CN118496326A - 抗痤疮的重组蛋白疫苗及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及抗痤疮的重组蛋白疫苗及制备方法和应用。为了解决目前痤疮疾病仍缺乏有效预防和治疗药物的问题，本发明提供了针对痤疮丙酸杆菌CAMP毒力因子为靶点的重组蛋白疫苗，其主要是通过诱导体内产生抗体等免疫反应，中和CAMP毒力因子，抑制痤疮丙酸杆菌导致的皮肤炎症反应，对痤疮发生能够起到预防和治疗效果。

Description

抗痤疮的重组蛋白疫苗及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及抗痤疮的重组蛋白疫苗及制备方法和应用。

背景技术

痤疮是世界上第八大流行病，影响全球超过6.4亿人。根据《2019版中国痤疮治疗指南》显示，我国人群截面统计痤疮发病率为81％，但有超过95％的人会不同程度发生痤疮。痤疮的发作通常与青春期荷尔蒙变化同时发生，并且该病症影响大约85％的12至25岁的青少年和年轻人。痤疮也可以持续到成年期或在成年期发展。痤疮病变和/或疤痕可能在成人中持续存在。尽管痤疮不是一种危及生命的疾病，但痤疮的心理负担可能很高且被低估了。最近的一项研究表明，痤疮会对90％的患者的生活质量产生负面影响。值得注意的是，超过一半的痤疮患者表现出严重的情绪障碍，包括焦虑，这是最普遍的症状。抑郁和明显的情绪困扰，。痤疮患者，尤其是最严重的痤疮患者，需要有效和安全的治疗。

目前对痤疮发病机制的理解在不断发展中，研究发现痤疮的发病也可能受到家族遗传、饮食、压力以及环境等其它因素影响。作为一种影响皮肤毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病，发挥重要作用的关键致病因素包括毛囊皮脂腺导管异常角化、皮脂腺活动紊乱、微生物异常定植、激素微环境失调以及先天性免疫与适应性免疫功能障碍等多种因素之间错综复杂的相互作用，而痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acne，C.acnes)作为世界公认的寻常痤疮机会性病原体受到科学家的广泛关注，其和皮肤微生物群之间的紧密平衡在痤疮发展过程中起关键作用。但目前临床上用于痤疮治疗的抗生素无法特异地针对该靶标微生物，如果我们针对C.acnes这一导致痤疮发生的病原菌研发更具针对性和靶向性的治疗药物或方案，将会为痤疮的临床治疗提供有价值的候选治疗手段。

痤疮丙酸杆菌是一种生长相对缓慢的厌氧嗜脂性革兰氏阳性细菌。健康成人皮肤中，C.acnes定植于面部和上半身的毛囊皮脂腺，它们主要生活在毛囊和毛孔深处，利用周围皮肤组织的皮脂、细胞碎片和代谢副产物作为其能量和营养的主要来源。在正常情况下，C.acnes和皮肤细胞“和谐共处”，但是当毛囊中的皮脂腺过度活跃(皮脂腺增生)或毛囊堵塞导致皮脂分泌增多时，可导致痤疮丙酸杆菌过度生长和繁殖。痤疮丙酸杆菌能够产生可与宿主相互作用的分泌型或表面附着因子，例如具有溶血活性的Christie-Atkins-MunchPetersen(CAMP)因子，具有纤维蛋白原结合活性的硫酸皮肤素结合粘附素(DsA)，具有促炎潜力的卟啉，短链脂肪酸和宿主组织成分降解酶(如脂肪酶、唾液酸酶和透明质酸酶)。总之，痤疮丙酸杆菌在皮肤的过度繁殖产生痤疮丙酸杆菌毒力因子、蛋白酶以及粘附分子等导致宿主免疫炎症反应是导致痤疮发生的重要原因。

根据寻常型痤疮基层治疗指南(2023年)，目前痤疮治疗方式主要为外用药物治疗、系统性药物治疗以及物理化学治疗等。外用药物治疗主要为维A酸类药物及抗氧化剂，可以杀灭痤疮丙酸杆菌、改善毛囊皮脂腺导管角化，溶解微粉刺和粉刺等，但外用药局部使用，难以全面覆盖痤疮发病部位。口服药物治疗主要为抗菌药物以及激素类药物，针对痤疮丙酸杆菌及炎症反应选择具有抗菌和抗炎作用的抗菌药物进行治疗，可能产生耐药问题。维A酸也可以口服使用，应仅限于严重痤疮的病例。有报告称，异维A酸治疗完成后六个月自杀风险增加。激素类药物口服不能长期大剂量使用，会诱导药物性痤疮及其他不良反应。物理与化学治疗主要采用光动力与红蓝光、激光与强脉冲光、射频、化学剥脱治疗，也可能会对其他正常皮肤有物理或化学损伤。因此，痤疮治疗仍需要更好的治疗手段。

