KR100649286B1 - 감독화톡신을 포함하는 백신제제 - Google Patents

Abstract

잔존활성이 천연체톡신의 1/2000 이하인 감독화톡신을 유효성분으로서 포함하는 아쥬반트 및 이 아쥬반트를 포함하는 백신에 의해 상기 과제를 해결한다. 예를 들면 천연 콜레라톡신의 감독화체의 이용에 의해, 경피접종 및 경비접종에 있어서도 충분한 면역증강성을 나타내는 백신을 제공한다.

감독화톡신, 면역증강성

Description

감독화톡신을 포함하는 백신제제{Vaccine preparations containing attenuated toxin}

본 발명은, 감독화톡신을 아쥬반트로서 포함하는, 치료와 예방에 유용한 백신제제에 관한 것이다.

백신은, 여러 질병의 예방에 사용되어, 수 많은 성과를 올려 왔다. 그러나, 백신의 부작용이나, 또 효과가 충분하지 않다고 하는 예도 많이 있어, 그 개선이 강하게 요망되고 있다. 현재, 인체용 또는 동물용으로 사용되고 있는 백신의 대부분은, 병원체 또는 병원체의 일부를 꺼내, 백신의 항원재료로서 사용한다. 따라서, 병원체를 구성하는 성분이나 병원체를 증식시키는 매체의 성분이 백신에 혼입될 가능성을 부정할 수 없다. 이는 백신접종시, 바람직하지 않은 부반응을 일으키는 원인이 될 수 있다. 또한, 면역부여에 작용하는 항원부위도 다량으로 접종되면 부반응을 유발하는 경우도 있다.

이와 같은 것을 가능한 한 피해, 안전성이 우수한 백신을 제조하는 방법으로서, 백신항원의 접종량을 적게 하는 것이나, 백신항원의 순도를 높이는 것, 주사 이외의 접종루트로 투여하는 것 등이 행해진다. 그러나, 일반적으로는, 이것에 동반하여 백신의 면역력이 저하되기 쉬운 문제점이 있다. 이 점에 대한 유효한 방책 으로서, 종래, 아쥬반트를 사용하는 것이 실시되어 왔다. 그러나, 여기에서도 아쥬반트의 유효성과 안전성의 향상 등, 개선해야 할 과제가 남아 있다.

종래, 대부분의 백신은 주사에 의해 접종되고 있다. 이 결과, 혈중 항체가가 상승하여, 그것이 접속하면 병원미생물의 증식이 억제되어, 병이 예방된다. 한편, 인플루엔자바이러스 등 대부분의 바이러스나 세균은 기도점막을 사이에 두고 감염되기 때문에, 감염의 초기단계에서 이환(罹患)을 저지하기 위해서는, 혈중보다도 점막에서의 국소면역을 강력하게 유발하는 백신이 바람직하다. 이를 위해서는 국소면역을 유발하기 쉽게 하는 우수한 아쥬반트가 필요하다. 즉, 항원의 종류나 접종루트에 따른, 유효하고 안전성이 높은, 우수한 아쥬반트를 개발하는 것은, 백신개발에 있어서도 중요한 과제이다.

주사 이외의 접종루트로서 주목되는 것은 경구접종, 경피접종 또는 경비접종이다. 주사는 의료기술자가 행해야만 하기 때문에, 예를 들면, 의료시설이 완비되어 있지 않은 상황에서 광범위한 사람들에게 백신을 접종할 때에는, 어려움을 동반한다. 이에 대해, 경구, 경피 또는 경비접종에서는, 백신제제를 입수할 수 있으면, 전문가의 지도하에, 직접적인 도움 없이도 접종이 가능하다. 그러나, 일반적으로 이러한 접종루트로는 충분한 면역자극을 얻기 어렵기 때문에, 역시 그것에 적합한 아쥬반트가 요구되어진다.

종래, 백신에는 아쥬반트로서 알루미늄화합물(황상알루미늄, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등)이 널리 사용되어 왔다. 알루미늄화합물의 겔은, 현재, 인체용 백신에 사용할 수 있는 거의 유일한 아쥬반트이다. 그러나, 알루미늄아쥬반트에 는 몇 가지 문제점이 있어, 개선이 요구되어지고 있다. 구체적으로는, 예를 들면 다음과 같은 문제점이 지적되고 있다.

1) 제법 및 취급상 문제로서, 제조의 로트 마다 품질이 변화되기 쉽기 때문에, 대량생산에 적합하지 않고, 더욱이 컬럼조작에 융합되기 어려운 등, 취급상도 불편하다.

2) 효과상 문제로서, 액성 면역의 유발력은 우수하지만, 이에 비해 세포성 면역의 유발력이 낮기 때문에, 사용하는 항원에 한계가 있다.

이들의 개선을 목적으로 하여, 세균 톡신 등 새로운 아쥬반트의 연구, 개발이 진행되고 있다. 그들을 예시하면 다음의 것을 들 수 있다.

1. 콜레라톡신 등, 세균 톡신.

2. 사포닌류, 고급 지방산 등 계면활성 작용물질.

3. BCG, 무라밀펩티드 등, 미생물 또는 식물성분.

4. 인터루킨 등의 사이토카인류, 열쇼크단백질 등의 기능단백질.

5. 합성 폴리음이온, 폴리양이온 등.

6. 마이크로캐리어 등.

세균 톡신이 아쥬반트활성(즉, 항원특이적 항체산생 증강작용)을 갖는 것은 알려져 있다. 그 중에서, 콜레라톡신의 아쥬반트활성은 상대적으로 높다(J. Holmgren et al., Vaccine, 11, 1179-1184, 1993). 본 발명자들은, 콜레라톡신이나 대장균 이열(易熱)톡신 및 그의 서브유닛을 아쥬반트로서 포함하는 백신의 개발연구를 계속해 왔다(특개평2-243633호).

