趋化因子受体来发挥生物效应。在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生CXCR4，CXCR4是一种允许工程化细胞沿着趋化因子梯度归巢至表达基质细胞来源因子1(又称SDF1、C-X-C模体趋化因子12和CXCL12)的细胞、组织或肿瘤的趋化因子受体。可由本公开的工程化核酸编码的趋化因子受体的非限制性实例包括：CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CXCR7)、CC趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1，其结合于CX3CL1)和XC趋化因子受体(例如XCR1)。在一些实施方案中，趋化因子受体为G蛋白连接跨膜受体，或肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员(包括(但不限于)TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生CXCL8、CXCL9和/或CXCL10(促进T细胞募集)、CCL3和/或CXCL5、CCL21(Th1募集和极化)。
在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生检测含有N-甲酰化寡肽(包括(但不限于)FPR2和FPRL1)的G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)。
在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生检测白细胞介素(包括(但不限于)IL6R)的受体。
在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生检测从其它细胞、组织或肿瘤分泌的生长因子的受体(包括(但不限于)FGFR、PDGFR、EGFR和VEGF家族受体，包括(但不限于)VEGF-C和VEGF-D)。
在一些实施方案中，归巢分子为整合素。整合素是促进细胞-细胞外基质(extracellular matrix，ECM)粘附的跨膜受体。整合素是具有两个亚基的专性异源二聚体：α(α)和β(β)。整合素的α亚基可为不限于：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整合素的β亚基可为不限于：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7和ITGB8。工程化核酸可被配置用于产生整合素α与β亚基的任何组合。
在一些实施方案中，归巢分子为基质金属蛋白酶(MMP)。MMP是使下伏在内皮细胞壁的基底膜的组分裂解的酶。MMP的非限制性实例包括MMP-2、MMP-9和MMP。在一些实施方案中，工程化核酸被配置用于产生抑制MMP的分子(例如蛋白质)的抑制剂。举例来说，工程化核酸可被配置用于表达膜1型MMP(MT1-MMP)的抑制剂(例如RNAi分子)或TIMP金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)。
在一些实施方案中，归巢分子为结合于例如靶组织的内皮上的选择素(例如造血细胞E-/L-选择素配体(HCELL)，Dykstra等人,Stem Cells.2016年10月；34(10):2501-2511)的配体。
术语“归巢分子”还涵盖调控改善/增强细胞归巢的分子产生的转录因子。
分泌信号
一般来说，一种或多种效应分子在效应分子的N端包含分泌信号肽(又称信号肽或信号序列)，其指导新合成的蛋白质进行分泌或膜插入至适当蛋白质加工通路。在两种或更多种效应分子的实施方案中，每种效应分子可包含分泌信号。在两种或更多种效应分子的实施方案中，每种效应分子可包含分泌信号，使得每种效应分子从工程化细胞分泌而来。
与效应分子可操作地相关联的分泌信号肽可为天然分泌信号肽天然分泌信号肽(例如一般与给定效应分子内源性相关的分泌信号肽)。与效应分子可操作地相关联的分泌信号肽可为非天然分泌信号肽天然分泌信号肽。非天然分泌信号肽可促进表达和功能改善，例如维持分泌，尤其环境，例如肿瘤微环境。非天然分泌信号肽的非限制性实例展示于表5中。
表5.例示性信号分泌肽
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工程化细胞
本文提供了工程化细胞，以及产生工程化细胞的方法，所述工程化细胞产生调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。这些细胞在本文中称为“工程化细胞”。这些细胞通常含有工程化核酸，在自然界中不存在。在一些实施方案中，细胞被工程化用于包括包含可操作地连接于编码效应分子(例如刺激免疫应答的效应分子)的核苷酸序列的启动子的核酸。工程化细胞可包含被整合到细胞基因组中的工程化核酸。工程化细胞可包含能够在不整合到细胞基因组中的情况下表达的工程化核酸，例如用例如质粒或mRNA的瞬时表达系统工程化。
本公开还涵盖了效应分子与产生其的工程化细胞之间的累加作用和协同作用。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少两种(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)效应分子，每一种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在其它实施方案中，细胞被工程化用于产生并非由所述细胞天然产生的至少一种效应分子。这类效应分子可例如补充由所述细胞天然产生的效应分子的功能。
在一些实施方案中，细胞被工程化用于表达膜系抗CD3和/或抗CD28激动剂细胞外结构域。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生至少两种效应分子。举例来说，细胞可被工程化用于产生2-20种不同效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生2-20种、2-19种、2-18种、2-17种、2-16种、2-15种、2-14种、2-13种、2-12种、2-11种、2-10种、2-9种、2-8种、2-7种、2-6种、2-5种、2-4种、2-3种、3-20种、3-19种、3-18种、3-17种、3-16种、3-15种、3-14种、3-13种、3-12种、3-11种、3-10种、3-9种、3-8种、3-7种、3-6种、3-5种、3-4种、4-20种、4-19种、4-18种、4-17种、4-16种、4-15种、4-14种、4-13种、4-12种、4-11种、4-10种、4-9种、4-8种、4-7种、4-6种、4-5种、5-20种、5-19种、5-18种、5-17种、5-16种、5-15种、5-14种、5-13种、5-12种、5-11种、5-10种、5-9种、5-8种、5-7种、5-6种、6-20种、6-19种、6-18种、6-17种、6-16种、6-15种、6-14种、6-13种、6-12种、6-11种、6-10种、6-9种、6-8种、6-7种、7-20种、7-19种、7-18种、7-17种、7-16种、7-15种、7-14种、7-13种、7-12种、7-11种、7-10种、7-9种、7-8种、8-20种、8-19种、8-18种、8-17种、8-16种、8-15种、8-14种、8-13种、8-12种、8-11种、8-10种、8-9种、9-20种、9-19种、9-18种、9-17种、9-16种、9-15种、9-14种、9-13种、9-12种、9-11种、9-10种、10-20种、10-19种、10-18种、10-17种、10-16种、10-15种、10-14种、10-13种、10-12种、10-11种、11-20种、11-19种、11-18种、11-17种、11-16种、11-15种、11-14种、11-13种、11-12种、12-20种、12-19种、12-18种、12-17种、12-16种、12-15种、12-14种、12-13种、13-20种、13-19种、13-18种、13-17种、13-16种、13-15种、13-14种、14-20种、14-19种、14-18种、14-17种、14-16种、14-15种、15-20种、15-19种、15-18种、15-17种、15-16种、16-20种、16-19种、16-18种、16-17种、17-20种、17-19种、17-18种、18-20种、18-19种或19-20种效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种效应分子。
在一些实施方案中，工程化细胞包含一种或多种工程化核酸，所述工程化核酸编码可操作地连接于编码效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸被工程化用于包括多种工程化核酸，例如至少两种工程化核酸，每种工程化核酸编码可操作地连接于编码至少一种(例如1种、2种或3种)效应分子的核苷酸序列的启动子。举例来说，细胞可被工程化用于包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少8种、至少9种或至少10种工程化核酸，每种工程化核酸编码可操作地连接于编码至少一种(例如1种、2种或3种)效应分子的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、8种、9种、10种或更多种工程化核酸，每种工程化核酸编码可操作地连接于编码至少一种(例如1种、2种或3种)效应分子的核苷酸序列的启动子。工程化细胞可包含编码至少一种上述接头的工程化核酸，所述接头例如连接第一多肽序列与第二多肽序列的多肽、一种或多种上述多顺反子接头、一种或多种可操作地连接于额外ORF的额外启动子或它们的组合。
本公开的工程化细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)通常产生多种效应分子，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，效应分子中的至少一种刺激肿瘤微环境中的炎性通路，并且效应分子中的至少一种抑制肿瘤微环境中的负炎症调节因子。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生至少一种归巢分子。“归巢”是指细胞主动导航(迁移)至靶位点(例如细胞、组织(例如肿瘤)或器官)。“归巢分子”是指将细胞引导至靶位点的分子。在一些实施方案中，归巢分子用于识别和/或起始工程化细胞与靶位点的相互作用。归巢分子的非限制性实例包括CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7和PDGFR。
在一些实施方案中，归巢分子是趋化因子受体(结合于趋化因子的细胞表面分子)。可由本公开的工程化细胞产生的趋化因子受体的非限制性实例包括：CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CXCR7)、CC趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1，其结合于CX3CL1)和XC趋化因子受体(例如XCR1)。在一些实施方案中，趋化因子受体为G蛋白连接跨膜受体，或肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员(包括(但不限于)TNFRSF1A、TNFRSF1B)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL8、CXCL9和/或CXCL10(促进T细胞募集)、CCL3和/或CXCL5、CCL21(Th1募集和极化)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCR4。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生检测含有N-甲酰化寡肽(包括(但不限于)FPR2和FPRL1)的G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生检测白细胞介素(包括(但不限于)IL6R)的受体。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生检测从其它细胞、组织或肿瘤分泌的生长因子的受体(包括(但不限于)FGFR、PDGFR、EGFR和VEGF家族受体，包括(但不限于)VEGF-C和VEGF-D)。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生一种或多种整合素。本公开的细胞可被工程化用于产生整合素α和β亚基的任何组合。整合素的α亚基可为不限于：ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。整合素的β亚基可为不限于：ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7和ITGB8。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)。MMP的非限制性实例包括MMP-2、MMP-9和MMP。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生抑制MMP的分子(例如蛋白质)的抑制剂。举例来说，细胞可被工程化用于表达膜1型MMP(MT1-MMP)的抑制剂(例如RNAi分子)或TIMP金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生结合于例如靶组织的内皮上的选择素的配体(例如造血细胞E-/L-选择素配体(HCELL)，Dykstra等人,Stem Cells.2016年10月；34(10):2501-2511)。
术语“归巢分子”还涵盖调控改善/增强细胞归巢的分子产生的转录因子。
本文还提供了被工程化用于产生多种效应分子的工程化细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)，其中至少两种效应分子调节不同的肿瘤介导的免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制，或抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制。在一些实施方案中，至少一种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制，并且至少一种效应分子(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫抑制机制。在其它实施方案中，至少两种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子刺激肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制。在其它实施方案中，至少两种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)效应分子抑制肿瘤微环境中的至少一种免疫刺激机制。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生至少一种刺激T细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激抗原呈递和/或加工的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激树突状细胞分化和/或成熟的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激免疫细胞募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激M1巨噬细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激Th1极化的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激基质降解的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激免疫刺激代谢物产生的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种刺激I型干扰素信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种抑制负共刺激信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导(例如经由TRAIL)的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种抑制肿瘤检查点分子的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种活化干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种降解免疫抑制因子/代谢物的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种抑制血管内皮生长因子信号传导的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生至少一种直接杀死肿瘤细胞的效应分子(例如颗粒酶、穿孔素、溶瘤病毒、细胞溶解肽和酶、例如引起ADCC的抗肿瘤抗体)。
在一些实施方案中，至少一种效应分子：刺激T细胞信号传导、活性和/或募集，刺激抗原呈递和/或加工，刺激自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号传导、活性和/或募集，刺激树突状细胞分化和/或成熟，刺激免疫细胞募集，刺激巨噬细胞信号传导，刺激基质降解，刺激免疫刺激代谢物产生，或刺激I型干扰素信号传导；且至少一种效应分子抑制负共刺激信号传导，抑制抗肿瘤免疫细胞的促细胞凋亡信号传导，抑制调节T(Treg)细胞信号传导、活性和/或募集，抑制肿瘤检查点分子，活化干扰素基因刺激蛋白(STING)信号传导，抑制骨髓来源抑制性细胞信号传导、活性和/或募集，降解免疫抑制因子/代谢物，抑制血管内皮生长因子信号传导或直接杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生至少一种选自IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和CD40L的效应分子；和/或至少一种选自检查点抑制剂的效应分子。可被靶向以进行阻断或抑制的例示性免疫检查点分子包括(但不限于)CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并在所有的NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(又称为BY55)以及CGEN-15049。免疫检查点抑制剂包括结合并阻断或抑制以下中的一种或多种的活性的抗体或它们的抗原结合片段，或其它结合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160以及CGEN-15049。示例性检查点抑制剂包括(但不限于)抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体以及抗TREM2抗体。例示性免疫检查点抑制剂包括派姆单抗(pembrolizumab)(抗PD-1；MK-3475/
Figure BDA0003596748340000811
-Merck)、纳武单抗(nivolumamb)(抗PD-1；
Figure BDA0003596748340000812
-BMS)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1抗体；CT-011-Teva/CureTech)、AMP224(抗PD-1；NCI)、阿维鲁单抗(avelumab)(抗PD-L1；
Figure BDA0003596748340000813
-Pfizer)、度伐鲁单抗(durvalumab)(抗PD-L1；MEDI4736/
Figure BDA0003596748340000814
-Medimmune/AstraZeneca)、阿特珠单抗(atezolizumab)(抗PD-L1；
Figure BDA0003596748340000815
-Roche/Genentech)、BMS-936559(抗PD-L1-BMS)、曲美利单抗(tremelimumab)(抗CTLA-4；Medimmune/AstraZeneca)、伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4；Yervoy
Figure BDA0003596748340000816
-BMS)、利丽单抗(lirilumab)(抗KIR；BMS)、莫那利珠单抗(monalizumab)(抗NKG2A；Innate Pharma/AstraZeneca)。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生至少一种选自IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和CD40L的效应分子；和/或至少一种选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗IL-35抗体的效应分子；和/或至少一种选自MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)和CCL21的效应分子；和/或至少一种选自CpG寡脱氧核苷酸的效应分子和/或至少一种选自微生物肽的效应分子。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-β和至少一种选自细胞因子、抗体、趋化因子、核苷酸、肽、酶和干扰素基因刺激蛋白(STING)的效应分子。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种细胞因子或受体/配体(例如IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和/或CD40L)。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-β和至少一种细胞因子或受体/配体(例如IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-配体和/或CD40L)。
在一些实施方案中，细胞因子产生为与自我结合于细胞因子以诱导细胞特异性靶向结合的抗体、抗体-片段或受体的工程化的融合蛋白，例如IL-2与防止IL-2结合于Treg细胞并且优先结合于CD8和NK细胞的抗体片段融合。在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-β和至少一种抗体(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗VEGF、抗TGF-β、抗IL-10、抗TNF-α和/或抗IL-35抗体)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种趋化因子(MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)和/或CCL21)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种核苷酸(例如CpG寡脱氧核苷酸)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种肽(例如抗肿瘤肽)。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种STING活化剂。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和至少一种具有直接抗肿瘤活性的效应子(例如溶瘤病毒)。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-α和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-β和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-12和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生干扰素基因刺激蛋白(STING)和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CD40L和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和MIP1-α。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和MIP1-β。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CXCL9。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CXCL10。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CXCL11。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-α和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-β和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生干扰素基因刺激蛋白(STING)和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CD40L和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生MIP1-α和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和MIP1-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生MIP1-β和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和MIP1-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CXCL9和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CXCL10和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CXCL11和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CCL21和IL-12。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和IFN-γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和IL-2。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和IL-7。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和IL-15。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和IL-36γ。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和IL-18。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和CD40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和41BB-L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体和/或OX40L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-α和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-α和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-β和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-β和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生TRAIL和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生TRAIL和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生STING和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生STING和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CD40L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生腺苷脱氨酶和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生腺苷脱氨酶和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL21。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生MIP1-α和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-α和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生MIP1-β和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生MIP1-β和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CXCL9和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL9和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CXCL10和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL10和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CXCL11和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CXCL11和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CCL21和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CCL21和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L和/或41BB-L。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-12和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-12和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IFN-γ和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-γ和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-γ和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IFN-γ和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-2和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-2和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-2和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-2和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-7和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-7和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-7和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-7和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-15和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-15和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-15和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-15和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-36-γ和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-36-γ和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-36-γ和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-36-γ和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生IL-18和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-18和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-18和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生IL-18和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生CD40L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生CD40L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
在一些实施方案中，细胞(例如肿瘤细胞、红血球、血小板细胞或细菌细胞)被工程化用于产生41BB-L和抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生41BB-L和OX40L。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生41BB-L和抗CTLA4抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于产生41BB-L和抗CD47抗体。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L和/或腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，细胞被工程化用于进一步产生MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CCL21。
工程化细胞类型
本文还提供了工程化肿瘤细胞。肿瘤细胞可被工程化成包含任何本文所述的工程化核酸。肿瘤细胞可被工程化成具有任何本文所述的工程化细胞的任何特征。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生一种或多种效应分子的肿瘤细胞。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生两种或更多种效应分子的肿瘤细胞。
肿瘤细胞的实例包括但不限于膀胱肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、宫颈肿瘤细胞、结肠直肠肿瘤细胞、食管肿瘤细胞、胶质瘤细胞、肾脏肿瘤细胞、肝脏肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、皮肤肿瘤细胞、甲状腺肿瘤细胞和子宫肿瘤细胞。
使用本领域的技术人员已知的方法，肿瘤细胞可被工程化用于产生效应分子。举例来说，肿瘤细胞可被转导成对肿瘤进行工程化。在一实施方案中，肿瘤细胞使用病毒转导。
在一特定实施方案中，肿瘤细胞使用溶瘤病毒转导。溶瘤病毒的实例包括但不限于溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。
病毒，包括任何本文所述的溶瘤病毒，可以是编码一种或多种转基因，例如任何本文所述的工程化核酸的重组病毒，所述转基因编码一种或多种效应分子。病毒，包括任何本文所述的溶瘤病毒，可以是编码一种或多种转基因，例如任何本文所述的工程化核酸的重组病毒，所述转基因编码两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子。
本文还提供了工程化红血球。红血球可被工程化成包含任何本文所述的工程化核酸。红血球可被工程化成具有任何本文所述的工程化细胞的任何特征。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生一种或多种效应分子的红血球。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生两种或更多种效应分子的红血球。
本文还提供了工程化血小板细胞。血小板细胞可被工程化成包含任何本文所述的工程化核酸。血小板细胞可被工程化成具有任何本文所述的工程化细胞的任何特征。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生一种或多种效应分子的血小板细胞。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生两种或更多种效应分子的血小板细胞。
本文还提供了工程化细菌细胞。细菌细胞可被工程化成包含任何本文所述的工程化核酸。细菌细胞可被工程化成具有任何本文所述的工程化细胞的任何特征。在一特定方面，本文提供了被工程化用于产生两种或更多种效应分子的细菌细胞。细菌细胞可被工程化用于产生一种或多种哺乳动物效应分子。细菌细胞可被工程化用于产生两种或更多种哺乳动物效应分子。细菌细胞的实例包括但不限于拜氏梭菌、生孢梭菌、诺氏梭菌、大肠埃希氏杆菌、绿脓杆菌、核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。
工程化细胞可以是人类细胞。工程化细胞可以是人类原代细胞。工程化原代细胞可以是肿瘤浸润性原代细胞。工程化原代细胞可以是原代T细胞。工程化原代细胞可以是造血干细胞(HSC)。工程化原代细胞可以是自然杀伤细胞。工程化原代细胞可以是任何体细胞。工程化原代细胞可以是MSC。
工程化细胞可从受试者，例如已知或怀疑患有癌症的受试者分离。本领域的技术人员已知细胞分离方法并且包括(但不限于)基于细胞表面标志物表达的分选技术，例如FACS分选、阳性分离技术和阴性分离、磁性分离以及它们的组合。工程化细胞对于施用治疗的受试者为同种异体的。同种异体的修饰细胞可与施用治疗的受试者HLA匹配。工程化细胞可以是培养细胞，例如离体培养细胞。工程化细胞可以是离体培养细胞，例如从受试者分离的原代细胞。培养细胞可用一种或多种细胞因子培养。
本文还提供了包括培养本公开的工程化细胞的方法。已知培养本文所述的工程化细胞的方法。本领域的技术人员将认识到培养条件将取决于所关注的特定工程化细胞。本领域的技术人员将认识到培养条件将取决于工程化细胞的特定下游使用，例如用于随后工程化细胞施用于受试者的特定培养条件。
表6：编码例示性效应分子的序列
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细胞工程化的方法
本文还提供了用于细胞工程化以产生一种或多种效应分子的组合物和方法。
一般说来，通过将编码一种或多种效应分子的多核苷酸引入(即，递送)到细胞的胞液和/或细胞核中来进行细胞工程化，以产生效应分子。举例来说，编码一种或多种效应分子的多核苷酸可能是任一种本文所述的工程化核酸。递送方法包括(但不限于)病毒介导的递送、脂质介导的转染、纳米颗粒递送、电穿孔、超声处理以及通过物理方式使细胞膜变形。本领域的技术人员将理解，递送方法的选择可取决于有待工程化的特定的细胞类型。
病毒介导的递送
可使用基于病毒载体的递送平台将细胞工程化。一般说来，基于病毒载体的递送平台通过引入(即，递送)到宿主细胞中将细胞工程化。举例来说，基于病毒载体的递送平台可通过引入任一种本文所述的工程化核酸将细胞工程化。基于病毒载体的递送平台可为核酸，因而，工程化核酸还可以涵盖工程化的病毒来源的核酸。这类工程化的病毒来源的核酸还可称为重组病毒或工程化病毒。
基于病毒载体的递送平台可在同一核酸内编码超过一种工程化核酸、基因或转基因。举例来说，工程化的病毒来源的核酸，例如重组病毒或工程化病毒，可编码一种或多种转基因，包括(但不限于)编码一种或多种效应分子的任一种本文所述的工程化核酸。编码一种或多种效应分子的一种或多种转基因可被配置成表达一种或多种效应分子。除了一种或多种转基因(例如编码一种或多种效应分子的转基因)之外，基于病毒载体的递送平台还可编码一种或多种基因，例如病毒感染性和/或病毒产生需要的病毒基因(例如衣壳蛋白、包膜蛋白、病毒聚合酶、病毒转录酶等)，称为顺式作用元件或基因。
基于病毒载体的递送平台可包含超过一种病毒载体，例如编码本文所述的工程化核酸、基因或转基因的独立的病毒载体，并称为反式作用元件或基因。举例来说，基于辅助病毒依赖性病毒载体的递送平台可在除了编码一种或多种效应分子的载体之外的一种或多种额外的独立载体上提供病毒感染性和/或病毒产生需要的额外基因。一种病毒载体可递送超过一种工程化核酸，例如一种载体递送被配置用于产生两种或更多种效应分子的工程化核酸。超过一种病毒载体可递送超过一种工程化核酸，例如超过一种载体递送被配置用于产生一种或多种效应分子的一种或多种工程化核酸。使用的病毒载体的数目可取决于上述基于病毒载体的疫苗平台的包装容量，并且本领域的技术人员可选择适当数目的病毒载体。
一般说来，任一种基于病毒载体的系统都可用于在体外产生分子，例如效应分子，或用于体内和离体基因疗法程序中，例如体内递送编码一种或多种效应分子的工程化核酸。适当的基于病毒载体的系统的选择将取决于多种因素，例如货物/有效负载物的尺寸、病毒系统的免疫原性、所关注的靶细胞、基因表达强度和时间选择以及本领域的技术人员了解的其它因素。
基于病毒载体的递送平台可为基于RNA的病毒或基于DNA的病毒。示例性的基于病毒载体的递送平台包括(但不限于)单纯疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒、流感病毒、印地安那州水疱病毒、新城疫病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、马拉巴病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、肝炎病毒、风疹病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、麻疹病毒、慢病毒、复制型逆转录病毒、棒状病毒、塞内卡谷病毒、辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。本领域中还描述了其它示例性的基于病毒载体的递送平台，例如痘苗、禽痘、自我复制型甲病毒、马拉巴病毒、腺病毒(参见例如Tatsis等人,Adenoviruses,Molecular Therapy(2004)10,616-629)或慢病毒，包括但不限于第二代、第三代或杂交第二代/第三代慢病毒和被设计用于靶向特定细胞类型或受体的任何一代重组慢病毒(参见例如Hu等人,Immunization Delivered byLentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev.(2011)239(1):45-61；Sakuma等人,Lentiviral vectors:basic to translational,Biochem J.(2012)443(3):603-18；Cooper等人,Rescue of splicing-mediated intron lossmaximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin Cpromoter,Nucl.Acids Res.(2015)43(1):682-690；Zufferey等人,Self-InactivatingLentivirus Vector for Safe and Efficient In vivo Gene Delivery,J.Virol.(1998)72(12):9873-9880)。
序列可在靶向亚细胞区室的一种或多种序列之前。在引入(即，递送)到宿主细胞中之后，受感染细胞(即，工程化细胞)可表达并在一些情况下分泌一种或多种效应分子。可用于免疫方案的痘苗载体和方法描述于例如美国专利No.4,722,848中。另一种载体为BCG(卡介苗)。BCG载体描述于Stover等人(Nature 351:456-460(1991))中。本领域的技术人员从本文中的描述中将显而易见多种其它的可用于引入(即，递送)工程化核酸的载体，如鼠伤寒沙门菌载体等。
基于病毒载体的递送平台可为靶向肿瘤细胞的病毒，本文中称为溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括(但不限于)溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。任一种本文所述的溶瘤病毒可为包含编码一种或多种效应分子的一种多种转基因(例如工程化核酸)的重组溶瘤病毒。编码一种或多种效应分子的转基因可被配置成表达一种或多种效应分子。
基于病毒载体的递送平台可基于逆转录病毒。一般说来，逆转录病毒载体由顺式作用的长末端重复序列构成，具有高达6-10kb外来序列的包装容量。最小的顺式作用的LTR足够复制和包装载体，然后用于将一种或多种工程化核酸(例如编码一种或多种效应分子的转基因)整合到靶细胞中以提供永久的转基因表达。基于逆转录病毒的递送系统包括(但不限于)基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)以及它们的组合(参见例如Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人,J,Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。其它的逆转录病毒系统包括Phoenix逆转录病毒系统。
基于病毒载体的递送平台可基于慢病毒。一般说来，慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。基于慢病毒的递送平台可基于HIV，例如ViraPower系统(ThermoFisher)或pLenti系统(Cell Biolabs)。基于慢病毒的递送平台可基于SIV或FIV。其它示例性的基于慢病毒的递送平台更详细地描述于美国专利No.7,311,907；7,262,049；7,250,299；7,226,780；7,220,578；7,211,247；7,160,721；7,078,031；7,070,993；7,056,699；6,955,919，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
基于病毒载体的递送平台可基于腺病毒。一般说来，基于腺病毒的载体在许多细胞类型中能够具有很高的转导效率，不需要细胞分裂，实现高滴度和表达水平，并且可在相对简单的系统中大量地产生。一般说来，腺病毒可用于在受感染细胞内瞬时表达转基因，因为腺病毒通常不整合到宿主的基因组中。基于腺病毒的递送平台更详细地描述于以下中：Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:77007704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。其它示例性地基于腺病毒的递送平台更详细地描述于以下中：美国专利No.5585362；6,083,716,7,371,570；7,348,178；7,323,177；7,319,033；7,318,919；以及7,306,793和国际专利申请WO96/13597，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