CAMP因子与痤疮丙酸杆菌相关的痤疮发病机制具有密切的相关性。当痤疮丙酸杆菌CAMP 2基因敲除后，可显著地降低痤疮丙酸杆菌的定植，减少痤疮小鼠模型局部免疫细胞浸润以及皮损组织中炎症细胞因子的表达水平，以此确定了CAMP2是痤疮治疗重要的候选靶点。如果能针对痤疮丙酸杆这一重要组分设计疫苗，可以突破现有临床治疗手段的局限性，降低痤疮发病的严重程度，降低炎症因子产生，减少瘢痕发生的概率，

发明内容

痤疮丙酸杆菌是一种厌氧菌，原本和皮肤细胞“和谐共处”。但是由于面部油脂分泌过多，堵塞毛囊，造成了一个厌氧环境，痤疮丙酸杆菌大量繁殖，进而分泌的一种毒力因子Christie-Atkins-Munch-Peterson因子(CAMP因子)。

为了解决痤疮疾病缺乏有效预防和治疗药物的问题，本发明提供了针对痤疮丙酸杆菌CAMP毒力因子为靶点的重组蛋白疫苗，其主要是通过诱导体内产生抗体等免疫反应，中和CAMP毒力因子，抑制皮肤炎症反应，对痤疮能够起到预防和治疗效果。

为此，本发明的目的在于提供预防和/或治疗痤疮的蛋白：其为痤疮丙酸杆菌CAMP野生型蛋白或其突变体。本发明的另一目的在于提供含有所述的蛋白用于预防和/或治疗痤疮杆菌感染的疫苗。

为了实现上述目的，本发明首先提供预防和/或治疗痤疮的蛋白，其是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示痤疮丙酸杆菌CAMP野生型蛋白(CAMP factor 2)；

或与SEQ ID No.1具有同源性且相同或相似的生物学活性的蛋白变体。

优选地，所述蛋白变体是与SEQ ID No.1具有至少70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99％以上同源性且相同或相似的生物学活性。

更优选地，所述蛋白变体是在SEQ ID No.1上包含至少一个如下的突变：

(a)第82位为甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(b)第153位为甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)；

(c)第154位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(d)第158位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(e)第160位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(f)第161位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)。

最优选地，所述蛋白变体的氨基酸序列是将痤疮丙酸杆菌的CAMP factor 2蛋白的第82位的甲硫氨酸(M)突变为甘氨酸(G)，所述蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

其中，编码所述痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了上述预防和/或治疗痤疮的蛋白前体，其是在所述预防和/或治疗痤疮的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签；优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

其中，在所述预防和/或治疗痤疮的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区；优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

本发明还提供了上述蛋白或蛋白前体在制备预防和/或治疗痤疮或痤疮丙酸杆菌引起或引发的药物中的用途。优选地，所述痤疮是由痤疮丙酸杆菌感染引起。

本发明还提供预防和/或治疗的重组蛋白疫苗，其含有所述痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白或蛋白前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

其中，所述的辅助性成分为免疫佐剂。优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A(MPL)、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、含角鲨烯水包油乳剂(MF59)、重组霍乱毒素(rCTB)、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列，人工合成的CpG)、TLR3(Toll-like receptors 3ligand)。

其中，所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种。

其中，所述的钙盐为磷酸三钙。

其中，所述的植物皂苷为QS-21或ISCOM。

其中，所述的植物多糖为黄芪多糖(APS)。

其中，所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

其中，所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、阳离子胆固醇(DC-Chol)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)。

优选地，所述免疫佐剂选自氢氧化铝佐剂或WGa01佐剂中至少一种。

其中，所述的疫苗的剂型为皮内或皮下注射制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂、口服或鼻腔吸入制剂。

优选地，所述的疫苗剂型为肌肉注射制剂。

本发明还提供上述疫苗在制备预防和/或治疗痤疮丙酸杆菌感染引起的感染性疾病的药物中的用途。

本发明还提供了多核苷酸，其编码所述蛋白或蛋白前体。

进一步地，所述多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中至少一种。

本发明还提供了重组载体，其含有所述多核苷酸。

进一步地，所述重组载体包括大肠杆菌表达载体、昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、酵母表达载体中至少一种。

优选地，所述大肠杆菌表达载体为pET-30a。

优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1。

优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。

进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

本发明提供了宿主细胞，它含有所述的重组载体。

进一步地，所述的宿主细胞采用大肠杆菌细胞。

本发明还提供预防和/或治疗痤疮的蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含有所述痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白或蛋白变体的重组载体，转化宿主细胞，表达出所述蛋白、纯化，即可。

优选地，所述制备方法中，是将痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白或蛋白变体基因插入pET-30a(+)载体，构建成表达重组质粒。

优选地，所述制备方法中，采用原核表达系统。更优选地，采用大肠杆菌表达。

优选地，所述制备方法中，诱导表达蛋白的诱导剂为异丙基-β-D硫代半乳糖苷、蔗糖、半乳糖。更优选地，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。