이 밖에, 현재 진행중인 콜레라톡신, 대장균 이열톡신, 백일해톡신 등을 아쥬반트로 하는 백신의 개발연구를 예시하면, 다음의 것을 들 수 있다. 즉, 인플루엔자백신(K. Komase et al., Vaccine 16, 248-254, 1998;A. S. Tamura et al., Eur. J. Immunol. 21, 1337-1344, 1991), 단순포진성 바이러스(herpes simplex virus)(C. M. Richards et al., Vaccine 15, 1065-1069, 1997), HIV-I백신(I. M. Belyakov et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1709-1714, 1998), 헬리코박터 ·피롤리백신(R. Weltzin et al., Vaccine 15, 370-378, 1997), 톡소플라즈마백신(I. Bourgiun et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol 12, 121-126, 1995), 홍역백신(C. D. Partidos et al., Imunology 89, 483-487, 1996), 폴리오백신 등이다.

그러나 세균 톡신은, 본래 인간에 대해 독성을 가지고 있기 때문에, 아쥬반트로서 가한 백신을 임상 사용할 때에 문제가 될 가능성이 있다. 본 발명자들은, 아쥬반트로서 유효한 톡신의 농도는 인간이나 동물에 독성을 나타내는 양 보다도 충분히 낮아, 백신에 사용하더라도 안전한 것으로 생각하여, 경비접종을 상정한 반복투여에 동반되는 문제에 대해서도 검토하여 이미 발표하고 있다(S. Tamura et al., Vaccine 15, 1784-1970, 1997). 그래도 대부분의 전문가는, 인간과 실험동물의 콜레라톡신 감수성의 차나 설사를 일으킬 가능성 등의 이유를 들어, 안전성에 대한 우려를 표명하고 있다(M. M. Levine et al. Microb. Rev. 47, 510-550, 1983).

세균 톡신의 우수한 면역증강활성을 살리면서 안전성의 문제를 해결하기 위 해, 이하의 방법이 제안되어 왔다. 그러나 어떤 방법도, 안전성과 아쥬반트활성의 양립이라는 과제를 완전히 달성하는 것이라고는 하기 어렵다.

(1) 화학적, 물리적 처리에 의한 감독화

포르말린, 글루타르알데히드, 산, 알칼리 등의 존재하, 또는 톡신에 있어 가혹한 온도조건하 등으로 처리하여, 톡신활성을 저하시키고, 또한 아쥬반트활성을 남기는 방법이다. 글루타르알데히드처리에 의해 톡신활성을 천연체의 약 1/1000로 한 콜레라톡신은, 아쥬반트활성을 나타내는 것이 알려져 있다(X. Liang et al., J. Immunol. 143, 484-490, 1989). 그러나 천연체의 1/1000의 톡신활성으로는 안전성면에서는 불충분한 것으로 평가된다.

(2) 변이주가 생산하는 교차반응성 변이단백질의 탐색

톡신생산성 세균을 변이유발 화학약품으로 처리하여, 얻어진 변이주가 생산하는 톡신중에서, 아쥬반트활성을 유지한 목적물을 탐색하는 방법이다. 백일해톡신 생산균 변이주의 배양액중으로부터, 톡신활성이 낮고, 또한 항 백일해톡신항체와 반응하는 교차반응성 단백질(CRM)이 발견되었다. 이 변이톡신은, 면역원성이 있어, 백일해백신항원의 후보로 생각되어진다(Y. Sato et al., Dev. Biol. Stand. 73, 93-107, 1991). 그와 동시에 저톡신활성의 아쥬반트로 될 가능성이 있지만, 톡신활성의 정도와 아쥬반트활성에 대해서는 보고되어 있지 않다.

디프테리아톡신의 교차반응성 단백질 CRM-197(DT-G52E)(T. Uchida et al., J. Biol. Chem. 248, 3838-3844, 1973; G. Giannini et al., Nucleic Acids Res. 12, 4063-4069, 1984), 녹농균 엔테로톡신A의 교차반응성 단백질 CRM-66(H462Y)(S. J. Cryz et al., Rev. Infec. Dis. 5 Suppl. 5, S992-S997, 1983. S. P. Kessler et al., J. Biol. Chem. 267, 19107-19111, 1992) 등은, ADP-리보실화 효소(ADP-ribosyltransferase)활성을 실질적으로 소실한 변이체톡신으로서 보고되었다. 이들의 변이체톡신에 있어서는, ADP-리보실화 효소활성이 톡신활성의 유일한 지표로 되어 있어, 다른 기구에 의한 잔존 톡신활성은 부정되고 있지 않다. 따라서 이들의 변이체에는, 다른 톡신활성을 동반하고 있을 가능성이 있다. 또한 CRM-197(DT-G52E)은, 다당항원과 화학결합시킨 경우, 아쥬반트활성은 있지만 충분한 항체가가 얻어지지 않기 때문에, 제2의 아쥬반트를 필요로 하는 것으로 보고되어 있다(G. S. Bixler et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 185-190, 1991. D. M. Granoff et al., Vaccine 11 Suppl. 1, S46-S51, 1993).

(3) 유전자조작에 의한 감독화 변이톡신의 작성

유전자 재조합기술에 의해, 톡신분자의 아미노산잔기의 1 내지 여러 개소를 인위적으로 변화시켜 톡신활성을 내리고, 또한 아쥬반트활성을 유지한 재조합 톡신을 작성하는 방법이다. 일례로서 대장균 이열톡신의 N말단으로부터 7번째 또는 192번째의 아르기닌잔기(Arg/R)를 리진잔기(Lys/K)에(LT-R7K, M. T. De Magistris et al., Dev. Biol. Stand. 92, 123-126, 1998), 또는 글리신잔기(Gly/G)에(LT-R192G, B. L. Dickinson et al., Infection Immun. 63, 1617-1623, 1995) 치환한 재조합체는, 실질적으로 톡신활성이 소실되고, 또한 아쥬반트활성이 있었다고 보고되었다.