基于病毒载体的递送平台可基于腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒(“AAV”)载体可用于用工程化核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)转导细胞。AAV系统可用于在体外产生效应分子，或用于体内和离体基因疗法程序中，例如体内递送编码一种或多种效应分子的工程化核酸(参见例如West等人,Virology 160:38-47(1987)；美国专利No.4,797,368；5,436,146；6,632,670；6,642,051；7,078,387；7,314,912；6,498,244；7,906,111；美国专利公布US 2003-0138772、US 2007/0036760和US 2009/0197338；Gao等人,J.Virol,78(12):6381-6388(2004年6月)；Gao等人,Proc Natl Acad Sci USA,100(10):6081-6086(2003年5月13日)；以及国际专利申请WO 2010/138263和WO 93/24641；Kotin,Human GeneTherapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的)。用于构建重组AAV载体的示例性方法更详细地描述于以下中：美国专利No,5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等人,Mol.Cell,Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&amp；Muzyczka,PNAS 81:64666470(1984)；以及Samuiski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。一般说来，基于AAV的载体包含具有与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11以及它们的变体对应的氨基酸序列的衣壳蛋白。
基于病毒载体的递送平台可为病毒样颗粒(VLP)平台。一般说来，VLP通过产生病毒结构蛋白并纯化所得到的病毒颗粒来构建。然后，在纯化后，将货物有效负载物(例如任一种本文所述的工程化核酸)离体封装在纯化的颗粒内。因此，VLP的产生维持编码病毒结构蛋白的核酸与货物/有效负载物的核酸的分离。在VLP产生中所用的病毒结构蛋白可在多种表达系统中产生，这些表达系统包括哺乳动物、酵母、昆虫、细菌或体内翻译表达系统。使用本领域的技术人员已知的方法，纯化的病毒颗粒可在所需货物存在下变性和重新形成，产生VLP。VLP的产生更详细地描述于Seow等人(Mol Ther.2009年5月；17(5):767-777)，以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
基于病毒载体的递送平台可被工程化用于靶向(即，感染)一系列细胞，靶向一小部分细胞，或靶向特定细胞。一般说来，被挑选用于基于病毒载体的递送平台的包膜蛋白将决定病毒嗜性。基于病毒载体的递送平台中所用的病毒可被假型化成靶向所关注的特定细胞。基于病毒载体的递送平台可为泛嗜性的并感染一系列细胞。举例来说，泛嗜性的基于病毒载体的递送平台可包括VSV-G包膜。基于病毒载体的递送平台可为双嗜性的并感染哺乳动物细胞。因此，本领域的技术人员可选择适当的嗜性、假型和/或包膜蛋白以靶向所期望的细胞类型。
脂质结构递送系统
可使用脂质介导的递送系统将工程化核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)引入到细胞中。一般说来，脂质介导的递送系统使用由包围内部区室的外部脂质膜构成的结构。基于脂质的结构的实例包括(但不限于)基于脂质的纳米颗粒、脂质体、胶束、外泌体、泡囊、细胞外泡囊、细胞或组织。脂质结构递送系统可在体外、体内或离体递送货物/有效负载物(例如任一种本文所述的工程化核酸)。
基于脂质的纳米颗粒可包括(但不限于)单室脂质体、多室脂质体和脂质制剂。如本文所用，“脂质体”是通称，它涵盖由所需货物，例如工程化核酸，例如任一种本文所述的工程化核酸封闭在脂质壳或脂质聚集体内而形成的脂质媒介物的体外制剂。脂质体的特征在于具有多孔结构与双层膜，一般包含磷脂，以及一般包含水性组合物的内部介质。脂质体包括(但不限于)乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。脂质体可为单室脂质体。脂质体可为多室脂质体。脂质体可为多囊脂质体。脂质体可带正电荷、带负电荷或是电中性的。在某些实施方案中，脂质体是电中性的。脂质体可由标准的成囊脂质形成，所述脂质一般包括电中性和带负电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。脂质的选择一般是根据预期目的的考虑因素，例如体内递送标准，例如脂质体尺寸、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性。多种方法可用于制备脂质体，如例如以下中所述：Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9；467(1980)；美国专利No.4,235,871、4,501,728、4,501,728、4,837,028和5,019,369，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
当包含磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中使得多个脂质层被水性介质隔开时，自发地产生多室脂质体。在脂质组分进行自我重排后，水和溶解的溶质被夹在脂质双层之间的封闭结构中。所期望的货物(例如多肽、核酸、小分子药物、工程化核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)、病毒载体、基于病毒的递送系统等)可封装在脂质体的水性内部中，经由与脂质体和多肽/核酸均缔合的连接分子连接于脂质体，散布在脂质体的脂质双层内，夹在脂质体中，与脂质体形成复合物，或以其它方式与脂质体相关联，以使得它可被递送到靶实体。具有亲脂性区域的亲脂性分子还可溶于脂质双层中或与脂质双层缔合。
根据本发明的实施方案使用的脂质体可通过不同的方法制成，如本领域的一般技术人员所知的。脂质体的制剂进一步详细地描述于以下中：WO 2016/201323、国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040和美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
脂质体可为阳离子脂质体。阳离子脂质体的实例更详细地描述于以下中：美国专利No.5,962,016；5,030,453；6,680,068；美国申请2004/0208921；以及国际专利申请WO03/015757A1、WO04029213A2和WO02/100435A1，每一者在此以引用的方式整体并入。
脂质介导的基因递送方法例如描述于以下中：WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682-691(1988)；美国专利No.5,279,833Rose美国专利No.5,279,833；WO91/06309；以及Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7414(1987)，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
外泌体是内吞来源的小膜囊，它在多囊体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。外泌体的尺寸在直径为30与100nm之间的范围内。它们的表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，并且它们含有来自产生外泌体的细胞的胞液，并在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。本领域的技术人员已知可用于递送核酸的外泌体，例如美国专利No.9,889,210(以引用的方式并入本文中以达成所有目的)中更详细地描述的外泌体。
如本文所用，术语“细胞外泡囊”或“EV”是指一种源自细胞的泡囊，它包含围成一个内部空间的膜。一般说来，细胞外泡囊包含直径小于它们所源自的细胞的所有膜结合的泡囊。一般地，细胞外泡囊的直径在20nm至1000nm范围内，并且可在内部空间内包含多种大分子货物，将大分子货物展示在细胞外泡囊的外表面上，和/或大分子货物跨越膜。货物可包含核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。举例来说并且不限于此，细胞外泡囊包括凋亡小体、细胞片段、通过直接或间接的操纵(例如通过连续挤压或用碱性溶液处理)从细胞获得的泡囊、泡囊化细胞器以及活细胞产生的泡囊(例如通过直接质膜出芽或次级内体与质膜的融合)。细胞外泡囊可源自于活的或死亡的生物体、外植的组织或器官和/或培养细胞。
如本文所用，术语“外泌体”是指源自细胞的小(直径在200-300nm之间，更优选地，直径为40-200nm)泡囊，它包含围成一个内部空间的膜，并通过直接质膜出芽或通过次级内体与质膜的融合从细胞产生。外泌体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载物(例如治疗剂)、接收剂(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA，例如任一种本文所述的工程化核酸)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其它的分子。外泌体可源自于生产细胞，并基于它的尺寸、密度、生化参数或它们的组合从生产细胞分离。外泌体为一种细胞外泡囊。一般地，外泌体的产生/生物合成不会对生产细胞产生破坏。外泌体和外泌体的制备进一步详细地描述于WO 2016/201323(以引用的方式整体并入本文中)中。
如本文所用，术语“纳米泡囊”(又称为“微泡”)是指源自细胞的小(直径在20-250nm之间，更优选地，直径为30-150nm)泡囊，它包含围成一个内部空间的膜，并通过直接或间接操纵从细胞产生，因此没有该操纵，该生产细胞将不会产生该纳米泡囊。一般说来，纳米泡囊是细胞外泡囊的亚种。生产细胞的适当操纵包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或它们的组合。在一些情况下，纳米泡囊的产生可能对该生产细胞产生破坏。优选地，纳米泡囊群体基本上不含借助于从质膜直接出芽或次级内体与质膜的融合从生产细胞获得的泡囊。纳米泡囊包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载物(例如治疗剂)、接收剂(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA，例如任一种本文所述的工程化核酸)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其它的分子。一旦根据该操纵从生产细胞获得纳米泡囊，则可基于它的尺寸、密度、生化参数或它们的组合从生产细胞分离纳米泡囊。
一般说来，脂质纳米颗粒(LNP)是合成的脂质结构，它依赖于脂质的两亲性形成膜和泡囊状结构(Riley 2017)。一般说来，这些泡囊通过吸收到靶细胞的膜中并将货物释放到胞液中来递送货物/有效负载物，例如任一种本文所述的工程化核酸或病毒系统。在LNP形成中使用的脂质可为阳离子、阴离子或中性的。脂质可以是合成的或天然来源的，并在一些情况下是生物可降解的。脂质可包括脂肪、胆固醇、磷脂、脂质缀合物(包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)缀合物(聚乙二醇化脂质))、蜡、油类、甘油酯和脂溶性维生素。脂质组合物一般包括限定的材料混合物，例如阳离子、中性、阴离子和两亲性脂质。在一些情况下，包括特定的脂质以防止LNP聚集，防止脂质氧化，或提供有助于连接额外部分的化学官能团。脂质组合物可影响总体LNP尺寸和稳定性。在一个实例中，脂质组合物包含二亚油醇基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(MC3)或MC3样分子。MC3和MC3样脂质组合物可被配制成包括一种或多种其它脂质，例如PEG或PEG缀合的脂质、甾醇或中性脂质。此外，LNP可进一步工程化或官能化以有助于靶向特定细胞类型。LNP设计的另一个考虑因素是靶向效率与细胞毒性之间的平衡。
一般说来，胶束是合成的球状脂质结构，它是使用单链脂质形成的，其中单链脂质的亲水头形成外层或膜，单链脂质的疏水尾形成胶束的中心。胶束通常是指只含脂质单分子层的脂质结构。胶束更详细地描述于Quader等人(Mol Ther.2017年7月5日；25(7):1501-1513)，以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
核酸载体，例如表达载体，直接暴露于血清会产生几种不良的后果，包括核酸被血清核酸酶降解或游离核酸对免疫系统的脱靶刺激。类似地，直接暴露于血清的病毒递送系统可能触发不想要的免疫应答和/或病毒递送系统的中和。因此，可封装工程化核酸和/或病毒递送系统来避免降解，同时还避免了潜在的脱靶影响。在某些实例中，工程化核酸和/或病毒递送系统完全封装在递送媒介物内，例如LNP的水性内部。可通过本领域的技术人员众所周知的技术，例如在微流体液滴产生装置上进行的微流体混合和液滴产生，将工程化核酸和/或病毒递送系统封装在LNP内。这类装置包括(但不限于)标准T形接头装置或流动聚焦装置。在一个实例中，将所需的脂质制剂如含MC3或MC3样组合物与工程化核酸或病毒递送系统和任何其它的所需剂同时提供到液滴产生装置，以使得递送载体和所需剂完全封装在基于MC3或MC3样LNP的内部。在一个实例中，液滴产生装置可控制所产生的LNP的尺寸范围和尺寸分布。举例来说，LNP具有在直径为1至1000毫微米范围内的尺寸，例如1毫微米、10毫微米、50毫微米、100毫微米、500毫微米或1000毫微米。在液滴产生后，封装货物/有效负载物(例如工程化核酸和/或病毒递送系统)的递送媒介物可进行进一步处理或工程化以准备用于施用。
纳米颗粒递送
纳米材料可用于递送工程化核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)。重要的是，纳米材料媒介物可由非免疫原性材料制成，一般可避免引起对递送载体本身的免疫性。这些材料可包括(但不限于)脂质(如先前所述)、无机纳米材料和其它聚合物材料。纳米材料颗粒更详细地描述于Riley等人(Recent Advances in Nanomaterials for GeneDelivery-A Review.Nanomaterials 2017,7(5),94)，以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
基因组编辑系统
基因组编辑系统可用于将宿主基因组工程化，以编码工程化核酸，例如本文所述的编码一或多种效应分子的工程化核酸。一般说来，“基因组编辑系统”是指任何用于将外源基因整合到宿主细胞的基因组中的系统。基因组编辑系统包括(但不限于)转座子系统、核酸酶基因组编辑系统和基于病毒载体地递送平台。
转座子系统可用于将工程化核酸，例如本文所述的编码一或多种效应分子的工程化核酸整合到宿主基因组中。转座子一般包含末端反向重复序列(TIR)，所述TIR侧接货物/有效负载核酸和转座酶。转座子系统可使转座子与TIR侧接的货物呈顺式或反式。转座子系统可为逆转录转座子系统或DNA转座子系统。一般说来，转座子系统将货物/有效负载物(例如工程化核酸)随机地整合到宿主基因组中。转座子系统的实例包括使用Tc1/水手转座子超家族的转座子的系统，例如睡美人转座子系统，如以下中更详细地描述：Hudecek等人(Crit Rev Biochem Mol Biol.2017年8月；52(4):355-380)和美国专利No.6,489,458、6,613,752和7,985,739，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。转座子系统的另一个实例包括PiggyBac转座子系统，如以下中更详细地描述：美国专利No.6,218,185和6,962,810，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
核酸酶基因组编辑系统可用于将宿主基因组工程化，以编码工程化核酸，例如本文所述的编码一或多种效应分子的工程化核酸。不希望受理论束缚，一般说来，用于引入外源基因的核酸酶介导的基因编辑系统利用细胞天然的DNA修复机制，尤其是同源重组(HR)修复通路。简单地说，在基因组DNA在损坏(通常是双链断裂)后，细胞可通过在DNA合成期间使用在5’和3’端具有相同或基本上相同的序列的另一DNA来源作为模板来修复损伤，从而消除损坏。在天然背景下，HDR可使用细胞中存在的其它染色体作为模板。在基因编辑系统中，外源多核苷酸被引入细胞中，用作同源重组模板(HRT或HR模板)。一般说来，在模板HDR期间，可将原先没有在具有损伤的染色体中发现的任何额外的外源序列并入(即，“整合”)到给定的基因组基因座中，所述序列包括在HRT内5’和3’互补端之间(例如基因或基因一部分)。因此，给定基因组的基因座的典型HR模板具有与内源基因组靶基因座的第一区域同一的核苷酸序列、与内源基因组靶基因座的第二区域同一的核苷酸序列和编码货物/有效负载物核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸，例如编码一种或多种效应分子的任一种工程化核酸)的核苷酸序列。
在一些实例中，HR模板可为线性的。线性HR模板的实例包括(但不限于)线性化质粒载体、ssDNA、合成DNA和PCR扩增的DNA。在特定实例中，HR模板可为环状的，例如质粒。环状模板可包括超螺旋模板。
对于有待引入的外源序列，在HR模板的5’和3’端发现的相同或基本上相同的序列一般称为臂(HR臂)。HR臂可与内源基因组靶基因座的区域同一(即，100％同一)。在一些实例中，HR臂可与内源基因组靶基因座的区域基本上同一。虽然可使用基本上相同的HR臂，但HR臂宜相同，因为具有小于100％同一性的HR臂会影响HDR通路的效率。
每个HR臂，即5’和3’HR臂，可以是相同的尺寸或不同的尺寸。每个HR臂各自长度可大于或等于50个、100个、200个、300个、400个或500个碱基。尽管一般说来，HR臂可具有任何长度，但仍要考虑实际情况，例如HR臂长和总模板尺寸对总编辑效率的影响。HR臂可与内源基因组靶基因座的紧邻裂解位点的区域同一或基本上同一。每个HR臂可与内源基因组靶基因座的紧邻裂解位点的区域同一或基本上同一。每个HR臂可与内源基因组靶基因座的离裂解位点一定距离，例如彼此1个碱基对、小于或等于10个碱基对、小于或等于50个碱基对或小于或等于100个碱基对的区域同一或基本上同一。
核酸酶基因组编辑系统可使用多种核酸酶来切割基因组靶基因座，包括(但不限于)成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢核酸内切酶(HE)或其衍生物。
CRISPR介导的基因编辑系统可用于将宿主基因组工程化，以编码工程化核酸，例如本文所述的编码一或多种效应分子的工程化核酸。CRISPR系统更详细地描述于M.Adli(“The CRISPR tool kit for genome editing and beyond”Nature Communications；第9卷(2018),文章编号:1911)，所有教授内容以引用的方式并入本文中。一般说来，CRISPR介导的基因编辑系统包含CRISPR相关(Cas)核酸酶和将裂解引导到特定靶序列的RNA。一种示例性CRISPR介导的基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统，它由Cas9核酸酶和具有CRISPR RNA(crRNA)结构域和反式激活CRISPR(tracrRNA)结构域的RNA构成。crRNA通常具有两个RNA结构域：向导RNA序列(gRNA)，其通过与靶序列(“限定的核苷酸序列”)，例如基因组序列的碱基对杂交引导特异性；和与tracrRNA杂交的RNA结构域。tracrRNA可与基因组的基因座相互作用，从而促进核酸酶(例如Cas9)募集到基因组的基因座。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是不同的多核苷酸。crRNA和tracrRNA多核苷酸可以是单一多核苷酸，又称为单一向导RNA(sgRNA)。虽然这里说明了Cas9系统，但可以使用其它的CRISPR系统，例如Cpf1系统。核酸酶可包括它们的衍生物，例如Cas9功能突变体，例如Cas9“切口酶”突变体，与Cas9酶通常引起完全双链断裂相对比，所述突变体一般只介导限定的核苷酸序列的单个链的裂解。
一般说来，CRISPR系统的组分彼此相互作用，形成核糖核蛋白(RNP)复合物，以介导序列特异性裂解。在一些CRISPR系统中，可分开产生每种组分并用于形成RNP复合物。在一些CRISPR系统中，可在体外分开产生每种组分并在体外互相接触(即，“形成复合物”)，从而形成RNP复合物。然后，体外产生的RNP可引入(即，“递送”)到细胞的胞液和/或细胞核中，例如T细胞的胞液和/或细胞核。体外产生的RNP复合物可以通过多种方式递送到细胞中，这些方式包括(但不限于)电穿孔、脂质介导的转染、通过物理方式使细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和超声处理。在一特定实例中，体外产生的RNP复合物可使用Nucleofactor/
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基于电穿孔的递送系统
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递送到细胞。其它的电穿孔系统包括(但不限于)MaxCyte电穿孔系统、Miltenyi CliniMACS电穿孔系统、Neon电穿孔系统和BTX电穿孔系统。CRISPR核酸酶，例如Cas9，可使用本领域的技术人员已知的多种蛋白质产生技术在体外产生(即，合成和纯化)。CRISPR系统RNA，例如sgRNA，可使用本领域的技术人员已知的多种RNA产生技术在体外产生(即，合成和纯化)，这些技术例如体外转录或化学合成。
体外产生的RNP复合物可在不同比率的核酸酶与gRNA下复合形成。体外产生的RNP复合物还可在CRISPR介导的编辑系统中以不同的量使用。举例来说，取决于期望编辑的细胞的数目，可调整添加的总RNP量，例如减少在反应中编辑大量细胞时添加的RNP复合物的量。
在一些CRISPR系统中，每种组分(例如Cas9和sgRNA)可通过多核苷酸分开编码，每种多核苷酸一起或分开引入到细胞中。在一些CRISPR系统中，每种组分可通过单一多核苷酸(即，多启动子或多顺反子载体，参见下文示例性多顺反子系统的描述)编码并引入到细胞中。在细胞内表达每种多核苷酸编码的CRISPR组分(例如翻译核酸酶和转录CRISPR RNA)后，细胞内可形成RNP复合物，然后引导位点特异性裂解。
一些RNP可被工程化成具有促进RNP递送到细胞核中的部分。举例来说，Cas9核酸酶可具有核定位信号(NLS)结构域，以使得如果Cas9 RNP复合物被递送到细胞的胞液中或在翻译Cas9和随后形成RNP后，NLS可促进促进Cas9 RNP进一步输送到细胞核中。
本文所述的工程化细胞可使用非病毒方法工程化，例如本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可使用非病毒方法递送到细胞中。本文所述的工程化细胞可使用病毒方法工程化，例如本文所述的核酸酶和/或CRISPR介导的基因编辑系统可使用病毒方法，如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或本文所述的其它基于病毒的递送方法中的任一种递送到细胞中。
在一些CRISPR系统中，可提供超过一种CRISPR组合物，以使得每种组合物分开靶向相同基因或通用基因组基因座的超过靶核苷酸序列。举例来说，可提供两种不同的CRISPR组合物，以引导在彼此相距一定距离的两个不同的靶核苷酸序列裂解。在一些CRISPR系统中，可提供超过一种CRISPR组合物，以使得每种组合物分开靶向相同基因或通用基因组基因座的相反链。举例来说，可提供两种不同的CRISPR“切口酶”组合物，以引导在相同基因或通用基因组基因座的相反链裂解。
一般说来，本文所述的CRISPR介导的编辑系统的特征适用于其它基于核酸酶的基因组编辑系统。TALEN是一种工程化的位点特异性核酸酶，它由TALE的DNA结合结构域(类转录激活因子效应物)和限制性核酸内切酶Fokl的催化结构域构成。通过改变DNA结合结构域的单体的高度可变残基区域中存在的氨基酸，可建立不同的人工TALEN以靶向多种核苷酸序列。随后DNA结合结构域将核酸酶引导至靶序列并建立双链断裂。基于TALEN的系统更详细地描述于以下中：美国序列No.12/965,590；美国专利No.8,450,471；美国专利No.8,440,431；美国专利No.8,440,432；美国专利No.10,172,880；以及美国序列No.13/738,381，均以引用的方式整体并入本文中。基于ZFN的编辑系统更详细地描述于以下中：美国专利No.6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；以及美国专利公布No.2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，均以引用的方式整体并入本文中以达成所有目的。
其它的工程化递送系统
多种另外的方式用于将工程化核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)引入到细胞或其它靶接受实体中，例如任一种本文所述的脂质结构。
电穿孔可用于将多核苷酸递送到接受实体。电穿孔是一种通过施加电场，使靶细胞或实体的外膜或壳暂时具有渗透性，将货物/有效负载物内化到靶细胞或实体的内部区室中的方法。一般说来，所述方法包括将细胞或靶实体在含有所关注的货物(例如任一种本文所述的工程化核酸)的溶液中放在两个电极之间。然后，通过施加允许货物进入实体(例如细胞的细胞质)内部的瞬态设定电压，破坏细胞的脂质膜，即具有渗透性。在细胞的实例中，如果不是大部分，至少一些细胞保持是活的。细胞和其它实体可在体外、体内或离体电穿孔。电穿孔条件(例如细胞数目、货物浓度、回收条件、电压、时间、电容、脉冲类型、脉冲长度、体积、比色皿长度、电穿孔溶液组成等)视数种因素而变，这些因素包括(但不限于)细胞或其它接受实体的类型、要递送的货物、所期望的内化效率和所需的活力。这类标准的优化在本领域的技术人员的能力范围内。多种装置和方案可用于电穿孔。实例包括(但不限于)
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转染系统、
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Flow ElectroporationTM、
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NucleofectorTM系统和
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电穿孔系统。
其它用于将工程化核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)引入到细胞或其它靶接受实体中的方式包括(但不限于)超声处理、基因枪、流体动力学注射和通过物理方式使细胞膜变形。
用于在体内递送工程化mRNA，例如裸质粒或mRNA的组合物和方法详细地描述于Kowalski等人(Mol Ther.2019年4月10日；27(4):710–728)和Kaczmarek等人(GenomeMed.2017；9:60.)，每一者以引用的方式并入本文中以达成所有目的。
递送媒介物
本文还提供了用于递送货物/有效负载物的组合物(“递送媒介物”)。
如上所述，货物可包含核酸(例如任一种本文所述的工程化核酸)。货物可包含蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。货物可为本文所述的效应分子中的任一种。货物可以是本文所述的效应分子，例如本文所述的两种或更多种效应分子的组合。
递送媒介物可包含适合于递送货物的任何组合物。递送媒介物可包含任何适合递送蛋白质(例如任一种本文所述的效应分子)的组合物。递送媒介物可以是任一种本文所述的脂质结构递送系统。举例来说，递送媒介物可以是基于脂质的结构，包括(但不限于)基于脂质的纳米颗粒、脂质体、胶束、外泌体、泡囊、细胞外泡囊、细胞或组织。递送媒介物可以是任一种本文所述的纳米颗粒，例如包含脂质的纳米颗粒(如先前所述)、无机纳米材料以及其它聚合物材料。
递送媒介物能够将货物递送到细胞，例如将任一种本文所述的效应分子递送到细胞。递送媒介物能够将货物递送到细胞，例如将任一种本文所述的效应分子递送到细胞。递送媒介物可被配置成靶向特定细胞，例如配置有重定向抗体以靶向特定细胞。递送媒介物能够在体内将货物递送到细胞。
递送媒介物能够将货物递送到组织或组织环境(例如肿瘤微环境)，例如在体内将任一种本文所述的效应分子递送到组织或组织环境。递送货物可包括分泌货物，例如分泌任一种本文所述的效应分子。因此，递送媒介物能够分泌货物，例如分泌任一种本文所述的效应分子。递送媒介物能够将货物分泌到组织或组织环境(例如肿瘤微环境)，例如在体内将任一种本文所述的效应分子分泌到组织或组织环境。递送媒介物可被配置成靶向特定的组织或组织环境(例如肿瘤微环境)，例如配置有重定向抗体以靶向特定的组织或组织环境。
治疗方法
本文还提供了包括向受试者(例如人类受试者)递送或施用如本文提供的工程化细胞以在体内产生由工程化细胞产生的至少一种效应分子的方法。本文还提供了包括向受试者(例如人类受试者)递送或施用如本文提供的工程化细胞以在体内产生由工程化细胞产生的至少两种效应分子的方法。
本文还提供了包括向受试者(例如人类受试者)递送或施用任一种本文所述的递送媒介物，例如包含任一种本文所述的效应分子的任一种本文所述的递送媒介物的方法。本文还提供了包括向受试者(例如人类受试者)递送或施用任一种本文所述的递送媒介物，例如包含两种或更多种效应分子的任一种本文所述的递送媒介物的方法。
在一些实施方案中，工程化细胞或递送媒介物经由静脉内、腹膜内、气管内、皮下、肿瘤内、经口、肛门、鼻内(例如包装成递送颗粒)或动脉(例如颈内动脉)途径施用。因此，工程化细胞或递送媒介物可全身或局部施用(例如施用至TME或经由肿瘤内施用)。工程化细胞可从受试者，例如已知或怀疑患有癌症的受试者。相对于施用治疗的受试者，工程化细胞可为同种异体的。同种异体的修饰细胞可与施用治疗的受试者HLA匹配。递送媒介物可以是任一种本文所述的脂质结构递送系统。递送媒介物可以是任一种本文所述的纳米颗粒。
工程化细胞或递送媒介物可单独或与其它治疗组合，同时或依序施用，取决于要治疗的疾患。举例来说，工程化细胞或递送媒介物可与检查点抑制剂疗法组合施用。示例性检查点抑制剂包括(但不限于)抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。例示性免疫检查点抑制剂包括派姆单抗(抗PD-1；MK-3475/
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-Merck)、纳武单抗(抗PD-1；
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-BMS)、匹地利珠单抗(抗PD-1抗体；CT-011-Teva/CureTech)、AMP224(抗PD-1；NCI)、阿维鲁单抗(抗PD-L1；
Figure BDA0003596748340001471
-Pfizer)、度伐鲁单抗(抗PD-L1；MEDI4736/
Figure BDA0003596748340001472
-Medimmune/AstraZeneca)、阿特珠单抗(抗PD-L1；
Figure BDA0003596748340001473
-Roche/Genentech)、BMS-936559(抗PD-L1-BMS)、曲美利单抗(抗CTLA-4；Medimmune/AstraZeneca)、伊匹单抗(抗CTLA-4；Yervoy
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-BMS)、利丽单抗(抗KIR；BMS)、莫那利珠单抗(抗NKG2A；Innate Pharma/AstraZeneca)。在其它实例中，工程化细胞或递送媒介物可与TGFβ抑制剂、VEGF抑制剂或HPGE2组合施用。在另一个实例中，工程化细胞或递送媒介物可与抗CD40抗体组合施用。
一些方法包括选择具有肿瘤(或癌症)的受试者(或患者群体)并用调节肿瘤介导的免疫抑制机制的工程化细胞或递送媒介物治疗该受试者。
在一些情况下，本公开的工程化细胞或递送媒介物可用于治疗癌症，例如卵巢癌。本文描述了其它癌症。举例来说，工程化细胞可用于治疗膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺瘤和/或子宫肿瘤。本公开的工程化细胞或递送媒介物可用于治疗肿瘤位于受试者的腹膜间隙的癌症。
本文提供的方法还包括递送工程化细胞或递送媒介物的制剂。在一些实施方案中，制剂为基本上纯的制剂，其含有例如少于5％(例如少于4％、3％、2％或1％)除工程化细胞以外的细胞。制剂可包含1×105个细胞/公斤至1×107个细胞/公斤的细胞。
体内表达
本文提供的方法还包括在体内递送能够产生本文所述的工程化细胞，例如能够在体内将任一种本文所述的工程化核酸递送至细胞中的组合物。这类组合物包括能够在体内将细胞工程化的任一种病毒介导的递送平台、任一种脂质结构递送系统、任一种纳米颗粒递送系统、任一种基因组编辑系统或任一种本文所述的其它工程化递送系统。
本文提供的方法还包括递送在体内能够产生任一种本文所述的效应分子的组合物。本文提供的方法还包括递送在体内能够产生两种或更多种本文所述的效应分子的组合物。能够在体内产生效应分子的组合物包括(但不限于)任一种本文所述的工程化核酸。能够在体内产生效应分子的组合物可以是裸mRNA或裸质粒。
额外实施方案
以下提供了描述本发明的特定非限制性实施方案的列举实施方案：
实施方案1.一种肿瘤细胞，所述肿瘤细胞被工程化用于产生两种或更多种效应分子。
实施方案2.实施方案1的工程化细胞，其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：膀胱肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、宫颈肿瘤细胞、结肠直肠肿瘤细胞、食管肿瘤细胞、胶质瘤细胞、肾脏肿瘤细胞、肝脏肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、皮肤肿瘤细胞、甲状腺肿瘤细胞和子宫肿瘤细胞。
实施方案3.实施方案1或实施方案2的工程化细胞，其中所述细胞经由用溶瘤病毒转导进行工程化。
实施方案4.实施方案3的工程化细胞，其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。
实施方案5.实施方案3或实施方案4的工程化细胞，其中所述溶瘤病毒为包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的一种或多种转基因的重组溶瘤病毒。
实施方案6.一种红血球，所述红血球被工程化用于产生两种或更多种效应分子。
实施方案7.一种血小板细胞，所述血小板细胞被工程化用于产生两种或更多种效应分子。
实施方案8.一种细菌细胞，所述细菌细胞被工程化用于产生两种或更多种哺乳动物效应分子。
实施方案9.实施方案8的工程化细胞，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：拜氏梭菌、生孢梭菌、诺氏梭菌、大肠埃希氏杆菌、绿脓杆菌、核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。
实施方案10.实施方案1-9中任一项的工程化细胞，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。
实施方案11.实施方案10的工程化细胞，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种是从所述细胞分泌的。
实施方案12.实施方案1和6-11中任一项的工程化细胞，其中所述细胞经由用分离的核酸转染进行工程化。
实施方案13.实施方案12的工程化细胞，其中所述分离的核酸为包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的cDNA。
实施方案14.实施方案12的工程化细胞，其中所述分离的核酸为包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的mRNA。
实施方案15.实施方案12的工程化细胞，其中所述分离的核酸为包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的裸质粒。
实施方案16.实施方案1-15中任一项的工程化细胞，其中所述两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码。
实施方案17.实施方案16的工程化细胞，其中所述多核苷酸序列包含启动子。
实施方案18.实施方案17的工程化细胞，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
实施方案19.实施方案17的工程化细胞，其中所述启动子包含内源性启动子。
实施方案20.实施方案16-19中任一项的工程化细胞，其中所述多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。
实施方案21.实施方案20的工程化细胞，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得所述两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，
其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于所述(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
实施方案22.实施方案20或实施方案21的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列与所述两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
实施方案23.实施方案20-22中任一项的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
实施方案24.实施方案23的工程化细胞，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案25.实施方案20-24的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
实施方案26.实施方案25的工程化细胞，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。
实施方案27.实施方案20-22中任一项的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案28.实施方案20-27中任一项的工程化细胞，其中所述接头多核苷酸序列编码额外启动子。
实施方案29.实施方案28的工程化细胞，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述额外启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且
其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
实施方案30.实施方案28或实施方案29的工程化细胞，其中所述启动子和所述额外启动子是相同的。
实施方案31.实施方案28或实施方案29的工程化细胞，其中所述启动子和所述额外启动子是不同的。
实施方案32.实施方案1-7和10-31中任一项的工程化细胞，其中所述工程化细胞为人类细胞。
实施方案33.实施方案32的工程化细胞，其中所述人类细胞为从受试者分离的细胞。
实施方案34.实施方案1-33中任一项的工程化细胞，其中所述工程化细胞为培养细胞。
实施方案35.实施方案17-34中任一项的工程化细胞，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含组成型启动子。
实施方案36.实施方案35的工程化细胞，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案37.实施方案17-36中任一项的工程化细胞，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含诱导型启动子。
实施方案38.实施方案37的工程化细胞，其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
实施方案39.实施方案10-38中任一项的工程化细胞，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。
实施方案40.实施方案10-39中任一项的工程化细胞，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。
实施方案41.实施方案40的工程化细胞，其中所述非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。
实施方案42.实施方案10-41中任一项的工程化细胞，其中每种分泌信号肽是相同的。
实施方案43.实施方案1-42中任一项的工程化细胞，其中第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案44.实施方案1-43中任一项的工程化细胞，其中第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案45.实施方案44的工程化细胞，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的。
实施方案46.实施方案43-45中任一项的工程化细胞，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
实施方案47.实施方案46的工程化细胞，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
实施方案48.实施方案43-47中任一项的工程化细胞，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。
实施方案49.实施方案43-48中任一项的工程化细胞，其中所述生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。
实施方案50.实施方案43-49中任一项的工程化细胞，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
实施方案51.实施方案43-50中任一项的工程化细胞，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
实施方案52.实施方案51的工程化细胞，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。
实施方案53.实施方案51的工程化细胞，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案54.实施方案51的工程化细胞，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
实施方案55.实施方案1-54中任一项的工程化细胞，其中所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。
实施方案56.实施方案1-55中任一项的工程化细胞，其中一种效应分子包含IL12。
实施方案57.实施方案56的工程化细胞，其中第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
实施方案58.实施方案21-57中任一项的工程化细胞，其中所述多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中
S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述多核苷酸，所述第一分泌信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二分泌信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
实施方案59.实施方案58的工程化细胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
实施方案60.实施方案16-59中任一项的工程化细胞，其中所述多核苷酸序列被整合到所述工程化细胞的基因组中。
实施方案61.实施方案16-60中任一项的工程化细胞，其中所述多核苷酸序列包含一个或多个病毒载体多核苷酸序列。
实施方案62.实施方案61的工程化细胞，其中所述一个或多个病毒载体多核苷酸序列包含慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子、腺病毒或腺相关病毒多核苷酸序列。
实施方案63.一种细胞群体，所述细胞群体包含实施方案1-62中任一项的一种或多种工程化细胞。
实施方案64.一种组合物，所述组合物包含实施方案1-62中任一项的工程化细胞或实施方案63的细胞群体和药学上可接受的载体。
实施方案65.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的实施方案1-62中任一项的工程化细胞、实施方案63的细胞群体或实施方案64的组合物。
实施方案66.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含实施方案1-62中任一项的工程化细胞或实施方案63的细胞群体和药学上可接受的载体的组合物。
实施方案67.实施方案65或实施方案66的方法，其中所述施用包括全身施用。
实施方案68.实施方案65或实施方案66的方法，其中所述施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。
实施方案69.实施方案65-68中任一项的方法，其中所述工程化细胞源自于所述受试者。
实施方案70.实施方案65-68中任一项的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者为同种异体的。
实施方案71.实施方案65-70中任一项的方法，其中所述方法还包括施用检查点抑制剂。
实施方案72.实施方案71的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案73.实施方案65-72中任一项的方法，其中所述方法还包括施用抗CD40抗体。
实施方案74.实施方案65-73中任一项的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
实施方案75.实施方案65-73中任一项的方法，其中所述肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
实施方案76.一种脂质结构递送系统，所述脂质结构递送系统包括包含两种或更多种效应分子的基于脂质的结构。
实施方案77.实施方案76的基于脂质的结构，其中所述两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码。
实施方案78.一种基于脂质的结构，所述基于脂质的结构包含工程化核酸，其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
实施方案79.实施方案78的基于脂质的结构，其中所述工程化核酸为cDNA。
实施方案80.实施方案78的基于脂质的结构，其中所述工程化核酸为mRNA。
实施方案81.实施方案78的基于脂质的结构，其中所述工程化核酸为裸质粒。
实施方案82.实施方案77-81中任一项的基于脂质的结构，其中所述多核苷酸序列包含启动子。