优选地，所述制备方法中，采用超滤膜和离子交换工艺纯化获得目的蛋白。

有益效果：本发明利用原核表达系统，在大肠杆菌中表达可溶性痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白。经非还原型电泳和反相高效液相分析，纯度达到95％以上；电泳分析CAMP蛋白25.3kDa与理论分子量一致。本发明将纯化获得的CAMP蛋白与佐剂共同免疫，制备的重组蛋白疫苗，具有非常高的抗原性，能很好的对抗痤疮丙酸杆菌的引发炎症。还能用于治疗或预防痤疮丙酸杆菌所引起的炎症，且该疫苗能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，预防痤疮丙酸杆菌引起的痤疮症状。本发明的重组蛋白疫苗的制备方法简单，质量易于控制，易于规模化生产，是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。

附图说明

图1为实施例1痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白制备过程中SDS-PAGE电泳图。

图2为实施例1痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白SDS-PAGE电泳检测分子量图谱(A图为CAMP蛋白分子量检测图；B图为非还原型SDS-PAGE电泳纯度，C图为反相高效液相色谱分析痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白的图谱)。

图3为实施例2CAMP蛋白突变前后的蛋白疏水性及溶血活性比较结果图。

图4为实施例5高中低量痤疮丙酸杆菌建立小鼠痤疮模型图。

图5为实施例6NIH小鼠接种CAMP重组蛋白疫苗的免疫原性长期实验结合抗体滴度的趋势图。

图6为实施例7CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌感染的预防性实验结合抗体滴度和HE评分结果图。

图7为实施例8CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌感染的治疗性实验痤疮直径测量、表观评分图。

图8为实施例8CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌感染的治疗性实验痤疮病灶表观与组织病理图以及病理HE评分结果图。

图9为实施例9野生型CAMP和CAMP重组蛋白疫苗预防性给药结果图。

具体实施方式

痤疮丙酸杆菌CAMP因子是一种分泌蛋白和成孔毒素，参与来自其他细菌(如金黄色葡萄球菌或宿主细菌)的酸性鞘磷脂酶(ASMase)的共溶血活性。当与金黄色葡萄球菌的溶血素一起作用时，痤疮丙酸杆菌CAMP 2因子也会增强溶血和细胞溶解活性。CAMP 2因子对HaCaT角质形成细胞和RAW264.7巨噬细胞中有较强细胞毒性，其可诱导皮脂腺中皮脂腺细胞死亡并引发炎症。用CAMP因子给小鼠接种疫苗可显著减少痤疮丙酸杆菌的生长和MIP-2的产生。痤疮丙酸杆菌CAMP因子和两种促炎因子(IL-8和IL-1β)在痤疮病灶中的表达水平高于正常皮肤。痤疮丙酸杆菌CAMP因子是痤疮炎症的重要来源。

也就是说，CAMP因子是具有细胞毒性的分泌蛋白，主要作用于角质形成细胞和巨噬细胞，是促进炎症反应的重要因子。痤疮丙酸杆菌CAMP因子能够与免疫球蛋白G和M类结合并充当成孔毒素。研究表明，CAMP因子与鞘磷脂酶发挥共溶血活性，可赋予角质形成细胞和巨噬细胞细胞毒性，通过降解和入侵宿主细胞增强毒力。此外，痤疮丙酸杆菌CAMP因子可诱导细胞死亡皮脂腺并引发炎症。此外，也有研究已经表明痤疮丙酸杆菌靶向皮肤细胞，即角质形成细胞和巨噬细胞等吞噬细胞，刺激细胞产生促炎细胞因子，包括IL-8、IL-1β、IL-12和肿瘤坏死因子-α，导致寻常痤疮的炎症。

因此，本发明设计了一种针对痤疮的重组蛋白疫苗及其制备方法和应用，痤疮重组蛋白疫苗是痤疮丙酸杆菌的CAMP factor 2蛋白或蛋白变体与复合佐剂配制而成。

本发明利用原核表达载体，在大肠杆菌中表达重组蛋白，菌体经破碎后可溶性表达在破菌上清中。根据原核表达系统和重组蛋白的理化特性，高压破碎菌体后，获取上清进行超滤，后经阴阳离子交换层析获得目的蛋白。将纯化获得的CAMP蛋白与佐剂共同免疫。

具体实施方式为：申请人合成痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白或蛋白变体的基因序列；并构建到pET-30a(+)l载体上。转入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性单克隆，扩大培养，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，收集菌体后进行高压破碎，目的蛋白在破菌上清中，通过超滤去除杂质、进行阴阳离子交换层析，获得高纯度的目的蛋白。进行蛋白质表征及含量测定、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了痤疮基因工程重组亚单位疫苗。其中，选择重组蛋白为痤疮丙酸杆菌的CAMP factor 2蛋白(NCBI ReferenceSequence:WP_002518322.1)作为优化的基础，为了提高蛋白的表达效率，申请人去除信号肽区，选择成熟肽段(29-267)作为抗原。