그러나, 다른 그룹의 시험에 의하면, 상기의 재조합체에는 무시할 수 없을 정도의 톡신활성이 인정되고, 또 천연체에 비교하여 불안정성으로, 동일한 레벨의 항체가를 부여하기 위해서는 천연톡신 보다 다량으로 사용하지 않으면 안 된다고 보고되었다(K. Komase et al., Vaccine 16, 248-254, 1998; C. C. R. Grant et al., Infect. Immun. 62, 4270-4278, 1994). 복수의 활성에 의해 톡신활성이 초래되고 있는 경우, 그 중 어느 한 활성이 저하되면 다른 활성이 현재화(顯在化)되는 경우가 있다. 톡신의 감독화에는, 항상 이 현상이 동반되기 때문에, 톡신활성의 지표는 신중히 선택되어야만 한다. 이상과 같이, 지금까지 저독성인 것으로 보고된 감독화 아쥬반트는, 아쥬반트활성, 안전성, 안정성, 또는 생산성의 문제가 충분히 해결되어 있지 않다. 또한, 아미노산의 치환을 토대로 톡신활성의 저하와 아쥬반트활성의 유지라고 하는 상반되는 과제를 달성하는 것은, 많은 스크리닝을 반복하지 않으면 안 되기 때문에, 시간이 걸리는 작업이라 할 수 있다.

발명의 개시

본 발명의 과제는, 톡신이 우수한 아쥬반트활성을 남기면서, 톡신활성이 실질적으로 없는 감독화톡신을 신규 아쥬반트로서 제공하는 것이다. 더욱이 본 발명은, 이러한 안전성과 유효성을 겸비하고, 또한 보다 용이한 수법에 의해 얻을 수 있는 아쥬반트를 이용한 백신의 제공을 과제로 하고 있다. 보다 구체적으로는, 백신의 사용량을 줄이거나, 주사 이외의 접종루트를 사용하더라도 면역력이 저하되지 않는 백신의 제공을 과제로 하고 있다.

본 발명자들은 각종 톡신의 톡신활성 경감방법에 대해서 연구를 진행한 결과, 화학처리에 의해 얻을 수 있는, 톡신활성을 실질적으로 갖지 않는 감독화톡신 이, 실질적인 수준의 아쥬반트활성을 갖는 것을 발견했다. 그리고 이 감독화톡신에 높은 안전성을 기대할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성했다. 즉 상기의 과제는, 이하의 본 발명에 의해 달성된다.

(1) 천연톡신을 구성하는 아미노산서열중, 세린잔기, 글루타민산잔기 및 리진잔기를 유지하고 있는 톡신, 또는 그의 서브유닛을 감독화하여, 잔존 톡신활성을 천연체의 1/2000 이하로 한 감독화톡신을 포함하는 아쥬반트.

(2) (1)에 있어서, 톡신이, 천연톡신의 아미노산서열에 대해 1, 또는 복수의 아미노산을 치환, 삽입, 결실 및/또는 부가한 아미노산서열에 의해 구성된, 아쥬반트활성을 갖는 변이체인 아쥬반트.

(3) (1)에 있어서, 톡신이 천연톡신인 아쥬반트.

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 톡신이 세균 톡신인 아쥬반트.

(5) (4)에 있어서, 톡신이, 콜레라톡신, 백일해톡신, 병원성 대장균 이열성 톡신, 포도상구균 α톡신, 포도상구균 β톡신 및 장염비브리오균 내열성 용혈톡신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 톡신인 아쥬반트.

(6) (5)에 있어서, 톡신이 천연 콜레라톡신으로, 포르말린처리에 의해 감독화하여 그 톡신활성을 1/2000 이하로 한 아쥬반트.

(7) (6)에 있어서, 톡신활성이 1/10000 이하인 아쥬반트.

(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 아쥬반트와 면역항원을 포함하는 백신제제.

(9) (8)에 있어서, 경비접종을 위한 것인 백신제제.

(10) (8)에 있어서, 경구접종을 위한 것인 백신제제.

(11) (8)에 있어서, 경피접종을 위한 것인 백신제제.

(12) (8)에 있어서, 면역항원이, 인플루엔자바이러스, 로타바이러스, 홍역바이러스, 풍진바이러스, 유행성 이하선염바이러스, 에이즈바이러스, 백일해균, 디프테리아균, 헬리코박터 ·피롤리균, 출혈성 대장균(EHEC), 클라미디어원충, 마이코플라즈마원충, 말라리아원충, 콕시듐원충 및 주혈흡충으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단일 또는 복수의 병원미생물의 항원인 백신제제.

또는 본 발명은, 감독화톡신의 아쥬반트로서의 사용에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은, 감독화톡신의 백신제제를 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.