实施方案83.实施方案82的基于脂质的结构，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
实施方案84.实施方案82的基于脂质的结构，其中所述启动子包含内源性启动子。
实施方案85.实施方案77-84中任一项的基于脂质的结构，其中所述多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。
实施方案86.实施方案85的基于脂质的结构，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得所述两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，
其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于所述(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
实施方案87.实施方案85或实施方案86的基于脂质的结构，其中所述接头多核苷酸序列与所述两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
实施方案88.实施方案85-87中任一项的基于脂质的结构，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
实施方案89.实施方案88的基于脂质的结构，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案90.实施方案85-89的基于脂质的结构，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
实施方案91.实施方案90的基于脂质的结构，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。
实施方案92.实施方案85-87中任一项的基于脂质的结构，其中所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案93.实施方案85-92中任一项的基于脂质的结构，其中所述接头多核苷酸序列编码额外启动子。
实施方案94.实施方案93的基于脂质的结构，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述额外启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且
其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
实施方案95.实施方案93或实施方案94的基于脂质的结构，其中所述启动子和所述额外启动子是相同的。
实施方案96.实施方案93或实施方案94的基于脂质的结构，其中所述启动子和所述额外启动子是不同的。
实施方案97.实施方案82-96中任一项的基于脂质的结构，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含组成型启动子。
实施方案98.实施方案97的基于脂质的结构，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案99.实施方案82-98中任一项的基于脂质的结构，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含诱导型启动子。
实施方案100.实施方案99的基于脂质的结构，其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
实施方案101.实施方案76-100中任一项的基于脂质的结构，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。
实施方案102.实施方案101的基于脂质的结构，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。
实施方案103.实施方案101或实施方案102的基于脂质的结构，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。
实施方案104.实施方案103的基于脂质的结构，其中所述非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。
实施方案105.实施方案101-104中任一项的基于脂质的结构，其中每种分泌信号肽是相同的。
实施方案106.实施方案76-105中任一项的基于脂质的结构，其中第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案107.实施方案76-106中任一项的基于脂质的结构，其中第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案108.实施方案107的基于脂质的结构，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的。
实施方案109.实施方案106-108中任一项的基于脂质的结构，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
实施方案110.实施方案109的基于脂质的结构，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
实施方案111.实施方案106-110中任一项的基于脂质的结构，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。
实施方案112.实施方案106-111中任一项的基于脂质的结构，其中所述生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。
实施方案113.实施方案106-112中任一项的基于脂质的结构，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
实施方案114.实施方案106-113中任一项的基于脂质的结构，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
实施方案115.实施方案114的基于脂质的结构，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。
实施方案116.实施方案114的基于脂质的结构，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案117.实施方案114的基于脂质的结构，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
实施方案118.实施方案76-117中任一项的基于脂质的结构，其中所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。
实施方案119.实施方案76-118中任一项的基于脂质的结构，其中一种效应分子包含IL12。
实施方案120.实施方案119的基于脂质的结构，其中第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
实施方案121.实施方案86-120中任一项的基于脂质的结构，其中所述多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中
S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述多核苷酸，所述第一分泌信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二分泌信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
实施方案122.实施方案121的基于脂质的结构，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO:144的多核苷酸序列。
实施方案123.实施方案76-122中任一项的基于脂质的结构，其中所述基于脂质的结构包含细胞外囊泡。
实施方案124.实施方案123的基于脂质的结构，其中所述细胞外囊泡选自由以下组成的组：纳米泡囊和外泌体。
实施方案125.实施方案76-122中任一项的基于脂质的结构，其中所述基于脂质的结构包含脂质纳米颗粒或胶束。
实施方案126.实施方案76-122中任一项的基于脂质的结构，其中所述基于脂质的结构包含脂质体。
实施方案127.一种组合物，所述组合物包含实施方案76-126中任一项的基于脂质的结构和药学上可接受的载体。
实施方案128.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的实施方案76-126中任一项的基于脂质的结构或实施方案127的组合物。
实施方案129.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含实施方案77-126中任一项的基于脂质的结构和药学上可接受的载体的组合物。
实施方案130.实施方案128或实施方案129的方法，其中所述施用包括全身施用。
实施方案131.实施方案128或实施方案129的方法，其中所述施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。
实施方案132.实施方案128-131中任一项的方法，其中所述基于脂质的结构能够将所述受试者中的细胞工程化以产生两种或更多种调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。
实施方案133.实施方案132的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞、免疫细胞、红血球或血小板细胞。
实施方案134.实施方案128-133中任一项的方法，其中所述方法还包括施用检查点抑制剂。
实施方案135.实施方案134的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案136.实施方案128-135中任一项的方法，其中所述方法还包括施用抗CD40抗体。
实施方案137.实施方案128-136中任一项的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
实施方案138.实施方案128-136中任一项的方法，其中所述肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
实施方案139.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含两种或更多种效应分子。
实施方案140.实施方案139的纳米颗粒，其中所述两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码。
实施方案141.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含工程化核酸，其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
实施方案142.实施方案141的纳米颗粒，其中所述工程化核酸为cDNA。
实施方案143.实施方案141的纳米颗粒，其中所述工程化核酸为mRNA。
实施方案144.实施方案141的纳米颗粒，其中所述工程化核酸为裸质粒。
实施方案145.实施方案140-144中任一项的纳米颗粒，其中所述多核苷酸序列包含启动子。
实施方案146.实施方案145的纳米颗粒，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
实施方案147.实施方案145的纳米颗粒，其中所述启动子包含内源性启动子。
实施方案148.实施方案140-147中任一项的纳米颗粒，其中所述多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。
实施方案149.实施方案148的纳米颗粒，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得所述两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，
其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于所述(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
实施方案150.实施方案148或实施方案149的纳米颗粒，其中所述接头多核苷酸序列与所述两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
实施方案151.实施方案148-150中任一项的纳米颗粒，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
实施方案152.实施方案151的纳米颗粒，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案153.实施方案148-152的纳米颗粒，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
实施方案154.实施方案153的纳米颗粒，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。
实施方案155.实施方案148-150中任一项的纳米颗粒，其中所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案156.实施方案148-155中任一项的纳米颗粒，其中所述接头多核苷酸序列编码额外启动子。
实施方案157.实施方案156的纳米颗粒，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述额外启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且
其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
实施方案158.实施方案156或实施方案157的纳米颗粒，其中所述启动子和所述额外启动子是相同的。
实施方案159.实施方案156或实施方案157的纳米颗粒，其中所述启动子和所述额外启动子是不同的。
实施方案160.实施方案156-159中任一项的纳米颗粒，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含组成型启动子。
实施方案161.实施方案160的纳米颗粒，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案162.实施方案156-161中任一项的纳米颗粒，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含诱导型启动子。
实施方案163.实施方案162的纳米颗粒，其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
实施方案164.实施方案139-163中任一项的纳米颗粒，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。
实施方案165.实施方案164的纳米颗粒，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。
实施方案166.实施方案164或实施方案165的纳米颗粒，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。
实施方案167.实施方案166的纳米颗粒，其中所述非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。
实施方案168.实施方案164-167中任一项的纳米颗粒，其中每种分泌信号肽是相同的。
实施方案169.实施方案139-168中任一项的纳米颗粒，其中第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案170.实施方案139-169中任一项的纳米颗粒，其中第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案171.实施方案170的纳米颗粒，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的。
实施方案172.实施方案169-171中任一项的纳米颗粒，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
实施方案173.实施方案172的纳米颗粒，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
实施方案174.实施方案169-173中任一项的纳米颗粒，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。
实施方案175.实施方案169-174中任一项的纳米颗粒，其中所述生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。
实施方案176.实施方案169-175中任一项的纳米颗粒，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
实施方案177.实施方案169-176中任一项的纳米颗粒，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
实施方案178.实施方案177的纳米颗粒，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。
实施方案179.实施方案177的纳米颗粒，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案180.实施方案177的纳米颗粒，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
实施方案181.实施方案139-180中任一项的纳米颗粒，其中所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。
实施方案182.实施方案139-181中任一项的纳米颗粒，其中一种效应分子包含IL12。
实施方案183.实施方案182的纳米颗粒，其中第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
实施方案184.实施方案149-183中任一项的纳米颗粒，其中所述多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中
S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述多核苷酸，所述第一分泌信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二分泌信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
实施方案185.实施方案184的纳米颗粒，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
实施方案186.实施方案139-185中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含无机材料。
实施方案187.一种组合物，所述组合物包含实施方案139-186中任一项的纳米颗粒和药学上可接受的载体。
实施方案188.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的实施方案139-186中任一项的纳米颗粒或实施方案187的组合物。
实施方案189.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含实施方案139-186中任一项的纳米颗粒和药学上可接受的载体的组合物。
实施方案190.实施方案188或实施方案189的方法，其中所述施用包括全身施用。
实施方案191.实施方案188或实施方案189的方法，其中所述施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。
实施方案192.实施方案188-191中任一项的方法，其中所述纳米颗粒能够将所述受试者中的细胞工程化以产生两种或更多种调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。
实施方案193.实施方案192的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞、免疫细胞、红血球或血小板细胞。
实施方案194.实施方案188-193中任一项的方法，其中所述方法还包括施用检查点抑制剂。
实施方案195.实施方案194的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案196.实施方案188-195中任一项的方法，其中所述方法还包括施用抗CD40抗体。
实施方案197.实施方案188-196中任一项的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
实施方案198.实施方案188-196中任一项的方法，其中所述肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
实施方案199.一种病毒，所述病毒被工程化成包含异源核酸，其中所述异源核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
实施方案200.实施方案199的工程化病毒，其中所述病毒选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)。
实施方案201.一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒被工程化成包含异源核酸，其中所述异源核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
实施方案202.实施方案199-201中任一项的工程化病毒，其中所述工程化核酸包含DNA。
实施方案203.实施方案199-201中任一项的工程化病毒，其中所述工程化核酸包含RNA。
实施方案204.实施方案199-203中任一项的工程化病毒，其中所述多核苷酸序列包含启动子。
实施方案205.实施方案204的工程化病毒，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
实施方案206.实施方案204的工程化病毒，其中所述启动子包含内源性启动子。
实施方案207.实施方案199-206中任一项的工程化病毒，其中所述多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。
实施方案208.实施方案207的工程化病毒，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得所述两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，
其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于所述(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
实施方案209.实施方案207或实施方案208的工程化病毒，其中所述接头多核苷酸序列与所述两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
实施方案210.实施方案207-209中任一项的工程化病毒，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
实施方案211.实施方案210的工程化病毒，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案212.实施方案207-211的工程化病毒，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
实施方案213.实施方案212的工程化病毒，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。
实施方案214.实施方案207-209中任一项的工程化病毒，其中所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案215.实施方案207-214中任一项的工程化病毒，其中所述接头多核苷酸序列编码额外启动子。
实施方案216.实施方案215的工程化病毒，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述额外启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且
其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
实施方案217.实施方案215或实施方案216的工程化病毒，其中所述启动子和所述额外启动子是相同的。
实施方案218.实施方案215或实施方案216的工程化病毒，其中所述启动子和所述额外启动子是不同的。
实施方案219.实施方案202-218中任一项的工程化病毒，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含组成型启动子。
实施方案220.实施方案219的工程化病毒，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案221.实施方案202-220中任一项的工程化病毒，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含诱导型启动子。
实施方案222.实施方案221的工程化病毒，其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
实施方案223.实施方案199-222中任一项的工程化病毒，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。
实施方案224.实施方案223的工程化病毒，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。
实施方案225.实施方案223或实施方案224的工程化病毒，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。
实施方案226.实施方案225的工程化病毒，其中所述非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。
实施方案227.实施方案223-226中任一项的工程化病毒，其中每种分泌信号肽是相同的。
实施方案228.实施方案199-227中任一项的工程化病毒，其中第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案229.实施方案199-228中任一项的工程化病毒，其中第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案230.实施方案229的工程化病毒，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的。
实施方案231.实施方案228-230中任一项的工程化病毒，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
实施方案232.实施方案231的工程化病毒，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
实施方案233.实施方案228-232中任一项的工程化病毒，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。
实施方案234.实施方案228-233中任一项的工程化病毒，其中所述生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。
实施方案235.实施方案228-234中任一项的工程化病毒，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
实施方案236.实施方案228-235中任一项的工程化病毒，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
实施方案237.实施方案236的工程化病毒，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。
实施方案238.实施方案236的工程化病毒，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案239.实施方案236的工程化病毒，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
实施方案240.实施方案199-239中任一项的工程化病毒，其中所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。
实施方案241.实施方案199-240中任一项的工程化病毒，其中一种效应分子包含IL12。
实施方案242.实施方案241的工程化病毒，其中第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
实施方案243.实施方案208-242中任一项的工程化病毒，其中所述多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的多核苷酸，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中
S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述多核苷酸，所述第一分泌信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二分泌信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
实施方案244.实施方案243的工程化病毒，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO:144的多核苷酸序列。
实施方案245.实施方案200-244中任一项的工程化病毒，其中所述两种或更多种效应分子能够在肿瘤细胞中得以转录和/或翻译。
实施方案246.实施方案245的工程化病毒，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
实施方案247.实施方案200-246中任一项的工程化病毒，其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物。
实施方案248.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案199-247中任一项的工程化病毒和药学上可接受的载体。
实施方案249.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的实施方案199-247中任一项的工程化病毒或实施方案248的组合物。
实施方案250.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包含实施方案199-247中任一项的工程化病毒和药学上可接受的载体的组合物。
实施方案251.实施方案249或实施方案250的方法，其中所述施用包括全身施用。
实施方案252.实施方案249或实施方案250的方法，其中所述施用包括肿瘤内施用或腹膜内施用。
实施方案253.实施方案249-252中任一项的方法，其中所述工程化病毒感染所述受试者中的细胞并产生两种或更多种调节肿瘤介导的免疫抑制机制的效应分子。
实施方案254.实施方案253的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞。
实施方案255.实施方案249-254中任一项的方法，其中所述方法还包括施用检查点抑制剂。
实施方案256.实施方案255的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案257.实施方案249-256中任一项的方法，其中所述方法还包括施用抗CD40抗体。
实施方案258.实施方案249-257中任一项的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
实施方案259.实施方案249-257中任一项的方法，其中所述肿瘤为位于腹膜间隙的肿瘤。
实施方案260.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含两种或更多种效应分子。
实施方案261.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含两种或更多种效应分子。
实施方案262.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含工程化核酸，并且其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
实施方案263.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含工程化核酸，并且其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列。
实施方案264.实施方案260-263中任一项的方法，其中所述施用包括一次或多次腹膜内注射。
实施方案265.实施方案260-263中任一项的方法，其中所述施用包括一次或多次肿瘤内注射。
实施方案266.实施方案260-263中任一项的方法，其中所述施用包括全身施用。
实施方案267.实施方案262-266中任一项的方法，其中所述工程化核酸为mRNA。
实施方案268.实施方案262-266中任一项的方法，其中所述工程化核酸为cDNA。
实施方案269.实施方案262-266中任一项的方法，其中所述组合物包含裸mRNA。
实施方案270.实施方案262-266中任一项的方法，其中所述组合物包含裸质粒。
实施方案271.实施方案262-268中任一项的方法，其中所述组合物包含选自由以下组成的组的递送系统：病毒系统、转座子系统和核酸酶基因组编辑系统。
实施方案272.实施方案271的方法，其中所述病毒系统选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)。
实施方案273.实施方案272的方法，其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物
实施方案274.实施方案271的方法，其中所述核酸酶基因组编辑系统选自由以下组成的组：锌指系统、TALEN系统和CRISPR系统。
实施方案275.实施方案260-268中任一项的方法，其中所述组合物包含红血球或血小板细胞。
实施方案276.实施方案260-268中任一项的方法，其中所述组合物包括包含基于脂质的结构的脂质结构递送系统。
实施方案277.实施方案276的方法，其中所述基于脂质的结构选自由以下组成的组：细胞外囊泡、脂质纳米颗粒、胶束、纳米泡囊、外泌体和脂质体。
实施方案278.实施方案260-268中任一项的方法，其中所述组合物包含纳米颗粒。
实施方案279.实施方案278的方法，其中所述纳米颗粒包含无机材料。
实施方案280.实施方案278或实施方案279的方法，其中所述纳米颗粒封装所述工程化核酸或封装所述两种或更多种效应分子。
实施方案281.实施方案262-280中任一项的方法，其中所述多核苷酸序列包含启动子。
实施方案282.实施方案281的方法，其中所述启动子包含外源性启动子多核苷酸序列。
实施方案283.实施方案281的方法，其中所述启动子包含内源性启动子。
实施方案284.实施方案260-283中任一项的方法，其中所述多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。
实施方案285.实施方案284的方法，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得所述两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，
其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于所述(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏。
实施方案286.实施方案284或实施方案285的方法，其中所述接头多核苷酸序列与所述两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
实施方案287.实施方案284-286中任一项的方法，其中所述接头多核苷酸序列编码2A核糖体跳跃标签。
实施方案288.实施方案287的方法，其中所述2A核糖体跳跃标签选自由以下组成的组：P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案289.实施方案284-288的方法，其中所述接头多核苷酸序列编码可裂解多肽。
实施方案290.实施方案289的方法，其中所述可裂解多肽包含弗林蛋白酶多肽序列。
实施方案291.实施方案284-286中任一项的方法，其中所述接头多核苷酸序列编码内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案292.实施方案284-291中任一项的方法，其中所述接头多核苷酸序列编码额外启动子。
实施方案293.实施方案292的方法，其中所述启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的第一多核苷酸能够得以转录，
其中所述额外启动子可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得编码所述两种或更多种效应分子中的第二种效应分子的第二多核苷酸能够得以转录，并且
其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为不同的多核苷酸。
实施方案294.实施方案292或实施方案293的方法，其中所述启动子和所述额外启动子是相同的。
实施方案295.实施方案292或实施方案293的方法，其中所述启动子和所述额外启动子是不同的。
实施方案296.实施方案281-295中任一项的方法，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含组成型启动子。
实施方案297.实施方案296的方法，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb和hUBIb。
实施方案298.实施方案281-297中任一项的方法，其中所述启动子和/或所述额外启动子包含诱导型启动子。
实施方案299.实施方案298的方法，其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组：minP、NFkB应答元件、CREB应答元件、NFAT应答元件、SRF应答元件1、SRF应答元件2、AP1应答元件、TCF-LEF应答元件启动子融合物、低氧应答元件、SMAD结合元件、STAT3结合位点、诱导分子应答型启动子和它们的串联重复序列。
实施方案300.实施方案260-299中任一项的方法，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号。
实施方案301.实施方案300的方法，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的相应效应分子来说是天然的天然分泌信号肽。
实施方案302.实施方案300或实施方案301的方法，其中一种分泌信号肽包含对所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子来说是非天然的非天然分泌信号肽。
实施方案303.实施方案302的方法，其中所述非天然分泌信号肽选自由以下组成的组：IL12、IL2、优化IL2、胰蛋白酶原-2、高斯荧光素酶、CD5、人IgKVII、鼠类IgKVII、VSV-G、催乳激素、血清白蛋白前蛋白、天青杀素前蛋白、骨结合素、CD33、IL6、IL8、IL21、CCL2、TIMP2、VEGFB、骨保护素、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、GROα和CXCL12。
实施方案304.实施方案300-303中任一项的方法，其中每种分泌信号肽是相同的。
实施方案305.实施方案260-304中任一项的方法，其中第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案306.实施方案260-305中任一项的方法，其中第二效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。
实施方案307.实施方案306的方法，其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的。
实施方案308.实施方案305-307中任一项的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ。
实施方案309.实施方案308的方法，其中所述IL12细胞因子为IL12p70融合蛋白。
实施方案310.实施方案305-309中任一项的方法，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1。
实施方案311.实施方案305-310中任一项的方法，其中所述生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF。
实施方案312.实施方案305-311中任一项的方法，其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L。
实施方案313.实施方案305-312中任一项的方法，其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2。
实施方案314.实施方案313的方法，其中所述TGFβ抑制剂选自由以下组成的组：抗TGFβ肽、抗TGFβ抗体、TGFb-TRAP以及它们的组合。
实施方案315.实施方案313的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
实施方案316.实施方案313的方法，其中所述VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体、抗VEGF肽或它们的组合。
实施方案317.实施方案260-316中任一项的方法，其中所述两种或更多种效应分子中的至少一种效应分子为人类来源效应分子。
实施方案318.实施方案260-317中任一项的方法，其中一种效应分子包含IL12。
实施方案319.实施方案318的方法，其中第二效应分子包含CCL21a、IL7、IL15或IL21。
实施方案320.实施方案285-319中任一项的方法，其中所述多核苷酸序列包含：
a)SFFV启动子；以及
b)下式中所述的表达盒，从5’至3’定向，所述式包含：
S1–E1–L–S2–E2
其中
S1包含编码第一分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第一分泌信号肽为人IL12分泌信号肽；
E1包含编码第一效应分子的多核苷酸序列，其中所述第一效应分子为人IL12p70融合蛋白；
L包含接头多核苷酸序列，其中所述接头多核苷酸序列编码弗林蛋白酶识别多肽序列、Gly-Ser-Gly多肽序列和T2A核糖体跳跃标签，从N端至C端以弗林蛋白酶:Gly-Ser-Gly:T2A定向；
S2包含编码第二分泌信号肽的多核苷酸序列，其中所述第二分泌信号肽为人IL21分泌信号肽；
E2包含编码第二效应分子的多核苷酸序列，其中所述第二效应分子为人IL21；并且
其中所述SFFV启动子可操作地连接于所述表达盒，所述第一分泌信号肽可操作地连接于所述第一效应分子，并且所述第二分泌信号肽可操作地连接于所述第二效应分子。
实施方案321.实施方案320的方法，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:144的多核苷酸序列。
实施方案322.实施方案263-321中任一项的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、食管肿瘤、胶质瘤、肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、甲状腺肿瘤和子宫肿瘤。
实施例
以下为用于进行本发明的特定实施方案的实施例。这些实施例只是出于说明的目的而提供，并不意图以任何方式限制本发明的范围。举例来说，以下描述和进行的实验证明了将细胞工程化以分泌有效负载物(例如效应分子)以及递送那些细胞以诱导针对肿瘤的免疫原性反应的一般效用。具体地说，以下描述的实施例证明了通过递送分泌多种本文所述的效应分子的工程化间充质干细胞(MSC)诱导针对肿瘤的免疫原性反应的能力。MSC的使用并不意图限制本发明针对本文所述的细胞工程化的范围。
努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但当然将允许一些实验误差和偏差。
实施例1
本实施例描述了利用个别和组合免疫疗法有效载荷对MSC进行体外表征。首先测量表达免疫疗法的MSC对癌细胞的直接抗癌作用。然后测量表达免疫疗法的MSC对原代免疫细胞(集中在T细胞上)与癌细胞的共培养物的作用。基于小鼠和人类细胞系统中的炎性生物标志物组，将表达免疫疗法的MSC的免疫刺激特性排序。鉴定独自或与T细胞一起显著增强癌细胞杀死的表达免疫疗法的MSC，并且选择进展至体外测试的最佳候选者。
方法：表达免疫疗法的MSC被工程化用于表达表1中列出的效应分子，使用与癌症疗法有关的体外模型评估其功能作用。从循环PBMC分离的人类卵巢癌细胞(例如OVCAR8和SKOV3)和人类免疫细胞用于测试表达hIT的hMSC。小鼠卵巢癌细胞(例如ID8)和小鼠免疫细胞用于测试表达mIT的mMSC。
检查点抑制剂.细胞结合测定法用于证实所表达的抗体的活性。虽然抗体的靶标CTLA4和PD1均负调控T细胞，但其在T细胞活化的不同阶段上调(Boutros C等人(2016)NatRev Clin Oncol 13(8):473-486；Valsecchi ME(2015)New Engl J Med 373(13):1270-1270)。CTLA4在启动期中暂时上调，而PD1在T细胞活化的效应期中始终表达(Pardoll DM(2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等人(2013)Front Immunol 4:455)。抗CTLA4抗体结合于T细胞表面上的CTLA4，阻断CTLA4在早期关闭T细胞活化，并且人类抗PD1抗体结合于PD1，阻止肿瘤细胞抑制T细胞活性。
使用EASYSEPTM磁性珠粒(STEMCELL Technologies)，通过阴性选择，从PBMC分离T细胞。通过人类T-活化剂CD3/28Dynabeads(Thermo Fisher)活化分离的T细胞，并且历经5天监测CTLA-4和PD-1的表达，以选择每种表面标志物的最佳表达时机。在适当天数，将来自表达CTLA-4或PD-1的抗体的MSC的条件培养基或来自无表达的MSC的对照条件培养基施加于活化T细胞，以验证这些抗体的直接细胞表面-受体结合。荧光染料标记的二次检测抗体将与流式细胞术一起证实结合。
趋化因子.使用细胞迁移测定法和表达对CCL21趋化性起反应的趋化因子受体CCR7的分离的未处理T细胞来证实CCL21趋化因子功能性。具体来说，将表达CCL21或对照MSC添加至trans-well的一个隔室，并接着通过分离的未处理T细胞评定从另一隔室的细胞迁移，接着计数迁移T细胞的数目(Justus CR等人(2014)J Vis Exp(88))。
细胞因子.测量IL2、IL12和IL15的活性。特定针对IL2、IL12和IL15的ELISA测定法用于检测这些细胞因子在MSC上清液中的水平。功能生物活性测定法采用CTLL-2细胞系评定IL2或IL15介导的增殖，或采用NKG细胞系评定IL12介导的MSC上清液的IFN-γ产生。使用
Figure BDA0003596748340001921
技术的多路细胞因子概况测定也可以用于评定细胞因子表达和对免疫细胞的作用。
STING通路.利用组成性STING突变体有效载荷测量STING通路活化。使用