在本发明一些实施例方式中，与SEQ ID NO：2具有60％以上序列同一性且具有所述多核苷酸的功能的多核苷酸也在本发明的保护范围内容，具体地，其他具有同一性的多核苷酸包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸的功能的多核苷酸。或者，其他具有同一性的多核苷酸可以是与SEQ ID NO：2具有70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99％以上的序列同一性的多核苷酸。

在本发明一些实施例方式中，与SEQ ID NO：1具有60％以上序列同一性且具有所述氨基酸的功能的氨基酸也在本发明的保护范围内容，具体地，其他具有同一性的氨基酸包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸的功能的氨基酸。或者，其他具有同一性的氨基酸可以是与SEQ ID No.2具有70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99％以上的序列同一性的氨基酸。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白变体是在SEQ ID No.1上包含至少一个如下的突变：

(a)第82位为甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(b)第153位为甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)；

(c)第154位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(d)第158位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(e)第160位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(f)第161位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)。

在本发明最优选地实施方式中，在SEQ ID NO：1进行人工改造即由第82位的甲硫氨酸突变为甘氨酸，以改造后的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示为基础而设计出的基因及载体将能实现更高的抗原表达量及降低绵羊红细胞溶血活性。

所述野生型痤疮丙酸杆菌的CAMP factor 2蛋白29-267位氨基酸序列如SEQ IDNO：1。

SEQ ID NO：1

MVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA

编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：2

ATGGTTGAACCGACCACCACCATCAGCGCGACCAGCACCCACGAACTGAGCGCGAGCGACGCGCGTAACAGCATCCAGCTGCTGAACGCGCACATCGCGACCCTGCAGAGCGTTCAGAAATCCGTTCCGGGCAGCGATTACTCCGACCAGATCCGTGACCTGCTGAAAGCGGCGTTCGACCTGCGTGGTCTGATCGAAACCCTGGCGCACGGTGGCATCCCGTTCTACGACCCGTCCACCATCGGCCCGCGTATCAAACTGGTGGCGACCACCATCGATACCATCCACACCGCGACCACCACCCTGCAGAACAAAGTGCGTCCGGCGCACGTGGAACTGGGTCTGGAAGTGACCAAAGCGGTGCTGCTGACCGCGAACCCGGCGTCCACCGCGAAAGAACTGGACGCGGAAGGTGCGGCGCTGAAAGCGCGCCTGGAAAAAGTTAGCCAGTACCCGGATCTGACCCCGAACGATGTTGCGACCGTTTACGTTCGTACCAACTTCTCTAAAACCATCTGGCAGGTTCGTGCTAACCGTGATCGTTACATCCTGGGCCACAAATCTGCGGCGGTGTACAAAACCCTGAACCACGCGATCACCAAAGCGGTTGGTGTTCGCCTGAACCCGAAAACCACCGTGGGTAACATCCAGGCGGCGCGTACCGAACTGCTGGCGGCGTACCAGACCGCGTTCAACTCTCCGGATGTTAAAAAAGCGGCGTAA

CAMP蛋白(突变蛋白)序列如SEQ ID NO：3所示：

MVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIGPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA

编码SEQ ID NO：3的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

ATGGTTGAACCGACCACCACCATCAGCGCGACCAGCACCCACGAACTGAGCGCGAGCGACGCGCGTAACAGCATCCAGCTGCTGAACGCGCACATCGCGACCCTGCAGAGCGTTCAGAAATCCGTTCCGGGCAGCGATTACTCCGACCAGATCCGTGACCTGCTGAAAGCGGCGTTCGACCTGCGTGGTCTGATCGAAACCCTGGCGCACGGTGGCATCCCGTTCTACGACCCGTCCACCATCGGCCCGCGTATCAAACTGGTGGCGACCACCATCGATACCATCCACACCGCGACCACCACCCTGCAGAACAAAGTGCGTCCGGCGCACGTGGAACTGGGTCTGGAAGTGACCAAAGCGGTGCTGCTGACCGCGAACCCGGCGTCCACCGCGAAAGAACTGGACGCGGAAGGTGCGGCGCTGAAAGCGCGCCTGGAAAAAGTTAGCCAGTACCCGGATCTGACCCCGAACGATGTTGCGACCGTTTACGTTCGTACCAACTTCTCTAAAACCATCTGGCAGGTTCGTGCTAACCGTGATCGTTACATCCTGGGCCACAAATCTGCGGCGGTGTACAAAACCCTGAACCACGCGATCACCAAAGCGGTTGGTGTTCGCCTGAACCCGAAAACCACCGTGGGTAACATCCAGGCGGCGCGTACCGAACTGCTGGCGGCGTACCAGACCGCGTTCAACTCTCCGGATGTTAAAAAAGCGGCGTAA