본 발명의 아쥬반트를 구성하는 톡신은, 톡신활성을 실질적으로 갖지 않고, 면역증강활성은 남아 있는 감독화톡신이다. 본 명세서에 있어서, 톡신활성을 실질적으로 갖지 않는다는 것은, 천연톡신을 기준으로 하여 1/2000 이하인 톡신활성 밖에 유지하고 있지 않은 것으로 정의된다. 콜레라톡신, 대장균 이열톡신, 백일해톡신, 디프테리아톡신, 또는 파상풍톡신이라고 하는, 대표적인 세균 톡신의 활성은, 예를 들면 ADP-리보실화 효소활성을 지표로 하여 비교할 수 있다. 즉, 예를 들면 ADP-리보실화 효소활성이 1/2000이라면, 그것은 톡신활성이 1/2000인 것을 의미한다. 선행 기술문헌에는 각종 감독화톡신에 대해서 ADP 리보실화 효소활성이 검출되지 않는다고 하는 보고가 있지만, 정량적인 비교를 동반하지 않는 것은, 그 판단기준이 명확하지 않기 때문에 톡신활성의 평가방법으로서 적절하지 않다. 또한, 다른 보고와의 비교가 곤란해지는 점에서 문제가 있다. 본 발명에서는, 톡신활성의 비교에 있어서의 이러한 폐해를 피하기 위해, 천연톡신의 활성을 기준으로 하여, 그의 1/2000이라는 비교기준을 채용했다. 콜레라톡신이나 대장균 이열톡신과 같은, 강력한 생리활성을 가진 세균 톡신이더라도, 1/2000이라는 높은 레벨의 감독화에 의해, 생체로의 투여에 있어서의 그의 안전성은 비약적으로 높아지는 한편, 면역자극활성은 유지된다.

이 밖에, 동물세포나 실험동물의 생리적인 응답반응을 지표로 한 생물학적 분석의 결과를 지표로 하여 톡신활성의 정량적인 비교를 행할 수도 있다. 어느 것으로 하던지, 그 톡신이 갖는 활성을 예민하게 반영하는 지표에 의해, 활성의 비교를 행하여 1/2000 이하인 것을 확인하는 것이 바람직하다. 또한, 대부분의 톡신은 다면적인 생리활성을 가지고 있는 것으로부터, 설령 예민한 지표를 이용한다고 하더라도, 성격이 다른 복수의 지표를 조합시켜 톡신활성을 평가하는 것은 안전성의 확보상에서 바람직한 방법이다. 각 톡신과 그의 활성에 대해서는 후술한다. 본 발명에 의한 감독화톡신은, 통상은 1/2000 이하, 바람직한 태양에 있어서는 1/10000 이하인 톡신활성을 갖는 것으로 한다.

톡신의 감독화는, 공지의 방법에 의해 달성할 수 있다. 즉, 화학적인 처리, 또는 물리적 처리에 의한 감독화기술이 공지이다. 감독화처리에 동반하여, 입체구조의 불가역적인 변화, 서브유닛의 해리, 또는 펩티드의 단편화라는 여러 가지 구조변화가 일어날 가능성이 있다. 그러나, 상기 3종류의 아미노산잔기를 유지한 톡신을 사용하면, 아쥬반트활성을 유지하는 것이 가능하다. 이들 공지의 수법을 사용하여, 상기 톡신활성의 지표를 부여하는 분석방법에 의해 톡신활성이 적어도 천연톡신활성의 1/2000 이하가 되는 조건을 경험적으로 설정하면 좋다. 구체적인 감독 화의 조건에 대해서는, 뒤에 상세히 기술한다.

본 발명의 톡신으로서는, 뒤에 구체적인 예를 열거하는 어떤 톡신을 사용하는 경우에도, 천연체톡신을 구성하는 아미노산서열중, 세린잔기, 글루타민산잔기 및 리진잔기는 유지되어 있어야만 한다. 본 발명에 있어서의 바람직한 톡신은, 천연체톡신이다. 천연체톡신을 선택함으로써, 높은 아쥬반트활성을 기대할 수 있는 동시에, 변이체를 스크리닝하는 수고를 덜 수 있다. 또한, 아쥬반트활성의 유지에 중요한 이들의 아미노산잔기 이외에 대해서는, 1, 또는 복수의 아미노산을 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 아미노산서열을 갖는 변이체일 수 있다. 또 아미노산서열 뿐 아니라, 다른 톡신 구성성분인 당잔기의 변이체일 수도 있다.

단백질의 기능발현에 있어서, 아미노산잔기의 관능기는 중요하다. 예를 들면, OH기를 갖는 세린잔기나 트레오닌잔기 등, COOH기를 갖는 글루타민산잔기나 아스파라긴산잔기 등, 또는 NH₂기를 갖는 리진잔기나 알기닌잔기 등이 활성중심을 구성하여, 활성발현에 중요한 역할을 다하고 있는 경우가 많다. 대부분의 효소나 기능적 단백질에 보여지는 바와 같이, 톡신에 있어서도 그 생물활성, 예를 들면, 효소활성, 면역증강활성, 수용체 결합활성 등의 활성발현에, 톡신분자를 구성하는 아미노산잔기중의 OH기, COOH기, NH₂기 등이 깊게 관여하는 것으로 생각된다. 더욱이, 예를 들면 OH기의 중요성을 나타내는 다른 지표로서 구성 아미노산수를 본 경우, OH기를 갖는 아미노산인 세린잔기, 트레오닌잔기, 그리고 티로신잔기는, 콜레라톡신, 인간형 대장균 이열톡신, 백일해톡신의 폴리펩티드중에, 3종의 아미노산잔기수 의 합계로 각각 약 18%, 22%, 20%를 차지한다. 이 숫자는, 그 만큼 활성중심에 관여할 가능성이 높은 것을 나타낸다. 따라서, 활성중심에 깊게 관여하는 이들 아미노산잔기를 결실하거나, 또는 다른 아미노산잔기로 치환한 재조합 변이체톡신에서는, 현저한 입체구조 변화를 일으키기 쉬워, 톡신활성 뿐 아니라, 면역증강활성도 동시에 소실할 가능성이 높다. 이 추정을 지지하는 예로서, 본 발명자들은 대장균 이열톡신의 N말단으로부터 112번째의 글루타민산잔기를 리진잔기로 치환한 재조합 변이체에서는, 톡신활성이 약 1/2,860로 저하되는 동시에, 면역증강활성도 잃게 되는 사실을 관찰했다(K. Komase et al., Vaccine 16, 248-254, 1998).