Figure BDA0003596748340001922
珠粒，对MSC中I型干扰素(例如IFN-α2和IFN-β)的分泌与STING突变体的表达进行概况分析。
表达免疫疗法的MSC对卵巢癌细胞的直接作用.在体外测试MSC对卵巢癌细胞生长和活力的任何直接作用。举例来说，将候选mMSC或hMSC与小鼠卵巢癌细胞系(ID8)或人类卵巢癌细胞系(OVCAR8和SKOV3)共培养，并且通过良好表征的乳酸脱氢酶(LDH)测定法测量癌细胞的细胞毒性。在共培养24小时之后，收集上清液，并且经由酶促反应来测量与细胞死亡相关的LDH水平，所述酶促反应随后通过板式读数器上的特定吸光度定量。另外，通过台盼蓝拒染法(Trypan Blue exclusion)计数活细胞对比死细胞，并且通过流式细胞术，使用膜联蛋白-V和碘化丙啶染色计数活细胞对比细胞凋亡/死细胞来评定癌细胞数目。
表达免疫疗法的MSC对T细胞和卵巢癌细胞共培养系统的作用.测试确定表达免疫疗法的MSC是否可刺激例如T细胞的免疫细胞，以具有提高的针对体外卵巢癌细胞的抗癌活性。具体来说，将候选mMSC-mIT与小鼠脾细胞和ID8癌细胞系共培养，或候选hMSC-hIT与人类PBMC和OVCAR8或SKOV3细胞系共培养。共培养测定法需要使用PBMC/脾细胞与卵巢癌细胞，有或无MSC，并且用抗CD3/28珠粒刺激。为了评定癌细胞死亡，使用例如LDH细胞毒性测量的技术，将染料标记的卵巢癌细胞与未标记的效应PBMC/脾细胞以固定比率组合并且通过流式细胞术分析杀死，进行16小时杀死测定法(Jedema I等人(2004)Blood 103(7):2677-2682)，并且通过流式细胞术，使用膜联蛋白-V与碘化丙啶进行细胞凋亡读取。特别地，通过在3-5天的CFSE细胞分裂和1-3天的IFN-γ的细胞因子产生来测定T细胞活化/增殖。
产生表达CTLA-4和PD1的T细胞的替代策略是用植物血球凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)活化以表达细胞表面受体PD1和CTLA4。在第3天，约99％的活化T细胞将表达PD1，而约15％将表达CTLA4(Pardoll DM(2012)Nat Rev Cancer 12(4):252-264；Legat A等人(2013)Front Immunol 4:455)。在第10天，活化T细胞将处于效应期，此时CTLA4表达下调但PD1表达维持。评估这些抗体的直接细胞表面-受体结合。在诱导后第3天和第10天，将具有相应检查点抑制剂抗体表达构建体的MSC施加于T细胞培养物。将标记的检测抗体与流式细胞术一起使用来证实结合。商业抗体用作对照。
实施例2
本实施例描述了在同基因卵巢癌症模型中表达免疫疗法有效载荷的MSC的体内表征。使用同基因小鼠卵巢癌模型表征表达免疫疗法的MSC的抗肿瘤功效(具有小鼠免疫系统的mMSC-mIT)。测量同基因卵巢小鼠模型中工程化MSC的肿瘤归巢以及个别和组合免疫疗法的表达。还测量在工程化MSC处理下的卵巢肿瘤负荷和小鼠生存。本实施例将证明在卵巢肿瘤对比其它身体部位中工程化MSC选择性归巢至TME和局部产生免疫疗法因子。本实施例还将证明在表达免疫疗法的工程化MSC下肿瘤负荷显著减少，并且小鼠生存延长。
方法：来源于小鼠卵巢上皮表面细胞(mouse ovarian epithelial surfacecell，MOSE)的自发转化的小鼠ID8细胞系用于建立同基因卵巢肿瘤模型(Roby KF等人(2000)Carcinogenesis 21(4):585-591)。还使用ID8细胞系的衍生物(例如ID8-VEGF(ID8-Defb29/Vegf-a)、ID8-P53DN、ID8-P53KO-PTEN KO、ID8-P53KO-BRCA2 KO、ID8-P53KO-BRCA1KO、ID8-PD53KO-Nf1KO)。ID8细胞系感染表达海肾荧光素酶(rLuc)的慢病毒以允许进行体内生物发光成像，其与表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)的MSC呈正交关系。在小鼠中建立同基因卵巢癌症模型之前，在体外在ID8中证实成功的rLuc表达。对于同基因模型，将5×105个ID8细胞注射至6至8周龄之间的C57BL/6小鼠的腹膜腔中(36,54)。如实施例1中，与表达ffLuc的质粒一起，对MSC进行工程化。
在第25天(在注射肿瘤细胞之后)，以每只动物106MSC的剂量将候选mMSC-mIT引入同基因小鼠模型中，每周一次，历时5周(Dembinski JL等人(2013)Cytotherapy 15(1):20-32)。随着时间过去，分别通过rLuc和ffLuc生物发光成像以及终点时刻后的组织学分析，目测卵巢肿瘤负荷和候选mMSC-mIT。当小鼠显现痛苦迹象，例如体重减轻、毛皮起皱、身体姿势不佳、腹部扩大和黄疸时，将其处死。测量小鼠的生存曲线。通过生物发光成像(bioluminescence imaging，BLI)和在处死时通过尸检来定量肿瘤细胞的远处转移。测量不同时间点的免疫系统概况和活性，作为对疗法的反应的生物标志物。
为了评定MSC的预期抗肿瘤作用的变化性，变化用于建立模型的ID8细胞的剂量(例如细胞数目至5×106)，变化所用MSC的剂量，以及调节建立肿瘤后递送MSC时的时间。
即使在小鼠模型中mMSC已显示归巢至卵巢肿瘤，一些有效载荷也可能破坏此归巢活性。在这些情况下，这些有效载荷的表达可以被工程化成诱导性的。这可以例如用根皮素诱导系统来实现(Gitzinger M等人(2009)Proc Natl Acad Sci U S A 106(26):10638-10643)。可替代地，二聚系统可用于使用小分子将合成锌指DNA结合结构域与反式活化结构域连接(Clackson T等人(1998)Proc Natl Acad Sci U S A95(18):10437-10442)。可替代地或另外，可构建诱导性有效载荷表达构建体，其是在肿瘤微环境中基于例如低O2的信号引起的。
慢病毒ffLuc构建体也可以用于感染MSC。
实施例3
本实施例描述了表达免疫疗法有效载荷的MSC在具有人类免疫细胞的小鼠中的人类卵巢癌的异种移植模型中的功效的体内表征。测试工程化MSC在经由CD34+细胞移植物(具有人源化免疫系统的hMSC-hIT)移植人类免疫细胞的免疫缺陷小鼠中的人类卵巢癌模型中的活性。测量具有人类免疫细胞的小鼠中的人类异种移植卵巢肿瘤中工程化MSC的肿瘤归巢以及个别和组合免疫疗法的表达。还测试在工程化MSC处理下的卵巢肿瘤负荷和小鼠生存。本实施例将证明在小鼠中人类异种移植卵巢肿瘤对比其它身体部位中工程化MSC的归巢增加和局部产生免疫疗法因子。本实施例还将证明在表达免疫疗法的工程化MSC下肿瘤负荷显著减少，并且小鼠生存延长，这与免疫系统组成的变化相关。
方法.为了能够将工程化MSC转化至人类临床试验，在人类癌症的人源化小鼠模型中测试hMSC-hIT构建体。通过在移植CD34+造血干细胞(HSC)的免疫缺陷小鼠(NSG)中使用人类卵巢癌细胞系的异种移植物来模拟表达免疫疗法的hMSC在小鼠中的作用。
对于人类卵巢癌细胞，使用OVCAR8和SKOV3细胞系。如实施例3中所述的类似分析用于研究随着时间过去的肿瘤负荷和小鼠生存。
还可以使用两种替代方法。(1)人类T细胞可输注至小鼠中。(2)人类PBMC可输注至小鼠中。
表达载体：pL+MCS
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATCAAAATTTTATCTCGACATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCGATAAGCTTGATATCGCCTGCAGCCGAATTCCTTGACTTGGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCCTGCAGGCATGCGTGACTGACTGAGGCCGCGACTCTAGTTTAAACTGCGTGACTGACTCTAGAAGATCCGGCAGTGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG(SEQ ID NO:111)
实施例4.4T1三阴性乳腺癌
在以下实验中，MSC被工程化用于表达以下效应分子中的一种，接着单独或组合施用于原位乳腺癌小鼠模型：IFNβ、IFNγ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、TRAIL、cGAS、CCL21a、OX40L、CD40L或HACv-PD1。在一些实例中，注射检查点抑制剂(抗CD40、抗PD1或抗CTLA-4抗体)与工程化MSC的施用组合。
MSC归巢
以下实验证明在原位小鼠乳腺癌模型中鼠类MSC归巢至肿瘤。将表达荧光素酶的4T1乳腺肿瘤细胞(5×105)原位植入雌性BALB/cJ小鼠的背部脂肪垫中。在5天之后，将小鼠经腹膜内注射1百万荧光标记(用XenoLight DiR(Caliper Life Sciences))的鼠类BM来源MSC(BM-MSC，治疗细胞)。在MSC注射后第1天和第7天，荧光分析用于使用Ami HT活动物成像器(Spectral Instruments)确定MSC定位。在第7天，使用Ami HT成像器，通过4T1细胞的荧光素酶生物发光报告体确定肿瘤定位和尺寸。如图3中所示，注射的MSC共同定位至肿瘤部位，这表明这些细胞实际上在体内特异性归巢至4T1乳腺肿瘤部位。注射的MSC在一天内归巢至肿瘤，并且持续7天。相比之下，在正常小鼠中缺少肿瘤时注射的MSC不归巢至背。这些结果表明，MSC可用作抗癌分子、蛋白质或化合物的递送媒介物。
为了确定工程化的人MSC是否可归巢至小鼠肿瘤，将表达GFP、IL2或CCL21a的工程化的人MSC的不同细胞系注射至具有4T1肿瘤的BALB/c小鼠中。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。图11A-11B展示人MSC未归巢至小鼠4T1肿瘤。
体内功效
以下实验证明表达免疫疗法效应子(有效载荷)的MSC在原位乳腺癌模型中的体内功效。将4T1-Neo-Fluc小鼠乳腺肿瘤细胞(Imanis Life Sciences，5×105个细胞)原位植入雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)的背部脂肪垫中。接着在植入肿瘤之后5天将小鼠随机化至处理组。小鼠接受对照MSC生长培养基或表达不同免疫疗法效应子(有效载荷)的工程化MSC(2×106个细胞)的腹膜内注射，每周一次，历时两周。每种免疫疗法通过不同的MSC表达，并且将MSC(1:1比率)组合以进行组合处理。通过每隔一天用测径规测量来监测肿瘤生长，并且每周记录小鼠重量两次。在第一次MSC处理之后14天处死小鼠，并且收集组织以供进一步分析。
图4展示与用培养基处理的对照相比，在用表达组合基因IL-12和CCL21a的工程化MSC处理的小鼠中肿瘤生长延迟。
图5A-5C展示与用培养基处理的小鼠相比，表达单个免疫疗法效应子(例如IFN-β、IFN-γ、IL-12或CCL21a)的工程化MSC抑制同基因4T1小鼠肿瘤的生长。意外地，当免疫疗法效应子组合时，尤其IL-12与CCL21a组合以及IFN-β、IFN-γ、IL-12和CCL21a组合，观察到对肿瘤生长的协同效应(图5A-5C)。
图6A-6B展示表达OX40L、TRAIL、IL15、cGAS或它们的组合的工程化MSC不抑制肿瘤生长。
图7A-7B展示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长；然而，添加抗CD40抗体不减少肿瘤生长。
图8A-8B展示在皮下乳腺癌模型中表达OX40L、TRAIL、IL15、HACvPD-1或它们的组合的工程化MSC不显著抑制肿瘤生长。
图9A-9B展示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制肿瘤生长；然而，表达CCL21a、IL-36γ和IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。然而，一些测试的效应子组合可能引起毒性。
剂量扩大
进行剂量扩大研究。本实验确定表达GFP的工程化MSC细胞不引起毒性(图10A-10B)。
对大肿瘤的作用
本实验测试表达IL12和CCL21a的工程化的小鼠MSC是否可减少较大肿瘤(>800mm3)的肿瘤负荷。较大肿瘤比小肿瘤更难以治疗，并且本实验证明此效应子组合可减少肿瘤扩增(图12A-12B)。
检查点抑制剂
图13A展示表达IL-12和CCL21的工程化MSC足够抑制肿瘤生长，不过在皮下肿瘤模型中通过注射添加检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)不增加功效。
实施例5.CT26结肠直肠癌
在以下实验中，MSC被工程化用于表达以下效应分子中的一种，接着单独或组合施用于结肠直肠癌小鼠模型：IFNβ、IL12、IL15、IL36γ、IL7、CCL21a、HACv-PD1或41BB。在一些实例中，注射检查点抑制剂(抗CD40或抗CTLA-4抗体)与工程化MSC的施用组合。
图14展示表达IL-12和CCL21a的工程化MSC诱导显著的肿瘤生长延迟。
图15展示CT26小鼠模型中的肿瘤生长动力学以确定给与工程化MSC细胞的最佳时间。
体内功效
以下实验证明表达免疫疗法效应子(有效载荷)的MSC在皮下小鼠结肠(结肠直肠)癌模型中的体内功效。将CT26-Neo-Fluc小鼠结肠癌细胞(Imanis Life Sciences，5×105个)皮下注射至雌性BALB/cJ小鼠(The Jackson Laboratory)的侧腹中。在植入肿瘤之后七天，接着将小鼠随机化至以下处理组：对照MSC生长培养基、工程化MSC(MSC-12+CCL21a)、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体(Bio X cell)、MSC-12+CCL21a与抗CD40抗体组合或MSC-12+CCL21a与抗CTLA4抗体组合。将工程化MSC(2×106个细胞)经腹膜内(ip)注射，每周一次，历时两周(第0天和第7天)。在第0天和第3天经腹膜内注射抗CD40抗体(100μg)。在第0天、第3天和第7天经腹膜内注射抗CTLA4抗体(100μg)。通过每隔一天用测径规测量来监测肿瘤生长，并且每周记录小鼠重量两次。在第一次MSC处理之后11天处死小鼠，并且收集肿瘤并称重。测量每个处理组中个别的小鼠的肿瘤重量，并且在图16B的左下图(左图)中展示结果。随着时间过去监测每个处理组的平均肿瘤体积(图16B，右图)。与经GFP处理的小鼠相比，处理组2(IL-12+CCL21a+抗CTLA4抗体)、4(IL-12+CCL21a)和7(IL-12+CCL21a+抗CD40抗体)抑制CT26结肠肿瘤的平均生长(图16B，右图)。当随着时间过去测量每个处理组中个别的小鼠的肿瘤体积时，观察到类似结果(图16A)。因此，用表达免疫疗法的MSC组合治疗抑制体内结肠癌细胞的生长。
图18A展示表达IL-12、CCL21a和IL15或HACvPD-1的工程化MSC显著抑制结肠直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长。图18B展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤重量。图18C是肿瘤微环境内浸润免疫群体的代表图。图18D展示总CD3群体中调节T细胞(Treg)的百分比。用工程化MSC-IL2和CCL21a处理的肿瘤微环境中Treg的数目显著下降。图18E使免疫浸润百分比与肿瘤重量相关。发现淋巴细胞增加(CD3+)的样品与低肿瘤重量相关，而具有高骨髓(CD11b+)浸润的样品与较高肿瘤负荷相关。
长期生存
向小鼠给与两次不同浓度的工程化MSC-IL12和CCL21a疗法与注射的抗CD40抗体组合。在第二次给药之后，每周监测肿瘤体积两次，直至肿瘤负荷超过1500mm3并处死小鼠。图17A展示个别组的肿瘤体积。图17B左图随时间追踪来自个别组的小鼠重量和肿瘤体积。图17B右图展示不同组的生存曲线。
MSC功效
图20A展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤体积。图20B展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤重量。通过用测径规每隔一天测量肿瘤体积来确定功效。
肿瘤生长动力学
图21A-21B展示腹膜内间隙中CT26-LUC(荧光素酶)肿瘤生长的动力学。在第0天注射CT26细胞系，并且在第7天、第10天、第14天和第18天收获三(3)只小鼠以确定肿瘤生长动力学。利用IVIS成像器监测肿瘤负荷，图21A第一行测量小鼠体重和ROI。第二行监测每个组中个别的小鼠的肿瘤的肿瘤重量和ROI。第三行将肿瘤重量与整体ROI或肿瘤ROI相关。图21B展示第18天组中三(3)只小鼠的免疫概况以更好地了解肿瘤微环境。
肿瘤浸润统计数据/免疫百分比/肿瘤重量
皮下小鼠模型
图22A包括表明表达IL-12和CCL21a的工程化MSC抑制皮下结肠直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长的数据；然而，表达CCL21a和IL-36γ或IL-7的MSC的组合不减少肿瘤生长。图23A-23B包括肿瘤免疫浸润统计数据。三只小鼠选自PBS、未处理MSC和MSC-IL12+MSC-CCL21a(组合)组，以针对免疫概况肿瘤微环境进行流式细胞术。图23A展示与给与未处理MSC的组相比，组合组中浸润CD3和CD8细胞毒性T群体显著增加。图23B展示与用未处理MSC处理的组相比，组合组中粒细胞骨髓来源抑制性细胞(gMDSC)和巨噬细胞群体显著减少。
图24A-24B包括关于免疫百分比和肿瘤重量的数据，展示具有更多CD3+和CD8+T细胞的样品(左上和中央图)与肿瘤重量下降强烈相关。这些图还展示具有较少CD11b骨髓细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和MDSC的样品显示较低肿瘤负荷(图24A的中下和右图以及图24B的上排)。
原位小鼠模型
图26A展示表达IL-12和CCL21a或CCL21a和IFN-β的工程化MSC抑制原位结肠直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长；然而，表达CCL21a和s41BBL的MSC的组合不减少肿瘤生长。每种效应子通过不同的MSC表达，并且将所述MSC(以1:1比率)组合以用于组合处理。每个图展示单独或组合的表达所指示免疫疗法的工程化MSC对小鼠(n＝6-8)中4T1乳腺肿瘤的生长的作用。图26A的每条线表示个别的小鼠。图26B展示每种处理中个别的小鼠的肿瘤重量。MSC-IL12+MSC-CCL21a展示与注射未处理MSC的小鼠相比功效更佳。还在用MSC-IFNb+MSC-CCL21a处理的组中观察到处理功效。
图27A-27B是展示用所指示的工程化MSC处理的每个组的免疫概况的图。在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理之后观察到巨噬细胞群体一致下降(图27A)。相对于未处理MSC，与用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组相比，还观察到CD3+群体的浸润增加和CD11b+群体的浸润减少的总趋势(图27A和图27B)。
图28A-28B展示免疫浸润与肿瘤重量相关。具有低巨噬细胞和树突状细胞的样品具有较低肿瘤负荷(图28B，中上和右上)。图28C展示来自每个组的平均肿瘤重量。与未处理MSC相比，在MSC-IL12+MSC-CCL21a或MSC-IFNb+MSC-CCL21a下均观察到统计显著性。
图29展示将以上来自结肠直肠癌模型的体内数据(图22A和图26A)组合的图。来自图22A和图26A的组合CT26数据记录三组：仅仅肿瘤(PBS)、用未处理MSC处理和用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理。
图30A-30C还展示来自图22A和图26A的组合数据。所述图展示来自流式细胞术实验数据的免疫浸润平均数。从图30A中，观察到CD8+T的统计显著性，这证实了MSC-IL12+MSC-CCL21a能够使肿瘤微环境恢复极化，并且允许更多细胞毒性T细胞浸润。此外，在用MSC-IL12+MSC-CCL21a处理的组中CD11b+骨髓群体浸润减少(图30B)。使用树突状细胞和巨噬细胞群体收集的数据具有统计显著性。
腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的IL12和CCL21a疗法
图25A-25B包括来自腹膜内和皮下结肠直肠癌小鼠模型中的MSC-IL-12+CCL21a疗法的数据。测试三批不同的慢病毒转导的细胞系的MSC-IL12和CCL21a(TLOO8-3/4、TL019-01/02和TL022-01/02；每个TL编号表示一批)。图25A展示在皮下与腹膜内模型中MSC-IL12+MSC-CCL21a所有三个批次均可降低肿瘤负荷(前5个图来自SC模型并且后3个图来自IP模型)。在第11天收集来自所有小鼠的肿瘤。图25B展示来自每个组的平均肿瘤重量。
实施例6.MSC组合细胞因子疗法方法
以下方法用于实验中，如所指示。
方法：
MSC培养
从Cyagen(分别目录号MUBMX-01001和MUCMX-01001)购得骨髓C57BL/6和Balb/C鼠类MSC(mMSC)。mMSC培养基由以下构成：MEM Corning目录号10-022-CV(500ml)+MSC FBSGibco目录号12662-029(最终浓度10％)+L-Glut(200mM)干细胞07100(最终浓度2mM)+PenStrep 100X VWR目录号97063-708(最终浓度1X)+鼠类FGF Peprotech目录号450-33-100uG(最终浓度-1:10,000稀释)。购得TrypLE Express(ThermoFisher-#12604021)。PBS不含镁、钙或酚红。
mMSC根据以下方案进行传代：
1.mMSC应在70％-90％汇合下传代。
2.从器皿/烧瓶吸出培养基。
3.用PBS冲洗平板(例如10cm器皿用2mL，15cm器皿用3ml)。
4.添加TrypLE Express(例如10cm器皿用2mL，15cm器皿用3ml)。
5.在37℃下孵育3-4分钟。
6.在侧面敲打平板以移去细胞。通过显微术证实大部分细胞已移去。
7.使用培养基将细胞从平板洗去(例如10cm器皿用8mL)。
8.将细胞置于15个圆锥管中并且400×g离心5分钟。
9.吸出培养基。
10.使细胞再悬浮于适当培养基中并将细胞涂铺至新鲜平板/烧瓶中。注意：70％汇合细胞可1:3分离。90％汇合细胞可1:4分离。可替代地，细胞可以3000-5000个细胞/平方厘米涂铺。
购得骨髓来源人MSC(RoosterBank-hBM-1M-XF,RoosterBio)。购得各种hMSC培养基：无异种蛋白的hMSC培养基-(RoosterBio-#KT-016)；+FBS(含血清)hMSC培养基(Lonza-MSCGM培养基-#PT-3001)。购得TrypLE Express(ThermoFisher-#12604021)。PBS不含镁、钙或酚红。
hMSC根据以下例示性方案进行传代：
1.hMSC应在70％-90％汇合下传代。
2.从器皿/烧瓶吸出培养基。
3.用PBS冲洗平板(例如10cm器皿用2mL)。
4.添加TrypLE Express(例如10cm器皿用2mL)。
5.在37℃下孵育3-4分钟或在室温下孵育5分钟。
6.在侧面敲打平板以移去细胞。通过显微术证实大部分细胞已移去。
7.使用Lonza MSCGM培养基将细胞从平板洗去(例如10cm器皿用8mL)。
8.将细胞置于15个锥形管中并且400×g离心5分钟。
9.吸出培养基。
10.使细胞再悬浮于Rooster无异种蛋白的培养基中并将细胞涂铺至新鲜平板/烧瓶中。
注意：70％汇合细胞可1:3分离。90％汇合细胞可1:4分离。可替代地，细胞可以3000-5000个细胞/平方厘米涂铺。
hMSC根据以下例示性方案进行解冻：
1.使hMSC培养基预温至37℃。
2.从液氮去除hMSC等分试样。
3.通过保持管1/2浸入在37℃浴的中60-90秒解冻，直至2/3冷冻样品解冻。
4.用70％酒精擦拭管以将管杀菌。
5.将0.5mL培养基添加至冷冻管，轻轻地移液2-3次，接着将细胞转移至15mL锥形管中的9mL培养基(总共10mL)。
6.400×g离心5分钟。
7.吸出培养基，接着轻轻地使团粒再悬浮于适当体积的Rooster无异种蛋白的培养基中。以3000-5000细胞/平方厘米的浓度涂铺细胞。
慢病毒产生
使用以下产生慢病毒：Lenti-X 293T包装细胞系(Clontech，目录号632180)；LX293T完全生长培养基，没有抗生素；DMEM，高葡萄糖；1mM丙酮酸钠；10％FBS，热失活；Opti-Mem I还原血清培养基(Gibco/Thermo Fisher；目录号31985)；FuGene HD(Promega；目录号E2311)；包膜质粒、包装质粒和转移载体质粒；VSV-G假型包膜载体(pMD2.G)；含有Gag、Pol、Rev和Tat的包装载体，其可与第二代和第三代转移载体(psMAX2)一起使用。在转染前一天下午稍晚时间将293T(FT)细胞从90％汇合10cm器皿提升并以1:3稀释分配，并且在37℃、5％CO2下如常孵育细胞过夜(在转染次日细胞应60％-85％汇合)。
根据以下方案，为每个10cm器皿准备转染反应：
1.在另一1.7mL管中为每个10cm器皿准备转染反应。
2.在室温下添加900uL Opti-Mem I。
3.每一反应添加9ug载体主链(含有所关注的基因)。
4.每一反应添加8ug包装载体。
5.每一反应添加1ug包膜载体(pMD2.G)。
6.通过迅速旋转3秒彻底混合。
7.每一反应添加55uL Fugene HD。
8.通过迅速地上下移液20-30次来混合。
9.在室温下静置10分钟(允许DNA复合物形成)。
10.以逐滴方式将混合物慢慢添加在器皿周围，接着通过轻轻地前后和上下晃动5-10秒(不旋动)来混合。
11.将器皿置放于病毒孵育箱中。
在第2天和第3天，使用血清移液管收获病毒上清液。使用Millipore steriflip0.45um过滤器去除细胞碎片。根据如下方案使用Lenti-X浓缩液(目录号631231和631232)：1)将1体积Lenti-X浓缩液与3体积澄清上清液组合。通过轻轻倒转来混合；2)在冰上或在4℃下孵育混合物30分钟至过夜；(3)在4℃下以1,500×g离心样品45分钟；(4)小心去除上清液并弃去，注意不扰动团粒；(5)使用无菌PBS+0.1％BSA轻轻地使原始体积的1/10至1/100的团粒再悬浮。
载体
将细胞因子表达盒克隆至pL17D中，其载体图展示于图31中，其中注释显著特征；例如SFFV启动子；FLAG和MYC抗原决定基标签；LTR等。
慢病毒转导
当细胞50％汇合时将鼠类MSC接种于6孔平板中并感染。病毒以适当MOI添加并孵育3小时以转导细胞。在感染后，将新鲜培养基添加至细胞中。
遵循以下例示性方案转导人MSC：
1.将200,000个人MSC于2mL无异种蛋白的人MSC培养基中涂铺于6孔平板的每个孔中。
2.在2小时之后，去除培养基并替换为1mL PBS。
3.将适当量的病毒添加至每个孔中，如通过以下MOI指示，并且在偶尔晃动下将细胞与病毒一起在37℃和5％CO2下孵育3小时。
4.在3小时之后去除病毒，用培养基洗涤平板，接着照常培养MSC(如上所述)，直至细胞到达衰老。计数每个传代的细胞，以便可确定总细胞数目。
实施例7：MSC组合细胞因子疗法(CT26)
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达各种细胞因子。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 ImanisLife Sciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化成处理组，并且用经腹膜内递送的呈单一剂或呈mMSC组合的表达效应分子的mMSC(1×106)处理以递送剂组合。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。在第12天和第17天评定肿瘤负荷。针对每一个别的小鼠，相对于起始信号(处理前)，归一化生物发光信号(光子/秒)。BLI信号减少超过100倍(0.01)相当于完全治愈(在尸检时无明显肿瘤)。如图32所示，如通过BLI水平所评定，单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC证明在IP肿瘤模型中降低CT26肿瘤负荷的功效。
实施例8：MSC组合细胞因子疗法(B16F10)
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达各种细胞因子。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化成处理组，并且用经腹膜内递送的呈单一剂或呈mMSC组合的表达效应分子的mMSC(1×106)处理以递送剂组合。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。在第12天和第17天评定肿瘤负荷。针对每一个别的小鼠，相对于起始信号(处理前)，归一化生物发光信号(光子/秒)。BLI信号减少超过100倍(0.01)相当于完全治愈(在尸检时无明显肿瘤)。如图33所示，如通过BLI水平所评定，单独或组合的被工程化用于表达不同效应分子的MSC证明在IP肿瘤模型中降低B16F10肿瘤负荷的功效。
实施例9：工程化的人MSC细胞因子产生
在以下实施例中，对骨髓来源hMSC(源自于3名人类志愿健康供体)进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法从单一慢病毒表达载体表达人IL12(p70)和人CCL21a。慢病毒表达载体(其示意载体图展示于图34中)使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
如图35所示，如通过细胞因子ELISA所评定，工程化的hMSC能够产生hIL12(图35A)和hCCL21a(图35B)。值得注意地，蛋白质分泌与MSC转导期间使用的病毒粒子的量(MOI)有关。
实施例10：工程化的人MSC的功能评定
在以下实施例中，对骨髓来源hMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达人IL12(p70)。工程化的hMSC与从健康献血者分离的人类T细胞共培养至0.4μmtranswell插入物(transwell测定法的示意图展示于图36A中)。为了评定活化的未处理T细胞上IL12诱导的Th1极化，通过ELISA，在从下部隔室(T细胞)收集的上清液上测量T细胞的IFNγ产生。如图36B所示，通过CD3T细胞与表达IL12p70的hMSC共培养，IFNγ产生以MOI剂量依赖方式增加。
实施例11：IP模型中MSC归巢至肿瘤
在以下实施例中，将表达fLUC的balb/c MSC(2×106个细胞)IP注射至CT-26IP肿瘤负载小鼠中。将小鼠处死并在注射后24小时收集组织。如图37所示，如通过生物发光成像(图37A中所示的影像、图37B中影像的定量)、定量实时PCR(图37C)和针对萤火虫荧光素酶的荧光显微术(图37D)所检测，fLUC-MSC显著富集在肿瘤。
另外，在植入肿瘤7天后，经腹膜内向C57Bl/6小鼠植入5×104B16F10-fLUC细胞，经腹膜内注射被工程化用于表达Nanoluc-EGFP的1×106C57Bl/6鼠类BM-MSC。在注射MSC之后24小时将小鼠处死，并且针对nanoluc信号传导，离体对腹膜器官(胃、肾、肝脏、结肠、脾、胰腺、网膜/肿瘤、卵巢和输卵管)成像(NanoGlo底物试剂盒，厂商：Promega，目录号：N1110)。如图37E所示，在B16F10肿瘤模型中，与腹膜腔中的其它器官相比，鼠类MSCnanoluc信号优先富集在肿瘤中。
实施例12：在IP模型中产生IL12的MSC减少CT26肿瘤负荷
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 ImanisLife Sciences)的CT26肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性balb/c(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达IL12p70的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图38所示，在CT26模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
实施例13：在IP模型中产生IL12的MSC减少B16F10肿瘤负荷
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12p70。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达IL12p70的mMSC 1×106个处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图39所示，在B16F10模型中如通过BLI所评定，表达IL12p70的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。
实施例14：在CT26 IP肿瘤模型中产生IL12和CCL21a的MSC减少肿瘤负荷并且延长生存
在以下实施例中，对balb/c mMSC进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类CCL21a。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 ImanisLife Sciences)的CT26肿瘤细胞(1×106个细胞)注射至免疫活性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的由相同MSC表达IL12p70和CCL21a的mMSC 1×106(“MSC-IL-12p70_2A_CCL21a”)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图40所示，在CT26模型中，如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的MSC引起肿瘤负荷减少(上图和左下图)，以及通过肿瘤重量，可检测的腹膜内肿瘤完全消除(右下图)。图40A展示如通过BLI所评定，PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”正方形)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(三角形)的平均肿瘤负荷。图40B展示如通过BLI所评定，个别的小鼠中PBS处理(圆形)、MSC-Flag-Myc(“未处理MSC”)和表达IL12p70/CCL21a的MSC(分别为左图、中图和右图)的平均肿瘤负荷。值得注意地，如图40C所示，用表达IL12p70/CCL21a的MSC处理延长生存(100％生存超过90天)，而对照物处理的小鼠至第20天均死亡或处死。
实施例15：在B16F10 IP肿瘤模型中产生IL12和IL21的MSC减少肿瘤负荷并且延长生存
在以下实施例中，对C57BL/6mMSC进行工程化以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法表达鼠类IL12(p70)或鼠类IL21(即每种MSC被工程化用于仅表达单一剂)。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(B16F10-Fluc-Puro目录号：CL052，批号：CL-IM150 Imanis Life Sciences)的B16F10肿瘤细胞(100μl中5×104个细胞)注射至免疫活性C57BL/6(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的表达IL12p70的mMSC(1×106个细胞)与表达IL21的mMSC(1×106个细胞)的组合或单独的表达IL12p70的mMSC(1×106个细胞)处理。MSC-Flag-Myc和PBS用作阴性对照物。如图41所示，相对于对照物处理的小鼠，用表达IL12p70的MSC处理延长生存，但所有小鼠至第50天均死亡或处死。相比之下，相对于用表达IL12p70的MSC处理，用表达IL12p70的MSC与表达IL21的MSC的组合处理延长生存(60％生存超出60天)。因此，MSC表达IL21可增强表达IL12p70的MSC的功效。
实施例16：在CT26 IP肿瘤模型中产生IL12和CCL21a的同种异体MSC减少肿瘤负荷并且延长生存
在以下实施例中，对balb/c mMSC(同基因)和C57BL/6mMSC(同种异体)进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达鼠类IL12(p70)和鼠类CCL21a。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
将被工程化用于组成性表达荧光素酶(目录号：CL043，批号：CL-IM147 ImanisLife Sciences)的CT26肿瘤细胞(1×106个细胞)注射至免疫活性balb/c小鼠(6-8周龄)的腹膜间隙中。在肿瘤植入一周之后，通过使用AMI成像器进行荧光素酶成像(BLI)来测量肿瘤负荷。将小鼠随机化至处理组，并且用腹膜内递送的由相同MSC表达IL12p70和CCL21a的mMSC(1×106个细胞)(“MSC-IL12+CCL21”)处理。balb/c对照mMSC(同基因)和C57BL/6对照mMSC(同种异体)被工程化用于表达MSC-Flag-Myc(“未处理”)。PBS也用作阴性对照物。如图1所示，在CT26模型中，如通过BLI所评定，表达IL12p70/CCL21a的同基因和同种异体MSC减少肿瘤负荷，而对照处理则未减少。另外，在同基因和同种异体模型中先前用表达IL12p70和CCL21a的mMSC处理并且确定90天无肿瘤的小鼠随后用皮下植入大腿中的CT26肿瘤细胞(100μl PBS中0.5×106个细胞)激发，如图2A中所图示。如图2B所示，与其中建立肿瘤的未处理对照小鼠对比，无肿瘤小鼠排斥肿瘤植入物。因此，用表达IL12p70/CCL21a的MSC处理延长肿瘤负荷减少以及免疫记忆。
实施例17：产生IL12和CCL21a的MSC显示相对于未修饰的细胞增强的生长
在以下实施例中，来自3种不同供体的人MSC以不同感染复数(MOI)进行工程化以从单一慢病毒表达载体表达和分泌人IL-12和人CCL21a。使用实施例6中所述的慢病毒转导方法，慢病毒表达载体使用2A核糖体跳跃元件从单一转录本表达两种细胞因子。
如图42所示，在所测试的三种供体中，与未基因工程化的人MSC(MOI＝0)相比，基因工程化的MSC(MOI＝95000、9500或950)展现增强的细胞扩增和生长(图42A，供体1；图42B，供体2；图42C，供体3)。经慢病毒进行基因工程化以表达GFP的人MSC未显示类似增强的细胞扩增或生长表型(数据未示)。
实施例18：用于人骨髓MSC(BM-MSC)中持续蛋白质表达的启动子的选择
在以下实施例中，针对驱动人MSC中报告EGFP构建体的表达，测试各种启动子。所测试的启动子为CMV、SFFV、EF1a、EF1a-LTR、EFS、MND、PGK、UbC(参见表4)。使用实施例中所述的慢病毒转导方法，使用同等MOI(感染复数)将细胞转导。使用流式细胞术，定量连续传代的EGFP百分比和中值荧光强度(MFI)。
如图43所示，来自2种不同供体的两种独立人类BM-MSC细胞系(分别为顶行和底行)进行工程化并且在转导后第25天评定工程化细胞的GFP百分比(左图)和MFI(右图)。通过GFP百分比与MFI，SFFV启动子在两种细胞系中显示GFP表达。
如图44所示，针对两种独立人类BM-MSC细胞系个别(左图)或来自两种独立人类BM-MSC细胞系组合的数据(右图)，随时间追踪EGFP MFI(转导后第7天至第28天)。在超过28天期间蛋白质表达随时间稳定。另外，如通过MFI所定量，与EF1a启动子相比，SFFV启动子一致地驱动多几乎十倍的蛋白质表达。
实施例19：对人MSC进行工程化以产生IL12和IL21
在以下实施例中，对人骨髓MSC进行稳定转导以使用实施例6中所述的慢病毒转导方法从各种构建体表达IL12p70和IL21。在转导后细胞扩增3至4个传代，并且将0.2×106个细胞于4mL培养基中接种于6孔平板中。在24小时之后收集条件培养基并且进行ELISA以确定所产生的IL-12和IL-21浓度。
测试具有启动子-信号序列1-细胞因子1-2A接头-信号序列2-细胞因子2的不同组合和/或排列的各种构建体。测试的组合描述于下表7中。构建体SB00880的细节呈现于下表8中。
表7-IL-12和IL-21表达构建体
Figure BDA0003596748340002191
Figure BDA0003596748340002201
*fT2A是指弗林蛋白酶-T2A表8-SB00880表达构建体序列
Figure BDA0003596748340002202
Figure BDA0003596748340002211
Figure BDA0003596748340002221
Figure BDA0003596748340002231
Figure BDA0003596748340002241
Figure BDA0003596748340002251
Figure BDA0003596748340002261
如通过ELISA所评定，工程化MSC的IL-12p70和IL-21的分泌分别示于图45和图46中。SB00880显示工程化MSC表达两种细胞因子的水平高于大部分测试构建体。另外，如通过ELISA所评定和图47中所示，确定IL-12与IL-21的比率。使用SB00880进行工程化的MSC显示IL-12p70相对于IL-21高10倍的比率。值得注意地，10:1的比率显示临床前功效(数据未示)。
进行功能测定，展示工程化MSC的IL-12p70的表达。具有STAT4-SEAP报告体的HEK-293T细胞用于确定由工程化的hMSC产生的IL12p70的效力和活性，所述STAT4-SEAP报告体报告IL12p70与其受体的结合和通过JAK-STAT4通路的信号传导。将工程化MSC培养24小时并收集培养基，并且与HEK-293T STAT4-SEAP报告细胞一起孵育。用分光光度计确定SEAP产生。如图48所示，编码IL-12的所有构建体均显示报告活性，表明功能性IL12p70信号传导。
进行功能测定，展示工程化MSC的IL-21的表达。NK-92人类自然杀伤细胞用于确定由工程化的hMSC产生的IL-21的功能。将工程化的hMSC培养24小时，并且收集条件培养基，并且用于处理源自于IL-2的NK-92细胞。进行细胞内磷酸流动以定量磷酸化STAT1和磷酸化STAT3活化，作为IL-21活性的读数。如图49所示，所有编码IL-21的构建体均显示STAT1(左图)和STAT3(右图)磷酸化，表明功能性IL-21信号传导。
还使用IL21R-U2OS IL21R/IL2RG二聚报告体(
Figure BDA0003596748340002271
U2OS IL21R/IL2RG二聚细胞系,DiscoverX目录号：93-1035C3)进行IL-21的功能测定。将报告细胞与来自工程化的人MSC的条件培养基或适当阳性(重组细胞因子)或阴性对照物一起孵育。如图50所示，所有编码IL-21的构建体均显示二聚。
实施例20：信号肽序列的优化
在以下实施例中，效应分子被修饰成用外源性信号肽序列替换其天然信号肽序列(测试的例示性信号肽序列参见表5)。测试修饰的效应分子的功能改善，例如改善的表达和维持的分泌，例如尤其环境(例如肿瘤微环境)。还在肿瘤模型中测试修饰的效应分子的功能效能(例如改善的清除肿瘤的能力、改善的在不同环境中清除肿瘤的能力或改善的清除不同类型肿瘤的能力)。
实施例21：工程化MSC的富集
在以下实施例中，MSC被工程化用于在包括未工程化的细胞，例如未工程化的MSC的细胞群体内表达效应分子。通过使工程化MSC与生长因子(例如表1中所述的效应分子)接触来富集工程化MSC，使得富集的那些工程化MSC是表达所述生长因子的受体或受体配体的工程化MSC的子群。所关注的工程化MSC的子群以各种方式接触生长因子：
1.以自分泌方式，通过对MSC本身进行基因工程化来表达因子。
2.以旁分泌方式，通过对饲养细胞或支持细胞进行基因工程化来表达所述因子且将那些因子供应至MSC，或通过使用含有来自被工程化用于表达这些因子的饲养细胞或支持细胞(例如293T)的所述因子的条件培养基。
3.以内分泌方式，通过在MSC移植后将这些因子的重组蛋白或核酸型式注射至患者中。
4.经由添加这些因子的可溶性重组蛋白型式至MSC培养条件。
5.经由用这些因子的重组型式涂布用于MSC繁殖的组织培养平板/烧瓶表面。
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66.Kumar RM，et al.(2014)Nature 516(7529)：56-61.
67.Zhang J，et al.(2016)Cell Stem Cell 19(1)：66-80.
68.Cahan P，et al.(2014)Cell 158(4)：903-915.
69.Doulatov S，et al.(2013)Cell Ste`n Cell 13(4)：459-470.
70.KimK，et al.(2011)Nat Biotechnol 29(12)：1117-1119.
71.Chavez A，et al.(2016)Nat Methods 13(7)：563-567.
72.Slomovic S＆Collins JJ(2015)Nat Methods 12(11)：1085-1090.
关于引用的主题，本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都以引用的方式并入，在一些情况下可涵盖文献整体。
如本文在说明书和权利要求书中所用，除非相反地明显指示，否则应了解不定冠词“一种(a/an)”意指“至少一种”。
还应了解，除非相反地明显指示，否则在本文中要求的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的次序不一定限于叙述的方法的步骤或动作的次序。
在权利要求书以及以上说明书中，应理解例如“包含”、“包括”、“运载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等所有衔接词语都是开放性的，即意指包括(但不限于)。仅衔接词语“由……组成”和“基本上由……组成”分别为封闭或半封闭式衔接词语，如美国专利局专利审查程序手册(the United States Patent Office Manual of PatentExamining Procedures)章节2111.03中所述。
序列表
<110> 森迪生物科学公司
<120> 组合癌症免疫疗法
<130> STB-017WO
<140> 随同提交
<141> 随同提交
<150> 62/893,060
<151> 2019-08-28
<160> 145
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 1
agagggtata taatggaagc tcgacttcca g 31
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 2
gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cc 52
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 3
caccagacag tgacgtcagc tgccagatcc catggccgtc atactgtgac gtctttcaga 60
caccccattg acgtcaatgg gagaa 85
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 4
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 90
<210> 5
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 5
aggatgtcca tattaggaca tctaggatgt ccatattagg acatctagga tgtccatatt 60
aggacatcta ggatgtccat attaggacat ctaggatgtc catattagga catct 115
<210> 6
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 6
agtatgtcca tattaggaca tctaccatgt ccatattagg acatctacta tgtccatatt 60
aggacatctt gtatgtccat attaggacat ctaaaatgtc catattagga catct 115