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白的制备

通过NCBI数据库和文献检索，选择了重组蛋白为痤疮丙酸杆菌的CAMP factor 2蛋白(NCBI Reference Sequence:WP_002518322.1)作为优化的基础，为了提高蛋白的表达效率我们去除信号肽区，选择成熟肽段(29-267)做为抗原，在成熟肽段起始处添加起始密码子甲硫氨酸(M)，并进行人工改造即由第82位的甲硫氨酸(M)突变为甘氨酸(G)，以改造后的氨基酸序列为基础而设计出的基因及载体将能实现更高的抗原表达量及降低绵羊红细胞溶血活性。

该突变后的蛋白(CAMP蛋白)序列全长240个氨基酸SEQ ID NO：3

MVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIGPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA

其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：4：

ATGGTTGAACCGACCACCACCATCAGCGCGACCAGCACCCACGAACTGAGCGCGAGCGACGCGCGTAACAGCATCCAGCTGCTGAACGCGCACATCGCGACCCTGCAGAGCGTTCAGAAATCCGTTCCGGGCAGCGATTACTCCGACCAGATCCGTGACCTGCTGAAAGCGGCGTTCGACCTGCGTGGTCTGATCGAAACCCTGGCGCACGGTGGCATCCCGTTCTACGACCCGTCCACCATCGGCCCGCGTATCAAACTGGTGGCGACCACCATCGATACCATCCACACCGCGACCACCACCCTGCAGAACAAAGTGCGTCCGGCGCACGTGGAACTGGGTCTGGAAGTGACCAAAGCGGTGCTGCTGACCGCGAACCCGGCGTCCACCGCGAAAGAACTGGACGCGGAAGGTGCGGCGCTGAAAGCGCGCCTGGAAAAAGTTAGCCAGTACCCGGATCTGACCCCGAACGATGTTGCGACCGTTTACGTTCGTACCAACTTCTCTAAAACCATCTGGCAGGTTCGTGCTAACCGTGATCGTTACATCCTGGGCCACAAATCTGCGGCGGTGTACAAAACCCTGAACCACGCGATCACCAAAGCGGTTGGTGTTCGCCTGAACCCGAAAACCACCGTGGGTAACATCCAGGCGGCGCGTACCGAACTGCTGGCGGCGTACCAGACCGCGTTCAACTCTCCGGATGTTAAAAAAGCGGCGTAA

将CAMP蛋白基因(酶切位点为NdeI/XhoI)，构建到pET-30a(+)载体上；构建成pET-30a-CAMP质粒。质粒酶切验证并用自动测序仪测序，验证载体构建成功后，转化E.coli BL2(DE3)感受态细胞中。阳性菌体经培养后加入诱导剂IPTG进行诱导表达，通过离心收集培养物，收集湿菌体。按湿菌体/缓冲液(20mM PB，pH7.5)1：10体积比例将菌体重悬，进行超声破碎或高压破碎。破碎细胞后，进行离心或膜过滤收集上清。上清液截留分子量为100-300kDa的超滤膜进行超滤，再用阴离子交换层析进行粗纯，最后用阳离子交换进一步精纯。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析其分子量和纯度，用反向高效液相色谱法(R-HPLC)分析纯度。

通过基因克隆构建的表达载体，表达并纯化目的蛋白，获得高稳定性表达产量高CAMP蛋白，且纯化过程中目的蛋白在每一步纯化过程纯度都能提高，且蛋白比较稳定(见图1：M：蛋白分子量(货号：26614，Thermo Scientific^TM)；泳道1：菌体诱导前；泳道2：菌体诱导后；泳道3：菌体破菌上清；泳道4：300kDa超滤透过液；泳道5：阴离子层析流穿样品；泳道6：阳离子层析洗脱收集样品)。

经还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测，计算目的蛋白相对分子量为25300道尔顿与理论分子量基本一致(图2A)；图2B-C分别用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶和反向高效液相色谱法(R-HPLC)液相检测CAMP蛋白纯度，结果显示纯度大于95％。

其中，野生型CAMP蛋白的制备方法与CAMP蛋白一样，只是构建到pET-30a(+)载体上的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白的溶血活性