이러한 사실을 토대로, 본 발명자들은, 상기 3종류의 관능기를 갖는 아미노산잔기중에서, 아쥬반트활성을 지지하는 중요한 아미노산잔기로서, 세린잔기, 글루타민산잔기 및 리진잔기의 3종을 선택했다. 이들 아미노산잔기는, 각종 톡신활성을 초래하는 중요한 아미노산잔기로서 알려져 있다.

이하에, 이들 아미노산잔기의 치환에 의한 톡신활성의 변화에 관한 보고를 정리한다. 톡신활성을 네가티브(negative)로 표기한 보고는, 사용한 측정조건에서는 실질적으로 잔존 톡신활성은 검출되지 않았지만, 정량적인 비교가 행해져 있지 않은 것이다. 대장균 이열톡신에 있어서는, 아쥬반트활성이 인정되고 있지만 면역증강활성은 충분한 것은 아니다. 또 콜레라톡신 변이체에 있어서도, 천연 콜레라톡신과 동일한 레벨의 면역증강활성을 부여하기 위해서는 천연 콜레라톡신의 10배량이 필요로 해지고 있다. 또한 아미노산의 치환에 대해서 「외」로 기재한 것에서는, 이 밖의 아미노산잔기의 치환이 동시에 행해지고 있다. 이와 같이, 글루타민산 잔기나 세린잔기는, 종종 치환의 표적이 되는 중요한 아미노산잔기인 한편으로, 그 치환에 의해 아쥬반트활성을 잃는, 또는 감쇠하는 보고가 많다.

본 발명에 있어서는, 이들 치환의 표적이 된 중요한 아미노산잔기에 더하여,

염기성 아미노산의 대표로서 NH₂기를 갖는 리진잔기를 가하여, 아쥬반트활성을 고도로 유지하기 위해 필요한 아미노산잔기로 했다. 리진산기는 톡신의 감독화에 있어서 중요한 역할을 가지고 있다. 예를 들면 포르말린처리에 있어서는, 리진이 갖는 εNH₂기에 포르말린이 반응하여, 여기에 시프(Schiff) 염기를 생성함으로써 입체구조의 변화를 초래하고, 그 결과로서 감독화가 성립되는 것으로 되어 있다. 따라서, 리진잔기를 유지시킴으로써, 1/2000 이하라는 고도의 감독화를 용이하게 달성할 수 있다.

표1

톡신활성의 지표 A: ADP-리보실화 효소활성

C: CHO세포 spindle 형성시험

Y: Y-1세포 변성시험

논문

(1) Komae et al., Vaccine 16, 248-254, 1998

(2) G. Douce et al., Infec. Immun. 65, 2821-2828, 1997

(3) S. Yamamoto Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 5267-5272, 1997

(4) S. Yamamoto J. Exp. Med. 185, 1203-1210, 1997

(5) M. Roberts et al., Infec. Immun. 63, 2100-2108, 1995

(6) T. Uchida et al., J. Biol. Chem. 248, 3838-3844, 1973

1/2000 이하, 또는 1/10000 이하라는 고도로 감독화한 톡신이 높은 면역증강활성을 갖는 것은, 선행 문헌으로부터 예상할 수 없는 것이다. 예를 들면 콜레라톡신의 주요한 톡신작용은, A서브유닛이 담당하는 것으로 되어 있다. 그 톡신활성은, A서브유닛이 강한 ADP-리보실화 효소활성에 의해, 톡신이 진입한 세포내에서 cAMP농도 균형의 파괴가 일어남으로써 발현하는 것으로 설명되고 있다. 대장균 이열톡신도, 동일한 기서(機序)에 의해 톡신활성을 발현한다. 대장균 이열톡신의 재조합 변이체에 있어서, ADP-리보실화 효소활성과 아쥬반트활성과의 상관관계를 해석한 연구가 보고되어 있다. 그 결과, 양활성은 서로 밀접하게 연결되어 있고, 양자는 분리 가능하다는 견해가 제출되었다(N. T. Lycke et al., Eur. J. Immunol. 22, 2277-2281, 1992). 다른 보고에서도, 효소활성을 저하시킨 재조합 변이체톡신은, 동시에 아쥬반트활성도 저하되는 것이 보고되었다(예를 들면, J. D. Clements et al, Vaccine 6, 269-277, 1988, 시험재료; 대장균 이열톡신. ;W. J. Black et al., Science 240(4852), 656-659, 1988, 시험재료; 백일해균톡신).

즉 종래의 학설에서는, 톡신활성을 대폭으로 저하시킨 경우, 면역증강활성도 그 만큼 저하되기 때문에, 안전성이 높은 아쥬반트의 개발로 연결되지 않는 것으로 생각되고 있었던 것이다. 그러나 본 발명의 감독화톡신에 의해, 톡신활성이 천연체의 1/2000 이하, 예를 들면 1/10000이더라도, 면역증강활성은 천연체와 실질적으로 동등한 경우가 있는 것이 명확해졌다. 이것은 본 발명자들의 오랜 기간의 연구에 의해 비로소 명확해진 새로운 사실이다.

감독화톡신에 있어서, 톡신활성과 면역증강활성이 분리된 기구는 현재 명확하지는 않다.