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 7
tgagtcagtg actcagtgag tcagtgactc agtgagtcag tgactcag 48
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 8
agatcaaagg gtttaagatc aaagggctta agatcaaagg gtataagatc aaagggccta 60
agatcaaagg gactaagatc aaagggttta agatcaaagg gcttaagatc aaagggccta 120
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 9
gtctagacgt ctagacgtct agacgtctag ac 32
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 10
cagacacaga cacagacaca gaca 24
<210> 11
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 11
ggatccggta ctcgagatct gcgatctaag taagcttggc attccggtac tgttggtaaa 60
gccac 65
<210> 12
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 12
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctc 588
<210> 13
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 13
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgccgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660
gcgcgaccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720
gtcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc cgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggtcctgctg cagggagctc aaaatggagg 840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179
<210> 14
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 14
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctac 544
<210> 15
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 15
tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60
aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240
atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360
tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399
<210> 16
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 16
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcggggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511
<210> 17
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 17
gtaacgccat tttgcaaggc atggaaaaat accaaaccaa gaatagagaa gttcagatca 60
agggcgggta catgaaaata gctaacgttg ggccaaacag gatatctgcg gtgagcagtt 120
tcggccccgg cccggggcca agaacagatg gtcaccgcag tttcggcccc ggcccgaggc 180
caagaacaga tggtccccag atatggccca accctcagca gtttcttaag acccatcaga 240
tgtttccagg ctcccccaag gacctgaaat gaccctgcgc cttatttgaa ttaaccaatc 300
agcctgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgcttcccg agctctataa aagagctcac 360
aacccctcac tcggcgcgcc agtcctccga cagactgagt cgcccggg 408
<210> 18
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 18
ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 60
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 120
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 180
actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 240
ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag 300
tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agct 344
<210> 19
<211> 1229
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 19
gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60
agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120
ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180
cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240
gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300
taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360
cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420
gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480
tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540
tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600
aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660
cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720
gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780
gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840
acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900
ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960
gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020
tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080
tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140
ttttcagtgt tagactagta aagcttctgc aggtcgactc tagaaaattg tccgctaaat 1200
tctggccgtt tttggctttt ttgttagac 1229
<210> 20
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 20
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720
ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179
<210> 21
<211> 1718
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 21
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac 660
gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 720
tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 780
agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 840
tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 900
tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 960
cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020
ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080
gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140
ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200
ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260
ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320
cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380
tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440
gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500
cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560
gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620
gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680
tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattc 1718
<210> 22
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 22
gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60
ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212
<210> 23
<211> 2379
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 23
ccactagttc catgtcctta tatggactca tctttgccta ttgcgacaca cactcaatga 60
acacctacta cgcgctgcaa agagccccgc aggcctgagg tgcccccacc tcaccactct 120
tcctattttt gtgtaaaaat ccagcttctt gtcaccacct ccaaggaggg ggaggaggag 180
gaaggcaggt tcctctaggc tgagccgaat gcccctctgt ggtcccacgc cactgatcgc 240
tgcatgccca ccacctgggt acacacagtc tgtgattccc ggagcagaac ggaccctgcc 300
cacccggtct tgtgtgctac tcagtggaca gacccaaggc aagaaagggt gacaaggaca 360
gggtcttccc aggctggctt tgagttccta gcaccgcccc gcccccaatc ctctgtggca 420
catggagtct tggtccccag agtcccccag cggcctccag atggtctggg agggcagttc 480
agctgtggct gcgcatagca gacatacaac ggacggtggg cccagaccca ggctgtgtag 540
acccagcccc cccgccccgc agtgcctagg tcacccacta acgccccagg cctggtcttg 600
gctgggcgtg actgttaccc tcaaaagcag gcagctccag ggtaaaaggt gccctgccct 660
gtagagccca ccttccttcc cagggctgcg gctgggtagg tttgtagcct tcatcacggg 720
ccacctccag ccactggacc gctggcccct gccctgtcct ggggagtgtg gtcctgcgac 780
ttctaagtgg ccgcaagcca cctgactccc ccaacaccac actctacctc tcaagcccag 840
gtctctccct agtgacccac ccagcacatt tagctagctg agccccacag ccagaggtcc 900
tcaggccctg ctttcagggc agttgctctg aagtcggcaa gggggagtga ctgcctggcc 960
actccatgcc ctccaagagc tccttctgca ggagcgtaca gaacccaggg ccctggcacc 1020
cgtgcagacc ctggcccacc ccacctgggc gctcagtgcc caagagatgt ccacacctag 1080
gatgtcccgc ggtgggtggg gggcccgaga gacgggcagg ccgggggcag gcctggccat 1140
gcggggccga accgggcact gcccagcgtg gggcgcgggg gccacggcgc gcgcccccag 1200
cccccgggcc cagcacccca aggcggccaa cgccaaaact ctccctcctc ctcttcctca 1260
atctcgctct cgctcttttt ttttttcgca aaaggagggg agagggggta aaaaaatgct 1320
gcactgtgcg gcgaagccgg tgagtgagcg gcgcggggcc aatcagcgtg cgccgttccg 1380
aaagttgcct tttatggctc gagcggccgc ggcggcgccc tataaaaccc agcggcgcga 1440
cgcgccacca ccgccgagac cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat 1500
ccgccgcccg tccacacccg ccgccaggta agcccggcca gccgaccggg gcaggcggct 1560
cacggcccgg ccgcaggcgg ccgcggcccc ttcgcccgtg cagagccgcc gtctgggccg 1620
cagcgggggg cgcatggggg gggaaccgga ccgccgtggg gggcgcggga gaagcccctg 1680
ggcctccgga gatgggggac accccacgcc agttcggagg cgcgaggccg cgctcgggag 1740
gcgcgctccg ggggtgccgc tctcggggcg ggggcaaccg gcggggtctt tgtctgagcc 1800
gggctcttgc caatggggat cgcagggtgg gcgcggcgga gcccccgcca ggcccggtgg 1860
gggctggggc gccattgcgc gtgcgcgctg gtcctttggg cgctaactgc gtgcgcgctg 1920
ggaattggcg ctaattgcgc gtgcgcgctg ggactcaagg cgctaactgc gcgtgcgttc 1980
tggggcccgg ggtgccgcgg cctgggctgg ggcgaaggcg ggctcggccg gaaggggtgg 2040
ggtcgccgcg gctcccgggc gcttgcgcgc acttcctgcc cgagccgctg gccgcccgag 2100
ggtgtggccg ctgcgtgcgc gcgcgccgac ccggcgctgt ttgaaccggg cggaggcggg 2160
gctggcgccc ggttgggagg gggttggggc ctggcttcct gccgcgcgcc gcggggacgc 2220
ctccgaccag tgtttgcctt ttatggtaat aacgcggccg gcccggcttc ctttgtcccc 2280
aatctgggcg cgcgccggcg ccccctggcg gcctaaggac tcggcgcgcc ggaagtggcc 2340
agggcggggg cgacctcggc tcacagcgcg cccggctat 2379
<210> 24
<211> 529
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 24
gttgatttcc ttcatccctg gcacacgtcc aggcagtgtc gaatccatct ctgctacagg 60
ggaaaacaaa taacatttga gtccagtgga gaccgggagc agaagtaaag ggaagtgata 120
acccccagag cccggaagcc tctggaggct gagacctcgc cccccttgcg tgatagggcc 180
tacggagcca catgaccaag gcactgtcgc ctccgcacgt gtgagagtgc agggccccaa 240
gatggctgcc aggcctcgag gcctgactct tctatgtcac ttccgtaccg gcgagaaagg 300
cgggccctcc agccaatgag gctgcggggc gggccttcac cttgataggc actcgagtta 360
tccaatggtg cctgcgggcc ggagcgacta ggaactaacg tcatgccgag ttgctgagcg 420
ccggcaggcg gggccggggc ggccaaacca atgcgatggc cggggcggag tcgggcgctc 480
tataagttgt cgataggcgg gcactccgcc ctagtttcta aggaccatg 529
<210> 25
<211> 794
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 25
agttccccaa ctttcccgcc tctcagcctt tgaaagaaag aaaggggagg gggcaggccg 60
cgtgcagtcg cgagcggtgc tgggctccgg ctccaattcc ccatctcagt cgctcccaaa 120
gtccttctgt ttcatccaag cgtgtaaggg tccccgtcct tgactcccta gtgtcctgct 180
gcccacagtc cagtcctggg aaccagcacc gatcacctcc catcgggcca atctcagtcc 240
cttcccccct acgtcggggc ccacacgctc ggtgcgtgcc cagttgaacc aggcggctgc 300
ggaaaaaaaa aagcggggag aaagtagggc ccggctacta gcggttttac gggcgcacgt 360
agctcaggcc tcaagacctt gggctgggac tggctgagcc tggcgggagg cggggtccga 420
gtcaccgcct gccgccgcgc ccccggtttc tataaattga gcccgcagcc tcccgcttcg 480
ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc aggtgaagac 540
gggcggagag aaacccggga ggctagggac ggcctgaagg cggcaggggc gggcgcaggc 600
cggatgtgtt cgcgccgctg cggggtgggc ccgggcggcc tccgcattgc aggggcgggc 660
ggaggacgtg atgcggcgcg ggctgggcat ggaggcctgg tgggggaggg gaggggaggc 720
gtgggtgtcg gccggggcca ctaggcgctc actgttctct ccctccgcgc agccgagcca 780
catcgctgag acac 794
<210> 26
<211> 532
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 26
agtgcggtta ccagcggaaa tgcctcgggg tcagaagtcg caggagagat agacagctgc 60
tgaaccaatg ggaccagcgg atggggcgga tgttatctac cattggtgaa cgttagaaac 120
gaatagcagc caatgaatca gctggggggg cggagcagtg acgtttattg cggagggggc 180
cgcttcgaat cggcggcggc cagcttggtg gcctgggcca atgaacggcc tccaacgagc 240
agggccttca ccaatcggcg gcctccacga cggggctggg ggagggtata taagccgagt 300
aggcgacggt gaggtcgacg ccggccaaga cagcacagac agattgacct attggggtgt 360
ttcgcgagtg tgagagggaa gcgccgcggc ctgtatttct agacctgccc ttcgcctggt 420
tcgtggcgcc ttgtgacccc gggcccctgc cgcctgcaag tcggaaattg cgctgtgctc 480
ctgtgctacg gcctgtggct ggactgcctg ctgctgccca actggctggc ac 532
<210> 27
<211> 701
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 27
tagtttcatc accaccgcca cccccccgcc cccccgccat ctgaaagggt tctaggggat 60
ttgcaacctc tctcgtgtgt ttcttctttc cgagaagcgc cgccacacga gaaagctggc 120
cgcgaaagtc gtgctggaat cacttccaac gaaaccccag gcatagatgg gaaagggtga 180
agaacacgtt gccatggcta ccgtttcccc ggtcacggaa taaacgctct ctaggatccg 240
gaagtagttc cgccgcgacc tctctaaaag gatggatgtg ttctctgctt acattcattg 300
gacgttttcc cttagaggcc aaggccgccc aggcaaaggg gcggtcccac gcgtgagggg 360
cccgcggagc catttgattg gagaaaagct gcaaaccctg accaatcgga aggagccacg 420
cttcgggcat cggtcaccgc acctggacag ctccgattgg tggacttccg ccccccctca 480
cgaatcctca ttgggtgccg tgggtgcgtg gtgcggcgcg attggtgggt tcatgtttcc 540
cgtcccccgc ccgcgagaag tgggggtgaa aagcggcccg acctgcttgg ggtgtagtgg 600
gcggaccgcg cggctggagg tgtgaggatc cgaacccagg ggtggggggt ggaggcggct 660
cctgcgatcg aaggggactt gagactcacc ggccgcacgt c 701
<210> 28
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 28
gggccgccca ctcccccttc ctctcagggt ccctgtcccc tccagtgaat cccagaagac 60
tctggagagt tctgagcagg gggcggcact ctggcctctg attggtccaa ggaaggctgg 120
ggggcaggac gggaggcgaa aaccctggaa tattcccgac ctggcagcct catcgagctc 180
ggtgattggc tcagaaggga aaaggcgggt ctccgtgacg acttataaaa gcccaggggc 240
aagcggtccg gataacggct agcctgagga gctgctgcga cagtccacta cctttttcga 300
gagtgactcc cgttgtccca aggcttccca gagcgaacct gtgcggctgc aggcaccggc 360
gcgtcgagtt tccggcgtcc ggaaggaccg agctcttctc gcggatccag tgttccgttt 420
ccagccccca atctcagagc ggagccgaca gagagcaggg aaccc 465
<210> 29
<211> 538
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 29
gccccacccc cgtccgcgtt acaaccggga ggcccgctgg gtcctgcacc gtcaccctcc 60
tccctgtgac cgcccacctg atacccaaac aactttctcg cccctccagt ccccagctcg 120
ccgagcgctt gcggggagcc acccagcctc agtttcccca gccccgggcg gggcgagggg 180
cgatgacgtc atgccggcgc gcggcattgt ggggcggggc gaggcggggc gccgggggga 240
gcaacactga gacgccattt tcggcggcgg gagcggcgca ggcggccgag cgggactggc 300
tgggtcggct gggctgctgg tgcgaggagc cgcggggctg tgctcggcgg ccaaggggac 360
agcgcgtggg tggccgagga tgctgcgggg cggtagctcc ggcgcccctc gctggtgact 420
gctgcgccgt gcctcacaca gccgaggcgg gctcggcgca cagtcgctgc tccgcgctcg 480
cgcccggcgg cgctccaggt gctgacagcg cgagagagcg cggcctcagg agcaacac 538
<210> 30
<211> 1091
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 30
ttccagagct ttcgaggaag gtttcttcaa ctcaaattca tccgcctgat aattttctta 60
tattttccta aagaaggaag agaagcgcat agaggagaag ggaaataatt ttttaggagc 120
ctttcttacg gctatgagga atttggggct cagttgaaaa gcctaaactg cctctcggga 180
ggttgggcgc ggcgaactac tttcagcggc gcacggagac ggcgtctacg tgaggggtga 240
taagtgacgc aacactcgtt gcataaattt gcgctccgcc agcccggagc atttaggggc 300
ggttggcttt gttgggtgag cttgtttgtg tccctgtggg tggacgtggt tggtgattgg 360
caggatcctg gtatccgcta acaggtactg gcccacagcc gtaaagacct gcgggggcgt 420
gagagggggg aatgggtgag gtcaagctgg aggcttcttg gggttgggtg ggccgctgag 480
gggaggggag ggcgaggtga cgcgacaccc ggcctttctg ggagagtggg ccttgttgac 540
ctaagggggg cgagggcagt tggcacgcgc acgcgccgac agaaactaac agacattaac 600
caacagcgat tccgtcgcgt ttacttggga ggaaggcgga aaagaggtag tttgtgtggc 660
ttctggaaac cctaaatttg gaatcccagt atgagaatgg tgtcccttct tgtgtttcaa 720
tgggattttt acttcgcgag tcttgtgggt ttggttttgt tttcagtttg cctaacaccg 780
tgcttaggtt tgaggcagat tggagttcgg tcgggggagt ttgaatatcc ggaacagtta 840
gtggggaaag ctgtggacgc ttggtaagag agcgctctgg attttccgct gttgacgttg 900
aaaccttgaa tgacgaattt cgtattaagt gacttagcct tgtaaaattg aggggaggct 960
tgcggaatat taacgtattt aaggcatttt gaaggaatag ttgctaattt tgaagaatat 1020
taggtgtaaa agcaagaaat acaatgatcc tgaggtgaca cgcttatgtt ttacttttaa 1080
actaggtcac c 1091
<210> 31
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
atgtgtcacc agcagctcgt tatatcctgg tttagtttgg tgtttctcgc ttcacccctg 60
gtggca 66
<210> 32
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 32
atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60
gtcgcc 66
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 33
atgcaactgc tgtcatgtat cgcactcatc ctggcgctgg ta 42
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
atgtatcgga tgcaactttt gagctgcatc gcattgtctc tggcgctggt gacaaattcc 60
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
atgaatctct tgctcatact tacgtttgtc gctgctgccg ttgcg 45
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：高斯荧光素酶序列
<400> 36
atgggcgtga aggtcttgtt tgcccttatc tgcatagctg ttgcggaggc g 51
<210> 37
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
atgccgatgg ggagccttca acctttggca acgctttatc ttctggggat gttggttgct 60
agttgccttg gg 72
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 38
atggaaactg acacgttgtt gctgtgggta ttgctcttgt gggtcccagg atctacgggc 60
gac 63
<210> 39
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
atggatatga gggttcccgc ccagcttttg gggctgcttt tgttgtggct tcgaggggct 60
cggtgt 66
<210> 40
<211> 48
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：VSV-G序列
<400> 40
atgaagtgtc tgttgtacct ggcgtttctg ttcattggtg taaactgt 48
<210> 41
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
atgaatatca aaggaagtcc gtggaagggt agtctcctgc tgctcctcgt atctaacctt 60
ctcctttgtc aatccgtggc accc 84
<210> 42
<211> 54
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
atgaaatggg taacattcat atcacttctc tttctgttca gctctgcgta ttct 54
<210> 43
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
atgacaaggc ttactgtttt ggctctcctc gctggactct tggcttcctc ccgagca 57
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
atgagggctt ggattttttt tctgctctgc cttgccggtc gagccctggc g 51
<210> 45
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
atgcctcttc tgcttttgct tcctcttttg tgggcaggtg ccctcgca 48
<210> 46
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
atgaactctt tctcaacctc tgcgtttggt ccggtcgctt tctcccttgg gctcctgctt 60
gtcttgccag cagcgtttcc tgcgcca 87
<210> 47
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
atgacaagta aactggcggt agccttgctc gcggcctttt tgatttccgc agccctttgt 60
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
atgaaggtaa gtgcagcgtt gctttgcctt ctcctcattg cagcgacctt tattcctcaa 60
gggctggcc 69
<210> 49
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
atgggagcgg cagctagaac acttcgactt gcccttgggc tcttgctcct tgcaaccctc 60
cttagacctg ccgacgca 78
<210> 50
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
atgtcaccgt tgttgcggag attgctgttg gccgcacttt tgcaactggc tcctgctcaa 60
gcc 63
<210> 51
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
atgaataacc tgctctgttg tgcgctcgtg ttcctggaca tttctataaa atggacaacg 60
caa 63
<210> 52
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
atgcaaatgt ctcctgccct tacctgtctc gtacttggtc ttgcgctcgt atttggagag 60
ggatcagcc 69
<210> 53
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
atggcaaggg ctgcactcag tgctgccccg tctaatccca gattgcttcg agttgcattg 60
cttcttctgt tgctggttgc agctggtagg agagcagcgg gt 102
<210> 54
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
atgaatgcaa aagtcgtggt cgtgctggtt ttggttctga cggcgttgtg tcttagtgat 60
ggg 63
<210> 55
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 55
atggaacgca ttgtgatctg cctgatggtc atcttcctgg gcaccttagt gcacaagtcg 60
agcagc 66
<210> 56
<211> 1626
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
atgtgccatc agcagcttgt catatcttgg ttttcacttg tattcctggc cagccctttg 60
gttgcgatct gggagctcaa gaaggatgtg tacgttgtag agctggactg gtaccccgat 120
gctcccggtg agatggtcgt tttgacatgt gacactccag aagaggacgg tattacgtgg 180
actctggacc agtcctccga agttcttggt tctggtaaga ctctgactat ccaggtgaaa 240
gaatttgggg atgcgggaca atacacatgc cacaagggag gcgaggtgtt gtctcatagt 300
ttgctgcttc tccacaagaa agaggatgga atctggagca ccgacatact caaggatcaa 360
aaggaaccca aaaataagac atttctgcga tgtgaggcta agaactatag tggccgcttc 420
acttgttggt ggctgactac catcagcaca gatctcacgt tttcagtaaa aagtagtaga 480
ggttcaagtg atcctcaagg ggtaacgtgc ggtgctgcaa cactgtctgc tgaacgcgta 540
agaggagata ataaggagta cgagtattcc gtagaatgcc aagaggacag tgcttgtcct 600
gcggccgagg agtctctccc aatagaagtg atggtggacg cggtgcataa actgaaatat 660
gagaactaca caagcagttt ttttataaga gatatcatca agcccgatcc gccgaagaat 720
ttgcaactta aaccgcttaa aaactcacgc caggttgaag tatcctggga gtatccggat 780
acatggtcaa caccacacag ctatttttcc cttaccttct gtgtgcaggt ccaagggaag 840
agcaaaaggg agaagaagga cagggtattc actgataaaa cttccgcgac ggtcatctgc 900
cgaaaaaacg ctagtatatc tgtacgggcg caggataggt actatagttc ttcttggtct 960
gagtgggcct cagttccgtg ctctggggga ggaagtggag gagggtccgg cggtggaagc 1020
gggggaggga gtcgcaactt gccagtggct acaccagatc caggcatgtt tccatgtctg 1080
catcattccc agaatctcct gagagcggtg tcaaatatgc tccaaaaagc gagacaaaca 1140
ctggaatttt acccgtgtac cagtgaggag attgatcacg aggacataac caaggacaag 1200
acctcaactg tagaagcgtg tttgccgctg gagttgacta agaatgagtc ctgcctcaat 1260
tccagagaaa cttcattcat tactaacggc agttgtcttg catcccggaa aacgtccttt 1320
atgatggccc tttgccttag ttcaatttac gaggatctta aaatgtatca agtggagttt 1380
aaaaccatga atgctaaact tcttatggac cccaaacgac aaatttttct ggatcagaat 1440
atgcttgccg tgatagacga actcatgcag gcgcttaatt ttaactccga aacagttcca 1500
caaaaatcta gccttgaaga acctgatttt tataaaacga agattaaact gtgtatcctg 1560
ctgcatgcct ttcgcatccg agctgtcaca atcgataggg ttatgtccta ccttaacgcg 1620
agctag 1626
<210> 57
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 57
atgtgccatc agcaactcgt catctcctgg ttctcccttg tgttcctcgc ttcccctctg 60
gtcgccattt gggaactgaa gaaggacgtc tacgtggtcg agctggattg gtacccggac 120
gcccctggag aaatggtcgt gctgacttgc gatacgccag aagaggacgg cataacctgg 180
accctggatc agagctccga ggtgctcgga agcggaaaga ccctgaccat tcaagtcaag 240
gagttcggcg acgcgggcca gtacacttgc cacaagggtg gcgaagtgct gtcccactcc 300
ctgctgctgc tgcacaagaa agaggatgga atctggtcca ctgacatcct caaggaccaa 360
aaagaaccga agaacaagac cttcctccgc tgcgaagcca agaactacag cggtcggttc 420
acctgttggt ggctgacgac aatctccacc gacctgactt tctccgtgaa gtcgtcacgg 480
ggatcaagcg atcctcaggg cgtgacctgt ggagccgcca ctctgtccgc cgagagagtc 540
aggggagaca acaaggaata tgagtactcc gtggaatgcc aggaggacag cgcctgccct 600
gccgcggaag agtccctgcc tatcgaggtc atggtcgatg ccgtgcataa gctgaaatac 660
gagaactaca cttcctcctt ctttatccgc gacatcatca agcctgaccc ccccaagaac 720
ttgcagctga agccactcaa gaactcccgc caagtggaag tgtcttggga atatccagac 780
acttggagca ccccgcactc atacttctcg ctcactttct gtgtgcaagt gcagggaaag 840
tccaaacggg agaagaaaga ccgggtgttc accgacaaaa cctccgccac tgtgatttgt 900
cggaagaacg cgtcaatcag cgtccgggcg caggatagat actactcgtc ctcctggagc 960
gaatgggcca gcgtgccttg ttccggtggc ggatcaggcg gaggttcagg aggaggctcc 1020
ggaggaggtt cccggaacct ccctgtggca acccccgacc ctggaatgtt cccgtgccta 1080
caccactccc aaaacctcct gagggctgtg tcgaacatgt tgcagaaggc ccgccagacc 1140
cttgagttct acccctgcac ctcggaagaa attgatcacg aggacatcac caaggacaag 1200
acctcgaccg tggaagcctg cctgccgctg gaactgacca agaacgaatc gtgtctgaac 1260
tcccgcgaga caagctttat cactaacggc agctgcctgg cgtcgagaaa gacctcattc 1320
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<213> 智人(Homo sapiens)
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tag 2103
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<213> 小鼠属(Mus sp.)