将购买的新鲜羊血4℃1000g离心5min，收集红细胞，用(0.01mol/L Na₃PO₄，0.015mol/L NaCl，pH 7.0，PBS)洗涤绵羊红细胞3次，每次4℃1000g离心5min去上清。取1ml绵羊红细胞用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L Na₃PO₄，0.015mol/L NaCl，pH 7.0，PBS)反复洗3次，每次4℃1000g离心5min去上清。最后用PBS配制2％(V/V)的红细胞悬液，用终浓度为50mU/ml的神经磷脂酶预处理30min。随后将CAMP蛋白和野生型CAMP蛋白稀释至不同浓度。将2％绵羊红细胞悬液与稀释好的蛋白溶液等体积混合(200μl反应体系)，37℃温育1h后置于4℃1h，低速离心后取上清100μl，酶标仪测定其在波长405nm的光密度值，计算溶血率。结果显示CAMP溶血率降低，与突变前的溶血率具有明显统计学差异(图3B)。图3A为CAMP蛋白与野生型CAMP蛋白的结构模拟图，结果显示；相比野生型，CAMP蛋白的N端区域的疏水性降低。蓝色代表疏水性，蓝色区域越大表示疏水性越强。

实施例3针对痤疮的重组蛋白疫苗制备

将纯化后的CAMP蛋白用紫外分光光度计检测蛋白浓度，用PBS稀释至0.5mg/mL，无菌过滤，备用；按现行《中国药典》进行无菌检验，用凝胶法进行内毒素检测，内毒素含量不高于10EU/mL方可使用；将CAMP蛋白与佐剂充分混合/吸附。

氢氧化铝佐剂疫苗配制：磷酸盐缓冲液(10mM PB，PH 7.0)：磷酸氢二钠0.866g，一水磷酸二氢钠0.538g，溶于800mL超纯水，待完全溶解后，定容至1L。用0.22μm滤膜过滤。将磷酸盐缓冲液加入到氢氧化铝佐剂，配制成铝含量为0.84mg/mL，室温下搅拌10分钟。抗原稀释：将蛋白原液用磷酸盐缓冲液稀释到500μg/mL。配制的疫苗铝含量为0.42mg/mL，抗原含量250μg/mL，定容后室温搅拌1小时，即得与氢氧化铝佐剂组的疫苗。

WGa01佐剂疫苗的配制：将蛋白原液用20mM PB，250mM氯化钠，pH7.5，稀释到500μg/mL。WGa01佐剂与抗原溶液(500μg/ml)等体积混合，即得与WGa01佐剂疫苗。

实施例4痤疮丙酸杆菌培养

痤疮丙酸杆菌购买自BNCC，操作参考说明书。硫乙醇酸盐液体培养基和平板放入厌氧培养箱除氧24小时。吸取约0.5mL液体培养基打入冻存管，充分溶解后加入含10mL培养基试管中，混匀。吸取0.2mL菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板。3天后，平板上挑取单克隆放入100mL液体培养基中37℃，厌氧培养，菌落形态观察正常，待菌液浑浊直到生长对数期。

实施例5痤疮丙酸杆菌建立小鼠痤疮模型

将培养好的痤疮丙酸杆菌倒入离心管中，3000g离心5分钟，弃上清，加入脱氧PBS洗涤2次，重悬于脱氧PBS中，分布以低、中、高剂量分1*10⁸细胞/mL、5*10⁸细胞/mL、1*10⁹细胞/mL数目的痤疮丙酸杆菌活细菌细胞制备悬液。参考非专利文献Photochem PhotobiolSci.2006Jan；5(1):66-72，基于以下假定来计算痤疮丙酸杆菌的活细菌细胞数：分光光度计在550nm处测量的0.98-1.02的OD测量值对应于5*10⁸细胞/mL。将50μL细菌悬液皮内注射到雄性ICR小鼠腹部皮肤内，第7天进行动物解剖，皮肤组织固定在4％多聚甲醛中，制备石蜡切片。

石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→75％酒5min梯度脱蜡→水洗。苏木素染色：切片入苏木素染3-5min，自来水洗净多余染液，1％盐酸水溶液分化数秒，自来水漂洗，然后0.6％-0.7％氨水水溶液返蓝，流水冲洗数秒。伊红染色：石蜡切片梯度酒精(85％乙醇→95％乙醇)脱水，放入伊红染液中染色5min。脱水封片：石蜡切片依次放入无水乙醇I 5min→无水乙醇II5min→无水乙醇Ⅲ5min→正丁醇5min→二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。切片判读：细胞核为蓝色，细胞质为红色。

结果显示在注射高中低剂量后痤疮丙酸杆菌后，均可见局部表皮增厚，出现角化过度，棘细胞层肥厚；毛囊皮脂腺增大明显，可见角化物质，毛囊漏斗部充满角化物质并扩大成壶状；真皮上层毛细血管明显扩张，有炎性细胞浸润，皮下组织水肿；真皮层有脓肿形成，脓肿周围血管扩张、充血、有大量的炎细胞浸润(见图4)。