그러나, 동일한 현상으로서, 톡소이드를 항원으로서 사용하는 대부분의 백신에 보여지는 바와 같이, 감독화톡신이 면역원성을 유지하고 있는 경우가 알려져 있는 것으로부터, 그 기구를 토대로 고찰한다. 예를 들면 감독화 콜레라톡신에 대해서는, 이하와 같이 생각된다. 톡신활성(예를 들면 ADP-리보실화 효소;ADP-ribosyltransferase 활성)발현에는, 일정한 크기의 올리고펩티드가 형성하는 특이한 입체구조가 필요하기 때문에, 약간의 구조변화도 활성의 소실로 이어진다. 이에 대해, 면역증강활성은, 톡신분자 그대로, 또는 보다 작은 펩티드로서 효과가 발현되는 경우가 있어, 톡신 단백질의 1차구조의 약간의 변화로는, 활성이 유지될 가능성이 있다.

콜레라톡신이 아쥬반트로서 작용하는 경우, 여러 가지 면역증강활성을 일으키는 것이 알려져 있다. 예를 들면, (1) 항원의 투과성을 촉진한다. 수용체와 결합하여, 헬퍼 T 세포를 활성화한다. 헬퍼 T 세포의 1형과 2형의 증식을 촉진한다. 또한, (2) 여러 사이토카인류, 예를 들면, 인터페론감마, 인터루킨 1,4,5,12 등의 산생을 촉진한다. 이들의 면역응답에 있어서는, (1)의 경우에는 톡신분자가 그 구조를 유지한 채 효과를 발휘하고, 한편 (2)의 경우에는, 펩티드단편에 분해되어 효과를 발현하는 가능성이 생각된다. 그러나, 이 점에 관하여, 충분히 상세하게는 해명되어 있지 않다.

항원단백질은, 프로테아솜의 작용으로 일련의 프로세싱을 받아, 펩티드단편으로 되어, 항원제시세포로 제시되고, 이것이 자극이 되어, 그 후 일련의 면역반응, 예를 들면, 헬퍼 T 세포의 활성화와 증식, 여러 사이토카인류의 산생, 더욱이 B세포에 의한 항체생산 등이 발생한다. 톡신의 아쥬반트효과가 발현되는 과정에서, 이것과 유사한 기구가 작용할 가능성이 생각된다.

상기의 가능성은, 현 단계에서는 가설이지만, 톡신활성은 주로 하나의 기구를 토대로 하는 것에 대해, 아쥬반트활성은 복수의 기구에 의해 발휘되기 때문에, 감독화톡신에 있어서, 톡신활성이 소실되더라도, 면역증강활성은 남는 일이 일어날 수 있을 것으로 생각된다.

(톡신)

본 발명에 의한 아쥬반트를 구성하는 감독화톡신이란, 세균, 진균 또는 동식물이라는 생물이 산생하는 천연체톡신의 감독화체이다. 본 발명의 아쥬반트에 이용 되는 톡신으로서는, 특히 세균톡신이 바람직하다. 세균 톡신은, 대량생산이 용이한 것으로부터 경제적으로 유리하고, 또 예를 들면 콜레라톡신과 같이 아쥬반트활성면에서도 우수한 톡신을 포함하고 있다. 이들은 단순단백질, 또는 복합단백질이다. 즉 본 발명에 있어서의 톡신이란, 자연계 생물이 생산하는 단백질성 톡신활성물질, 그 단편, 서브유닛을 의미한다. 또한, 아쥬반트활성을 기대할 수 없는 분자량이 500 이하인 저분자 톡신은 포함되지 않는다. 또한, 유기합성화학에 의해 제조되는 화합물의 일부에 포함되는 독성물질(독성)이나 유해 중금속류에 대해서도, 본 발명에 의한 톡신을 구성하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서의 천연체톡신으로서 다음의 것이 예시된다.

세균 톡신: 콜레라톡신, 디프테리아톡신, 백일해톡신, 포도상구균α톡신, 포도상구균β톡신, 장염비브리오균 내열성 용혈톡신, 병원성 대장균 이열성 톡신, 시가톡신(Shiga toxin) 및 녹농균 엔테로톡신A 등

진균톡신: 칸디톡신(canditoxin), 푸미가톡신(fumigatoxin) 및 버섯류의 톡신 등

식물톡신: 리신 등

동물톡신: 사독(蛇毒), 봉독(蜂毒), 절지동물톡신(예를 들면 전갈독) 등

톡신은 색소, 항생물질 등과 마찬가지로, 이른바, 2차 대사산물이다. 톡신생산성의 미생물이나 동식물에 있어서의 본래의 생리적 역할은 반드시 명백하지 않은 경우가 많다. 2차 대사산물생산의 특징으로서, 톡신생산능은 균주(동식물에 있어서는 개체) 특이적으로, 그 종속의 생물이라면 어떤 개체도 생산하는 것은 아니다. 동일한 종의 균주가 동일한 톡신을 생산하는 빈도는 톡신에 따라 일정하지 않다. 동일한 톡신이 아종, 근연종에 의해서도 생산된다. 야생주에서도 근연종에서도, 인공변이주에서도, 생산되는 톡신은, 구조가 부분적으로 조금씩 변화된 다성분의 톡신을 생산하는 경우가 많다. 본 발명의 아쥬반트에 복수종의 톡신혼합물을 사용할 수도 있다. 또한, 톡신분자가 몇개의 서브유닛으로 구성되는 경우, 본 발명의 아쥬반트에는 아쥬반트활성에 필요한 서브유닛 만을 단독으로, 또는 복수의 서브유닛을 선택하여 이용할 수도 있다. 서브유닛으로 구성되는 톡신으로서, 콜레라톡신, 백일해톡신, 디프테리아톡신, 병원성 대장균 이열성 톡신 및 칸디톡신 등이 예시된다. 톡신을 구성하는 서브유닛은, 일반적으로 서브유닛단위로도 아쥬반트활성을 나타낸다(특개평2-243633호). 따라서, 본 발명의 톡신은 그들의 서브유닛일 수도 있다.