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ggcactactt gtcctccacc cgtatccatc gagcacgccg atattcgagt taaaaattat 540
agtgttaata gcagagaacg atacgtctgc aactcagggt ttaagagaaa ggccggaact 600
tcaactctca tagaatgcgt gattaataag aatactaacg tcgcacattg gactactccc 660
agtctcaagt gcatacgcga tccatctctc gctcattact caccagtacc tacagtggtt 720
actcctaagg tgacctctca gcccgaatca ccatctccca gcgcaaaaga gcctgaggcc 780
ttttctccta aatcagacac tgctatgact acagaaacag ccataatgcc aggaagccgg 840
ctgacaccat ctcaaactac cagcgcaggc acaactggga ctggctccca caaaagctca 900
cgcgcaccaa gtctcgccgc aacaatgaca ttggagccta cagccagcac atctcttaga 960
atcacagaaa tttctcccca cagtagcaag atgaccaagg tggcaattag taccagcgtc 1020
cttcttgtag gagctggagt tgtgatggca tttttggcat ggtatatcaa aagcaggtag 1080
<210> 67
<211> 489
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 67
atgaagatcc tcaagccata catgcgaaac actagtatta gctgttactt gtgttttctg 60
ctgaatagtc attttttgac tgaagcagga atccatgtat ttatactcgg ttgtgtgtct 120
gtaggtctgc caaagactga ggctaattgg attgacgtgc gctatgatct tgaaaaaata 180
gagtccttga ttcaatcaat acacatcgat accactctct acaccgacag tgatttccat 240
ccttcctgca aggtaacagc tatgaattgc ttcctcctgg agctccaagt cattctccat 300
gagtactcca acatgacttt gaacgaaact gtaagaaacg tattgtatct ggctaatagc 360
accttgtcta gtaacaaaaa tgtggcagag agcggctgca aagaatgtga agaattggaa 420
gagaaaacat ttacagagtt cctgcaatcc tttattcgca tcgtccaaat gtttatcaat 480
acctcttag 489
<210> 68
<211> 438
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 68
atgtattcca tgcaacttgc cagttgtgta acccttactc tcgtcctgct cgttaattcc 60
gctggtgcta actggataga tgttcgatac gatctggaaa agattgagtc ccttatccaa 120
tccattcata tagataccac cctttatact gacagcgact tccatccttc ttgcaaggtg 180
accgctatga attgtttcct gctggaactc caagttattc tgcatgaata ctctaatatg 240
acacttaacg agaccgtaag aaatgttctc tatctcgcta atagtacttt gagctcaaat 300
aagaacgtgg ccgagtctgg gtgtaaggaa tgcgaagagc tggaagaaaa gacattcacc 360
gagtttctcc agtctttcat acggattgtg cagatgttta tcaacacatc agattacaaa 420
gacgacgatg ataagtag 438
<210> 69
<211> 579
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 69
atggcagcca tgtctgagga ctcttgtgtg aactttaaag aaatgatgtt catagacaat 60
acactctact ttatacctga ggagaatgga gatttggaat ctgacaactt tggcaggctg 120
cattgcacta ccgcagttat ccgaaacatc aacgatcagg tactgtttgt tgataaaaga 180
caacctgtat tcgaggacat gaccgacata gatcagtctg cctcagagcc ccagactagg 240
cttatcatct atatgtacaa ggacagcgaa gtacgaggcc tggctgttac actctcagtc 300
aaagactcta agatgagcac cctgtcatgc aagaacaaaa ttatcagttt tgaggagatg 360
gacccacctg aaaacataga tgacattcag tcagacctca ttttttttca aaagcgggta 420
ccaggacaca acaaaatgga atttgaatca tcactctacg aaggacattt ccttgcatgc 480
cagaaagagg atgacgcatt caaattgatc ctgaaaaaaa aggacgaaaa tggtgataaa 540
tcagtcatgt ttacattgac caatcttcac caaagttag 579
<210> 70
<211> 579
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 70
atggctgcaa tgtctgaaga tagctgtgtc aactttaagg agatgatgtt cattgataat 60
actttgtact ttatacctga agaaaatgga gaccttgagt cagacaactt cgggagactg 120
cactgcacaa ctgccgttat ccgaaacata aatgatcaag tattgttcgt ggacaaaaga 180
caaccagtct ttgaggatat gacagacatc gaccaatccg catctgaacc tcagactagg 240
ctgatcatct atatgtacgc cgactccgaa gtaagaggcc ttgctgtgac acttagtgtt 300
aaggatagta agatgagcac actgtcctgt aagaataaga ttatatcttt tgaagagatg 360
gaccctcccg agaacataga tgacatccag agcgacttga tcttctttca gaagcgagtg 420
ccaggccata acaagatgga atttgaatca tctctttatg aaggccattt cctcgcatgt 480
caaaaggagg acgatgcctt caagctcatt ctgaaaaaaa aagacgagaa cggtgataag 540
agcgtgatgt tcactctgac aaatctgcac cagtcatag 579
<210> 71
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
atgtatcgca tgcaactcct gtcctgcatt gctctgagct tggctttggt aaccaactca 60
tacttcggga aactggagag taaactctcc gtaatcagga atcttaatga ccaagtattg 120
tttattgacc agggcaaccg cccgttgttc gaggatatga ctgattctga ctgtcgggat 180
aacgctccga gaactatctt tatcatttca atgtacaagg acagccaacc gcggggtatg 240
gctgtgacaa tcagtgtcaa atgtgagaag atttccacgc tgtcctgcga aaacaagata 300
atttctttca aagaaatgaa cccccctgac aatataaagg atacaaagag tgatatcatc 360
ttctttcaga ggtccgtgcc cggccacgat aataagatgc aatttgaaag ttcatcttat 420
gaggggtact ttttggcatg cgagaaagaa agggatctct tcaagttgat cctgaagaag 480
gaggacgaat tgggcgaccg ctccatcatg ttcacagtcc agaacgagga ctag 534
<210> 72
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
atgtaccgca tgcagctcct gagttgtatt gccctttccc tcgctctcgt taccaattct 60
tacttcggta agcttgcctc taaactctct gttattagga acttgaacga ccaagtcctt 120
ttcatagacc aagggaacag accactgttt gaagatatga cggatagcga ttgccgagat 180
aatgccccta ggacgatttt tatcattagt atgtatgcgg actctcaacc gagggggatg 240
gccgttacta taagtgtgaa atgcgagaaa atatcaacgc tcagttgtga gaacaaaatc 300
ataagtttca aggagatgaa tccacctgat aacatcaaag acactaagtc tgatattata 360
tttttccaac gaagtgttcc gggacacgat aacaaaatgc aatttgagag ctcctcatac 420
gagggctact tcctcgcgtg tgagaaagaa agggatttgt ttaagcttat cctcaagaaa 480
gaggacgagt tgggggatcg gagcataatg tttaccgtac agaatgagga ctag 534
<210> 73
<211> 441
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 73
atggagcgga cactcgtgtg tcttgtcgta atttttctcg ggacagtcgc acacaagtcc 60
tcaccccagg gtcctgatcg ccttctcata cgcctccgac atttgatcga cattgtagag 120
cagctcaaaa tttacgagaa tgacctcgat cccgagcttt tgagtgctcc ccaagacgtt 180
aagggtcatt gcgagcacgc agcttttgct tgcttccaga aggccaagtt gaaaccaagc 240
aaccctggta ataataagac tttcatcatc gacttggtcg cccaactccg aaggaggctg 300
cctgcccggc gcggaggaaa aaaacaaaag catattgcaa agtgtccttc atgtgattca 360
tacgaaaagc ggactcccaa agagttcttg gaaaggttga aatggcttct tcagaagatg 420
attcatcaac atttgtcata g 441
<210> 74
<211> 564
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
atgaccaaca aatgcctttt gcaaattgcc ctgcttttgt gttttagcac taccgcattg 60
agcatgtcat ataacctcct cggcttcctt cagagatcat caaactttca gtgtcagaaa 120
ctgctttggc aacttaatgg caggctcgaa tattgtctga aagatcggat gaatttcgac 180
attccagaag aaataaaaca gcttcaacaa ttccagaaag aggacgccgc cctgactatt 240
tacgagatgc tccagaatat cttcgccatt ttccggcagg acagctcatc cacggggtgg 300
aatgagacta ttgtagaaaa tcttctggct aatgtgtacc atcaaattaa tcacctcaaa 360
acggtgcttg aggaaaaact tgaaaaggaa gatttcacac ggggcaagtt gatgtcctcc 420
ctgcacctta aacgatacta cggcaggatt cttcattact tgaaggctaa ggagtatagc 480
cattgcgcgt ggacaattgt acgggtagaa atactgcgaa acttttattt catcaaccgg 540
ctcactggat accttagaaa ttag 564
<210> 75
<211> 549
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 75
atgaacaatc ggtggatact ccacgccgca tttctcctct gctttagcac gacggccctg 60
tccatcaact acaaacagct tcagttgcag gagcggacta acataaggaa gtgccaggaa 120
ctgctggaac agcttaatgg taaaattaat cttacatacc gagctgactt caaaattcct 180
atggaaatga ccgagaagat gcagaaatcc tacacggcat tcgccatcca ggaaatgctc 240
cagaacgtat ttctcgtgtt ccgcaataat ttctcttcta cgggttggaa cgaaaccatt 300
gttgttagac tgcttgacga actgcatcag caaaccgtgt tccttaaaac cgtgcttgag 360
gagaagcagg aggagcgcct gacttgggag atgtctagta ccgcacttca cttgaaatcc 420
tactactggc gcgttcagcg gtatctgaag ctgatgaagt ataactcata cgcctggatg 480
gtagtgcgcg cagagatctt cagaaacttt cttatcatcc ggcgactgac ccgaaacttt 540
cagaattag 549
<210> 76
<211> 501
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
atgaagtaca ctagctatat attggccttc cagctttgca tcgtattggg tagcctcgga 60
tgctattgcc aagacccgta tgtcaaagaa gccgaaaatc tcaaaaagta tttcaatgcc 120
ggacactcag acgtcgcgga taacggtaca ctgtttcttg gcatcctgaa aaattggaag 180
gaagagagtg acagaaaaat aatgcagtca caaatagtgt ccttttactt taagctgttc 240
aaaaatttca aggatgacca aagtatccag aagagtgttg aaactatcaa agaggacatg 300
aatgtgaaat tctttaacag taataagaag aagcgcgatg acttcgagaa actcactaat 360
tacagcgtaa cggatcttaa cgtccaacgc aaggcaatcc acgagcttat acaggtaatg 420
gctgagctta gtcccgcagc caagacaggg aagagaaaaa ggtctcaaat gctttttcgg 480
ggccggcgag cttcacaata g 501
<210> 77
<211> 468
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 77
atgaacgcta cgcattgcat cctcgcactc caattgttcc tcatggctgt gtcagggtgt 60
tactgtcacg gtactgtcat agaaagcctc gaatccctga ataactattt taacagtagc 120
ggtatagatg tagaagaaaa gtctctcttt cttgacatct ggaggaattg gcaaaaggat 180
ggagacatga agattctcca atctcagatt atatcatttt acttgaggct ttttgaggtt 240
ctgaaggata accaggcgat cagcaataat atcagcgtaa ttgaatctca ccttattaca 300
acatttttct caaattccaa ggcaaagaaa gatgctttca tgtctatcgc gaaatttgag 360
gtgaacaatc ctcaggtaca aaggcaagcc tttaacgagc tgattagagt tgtacatcag 420
ttgttgcccg aaagtagtct tagaaaacgc aaacggagcc gatgctag 468
<210> 78
<211> 570
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 78
atggcaaggt tgtgcgcttt tctcatggta ctggctgtgc tctcctattg gcctacttgt 60
tctctgggat gcgacttgcc acagacccac aatctgcgga ataagagggc tctgactctg 120
ctggtgcaaa tgagacggct ctctccactt agctgtttga aagatagaaa ggatttcggg 180
ttcccccagg agaaggtgga tgcccagcag atcaagaagg cacaggctat ccccgtcctt 240
tccgagctga cccagcaaat tttgaacatc tttacaagta aggatagttc agctgcatgg 300
aataccacac ttttggattc tttttgtaac gatctgcatc agcagctgaa cgatctccag 360
ggatgcctga tgcagcaagt cggcgtgcaa gaatttccac tcacccagga ggacgctctg 420
ctcgcagtgc gaaagtattt tcaccgaatt accgtgtacc tccgggagaa aaagcattca 480
ccctgcgctt gggaagtagt cagggccgaa gtatggagag cccttagtag ctccgctaat 540
gtactgggcc ggttgcggga agagaaatag 570
<210> 79
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
atggcgcaaa gtctggctct ttcactcctg atcctggtct tggccttcgg gattccgagg 60
acccaaggaa gtgatggtgg cgcccaagat tgttgcctta aatacagcca gcggaaaata 120
cccgcgaaag tggtcaggag ttatagaaaa caggagcctt ccctgggttg tagtatcccc 180
gccatacttt tcctcccgag aaaacggagc caggccgaac tgtgcgctga ccctaaggaa 240
ctttgggtgc aacaacttat gcaacacctg gataagacac cttctcctca aaagccagct 300
cagggctgcc gaaaagatag aggcgcctca aaaaccggaa aaaagggcaa aggttctaaa 360
ggatgtaagc ggactgaacg ctctcaaacg cctaaagggc cgtag 405
<210> 80
<211> 402
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 80
atggcgcaaa tgatgaccct ttccctgctg agtcttgtcc tcgcgctctg catcccgtgg 60
acgcaggggt ctgatggggg gggccaagac tgttgcctga agtattcaca aaaaaagata 120
ccgtactcta ttgtcagagg gtacaggaag caagaaccct ccttgggttg ccctatacca 180
gcaattcttt tctccccacg caagcattcc aaaccagaac tgtgtgcgaa ccccgaggag 240
ggttgggtac agaacttgat gcgaaggctt gaccagcccc cagcccctgg caagcagtca 300
cctgggtgca gaaaaaacag aggtacttca aagagcggca agaaaggcaa agggagtaaa 360
ggatgtaaaa gaacggagca gacccagcct tcacgaggct ag 402
<210> 81
<211> 309
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
atggcgcaaa gtctggctct ttcactcctg atcctggtct tggccttcgg gattccgagg 60
acccaaggaa gtgatggtgg cgcccaagat tgttgcctta aatacagcca gcggaaaata 120
cccgcgaaag tggtcaggag ttatagaaaa caggagcctt ccctgggttg tagtatcccc 180
gccatacttt tcctcccgag aaaacggagc caggccgaac tgtgcgctga ccctaaggaa 240
ctttgggtgc aacaacttat gcaacacctg gataagacac cttctcctca aaagccagct 300
cagggctag 309
<210> 82
<211> 309
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 82
atggcgcaaa tgatgaccct ttccctgctg agtcttgtcc tcgcgctctg catcccgtgg 60
acgcaggggt ctgatggggg gggccaagac tgttgcctga agtattcaca aaaaaagata 120
ccgtactcta ttgtcagagg gtacaggaag caagaaccct ccttgggttg ccctatacca 180
gcaattcttt tctccccacg caagcattcc aaaccagaac tgtgtgcgaa ccccgaggag 240
ggttgggtac agaacttgat gcgaaggctt gaccagcccc cagcccctgg caagcagtca 300
cctgggtag 309
<210> 83
<211> 327
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 83
atggcacccc gcgtcacacc cttgcttgct ttttctctgc ttgtcctctg gaccttcccc 60
gctcctaccc ttggaggagc caatgatgcc gaggattgct gcctgagtgt tacacaaagg 120
ccaataccag ggaatatagt gaaggcattc cggtatctgc tcaatgaaga tgggtgcaga 180
gtccccgcag ttgtctttac aacattgcga ggttaccagc tttgtgctcc cccagaccag 240
ccttgggtag atcgcattat tcgccggttg aagaagagct cagcaaagaa taagggcaat 300
tccacacgga gaagccccgt ctcctag 327
<210> 84
<211> 381
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 84
atgaaatcag cagtcctttt cttgctcggg attatttttc tggaacaatg tggagtgagg 60
ggaacactcg taataagaaa cgctcggtgc tcatgcatat caacatcacg gggcactatc 120
cactacaaat ccctgaagga tctgaagcag ttcgccccaa gccctaactg taacaagacc 180
gaaattatcg caactctcaa aaatggagat cagacttgtc ttgacccaga ttcagcaaat 240
gtcaagaagc tgatgaaaga gtgggaaaag aagatttcac aaaaaaaaaa gcaaaaacgc 300
ggcaagaaac atcaaaagaa catgaaaaac aggaaaccta agactcccca gtcaaggaga 360
agatcccgca agacaaccta g 381
<210> 85
<211> 303
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 85
atgaacagaa aagttaccgc tatagcactt gctgccataa tatgggccac cgcagctcaa 60
gggttcctga tgttcaagca gggccgatgc ctctgcattg gccctggaat gaaggccgtg 120
aaaatggccg aaatagaaaa agctagtgtc atatacccct ctaacggttg cgataaagtc 180
gaggttatag tcacaatgaa agctcataaa cgccaacgct gcctcgaccc ccggtctaag 240
caggctaggc tcataatgca agcaatcgag aagaaaaact ttcttagacg gcaaaacatg 300
tag 303
<210> 86
<211> 297
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 86
atgaacccat ctgccgccgt tattttctgt ctgatactcc ttgggctgag tggcacacaa 60
ggcatacccc tcgcccgcac agtccggtgt aattgtatac atattgacga cggccctgtt 120
agaatgcggg ccatcggtaa gctggagatt ataccagcaa gccttagttg tcccagggtt 180
gaaatcatag caactatgaa aaaaaacgac gaacaaagat gtttgaatcc cgagagcaag 240
acaatcaaaa accttatgaa agcatttagt caaaaacgct ctaaacgcgc tccatag 297
<210> 87
<211> 297
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
atgaatcaga cggcaatcct tatatgctgc cttatattcc ttactctctc agggatacaa 60
ggggtaccac tttctcggac tgttcgctgc acttgcattt caatatctaa ccaacctgta 120
aatccgcgga gcctggaaaa attggagatt atacctgctt ctcaattctg ccctcgggtg 180
gaaatcatcg ccactatgaa gaagaagggc gagaaaaggt gtctgaatcc agagtcaaag 240
gcaatcaaaa acctgctgaa agcggtgtca aaggaacggt ccaagagatc accctag 297
<210> 88
<211> 534
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 88
atgaacagga aagtaacagc cattgcattg gctgccatca tctgggccac cgcagcacag 60
ggttttctga tgtttaagca agggcgctgt ctctgtatag gcccaggcat gaaggccgtg 120
aagatggcag agattgagaa ggcatctgtg atttatcctt ctaacgggtg cgataaagtc 180
gaagttattg tgacaatgaa ggcacacaaa cgccaacggt gtttggaccc acgatctaaa 240
caggcaagat tgattatgca agccatcgag aaaaagaact ttctccgaag gcaaaatatg 300
atccctttgg ctcggacagt gcggtgtaac tgtattcaca tcgacgatgg gccagtacgg 360
atgagagcaa taggaaagct cgaaatcata cccgcctcat tgtcttgtcc cagggtggaa 420
ataatcgcca ctatgaaaaa gaacgatgaa cagaggtgtc tcaacccaga gagtaagact 480
atcaagaacc ttatgaaggc attcagtcag aagaggtcaa agcgagcacc atag 534
<210> 89
<211> 345
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
atgagacttc tcatattggc gcttctcggg atatgttctc ttacggcata catagttgag 60
ggggtgggat ctgaggttag cgataaacga acttgtgtta gtcttacaac acagaggctt 120
ccagtctcca ggataaaaac atatacgata actgagggat ctctcagagc ggtcatcttc 180
ataacgaaga ggggcctgaa ggtctgtgct gacccacaag cgacttgggt aagggacgtt 240
gtgcggagca tggacaggaa gagcaatact cgcaacaaca tgatccaaac caaacctacg 300
ggcacccaac agtcaaccaa tactgcggta acattgacgg ggtag 345
<210> 90
<211> 345
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 90
atgcgcctcc ttctgctgac ttttctgggt gtatgttgcc tgacaccctg ggtcgtagaa 60
ggagtaggaa ccgaggttct ggaagagtcc tcatgtgtaa acttgcagac acaacgactc 120
cccgtccaaa aaatcaagac ctatataatc tgggaggggg caatgcgggc cgtcattttc 180
gtgactaaac gaggtctcaa aatctgcgcc gaccccgagg ctaagtgggt gaaggcagcc 240
attaagaccg tggatgggag agccagcacc agaaagaaca tggccgaaac agtacctact 300
ggcgcacagc ggtcaacctc aactgctata accttgacag gatag 345
<210> 91
<211> 513
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：m_sCD40L #1序列
<400> 91
atggagactg acactctgct tctgtgggtg ttgctgctgt gggtgcctgg cagtacaggc 60
gatatgcaac gaggtgacga ggaccctcaa atcgccgccc atgtagtctc tgaagctaat 120
agcaacgctg catccgtctt gcagtgggca aagaaaggct actatactat gaagtccaac 180
ttggtaatgc ttgaaaacgg caagcagttg actgtcaaga gagagggact ttattacgtc 240
tatacccaag tcacattctg tagcaatcga gaaccctcct cacagaggcc ttttatagtg 300
ggactctggc ttaaaccaag tagcggctct gagcgcatac tgttgaaagc cgcaaacaca 360
cacagctctt cccaactctg cgagcagcaa tccgtgcatc tcggtggagt atttgagctt 420
caagccggtg cctcagtgtt tgtgaacgtc actgaggcct cccaggtcat acatcgagtt 480
gggttcagct ccttcggctt gctcaagctc tag 513
<210> 92
<211> 588
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：m_sCD40L #2序列
<400> 92
atggaaactg atacattgct gctctgggtt ttgctgctct gggtgcctgg gagtacaggc 60
gacatgagga ggcagttcga ggatctcgtt aaggatatta cccttaataa ggaggagaag 120
aaagaaaact cttttgagat gcaacgaggg gacgaagatc ctcagatcgc tgctcacgtg 180
gtctctgaag ctaacagcaa cgccgcttct gtcctccagt gggccaagaa aggttattac 240
accatgaaat caaaccttgt aatgcttgaa aacgggaaac agcttacagt gaagagggaa 300
ggtctttact acgtctatac ccaggtaacc ttctgctcaa acagagaacc atcaagccag 360
aggccattca tagtggggct ctggctcaaa ccttccagtg gcagcgagag aatcttgttg 420
aaagctgcta atacacatag tagtagccag ctttgcgagc aacagtcagt ccacctcggg 480
ggggtgtttg agttgcaagc aggggcctca gtattcgtga atgtcactga ggcttcccag 540
gtaattcaca gggtaggctt tagttcattc ggtttgctga agctttag 588
<210> 93
<211> 849
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：m_sCD40L #3序列
<400> 93
atgcgaagaa tgcagcttct gctccttatt gctctgagtc tcgcccttgt caccaactcc 60
ggggacagaa tgaaacaaat cgaggacaaa attgaagaaa tactgagtaa aatatatcac 120
atcgaaaacg aaattgcacg cattaagaaa ttgattggcg aacgcaccag tggcggctct 180
ggtggcaccg gaggttcagg cgggaccggg ggctctgaca aagtcgaaga ggaggttaac 240
cttcatgagg actttgtgtt catcaagaag ctgaaacggt gcaataaagg agaaggttct 300
ttgagcctcc ttaattgcga agagatgcga cgacagttcg aggatctggt taaggacatt 360
acacttaata aggaagagaa aaaggagaac tctttcgaaa tgcagcgcgg cgatgaagat 420
ccccagatag ccgcccatgt cgtctctgag gccaactcta acgcagcatc cgtcctccag 480
tgggctaaga aaggatatta tactatgaaa agcaatttgg tcatgctcga aaacggtaaa 540
cagctcactg ttaagagaga aggcctctat tacgtatata ctcaagtaac tttctgttct 600
aatagggaac cctcctctca aagacctttt atcgtaggac tctggttgaa accaagtagc 660
ggtagtgaaa ggattctgct caaagcagct aatactcact ccagcagtca actgtgcgaa 720
caacaaagcg ttcacctcgg gggcgtcttt gaacttcagg caggtgccag tgttttcgtc 780
aacgtaacag aagcatccca ggtaattcat cgagtagggt tttctagctt tggtttgctg 840
aagctgtag 849
<210> 94
<211> 2160
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：抗CD40_FGK4.5序列
<400> 94
atggaaactg atcgcctgtt gctctgggta cttcttctgt gggtgcctgg gtccactggt 60
gacactgtac ttacacaatc acccgctttg gccgtttctc ctggtgaacg ggtcacaatt 120
agttgccgag cttccgattc tgtatctact cttatgcatt ggtatcaaca aaaacctggt 180
cagcagccaa aattgctcat ttatcttgct agtcacttgg agtccggcgt acctgctcga 240
ttcagcggta gtgggtctgg cacagatttc actttgacca tagatcccgt ggaggccgat 300
gacactgcaa cctactattg ccagcaatcc tggaacgacc cttggacttt cggcggcggc 360
accaagctgg aactcaagcg agcagatgct gccccaaccg ttagtatatt cccaccctca 420
accgaacaac tcgccacagg aggcgctagt gtcgtgtgtc ttatgaacaa tttctatcca 480
cgagacatta gcgtcaagtg gaaaattgat gggacagaaa ggcgagatgg agttttggat 540
tcagtaacag accaggattc aaaggattct acctatagca tgagctccac cttgagcctg 600
accaaagctg attatgaatc tcataacctg tatacttgtg aagtggtgca taagacttct 660
agctcaccag tggttaaatc ttttaaccgc aacgaatgtc ggcgcaagag gggttccgga 720
gagggaaggg gtagtctgct cacctgcggc gatgttgaag aaaatcctgg tcccatggac 780
attcggctct ctttggtatt cctggtactt tttataaagg gggtgcaatg tgaagtccag 840
ctcgtggaaa gcggtggggg cctggttcag cccggtcgca gccttaaact tagttgcgca 900
gcatccggat ttacattttc tgactataac atggcctggg ttcgacaggc acccaaaaaa 960
gggctggagt gggtcgcaac tatcatatac gatggttccc ggacatacta tagagattca 1020
gtgaaggggc gctttacaat aagcagggac aatgctaagt ctaccttgta tcttcagatg 1080
gactccctga ggagcgaaga tacagcaaca tattattgtg ctacaaaccg ctggttgctg 1140
cttcattatt tcgactactg gggtcagggc gtcatggtaa ctgtatcaag cgccgagacc 1200
acagcccctt ctgtatatcc attggcacca ggtactgctc tgaaatccaa ctcaatggta 1260
acccttggat gtctggttaa gggttatttt cccgagcccg tcacagttac ttggaactct 1320
ggggcccttt ctagcggagt ccataccttt cccgccgttt tgcagagtgg tctgtacacc 1380
cttacctcaa gcgtcacagt tccatctagc acatggagct cccaggcagt aacttgtaat 1440
gtggcccatc cagcctcctc aactaaggta gataaaaaga tcgttcccag agaatgcaat 1500
ccatgtggat gcaccgggtc tgaggtcagc agtgtgttca ttttcccacc caagactaaa 1560
gatgtattga ctattactct tacacccaaa gtaacctgcg tggtggttga tattagtcaa 1620
aatgatcccg aggtacggtt ctcttggttt atcgacgacg tcgaagtaca tacagctcag 1680
acacacgctc ccgagaaaca aagcaattcc actcttagga gcgtgtccga gttgccaatc 1740
gtacataggg attggcttaa tggcaagacc tttaagtgta aggtcaattc aggggcattc 1800
cccgcaccaa tagagaagag tataagcaaa cccgagggga cacccagagg tccacaggtc 1860
tatacaatgg ctccccccaa ggaagagatg acccaaagtc aagtctcaat tacatgtatg 1920
gtgaagggct tttatccacc cgacatatac actgagtgga agatgaatgg acagccccaa 1980
gagaattata aaaacactcc ccctaccatg gacaccgacg ggtcctattt tctttatagt 2040
aaattgaacg tgaaaaagga gacctggcaa caaggcaaca ctttcacctg ctccgttctt 2100
cacgagggcc tgcataatca tcataccgaa aagtctctca gtcattctcc aggtaagtag 2160
<210> 95
<211> 528
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
atggaaacag atacgttgct gttgtgggta cttctccttt gggtccctgg cagcacaggg 60
gacgagaata gtttcgaaat gcagaagggc gaccagaacc cacagatcgc ggctcacgtt 120
atatcagaag caagtagtaa gaccacttcc gtacttcagt gggctgaaaa aggatattac 180
accatgtcca acaatctcgt gacactggag aacggtaaac aacttacggt gaaacgacag 240
ggcctctatt acatctacgc tcaggtgaca ttctgctcaa atagggaggc ttctagtcaa 300
gcgcccttca tcgccagcct gtgcctcaaa tctcccggcc ggttcgaacg aatcctgttg 360
cgagcggcca atacccatag ctcagctaaa ccttgcggcc agcagagtat tcatcttggt 420
ggtgtgtttg aacttcagcc gggagcatct gtgttcgtca acgtaacgga ccctagccaa 480
gtgtctcatg ggacaggttt tacatccttc ggactcctca agttgtag 528
<210> 96
<211> 540
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
atgacagttc tcgcgccagc ttggagtccc accacatact tgcttttgct tctgcttctg 60
tcctctggcc tgagtgggac ccaagattgt tcctttcaac attccccaat tagttctgat 120
tttgcagtga agattagaga gctctcagac tatctgctgc aagattatcc tgtcacagtc 180
gcttcaaacc tgcaagacga agagctctgc ggtgccttgt ggcggttggt cttggctcaa 240
agatggatgg agagactgaa aaccgtagca ggcagcaaga tgcagggtct cctggaaagg 300
gtgaacacgg aaatccattt tgtgaccaag tgcgcgttcc agcccccacc gagttgtctc 360
cggtttgttc aaacgaatat atcccggttg ctccaggaaa cctcagaaca actggtggct 420
ttgaaaccct ggatcacaag acaaaacttt agtcggtgcc tcgaactcca gtgccaacca 480
gattcttcta cacttccccc cccgtggtcc ccgcgcccgt tggaagcaac ggccccatag 540
<210> 97
<211> 876
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
atggcctgga gtcctctgtt tctgactctt ataactcact gtgccggcag ttgggctata 60
ccccctcatg tacagaagtc tgtaaacaac gacatgattg taaccgacaa taatggcgca 120
gtgaaattcc cacaactgtg taagttctgt gatgtacggt ttagtacatg cgacaatcaa 180
aaaagctgta tgtctaactg ctctattaca tccatatgtg aaaaacctca ggaggtgtgt 240
gttgccgttt ggcgaaaaaa tgatgagaat atcacactgg agacagtatg tcatgaccct 300
aaactgccat accatgattt catactggag gacgccgcca gtcctaagtg cattatgaaa 360
gagaaaaaga aacccggtga aacattcttt atgtgctctt gtagctctga cgagtgtaac 420
gacaacatta tattcagcga ggagtacaat acaagcaacc ccgatatacc acctcacgta 480
caaaaaagtg tcaacaacga tatgattgtt accgacaata acggagctgt taagtttcct 540
cagttgtgca agttctgcga tgtacgattc tctacctgcg acaaccaaaa gtcatgtatg 600
tctaactgtt ccataacctc catctgcgag aagccccagg aagtctgcgt cgccgtgtgg 660