实施例6CAMP重组蛋白疫苗能够在NIH小鼠体内诱导长期免疫

选用6周龄NIH小鼠，分别使用WGa01佐剂和氢氧化铝佐剂，按照实施例3进行CAMP蛋白疫苗配制，通过小鼠大腿肌肉进行三针免疫注射，分别在7、21、35、90、180天小鼠眼眶后静脉丛采血或摘除眼球采血，不抗凝，室温放置1-2h后，4℃1800g离心10min分离血清，保存于-20℃备用，实验程序步骤如图5所示。结合抗体滴度检测：将抗原用包被液(50mm碳酸盐包被液)稀释成浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板，覆膜，2～8℃包被过夜；洗板：洗涤液(0.05％PBST)洗板3次，300μL/孔，去除残留液体；封闭：加入封闭液(1％BSA PBST配)，100μL/孔，覆膜，37℃孵育1h；样本稀释：用1％BSA将各样按照相应倍数进行稀释后加样；洗板：洗涤液(0.05％PBST)洗板1次，300μL/孔，去除残留液体；加样：将各质控及样本以100μL/孔加入酶标板，覆膜，37℃孵育1h；洗板：洗涤液(0.05％PBST)洗板3次，300μL/孔，去除残留液体；加检测试剂：将Goat anti-mouse-IgG Secondary Antibody HRP用1％BSA稀释10000倍作为检测试剂，100μL/孔，加入酶标板，覆膜，37℃孵育1h；洗板：洗涤液(0.05％PBST)洗板5次，300μL/孔，去除残留液体；显色：加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光显色5-10min；终止：加入终止液，100μL/孔，终止反应；读板：酶标仪设置检测波长450nm(参比波长630nm)读取OD值。

结果如图5A所示：在使用Al(OH)₃佐剂时，首次免疫21天后，1μg、5μg、10μg、25μg剂量组小鼠体内血清特异性结合抗体水平均急速上升，并在第35天达到顶峰。第90天和第180天特异性结合抗体仍处于较高水平。

结果如图5B所示：在使用WGa01佐剂时，CAMP重组蛋白在1μg、5μg、10μg、25μg剂量组小鼠中首次免疫后第7天均有特异性结合抗体产生。首次免疫21天后，各剂量组小鼠体内血清特异性结合抗体水平均急速上升，并在第35天达到顶峰。首次免疫90天后抗体水平有无统计学意义的下降，但仍处于较高水平。第180天特异性结合抗体依然处于较高水平。

结论：NIH小鼠对CAMP重组蛋白疫苗敏感，在小鼠体内具有良好的免疫原性，能诱导产生较强的功能性免疫抗体，通过肌肉注射重组蛋白CAMP疫苗能够在NIH小鼠体内诱导长期免疫超过180天。

实施例7CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌感染的预防作用

选用6周龄ICR小鼠，使用WGa01佐剂按照实施例3进行疫苗配制，通过小鼠大腿肌肉进行三针免疫注射，在末次免疫后14天小鼠眼眶后静脉丛采血不抗凝，室温放置1-2h后，4℃1800g离心10min分离血清，保存于-20℃备用。结合抗体滴度检测方法同实施例6。采血后一周，将50μL细菌悬液(5*10⁸细胞/mL)皮内注射到雄性ICR小鼠腹部皮肤内，7日后解剖小鼠皮肤组织固定在4％多聚甲醛中，进行后续HE染色实验，方法同实施例5。

结果如图6所示：通过小鼠大腿肌肉进行两针免疫后，ICR小鼠血清检测到CAMP特异性结合抗体滴度在1μg、5μg、25μg剂量组均处于较高水平(图6A)。与模型组相比，低中高三个剂量组显著降低炎症水平(P＜0.001)，差异具有统计学意义(图6B)。CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌引起的炎症具有良好的抗炎作用，能够对皮肤起到一定的保护作用

实施例8CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌感染的治疗作用

选用6周龄ICR小鼠，在0、14、28、42天，将50μL细菌悬液(5*10⁸细胞/mL)皮内注射到雄性ICR小鼠腹部皮肤内。分别使用氢氧化铝和WGa01佐剂，按照实施例3进行疫苗配制，在0、21、42天通过小鼠大腿肌肉进行三针免疫注射。分别在第2、4、6、8周进行痤疮病灶直径测量与表观评分。在第56天解剖小鼠，将小鼠皮肤组织固定在4％多聚甲醛中，进行后续HE染色实验，方法同实施例5。

结果如图7所示：第6周，与模型组相比，阳性药物组(阳性药物为奥络夫西地酸乳膏和丽芙维A酸乳膏，联合用药，每日涂抹)、10μg CAMP蛋白(氢氧化铝佐剂与WGa01佐剂疫苗组)痤疮病灶直径均显著减小，表观评分显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在第8周，与模型组相比，阳性药物组、5、10μg氢氧化铝佐剂重组蛋白疫苗组与10μg WGa01佐剂重组蛋白疫苗组痤疮病灶直径显著减小，表观评分显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图7)。

与模型组相比，阳性药物组、各剂量氢氧化铝佐剂重组蛋白疫苗组与10μgWGa01佐剂重组蛋白疫苗组组织病理学评分显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.0001)(图8)