더욱이 본 발명의 아쥬반트를 구성하는 톡신으로서, 천연체톡신의 아미노산서열이나, 당쇄로 대표되는 그 밖의 구조를 개변한 변이체를 사용할 수도 있다. 변이체톡신은, 톡신생산성 야생주 또는 근연종을 변이유기제로 처리하여 작성된 인공변이주에 의해 생산된다. 이 경우를 인공 변이체톡신이라 기재한다. 변이체톡신은 또 유전자 재조합기술을 이용하여 변이체톡신 생산능이 부여된 재조합 세포생물에 의해서도 생산된다. 후자의 경우를 재조합 변이체톡신이라 기재한다.

변이체톡신은 천연체 분자구조의 일부분이 변화되어 있기 때문에, 톡신분자의 구조변화에 동반하여, 통상, 톡신의 특성 일부를 잃는다. 그러나 한편으로는 면역증강활성을 유지하는 경우도 있을 수 있다. 변이체톡신의 톡신활성이 충분히 낮아, 천연체의 1/2000 이하라면, 면역증강활성을 확인후, 그대로 감독화톡신으로서 본 발명의 아쥬반트에 이용할 수 있다. 또한, 그렇지 않은 경우, 변이체톡신을 상 기의 방법으로 화학적 또는 물리적 처리에 의해, 더 감독화함으로써 아쥬반트로서 이용할 수 있게 된다. 변이체톡신은, 그것을 포함하는 백신의 사용조건하에서, 안정한 것이 바람직하다. 또 톡신활성이 부활하기 어려운 것이 바람직하다. 톡신활성의 부활이란, 여러 가지 처리에 의해 대폭으로 저하된 톡신활성이, 처리후의 시간경과에 동반하여 회복되는 현상을 가리킨다.

인공 변이체톡신에 있어서의 구조변화의 부분은, 유지해야 할 아미노산잔기로서 특정한 3아미노산잔기를 제외하면, 그 변이체가 아쥬반트활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 톡신분자를 구성하는 올리고펩티드부분의 아미노산잔기, 올리고당부분의 당잔기, 또는 유기산부분 등의 1개소, 또는 복수의 변화가 예시된다.

인공 변이체에 있어서는, 변이하는 아미노산잔기, 또는 당잔기를 인위적으로 선택할 수 없기 때문에, 통상은 변이의 내용을 미리 규정하는 것은 곤란하다. 그러나, 연구과정에 있어서는, 톡신활성의 저하나 면역증강활성은 용이하게 확인할 수 있기 때문에, 본 발명의 목적에 맞는 변이체를 얻을 수 있다. 또한, 예상외의 아미노산잔기가 변화된 변이체를 발견할 수 있다고 하는 이점이 있다.

한편, 재조합 변이체톡신의 경우에는, 변이하는 아미노산잔기, 또는 당잔기를 선택하여, 목적으로 하는 변이를 인위적으로 도입할 수 있다. 구체적으로는, 톡신분자를 구성하는 올리고펩티드부분의 아미노산잔기, 올리고당부분의 당잔기, 또는 유기산부분 등의 1개소, 또는 2개소 이상의 변이가 예시된다. 면역증강활성 발현에 있어서 중요한 펩티드단편을 포함하는 올리고펩티드단편도 본 발명의 아쥬반 트에 포함된다.

천연체톡신 및 변이체톡신의 제조

천연체톡신은, 야생주의 생산물로서 취득할 수 있다. 또는 고역가생산성 변이주 등 여러 가지 인공 변이주의 생산물로서 취득할 수 있다. 또는, 유전자조작에 의해 야생주 등의 유전자를 짜 넣은 동종 또는 이종의 재조합 생물세포의 생산물로서 취득할 수 있다. 더 나아가서는 합성화학적 수단에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명에 사용하는 세균 톡신은, 예를 들면, 톡신생산성 세균의 배양물을 원료로서 공지의 방법을 조합시키고, 추출, 분리, 정제하여, 제조할 수 있다. 콜레라톡신에 대해서 예시하면 다음과 같다. 톡신생산성 콜레라균(Vibrio chorela)을 36℃에서 18시간 배양한다. 배양액을 종균으로서 한천배지상, 또는, 액체배지에서 대량 배양한다. 배양후, 배양상청(액체배양의 경우)을 황안침전(硫安沈殿), 또는 한외여과로 농축한다. 농축후, 세파덱스 등을 사용하는 공지의 컬럼 크로마토그래피법, 초원심법, 겔 전기영동법 등을 조합시켜 톡신을 정제한다. 배양중 및 정제도중 시료의 톡신활성은 후술의 방법에 의해 측정한다.

또한, 백일해톡신에 대해서 예시하면 다음과 같다. 백일해균(Bordetella pertussis) 동빈주(東浜株) I상균을 Bordet-Gengou배지에서 종배양하고, 이를 Cohen-Wheeler배지에 이식하여, 48시간 배양하고, 그 배양상청을 출발원료로서 사용한다. 배양상청을 수산화인회석(hydroxyapatite) 컬럼에 어플라이하여, 0.1M 인산완충액(pH 7.0)으로 세정하고, 이어서 0.5M NaCl 첨가 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 으로 용출한다. 더욱이, CM-세팔로오스나 적당한 친화성 리간드를 결합한 담체를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다. 배양중 및 정제도중 시료의 톡신활성은 공지의 방법에 의해 측정한다.