cggaaaaacg acgagaatat cactcttgaa accgtttgtc atgatcctaa actgccctat 720
cacgacttta ttctggaaga tgctgcttcc cctaagtgta tcatgaaaga aaagaagaaa 780
cctggggaga cattctttat gtgttcatgc tcctccgatg agtgtaacga caatatcatc 840
ttctctgagg aatacaacac ttctaaccct gattag 876
<210> 98
<211> 2178
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
atggcctggt cccctctttt tctgaccctc atcacacact gtgcaggctc atgggctgag 60
accgtcttga cccagtcccc aggaactttg tctctgtctc ctggtgaaag agctaccctt 120
agttgtcgag cctctcagtc ccttggttct agctatctcg cttggtacca gcaaaagcca 180
ggccaggccc cacgactgct gatctacgga gcatcttcac gggctcccgg cattcccgat 240
cgattttccg gatctggtag tggtacagat ttcacactga ccatatctcg cctggagccc 300
gaggactttg ctgtttatta ttgtcagcag tacgccgatt ctcctatcac ttttggacag 360
ggaacccgcc tggagattaa gcgcacagta gcagctccat ccgtctttat ctttccacca 420
tcagatgaac agctcaagag tgggaccgca agtgtagtat gcctgctgaa caatttttac 480
cctagagagg ccaaagtgca gtggaaggtg gataacgccc tccagagtgg caatagtcaa 540
gaaagtgtta ctgagcaaga tagtaaggac tctacatact ctttgagttc tactttgacc 600
ctgtcaaaag cagattatga aaaacataag gtgtatgcat gtgaagttac acaccaaggg 660
ttgtcctctc cagttacaaa atcttttaat agaggagagt gccgccgcaa acgcggtagt 720
ggagaaggtc gaggctcact cttgacctgt ggcgacgtgg aagaaaatcc cggtcctatg 780
gattggactt ggagggtatt ttgtcttttg gcagtaacac ctggagctca cccccaagta 840
cagctcgtcc aatctggtgc cgaggttaaa aagcctggaa gttcagtgaa ggtctcttgc 900
aaggcatctg gatacacctt ttcatctaac gtcatatcct gggtacggca agccccagga 960
cagggacttg agtggatggg aggggtcatc cccatcgtgg acattgctaa ttacgctcag 1020
cgattcaaag ggcgggttac tataactgcc gacgagtcta cctcaactac ctacatggag 1080
ttgtcctctc tccgctccga ggacactgct gtatattact gtgccagcac tctcgggttg 1140
gtgttggatg ccatggacta ttggggacaa ggaaccctgg tgacagttag ctccgcaagc 1200
actaaaggcc cttctgtttt tcccttggca ccttgtagta ggtctacctc tgagtctaca 1260
gcagcacttg gatgcttggt taaggactat tttcccgagc cagttacagt ctcttggaac 1320
agtggtgccc tcacaagtgg ggttcatacc ttccccgcag tcctccagag tagtggcctt 1380
tacagcctct catcagttgt gactgttcct agttcatcac tcggtactaa gacatataca 1440
tgtaacgtag accacaagcc aagcaacaca aaagtagaca aacgagtcga atctaagtat 1500
ggaccccctt gtccctcctg tcctgctccc gagttccttg ggggcccttc cgtgttcttg 1560
tttcctccca agcccaagga taccctcatg atctcacgaa ccccagaggt aacatgtgtg 1620
gttgttgacg taagtcagga agatcccgaa gtgcaattta attggtacgt ggatggcgtc 1680
gaagtccata acgctaaaac aaaaccccga gaggaacaat tcaattccac atatcgggtg 1740
gtgagtgtat tgaccgttct tcaccaagat tggctgaacg gcaaggagta taagtgtaaa 1800
gtaagcaaca aaggtctgcc aagtagcata gaaaaaacaa tatctaaagc taagggccaa 1860
ccaagggaac cacaagtata tacattgccc ccctctcagg aagagatgac aaagaatcaa 1920
gttagcctga cctgtttggt aaaggggttc tatccctcag atatagcagt cgagtgggaa 1980
tctaacggcc agcccgagaa taattataaa acaacccccc ctgtgttgga ctcagacggc 2040
agcttctttc tctattcacg gctcactgtt gataagtccc gatggcagga ggggaatgtt 2100
ttcagctgta gcgtgatgca cgaagctctc cacaaccact atacacagaa aagtttgtct 2160
ttgtcccttg gaaaatag 2178
<210> 99
<211> 1062
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
atgagtacat cctttccaga gctggatctg gagaattttg agtatgacga cagtgccgaa 60
gcctgctacc tcggggacat agtcgcattc gggacaatct ttttgtctgt attttacgcc 120
ctggtgttta catttggcct ggttggaaat ctgttggtcg tactcgctct caccaattcc 180
cgaaaaccca aaagtataac agacatatac ctgttgaatc tggcactgag tgaccttttg 240
ttcgtcgcca cccttccttt ttggacacac taccttatca gtcacgaggg gcttcataat 300
gctatgtgca agctcactac tgccttcttc tttatcggat tcttcggggg tatctttttt 360
atcacagtta ttagcattga ccgatacctt gccatagtgc tcgcagccaa ctcaatgaac 420
aaccgcaccg tgcagcatgg agtgactatt tccttgggtg tgtgggccgc tgctatactt 480
gtcgccagcc ctcaattcat gtttaccaaa aggaaagaca atgagtgcct cggagattac 540
cctgaggtgt tgcaagaaat gtggcctgta cttcgaaata gcgaagtgaa tatactcggc 600
tttgctcttc ctctgctcat catgtcattc tgttattttc gaataatcca aacattgttc 660
agctgtaaga accgaaagaa agcccgcgcc gtacgcctga ttctgctcgt tgtgttcgcc 720
ttttttctgt tttggactcc ttacaacata atgatattcc tggagactct caaattctat 780
aacttttttc cctcctgtga tatgaaaagg gaccttagat tggctctcag tgtcactgaa 840
acagtagcct ttagccattg ttgtctcaac cctttcatat atgcatttgc aggggaaaag 900
ttccggcggt atctcggaca tttgtatcgg aagtgcttgg ccgtgttgtg tggtcatcct 960
gtccataccg gattctctcc tgagagtcaa cggagccgcc aagattcaat cctgtccagt 1020
ttcactcact atacttcaga gggggatggc agccttctgc tc 1062
<210> 100
<211> 1458
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：犬尿氨酸酶#1序列
<400> 100
atggagaccg acactttgtt gctgtgggta cttttgttgt gggtcccagg atctaccggg 60
gatatggaac cctctcctct tgaactgcca gtagacgccg tgcgccgcat tgcagccgag 120
ttgaattgcg atccaacaga tgaacgcgtt gccctgaggc tcgacgaaga ggataaattg 180
tcacatttca ggaactgctt ttacattcca aagatgaggg atcttccatc catagatctt 240
agcctcgtgt ccgaggatga cgatgccata tattttcttg ggaacagtct tgggttgcag 300
ccaaaaatgg tacggacata tctcgaagag gagctggaca aatgggctaa aatgggtgct 360
tacggccacg acgtgggaaa acgcccctgg atagttggcg acgaatctat cgtgagtctt 420
atgaaagata tagttggagc acatgagaaa gaaattgcac tgatgaatgc ccttactatc 480
aatctgcatc tcctcttgct ttcattcttt aagcccactc ctaaacgcca caaaatactt 540
ttggaagcaa aagcctttcc aagcgaccac tacgctattg agtcacaaat acaactccat 600
ggacttgatg tggaaaagtc tatgcggatg gtaaaaccac gcgaaggcga ggagaccctt 660
cgaatggagg acatacttga ggtcatcgaa gaagaaggag atagtatagc agttatcctt 720
ttcagcgggc tgcacttcta cacaggtcaa ctctttaaca ttccagctat tactaaggca 780
ggccacgcta aaggatgctt cgtgggcttt gaccttgcac acgcagtagg aaacgtagag 840
ctccgcttgc acgattgggg cgttgatttc gcctgctggt gttcatataa gtatcttaac 900
tcaggagctg gtgggttggc aggcgcattc gtacacgaga aacacgctca taccgtaaag 960
cctgcactgg tagggtggtt cggacacgat ctctctaccc gcttcaatat ggataataaa 1020
ctccagctta tacctggcgc caatggattc aggatctcaa atcctcctat tttgctcgtt 1080
tgcagtttgc acgcatctct tgaggtgttc cagcaggcta ccatgactgc actccgccgg 1140
aagtcaatcc ttttgaccgg atacttggag tatatgctga aacattatca ctcaaaagat 1200
aacactgaga ataagggccc catagtaaac attatcactc catctcgggc tgaagagcgc 1260
ggctgccaac tcacattgac tttttccatt cccaagaagt cagtgttcaa agagttggag 1320
aaacgggggg ttgtatgtga taagcgggag ccagatggaa tccgcgttgc cccagtcccc 1380
ctctataatt cttttcacga tgtatacaag tttattagac tgctgacaag tatcttggac 1440
tcatctgagc gatcttag 1458
<210> 101
<211> 1395
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：犬尿氨酸酶#2序列
<400> 101
atggaaccct ctcctcttga actgccagta gacgccgtgc gccgcattgc agccgagttg 60
aattgcgatc caacagatga acgcgttgcc ctgaggctcg acgaagagga taaattgtca 120
catttcagga actgctttta cattccaaag atgagggatc ttccatccat agatcttagc 180
ctcgtgtccg aggatgacga tgccatatat tttcttggga acagtcttgg gttgcagcca 240
aaaatggtac ggacatatct cgaagaggag ctggacaaat gggctaaaat gggtgcttac 300
ggccacgacg tgggaaaacg cccctggata gttggcgacg aatctatcgt gagtcttatg 360
aaagatatag ttggagcaca tgagaaagaa attgcactga tgaatgccct tactatcaat 420
ctgcatctcc tcttgctttc attctttaag cccactccta aacgccacaa aatacttttg 480
gaagcaaaag cctttccaag cgaccactac gctattgagt cacaaataca actccatgga 540
cttgatgtgg aaaagtctat gcggatggta aaaccacgcg aaggcgagga gacccttcga 600
atggaggaca tacttgaggt catcgaagaa gaaggagata gtatagcagt tatccttttc 660
agcgggctgc acttctacac aggtcaactc tttaacattc cagctattac taaggcaggc 720
cacgctaaag gatgcttcgt gggctttgac cttgcacacg cagtaggaaa cgtagagctc 780
cgcttgcacg attggggcgt tgatttcgcc tgctggtgtt catataagta tcttaactca 840
ggagctggtg ggttggcagg cgcattcgta cacgagaaac acgctcatac cgtaaagcct 900
gcactggtag ggtggttcgg acacgatctc tctacccgct tcaatatgga taataaactc 960
cagcttatac ctggcgccaa tggattcagg atctcaaatc ctcctatttt gctcgtttgc 1020
agtttgcacg catctcttga ggtgttccag caggctacca tgactgcact ccgccggaag 1080
tcaatccttt tgaccggata cttggagtat atgctgaaac attatcactc aaaagataac 1140
actgagaata agggccccat agtaaacatt atcactccat ctcgggctga agagcgcggc 1200
tgccaactca cattgacttt ttccattccc aagaagtcag tgttcaaaga gttggagaaa 1260
cggggggttg tatgtgataa gcgggagcca gatggaatcc gcgttgcccc agtccccctc 1320
tataattctt ttcacgatgt atacaagttt attagactgc tgacaagtat cttggactca 1380
tctgagcgat cttag 1395
<210> 102
<211> 573
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：VEGF序列
<400> 102
atgaatttct tgctgagctg ggtgcattgg acactcgcat tgttgctgta cttgcaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccactact gagggcgagc aaaagtctca tgaggtgatt 120
aaatttatgg acgtttacca acgatcatac tgtcggccaa tcgaaaccct cgtagatata 180
ttccaggagt acccagacga gatcgaatac attttcaagc cctcatgtgt cccattgatg 240
cgatgtgctg ggtgctgtaa cgacgaagca cttgaatgtg tccccacctc cgagagtaac 300
atcacaatgc aaataatgag aatcaagccc caccaatccc aacatatcgg tgaaatgtca 360
ttccttcagc attcccgctg cgagtgccgg cctaagaagg accgcaccaa accagagaac 420
cattgtgaac cctgttctga gagacggaag cacttgttcg tacaggaccc tcaaacatgc 480
aagtgcagct gtaagaatac cgactcacgg tgtaaagcta ggcaactgga gcttaatgaa 540
aggacctgcc gatgcgataa acccaggagg taa 573
<210> 103
<211> 426
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：GM-CSF序列
<400> 103
atgtggttgc agaatttgct cttcctgggg attgtggtct acagcctctc cgcacctacc 60
cgctctccta tcacagttac aagaccctgg aaacatgtgg aggccattaa agaagcattg 120
aatttgttgg acgatatgcc cgtcaccctg aatgaagaag tagaagttgt ttctaatgag 180
ttcagcttta aaaaattgac ctgtgtgcag acacggctta aaatttttga acagggactt 240
agaggaaact ttactaagct gaagggggca cttaacatga cagcttctta ttatcagacc 300
tattgtcctc caacacctga aaccgactgt gaaacacagg taaccactta cgccgatttt 360
attgattctt tgaaaacatt cctcaccgat ataccatttg agtgtaagaa gccaggccaa 420
aagtag 426
<210> 104
<211> 822
<212> DNA
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：抗PD1序列
<400> 104
atggaaactg acacacttct tctgtgggtc ttgctcctgt gggtcccagg ctctactggt 60
gacagtcctg ataggccatg gaacccacct acctttagtc cagccttgct cgtcgtaacc 120
gaaggggaca acgctacatt cacctgctct tttagcaata cttctgagag ttttcatgta 180
gtctggcatc gggagagtcc atccggacaa acagatactt tggccgcttt tccagaggat 240
aggtctcaac ctgggcaaga cgcaaggttt cgagtcacac agcttcctaa cgggagagat 300
tttcacatgt ctgtagttcg ggcacgccga aatgattctg gcacatatgt ttgcggtgtg 360
atctcacttg ctccaaagat tcaaataaag gagagccttc gcgccgagtt gcgggtgact 420
gagcgggagc ccaagtcctg cgacaaaacc catacttgtc caccctgtgg cggcgggtca 480
tccggtggcg ggtctggggg gcaaccaaga gagccacagg tatatactct tccccccagc 540
agagaagaaa tgacaaaaaa ccaagtgtcc ctgacatgtc tggttaaagg attttatccc 600
agtgacattg ctgtagaatg ggaatccaat ggtcaacccg agaataacta caaaaccact 660
cctccagtat tggacagtga cggttccttc ttcctctatt ccaaacttac agtggataaa 720
tcccgctggc agcaagggaa tgtattcagc tgtagtgtca tgcacgaagc tcttcataac 780
cattatacac agaaatctct ttccctgagc ccaggtaaat ag 822
<210> 105
<211> 1116
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 105
atggagactg atacactttt gctctgggtt ttgctcttgt gggtaccagg gtctactgga 60
gatgcacaaa ctcctgcatt caacaagcct aaggtagagc ttcatgtcca tttggacgga 120
gccataaaac ctgaaaccat actctatttc ggcaagaaac ggggtatagc acttcccgct 180
gataccgtgg aagagttgag aaatatcatt ggcatggaca aacctcttag cctgcctggc 240
tttcttgcaa agttcgacta ctatatgcca gttatagcag ggtgtagaga agcaataaag 300
cgaatcgcct atgagttcgt tgagatgaag gctaaagaag gagttgttta cgtggaagtc 360
cggtactcac ctcatctgct tgctaatagc aaggtggacc caatgccatg gaatcaaact 420
gaaggtgatg taacccctga cgatgtggtc gatttggtca atcaaggtct ccaagaaggc 480
gagcaggctt tcggcattaa ggtaagaagt atattgtgct gtatgcgaca tcaaccttca 540
tggtccctgg aggtcctcga attgtgcaaa aagtacaatc aaaaaacagt ggtcgcaatg 600
gatctcgctg gagatgagac catagaaggt tcctctcttt tccccggtca tgtcgaagca 660
tatgaagggg ctgtcaaaaa tggtatccac cgcaccgtcc acgcagggga agtagggtcc 720
ccagaagtag tcagggaagc cgttgacatt ttgaaaacag aaagagtcgg gcatggctac 780
catacaatag aggacgaagc cttgtacaat cgacttttga aagaaaatat gcacttcgag 840
gtctgtccct ggagttcata tctcaccgga gcatgggacc ccaaaacaac ccacgccgtc 900
gtacgcttca agaatgataa ggcaaactac agtttgaata cagatgatcc actgatattc 960
aagtcaacac ttgacactga ctaccagatg acaaaaaaag atatgggttt caccgaagaa 1020
gagttcaaga gattgaacat taacgcagca aaaagctcct tcctgccaga ggaagagaaa 1080
aaagaattgc ttgaaaggtt gtatcgagaa taccaa 1116
<210> 106
<211> 1056
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 106
atggcacaaa ctccagcttt taataagccc aaagtggaac ttcatgttca tctggatggg 60
gcaattaagc ccgaaactat attgtacttt ggcaaaaaga ggggtattgc cctgccagca 120
gataccgttg aggagcttcg caacatcatt gggatggaca agcccctctc tctgccaggt 180
tttctcgcta aattcgatta ttatatgcct gttattgctg gttgccggga ggccatcaag 240
aggatagcct acgagtttgt tgagatgaag gccaaagagg gcgtggtgta cgtagaggtc 300
agatacagcc ctcacctgct tgccaacagc aaggtggacc caatgccctg gaaccaaacc 360
gagggggatg tcactcccga cgacgttgta gacctcgtaa atcagggcct tcaagagggc 420
gagcaggcat ttggcataaa agtccggtct atactctgct gtatgaggca ccaaccctcc 480
tggtctttgg aggtacttga gttgtgtaag aaatacaatc aaaagactgt agtcgccatg 540
gatcttgcag gcgatgaaac catcgagggt agctccttgt tccctggaca tgttgaagcc 600
tacgaggggg ccgtaaaaaa tgggatacac aggactgtcc acgctggtga agtcggaagc 660
ccagaggtgg taagggaggc agttgacata ctcaagacag agcgggttgg acacggatac 720
cacacaattg aggacgaggc cctgtataac cgcctcctca aagagaacat gcattttgag 780
gtgtgtcctt ggtccagcta cctgactggt gcttgggacc ctaaaacaac tcacgccgtg 840
gtccggttca agaacgataa agccaattac tctttgaata ccgacgaccc cctcatattc 900
aaatcaacat tggataccga ctaccaaatg accaaaaagg atatggggtt tactgaagag 960
gagttcaaga ggctcaacat aaatgccgct aaatcctcct ttctccccga ggaagaaaaa 1020
aaagaactcc ttgagcggct gtatagggag tatcaa 1056
<210> 107
<211> 966
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 107
atggaaacag atacactctt gctctgggta ctgcttctgt gggtccccgg ctctactggg 60
gatgaagatg atgtaactac tacagaagaa ctcgctcccg ctcttgtccc cccacccaag 120
ggtacctgcg ccggttggat ggctggcatc ccaggacatc caggtcacaa cggtaccccc 180
ggaagagatg gtcgggatgg aactcccggc gagaagggcg aaaaagggga tgcagggctt 240
ctgggaccta aaggtgaaac aggggacgtt ggaatgactg gtgcagaagg gcctcgcggc 300
tttcctggca cccctgggag gaaaggagag cccggagagc tccagagaac tgaacctcgg 360
cctgcactca ctataactac ttcccctaat cttgggaccc gcgagaacaa cgccgatcag 420
gttacacctg taagccatat cgggtgcccc aatactaccc agcaagggag tcccgtgttc 480
gcaaagcttt tggctaaaaa ccaagcatcc ctgtgtaaca ctactcttaa ttggcattca 540
caagacggtg ctggtagctc ttatctttct caggggctgc ggtacgaaga agataagaag 600
gaattggttg tggattctcc aggactctat tatgtctttc tcgaattgaa gctcagtccc 660
accttcacaa acactggaca caaagtccag ggctgggtaa gtctggtact ccaagcaaag 720
ccccaggttg acgatttcga caatttggca ctcaccgtag agcttttccc atgctccatg 780
gaaaataaac ttgttgatcg gtcatggtca cagctcttgc tgcttaaggc agggcatcgc 840
ctctcagtgg gtctgagagc ttatttgcat ggtgcacaag atgcttacag ggattgggaa 900
ttgtcctacc caaacactac aagtttcggg ttgttccttg tcaaacctga taacccatgg 960
gagtag 966
<210> 108
<211> 900
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 108
atggaaactg atacactcct cctgtgggtc cttcttttgt gggtgcccgg atcaaccggc 60
gatggctgga tggcaggcat cccaggacac ccaggacaca acggtactcc aggtcgagac 120
ggtcgggatg ggactcctgg ggagaaaggc gagaaagggg acgctggttt gctcggtcct 180
aagggggaaa ccggggatgt aggaatgaca ggggctgaag ggcctcgggg atttcctggg 240
acaccaggca ggaagggtga accaggggag gccctccagc gcaccgagcc acggccagct 300
ctgaccataa caacaagtcc aaacctgggc acacgcgaaa acaatgctga ccaggtgact 360
cctgtaagtc acatcggatg ccctaacact acacaacagg gctctcctgt atttgcaaag 420
cttctcgcaa aaaatcaagc atcactttgt aatacaaccc tgaactggca ttctcaggac 480
ggagcagggt cctcttattt gtctcaaggg ctccgctacg aagaagataa aaaggaattg 540
gttgttgaca gtccaggttt gtattatgtg tttttggaac ttaagctgtc accaaccttc 600
actaacaccg gccacaaggt ccaaggctgg gttagtcttg ttttgcaagc caaacctcaa 660
gtggatgatt ttgacaatct ggctttgact gttgagcttt ttccatgcag tatggagaat 720
aaactggttg atcggtcatg gtcacagctc cttctgctca aggccggaca taggctgagt 780
gtgggacttc gggcctactt gcacggcgcc caggacgcat accgagactg ggaactcagc 840
taccctaaca caacttcttt tgggttgttc cttgtcaaac ccgataatcc ttgggaatag 900
<210> 109
<211> 870
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 109
atggagactg atactttgct cctgtgggtt cttctcctgt gggttcctgg ttccacaggg 60
gatatgcatg tcaatggcaa ggtagcactc gtgactgggg ctgcacaggg tatcgggaaa 120
gcttttgccg aggccctgtt gctgcatggc gccaaggtcg ctttggtaga ttggaacttg 180
gaggctggag ttaaatgcaa agctgcactc gacgaacaat ttgagcctca aaaaaccctc 240
tttgtgcagt gtgacgttgc tgaccaaaag caactcaggg acacattcag gaaggtcgta 300
gaccatttcg gacgcctcga tatactcgtt aataatgccg gggtaaacaa cgaaaagaac 360
tgggaacaaa cattgcaaat caacctggta agtgtcatta gcggaactta tctgggtctt 420
gattatatga gcaagcagaa cgggggcgag ggcgggatca ttatcaacat gtcaagtctt 480
gccggattga tgccagttgc tcagcagcct gtttactgtg ccagcaagca cggtattatt 540
gggtttaccc ggagtgccgc catggccgca aatcttatga agagtggggt aagactgaat 600
gttatctgcc caggtttcgt agatacccca atcctggaga gcatcgagaa ggaggaaaat 660
atgggacaat acattgaata taaagatcaa atcaaggcta tgatgaagtt ctacggggtt 720
ctgcatccat ccacaattgc caacgggctc attaatctga ttgaggacga cgccttgaac 780
ggagctataa tgaaaatcac agcttccaaa ggcattcact tccaagatta tgatatatca 840
cccttgcttg tcaaggctcc tctgacaagt 870
<210> 110
<211> 807
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 110
atgcatgtca atggcaaggt agcactcgtg actggggctg cacagggtat cgggaaagct 60
tttgccgagg ccctgttgct gcatggcgcc aaggtcgctt tggtagattg gaacttggag 120
gctggagtta aatgcaaagc tgcactcgac gaacaatttg agcctcaaaa aaccctcttt 180
gtgcagtgtg acgttgctga ccaaaagcaa ctcagggaca cattcaggaa ggtcgtagac 240
catttcggac gcctcgatat actcgttaat aatgccgggg taaacaacga aaagaactgg 300
gaacaaacat tgcaaatcaa cctggtaagt gtcattagcg gaacttatct gggtcttgat 360
tatatgagca agcagaacgg gggcgagggc gggatcatta tcaacatgtc aagtcttgcc 420
ggattgatgc cagttgctca gcagcctgtt tactgtgcca gcaagcacgg tattattggg 480
tttacccgga gtgccgccat ggccgcaaat cttatgaaga gtggggtaag actgaatgtt 540
atctgcccag gtttcgtaga taccccaatc ctggagagca tcgagaagga ggaaaatatg 600
ggacaataca ttgaatataa agatcaaatc aaggctatga tgaagttcta cggggttctg 660
catccatcca caattgccaa cgggctcatt aatctgattg aggacgacgc cttgaacgga 720
gctataatga aaatcacagc ttccaaaggc attcacttcc aagattatga tatatcaccc 780
ttgcttgtca aggctcctct gacaagt 807
<210> 111
<211> 6029
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 111
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800
aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa tcaaaatttt 1920
atctcgacat ggtggcgacc ggtagcgcta gcggatcgat aagcttgata tcgcctgcag 1980
ccgaattcct tgacttggga tccgcgtcaa gtggagcaag gcaggtggac agtcctgcag 2040
gcatgcgtga ctgactgagg ccgcgactct agtttaaact gcgtgactga ctctagaaga 2100
tccggcagtg cggccgcgtc gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 2160
ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 2220
tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 2280
tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 2340
tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 2400
ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 2460
gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat 2520
catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 2580
tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 2640
ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 2700
ccgcctcccc gcctggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 2760
cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aaaataagat 2820
ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 2880
ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 2940
gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 3000
gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt 3060
gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac 3120
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 3180
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc 3240
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 3300
cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 3360
gaggcctaga cttttgcaga gacggcccaa attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 3420
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 3480
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 3540
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 3600
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 3660
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 3720
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 3780
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 3840
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 3900
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 3960
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 4020
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 4080
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 4140
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 4200
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 4260
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 4320
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 4380
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 4440
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 4500
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 4560
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 4620
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 4680
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 4740
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 4800
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 4860
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 4920
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 4980
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 5040
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 5100
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 5160
gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 5220
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 5280
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 5340
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 5400
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 5460
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 5520
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 5580
tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg 5640
atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 5700
cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 5760
gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 5820
aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc 5880
tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 5940
aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 6000
gttgtaaaac gacggccagt gccaagctg 6029
<210> 112
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 112
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala
20
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 113
Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu Val
1 5 10
<210> 114
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：高斯荧光素酶序列
<400> 116
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 117
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 117
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly
20
<210> 118
<211> 21
<212> PRT
<213> 小鼠属(Mus sp.)