实施例9CAMP和野生型CAMP重组蛋白疫苗对痤疮丙酸杆菌感染具有抗炎作用

选用6周龄ICR小鼠，分别使用WGa01佐剂和氢氧化铝佐剂，按照实施例3进行疫苗配制，通过小鼠大腿肌肉进行三针免疫注射，注射剂量是10μg/只。免疫完成后，将50μL细菌悬液(5*10⁸细胞/mL)皮内注射到雄性ICR小鼠腹部皮肤内。7日后解剖摘除眼球取血，室温放置1-2h后，4℃1800g离心10min分离血清，结合抗体滴度检测方法同实施例6。小鼠皮肤组织固定在4％多聚甲醛中，进行后续HE染色实验，方法同实施例5。

结果如图9所示：在WGa01佐剂或氢氧化铝佐剂中，CAMP和野生型CAMP重组蛋白疫苗的特异性结合抗体滴度均处于较高水平(图9A)。与模型组相比，使用WGa01佐剂与氢氧化铝佐剂，CAMP和野生型CAMP重组蛋白疫苗均能显著降低痤疮丙酸杆菌感染引起的炎症水平(P<0.05)，差异具有统计学意义(图9B)。

Claims (19)

1.预防和/或治疗痤疮的蛋白，其特征在于：其是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的痤疮丙酸杆菌CAMP野生型蛋白；

或与SEQ ID No.1具有同源性且相同或相似的生物学活性的CAMP蛋白变体。

2.根据权利要求1所述的预防和/或治疗痤疮的蛋白，其特征在于：蛋白变体是与SEQIDNo.1具有至少70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99％以上同源性且相同或相似的生物学活性。

3.根据权利要求1所述的预防和/或治疗痤疮的蛋白，其特征在于：所述蛋白变体是在SEQ ID No.1上包含至少一个如下的突变：

(a)第82位为甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(b)第153位为甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)；

(c)第154位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(d)第158位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(e)第160位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)；

(f)第161位为甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)。

4.根据权利要求3所述的预防和/或治疗痤疮的蛋白，其特征在于：所述蛋白变体的氨基酸序列是将痤疮丙酸杆菌CAMP factor 2野生型蛋白的第82位的甲硫氨酸突变为甘氨酸，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求4所述的预防和/或治疗痤疮的蛋白，其特征在于：编码所述痤疮丙酸杆菌CAMP蛋白变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.蛋白前体，其特征在于：其是在所述权利要求1～5任一项所述预防和/或治疗痤疮的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签；优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

7.根据权利要求6所述的蛋白前体，其特征在于：在所述预防和/或治疗痤疮的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区；优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

8.权利要求1～5任一项所述的蛋白或权利要求6～7任一项所述的蛋白前体在制备预防和/或治疗痤疮或痤疮丙酸杆菌引起或引发的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述痤疮是由痤疮丙酸杆菌感染引起。

10.预防和/或治疗痤疮的重组蛋白疫苗，其特征在于：其含有权利要求1～5任一项所述的蛋白或权利要求6～7任一项所述的蛋白前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

11.根据权利要求10所述的重组蛋白疫苗，其特征在于：所述的辅助性成分为免疫佐剂；优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、含角鲨烯水包油乳剂、重组霍乱毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN、TLR3。

12.根据权利要求11所述的重组蛋白疫苗，其特征在于：满足以下至少一项：所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种；所述的钙盐为磷酸三钙；所述的植物皂苷为QS-21或ISCOM；所述的植物多糖为黄芪多糖；所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺；所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵；优选地，所述免疫佐剂选自氢氧化铝佐剂或WGa01佐剂中至少一种。

13.根据权利要求10～12任一项所述的重组蛋白疫苗，其特征在于：所述的疫苗的剂型为皮内或皮下注射制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂、口服或鼻腔吸入制剂；优选地，所述的疫苗剂型为肌肉注射制剂。

14.权利要求10～13任一项所述的疫苗在制备预防和/或治疗痤疮丙酸杆菌感染引起的感染性疾病的药物中的用途。

15.多核苷酸，其特征在于：其编码权利要求1～5任一项所述的蛋白或权利要求6～7任一项所述的蛋白前体；优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中至少一种。

16.重组载体，其特征在于：其含有权利要求15所述的多核苷酸。

17.如权利要求16所述重组载体，其特征在于：采用大肠杆菌表达载体、昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、酵母表达载体中至少一种；优选地，所述大肠杆菌表达载体为pET-30a；优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1；优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体；进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

18.宿主细胞，其特征在于：含有权利要求16或17任一项所述的重组载体；进一步地，所述的宿主细胞采用大肠杆菌。

19.预防和/或治疗痤疮的蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：构建含有权利要求1～5任一项所述的蛋白或权利要求6～7任一项所述的蛋白前体的重组载体，转化宿主细胞，表达出所述蛋白、纯化，即可。