<400> 118
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 119
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：VSV-G序列
<400> 120
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
<210> 121
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
Met Asn Ile Lys Gly Ser Pro Trp Lys Gly Ser Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Ser Val Ala Pro
20 25
<210> 122
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 123
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 126
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro
20 25
<210> 127
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys
20
<210> 128
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr
1 5 10 15
Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala
20
<210> 129
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Met Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Thr Leu Leu Arg Pro Ala Asp Ala
20 25
<210> 130
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gln Ala
20
<210> 131
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile
1 5 10 15
Lys Trp Thr Thr Gln
20
<210> 132
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Met Gln Met Ser Pro Ala Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Phe Gly Glu Gly Ser Ala
20
<210> 133
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
Met Ala Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Arg Arg Ala
20 25 30
Ala Gly
<210> 134
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Asp Gly
20
<210> 135
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val His Lys Ser Ser Ser
20
<210> 136
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 136
atttgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtcgagctgg attggtaccc ggacgcccct 60
ggagaaatgg tcgtgctgac ttgcgatacg ccagaagagg acggcataac ctggaccctg 120
gatcagagct ccgaggtgct cggaagcgga aagaccctga ccattcaagt caaggagttc 180
ggcgacgcgg gccagtacac ttgccacaag ggtggcgaag tgctgtccca ctccctgctg 240
ctgctgcaca agaaagagga tggaatctgg tccactgaca tcctcaagga ccaaaaagaa 300
ccgaagaaca agaccttcct ccgctgcgaa gccaagaact acagcggtcg gttcacctgt 360
tggtggctga cgacaatctc caccgacctg actttctccg tgaagtcgtc acggggatca 420
agcgatcctc agggcgtgac ctgtggagcc gccactctgt ccgccgagag agtcagggga 480
gacaacaagg aatatgagta ctccgtggaa tgccaggagg acagcgcctg ccctgccgcg 540
gaagagtccc tgcctatcga ggtcatggtc gatgccgtgc ataagctgaa atacgagaac 600
tacacttcct ccttctttat ccgcgacatc atcaagcctg acccccccaa gaacttgcag 660
ctgaagccac tcaagaactc ccgccaagtg gaagtgtctt gggaatatcc agacacttgg 720
agcaccccgc actcatactt ctcgctcact ttctgtgtgc aagtgcaggg aaagtccaaa 780
cgggagaaga aagaccgggt gttcaccgac aaaacctccg ccactgtgat ttgtcggaag 840
aacgcgtcaa tcagcgtccg ggcgcaggat agatactact cgtcctcctg gagcgaatgg 900
gccagcgtgc cttgttccgg tggcggatca ggcggaggtt caggaggagg ctccggagga 960
ggttcccgga acctccctgt ggcaaccccc gaccctggaa tgttcccgtg cctacaccac 1020
tcccaaaacc tcctgagggc tgtgtcgaac atgttgcaga aggcccgcca gacccttgag 1080
ttctacccct gcacctcgga agaaattgat cacgaggaca tcaccaagga caagacctcg 1140
accgtggaag cctgcctgcc gctggaactg accaagaacg aatcgtgtct gaactcccgc 1200
gagacaagct ttatcactaa cggcagctgc ctggcgtcga gaaagacctc attcatgatg 1260
gcgctctgtc tttcctcgat ctacgaagat ctgaagatgt atcaggtcga gttcaagacc 1320
atgaacgcca agctgctcat ggacccgaag cggcagatct tcctggacca gaatatgctc 1380
gccgtgattg atgaactgat gcaggccctg aatttcaact ccgagactgt gcctcaaaag 1440
tccagcctgg aagaaccgga cttctacaag accaagatca agctgtgcat cctgttgcac 1500
gctttccgca ttcgagccgt gaccattgac cgcgtgatgt cctacctgaa cgccagt 1557
<210> 137
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 137
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro
325 330 335
Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg
385 390 395 400
Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr
405 410 415
Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
515
<210> 138
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 138
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro
340 345 350
Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg
355 360 365
Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr
370 375 380
Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys
385 390 395 400
Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu
405 410 415
Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys
420 425 430
Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser
435 440 445
Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn
450 455 460
Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn
465 470 475 480
Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser
485 490 495
Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys
500 505 510
Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala
515 520 525
Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
530 535 540
<210> 139
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 139
agacggaaac gcggaagcgg agagggcaga ggctcgctgc ttacatgcgg ggacgtggaa 60
gagaaccccg gtccg 75
<210> 140
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 140
Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 141
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 141
cagggacagg acaggcacat gattagaatg cgccagctca tcgatatcgt ggaccagttg 60
aagaactacg tgaacgacct ggtgcccgag ttcctgccgg cccccgaaga tgtggaaacc 120
aattgcgaat ggtcggcatt ttcctgcttt caaaaggcac agctcaagtc cgctaacacc 180
gggaacaacg aacggatcat caacgtgtcc atcaaaaagc tgaagcggaa gcctccctcc 240
accaacgccg gacggaggca gaagcatagg ctgacttgcc cgtcatgcga ctcctacgag 300
aagaagccgc cgaaggagtt cctggagcgg ttcaagtcgc tcctgcaaaa gatgattcat 360
cagcacctgt cctcccggac tcatgggtct gaggattca 399
<210> 142
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 143
<211> 155
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met
20 25 30
Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp
35 40 45
Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys
50 55 60
Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala
65 70 75 80
Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu
85 90 95
Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg
100 105 110
Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu
115 120 125
Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His
130 135 140
Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
145 150 155
<210> 144
<211> 2598
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 144
gtaacgccat tttgcaaggc atggaaaaat accaaaccaa gaatagagaa gttcagatca 60
agggcgggta catgaaaata gctaacgttg ggccaaacag gatatctgcg gtgagcagtt 120
tcggccccgg cccggggcca agaacagatg gtcaccgcag tttcggcccc ggcccgaggc 180
caagaacaga tggtccccag atatggccca accctcagca gtttcttaag acccatcaga 240
tgtttccagg ctcccccaag gacctgaaat gaccctgcgc cttatttgaa ttaaccaatc 300
agcctgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgcttcccg agctctataa aagagctcac 360
aacccctcac tcggcgcgcc agtcctccga cagactgagt cgcccggggg atccgcggaa 420
ttcgccgcca ccatgtgcca tcagcaactc gtcatctcct ggttctccct tgtgttcctc 480
gcttcccctc tggtcgccat ttgggaactg aagaaggacg tctacgtggt cgagctggat 540
tggtacccgg acgcccctgg agaaatggtc gtgctgactt gcgatacgcc agaagaggac 600
ggcataacct ggaccctgga tcagagctcc gaggtgctcg gaagcggaaa gaccctgacc 660
attcaagtca aggagttcgg cgacgcgggc cagtacactt gccacaaggg tggcgaagtg 720
ctgtcccact ccctgctgct gctgcacaag aaagaggatg gaatctggtc cactgacatc 780
ctcaaggacc aaaaagaacc gaagaacaag accttcctcc gctgcgaagc caagaactac 840
agcggtcggt tcacctgttg gtggctgacg acaatctcca ccgacctgac tttctccgtg 900
aagtcgtcac ggggatcaag cgatcctcag ggcgtgacct gtggagccgc cactctgtcc 960
gccgagagag tcaggggaga caacaaggaa tatgagtact ccgtggaatg ccaggaggac 1020
agcgcctgcc ctgccgcgga agagtccctg cctatcgagg tcatggtcga tgccgtgcat 1080
aagctgaaat acgagaacta cacttcctcc ttctttatcc gcgacatcat caagcctgac 1140
ccccccaaga acttgcagct gaagccactc aagaactccc gccaagtgga agtgtcttgg 1200
gaatatccag acacttggag caccccgcac tcatacttct cgctcacttt ctgtgtgcaa 1260
gtgcagggaa agtccaaacg ggagaagaaa gaccgggtgt tcaccgacaa aacctccgcc 1320
actgtgattt gtcggaagaa cgcgtcaatc agcgtccggg cgcaggatag atactactcg 1380
tcctcctgga gcgaatgggc cagcgtgcct tgttccggtg gcggatcagg cggaggttca 1440
ggaggaggct ccggaggagg ttcccggaac ctccctgtgg caacccccga ccctggaatg 1500
ttcccgtgcc tacaccactc ccaaaacctc ctgagggctg tgtcgaacat gttgcagaag 1560
gcccgccaga cccttgagtt ctacccctgc acctcggaag aaattgatca cgaggacatc 1620
accaaggaca agacctcgac cgtggaagcc tgcctgccgc tggaactgac caagaacgaa 1680
tcgtgtctga actcccgcga gacaagcttt atcactaacg gcagctgcct ggcgtcgaga 1740
aagacctcat tcatgatggc gctctgtctt tcctcgatct acgaagatct gaagatgtat 1800
caggtcgagt tcaagaccat gaacgccaag ctgctcatgg acccgaagcg gcagatcttc 1860
ctggaccaga atatgctcgc cgtgattgat gaactgatgc aggccctgaa tttcaactcc 1920
gagactgtgc ctcaaaagtc cagcctggaa gaaccggact tctacaagac caagatcaag 1980
ctgtgcatcc tgttgcacgc tttccgcatt cgagccgtga ccattgaccg cgtgatgtcc 2040
tacctgaacg ccagtagacg gaaacgcgga agcggagagg gcagaggctc gctgcttaca 2100
tgcggggacg tggaagagaa ccccggtccg atggaacgca ttgtgatctg cctgatggtc 2160
atcttcctgg gcaccttagt gcacaagtcg agcagccagg gacaggacag gcacatgatt 2220
agaatgcgcc agctcatcga tatcgtggac cagttgaaga actacgtgaa cgacctggtg 2280
cccgagttcc tgccggcccc cgaagatgtg gaaaccaatt gcgaatggtc ggcattttcc 2340
tgctttcaaa aggcacagct caagtccgct aacaccggga acaacgaacg gatcatcaac 2400
gtgtccatca aaaagctgaa gcggaagcct ccctccacca acgccggacg gaggcagaag 2460
cataggctga cttgcccgtc atgcgactcc tacgagaaga agccgccgaa ggagttcctg 2520
gagcggttca agtcgctcct gcaaaagatg attcatcagc acctgtcctc ccggactcat 2580
gggtctgagg attcatga 2598
<210> 145
<211> 7213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 145
tgactcctgc gcagtccaaa aaaaaaggct ccaaaaggag cctttaattg tatcggtggg 60
cccttagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 120
aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 180
ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 240
acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 300
gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg 360
ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga 420
ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 480
cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg 540
atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc 600
atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca 660
gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag 720
aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc 780
gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg 840
cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt 900
tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca 960
tcagagattt tgagacacaa cgtggtttaa acaaatagtc aaaagcctcc ggcgactagt 1020
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 1080
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 1140
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 1200
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 1260
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 1320
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 1380
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 1440
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 1500
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1560
gagctggttt agtgaaccgg gtctctctgg ttagaccaga tttgagcctg ggagctctct 1620
ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 1680
gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 1740
gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag 1800
aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc 1860
ggcgactgca gagtacgcca aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg 1920
cgagagcgtc agtattaagc gggggaaaat agcggccgcc acaattttaa aagaaaaggg 1980
gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa 2040
actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaattt tcgggggatc cgtaacgcca 2100
ttttgcaagg catggaaaaa taccaaacca agaatagaga agttcagatc aagggcgggt 2160
acatgaaaat agctaacgtt gggccaaaca ggatatctgc ggtgagcagt ttcggccccg 2220
gcccggggcc aagaacagat ggtcaccgca gtttcggccc cggcccgagg ccaagaacag 2280
atggtcccca gatatggccc aaccctcagc agtttcttaa gacccatcag atgtttccag 2340
gctcccccaa ggacctgaaa tgaccctgcg ccttatttga attaaccaat cagcctgctt 2400
ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgcttccc gagctctata aaagagctca caacccctca 2460
ctcggcgcgc cagtcctccg acagactgag tcgcccgggg gatccgcgga attcgccgcc 2520
accatgtgcc atcagcaact cgtcatctcc tggttctccc ttgtgttcct cgcttcccct 2580
ctggtcgcca tttgggaact gaagaaggac gtctacgtgg tcgagctgga ttggtacccg 2640
gacgcccctg gagaaatggt cgtgctgact tgcgatacgc cagaagagga cggcataacc 2700
tggaccctgg atcagagctc cgaggtgctc ggaagcggaa agaccctgac cattcaagtc 2760
aaggagttcg gcgacgcggg ccagtacact tgccacaagg gtggcgaagt gctgtcccac 2820
tccctgctgc tgctgcacaa gaaagaggat ggaatctggt ccactgacat cctcaaggac 2880
caaaaagaac cgaagaacaa gaccttcctc cgctgcgaag ccaagaacta cagcggtcgg 2940
ttcacctgtt ggtggctgac gacaatctcc accgacctga ctttctccgt gaagtcgtca 3000
cggggatcaa gcgatcctca gggcgtgacc tgtggagccg ccactctgtc cgccgagaga 3060
gtcaggggag acaacaagga atatgagtac tccgtggaat gccaggagga cagcgcctgc 3120
cctgccgcgg aagagtccct gcctatcgag gtcatggtcg atgccgtgca taagctgaaa 3180
tacgagaact acacttcctc cttctttatc cgcgacatca tcaagcctga cccccccaag 3240
aacttgcagc tgaagccact caagaactcc cgccaagtgg aagtgtcttg ggaatatcca 3300
gacacttgga gcaccccgca ctcatacttc tcgctcactt tctgtgtgca agtgcaggga 3360
aagtccaaac gggagaagaa agaccgggtg ttcaccgaca aaacctccgc cactgtgatt 3420
tgtcggaaga acgcgtcaat cagcgtccgg gcgcaggata gatactactc gtcctcctgg 3480
agcgaatggg ccagcgtgcc ttgttccggt ggcggatcag gcggaggttc aggaggaggc 3540
tccggaggag gttcccggaa cctccctgtg gcaacccccg accctggaat gttcccgtgc 3600
ctacaccact cccaaaacct cctgagggct gtgtcgaaca tgttgcagaa ggcccgccag 3660
acccttgagt tctacccctg cacctcggaa gaaattgatc acgaggacat caccaaggac 3720
aagacctcga ccgtggaagc ctgcctgccg ctggaactga ccaagaacga atcgtgtctg 3780
aactcccgcg agacaagctt tatcactaac ggcagctgcc tggcgtcgag aaagacctca 3840
ttcatgatgg cgctctgtct ttcctcgatc tacgaagatc tgaagatgta tcaggtcgag 3900
ttcaagacca tgaacgccaa gctgctcatg gacccgaagc ggcagatctt cctggaccag 3960
aatatgctcg ccgtgattga tgaactgatg caggccctga atttcaactc cgagactgtg 4020
cctcaaaagt ccagcctgga agaaccggac ttctacaaga ccaagatcaa gctgtgcatc 4080
ctgttgcacg ctttccgcat tcgagccgtg accattgacc gcgtgatgtc ctacctgaac 4140
gccagtagac ggaaacgcgg aagcggagag ggcagaggct cgctgcttac atgcggggac 4200
gtggaagaga accccggtcc gatggaacgc attgtgatct gcctgatggt catcttcctg 4260
ggcaccttag tgcacaagtc gagcagccag ggacaggaca ggcacatgat tagaatgcgc 4320
cagctcatcg atatcgtgga ccagttgaag aactacgtga acgacctggt gcccgagttc 4380
ctgccggccc ccgaagatgt ggaaaccaat tgcgaatggt cggcattttc ctgctttcaa 4440
aaggcacagc tcaagtccgc taacaccggg aacaacgaac ggatcatcaa cgtgtccatc 4500
aaaaagctga agcggaagcc tccctccacc aacgccggac ggaggcagaa gcataggctg 4560
acttgcccgt catgcgactc ctacgagaag aagccgccga aggagttcct ggagcggttc 4620
aagtcgctcc tgcaaaagat gattcatcag cacctgtcct cccggactca tgggtctgag 4680
gattcatgag gttagtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 4740
gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 4800
atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 4860
tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 4920
ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 4980
ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 5040
gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 5100
cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 5160
gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 5220
tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 5280
cctccccgct tagtactggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt 5340
agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa 5400
gattccggaa tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa accggtgcag 5460
ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 5520
ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 5580
gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 5640
gtgtggaaaa tctctagcat ctagagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 5700
aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 5760
tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 5820
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 5880
gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggctag 5940
agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 6000
acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 6060
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 6120
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgct 6180
agccgggctt ttttttctta ggccttcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 6240
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 6300
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 6360
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 6420
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 6480
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 6540
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 6600
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 6660
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 6720
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 6780
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 6840
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 6900
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 6960
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 7020
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 7080
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 7140
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 7200
atccatagtt gcc 7213

Claims (16)

1.一种病毒，所述病毒被工程化成包含异源核酸，其中所述异源核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列，任选地其中所述病毒选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)，
任选地其中所述异源核酸包含DNA或RNA，
任选地其中所述多核苷酸序列包含启动子。
2.一种肿瘤细胞，所述肿瘤细胞被工程化用于产生两种或更多种效应分子，
任选地其中所述肿瘤细胞选自由以下组成的组：膀胱肿瘤细胞、脑肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、宫颈肿瘤细胞、结肠直肠肿瘤细胞、食管肿瘤细胞、胶质瘤细胞、肾脏肿瘤细胞、肝脏肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、皮肤肿瘤细胞、甲状腺肿瘤细胞和子宫肿瘤细胞，
任选地其中所述细胞如下进行工程化：
(a)经由用溶瘤病毒转导，任选地其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物，或
(b)经由用分离的核酸转染，任选地其中所述分离的核酸为包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种或多种效应分子的多核苷酸序列的cDNA、mRNA或裸质粒，
任选地其中所述两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码，
任选地其中所述多核苷酸序列包含启动子，
任选地其中所述多核苷酸序列还包含接头多核苷酸序列。
3.一种红血球或血小板细胞，所述红血球或血小板细胞被工程化用于产生两种或更多种效应分子。
4.一种细菌细胞，所述细菌细胞被工程化用于产生两种或更多种哺乳动物效应分子，
任选地其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：拜氏梭菌、生孢梭菌、诺氏梭菌、大肠埃希氏杆菌、绿脓杆菌、核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。
5.一种脂质结构递送系统，所述递送系统包括包含两种或更多种效应分子的基于脂质的结构，任选地其中所述两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码，或所述基于脂质的结构包括包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列的工程化核酸，
任选地其中所述工程化核酸为cDNA、mRNA或裸质粒，
任选地其中所述多核苷酸序列包含启动子。
6.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含两种或更多种效应分子，任选地其中所述两种或更多种效应分子由多核苷酸序列编码，或其中所述纳米颗粒包含工程化核酸，其中所述工程化核酸包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列，
任选地其中所述工程化核酸为cDNA、mRNA或裸质粒，
任选地其中所述多核苷酸序列包含启动子。
7.如权利要求1-6中任一项所述的病毒、工程化细胞、脂质结构或纳米颗粒，其中所述两种或更多种效应分子中的每一种包含分泌信号，并且其中所述两种或更多种效应分子中的每一种从如请求项2-4中任一项所述的工程化细胞或与如权利要求1所述的病毒、如权利要求5所述的脂质结构或如权利要求6所述的纳米颗粒接触的细胞分泌的。
8.如权利要求1-7中任一项所述的病毒、工程化细胞、脂质结构或纳米颗粒，其中存在所述启动子并且可操作地连接于所述多核苷酸序列，以使得所述两种或更多种效应分子能够转录为包含式(L-E)x的单一多核苷酸，
其中
L包含接头多核苷酸序列，
E包含编码所述两种或更多种效应分子中的一种效应分子的多核苷酸，
X＝2至20，并且
其中对于所述(L-E)单元的第一次迭代来说，L缺乏，
任选地其中所述接头多核苷酸序列与所述两种或更多种效应分子翻译为不同的多肽可操作地相关联。
9.如权利要求1-8中任一项所述的病毒、工程化细胞、脂质结构或纳米颗粒，其中第一效应分子选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶，并且其中第二效应分子独立地选自治疗类别，其中所述治疗类别选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、生长因子、共活化分子、肿瘤微环境调节剂、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶，
任选地其中所述第一效应分子和所述第二效应分子的所述治疗类别是不同的，
任选地其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL12、IL7、IL21、IL18、IL15、I型干扰素和干扰素-γ，
任选地其中所述趋化因子选自由以下组成的组：CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-11融合物、CCL19、CXCL9和XCL1，
任选地其中所述生长因子选自由以下组成的组：FLT3L和GM-CSF，
任选地其中所述共活化分子选自由以下组成的组：4-1BBL和CD40L，
任选地其中所述肿瘤微环境调节剂选自由以下组成的组：腺苷脱氨酶、TGFβ抑制剂、免疫检查点抑制剂、VEGF抑制剂和HPGE2，
任选地其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体和抗TREM2抗体。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-9中任一项所述的病毒、工程化细胞、脂质结构或纳米颗粒和药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂或它们的任何组合。
11.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的如权利要求1-9中任一项所述的病毒、工程化细胞、脂质结构或纳米颗粒，或如权利要求10所述的药物组合物。
12.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用包括如权利要求1-9中任一项所述的病毒、工程化细胞、脂质结构或纳米颗粒、或如权利要求10所述的药物组合物的组合物。
13.一种减小受试者中的肿瘤体积的方法，所述方法包括向具有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的组合物，其中所述组合物包含两种或更多种效应分子或其中所述组合物包括包含编码两种或更多种效应分子的多核苷酸序列的工程化核酸。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述施用包括一次或多次腹膜内注射或一次或多次肿瘤内注射，任选地其中所述施用包括全身施用。
15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含选自由以下组成的组的递送系统：病毒系统、转座子系统和核酸酶基因组编辑系统，
任选地其中所述病毒系统选自由以下组成的组：慢病毒、逆转录病毒、逆转录转座子、溶瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和病毒样颗粒(VLP)，
任选地其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤流感病毒、溶瘤印地安那州水疱病毒、溶瘤新城疫病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤脊髓灰质炎病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤腮腺炎病毒、溶瘤马拉巴病毒、溶瘤狂犬病病毒、溶瘤轮状病毒、溶瘤肝炎病毒、溶瘤风疹病毒、溶瘤登革病毒、溶瘤基孔肯雅病毒、溶瘤呼吸道合胞病毒、溶瘤淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤慢病毒、溶瘤复制型逆转录病毒、溶瘤棒状病毒、溶瘤塞内卡谷病毒、溶瘤辛德毕斯病毒以及它们的任何变体或衍生物，
任选地其中所述核酸酶基因组编辑系统选自由以下组成的组：锌指系统、TALEN系统和CRISPR系统。
16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述组合物包含：
(a)红血球或血小板细胞；
(b)包含基于脂质的结构的脂质结构递送系统，任选地其中所述基于脂质的结构选自由以下组成的组：细胞外囊泡、脂质纳米颗粒、胶束、纳米泡囊、外泌体和脂质体；或
(c)纳米颗粒，任选地其中所述纳米颗粒包含无机材料，任选地其中所述纳米颗粒封装所述工程化核酸或封装所述两种或更多种效应分子。
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