이 밖에, 버섯이 산생하는 톡신으로는, 자생, 또는 재배된 버섯으로부터 추출, 정제할 수 있다. 동물이 산생하는 톡신의 제조방법은, 톡신생산성 동물, 예를 들면, 뱀을 사육하여, 입턱부분의 톡신 산생기관으로부터 채취한다. 물론 이미 톡신이 시판되고 있는 경우에는, 톡신제조 메이커로부터 구입할 수도 있다. 톡신생산공정과 톡신의 품질은, 해당생물 제제기준과 관련법규에 따르는 한, 여러 가지로 변경할 수 있다.

인공 변이체톡신은, 톡신생산성 야생주로부터 유도되는 인공 변이주에 의해 생산된다. 인공 변이주는 야생주를 변이유기제 등으로 처리하여 작성된다. 변이유기 처리방법으로서는, N-methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine, nitrosourea, nitrogen mastard 등의 화학약품에 의한 처리 및 자외선조사, 코발트 60 등에 의한 방사선조사, 가온 등의 물리화학적 처리 등이 공지이다. 인공 변이주의 배양법, 톡신의 정제법, 활성확인법 등은, 야생주의 경우에 준한다.

재조합 변이체톡신은 재조합 세포생물에 의해서도 생산된다. 그를 위한 방법은, 공지이다. 대장균 이열톡신의 재조합 변이체의 제조방법을 예시한다. 환자분리의 이열톡신 생산주(Escherichia coli 1032주)로부터, 예를 들면 다무라등의 방법(S. Tamura et al., Vaccine 12, 1083-1089, 1994)에 의해 고역가 톡신생산성 재조합주를 작성한다. 먼저, 이열톡신과 내열톡신의 양쪽 유전자를 코드화 하는 플 라스미드(65kbp)를 분리한다. 플라스미드로부터 제한효소처리 등에 의해 이열톡신 유전자(6.7kbp)를 잘라내고, pBR322 등의 플라스미드에 연결한다. PCR법 등으로 증폭시킨 후, 이열톡신 유전자를 다른 발현벡터에 연결한다. 다음에, Ho등의 방법(S. N. Ho et al., Gene 77, 51-59, 1989) 등에 의해, 이 벡터상에서 위치 특이적 변이처리를 행하고, 계속해서 선택적 프라이머를 사용하여 PCR법으로 증폭시켜, 재조합 변이체톡신을 생산하는 재조합 대장균의 균주를 작성한다. 다음에 클레멘츠(Clements)등의 방법(J. D. Clements et al., Infect. Immun. 24, 760-769, 1979)에 따라 배양하고, 배양액으로부터 한외여과, 황산암모늄침전, 아가로우즈 겔 크로마토그래피(갈락토오스첨가 완충액으로 용출) 등에 의해 목적으로 하는 단백질정제하여, 인간형 대장균 이열톡신의 재조합 변이체톡신을 얻을 수 있다. 또는, 상기 프로세스중에서 위치 특이적 변이처리를 행하지 않으면, 천연체톡신을 얻을 수 있다.

예를 들면 상기와 같이, 위치 특이적 변이처리법 등을 응용하면, 톡신의 아미노산서열중에서, 임의의 부위의 아미노산잔기를 다른 잔기로 변화시키는 것도 가능해져 있다. 반대로, 특정부위의 특정 아미노산잔기, 예를 들면 글루타민산잔기를 변화시키지 않고 유지하는 것이 가능하다. 당잔기에 대해서도 기본적으로 동일하다. 얻어진 변이체중에서, 아쥬반트활성을 유지할 수 있는 것을 선택하여 본 발명의 톡신변이체로 한다. 또한, 이 변이체가 갖는 톡신활성에 대해서는, 임의의 레벨에 있을 수 있다. 즉, 아쥬반트활성 뿐 아니라, 톡신활성에 대해서 천연인 것과 동등한 수준으로 가지면, 천연인 것과 동일하게 적당한 감독화처리를 행해 아쥬반트 로 할 수 있다. 또는, 만일 아쥬반트활성을 가지면서 톡신활성이 낮은 바람직한 변이체를 얻을 수 있다면, 그 대로, 또는 약간의 감독화처리후에 감독화톡신으로서 아쥬반트에 이용할 수 있다. 변이체를 얻기에는, 몇개의 사고착오적인 실험이 필요해 지지만, 반면 얻어진 재조합 변이체톡신은, 일반적으로, 톡신활성이 복귀하기 어려운 이점이 있다.

톡신의 감독화방법

야생주, 인공 변이주, 또는 재조합 변이주가 생산하는 톡신은, 감독화후에 면역증강활성이 있는 것을 확인하고, 본 발명의 아쥬반트로 한다. 톡신의 감독화방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다. 감독화방법을 예시하면 다음과 같다. 본 발명에 있어서의 감독화란, 어떤 형태의 수단에 의해 톡신활성을 줄이는 것을 의미하고, 여기에 예시하는 방법에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 이들 방법은 간편하고 확실한 처리효과를 기대할 수 있는 유리한 방법이다.

이들 감독화방법은 어느 것도 톡소이드화 등에 이용되고 있는 공지의 수법이다. 그러나 본 발명에 있어서는 1/2000 이하라는 고도의 감독화가 필요하다. 따라서, 공지의 수법과 동일한 원리를 토대로 하지만, 보다 가혹한 조건이 요구된다. 구체적으로는, 예를 들면 콜레라톡신의 포르말린처리의 경우, 처리온도는 5℃-30℃(통상은 5℃), 포르말린농도를 0.5%-0.8%(통상은 0.3%), 그리고 처리일수를 20-70일(역시 통상은 7-14일 정도) 등이 예시된다.

[1] 화학적 방법

톡신을 적당한 농도로 완충액에 용해하고, 톡신이 안정한 범위(통상 pH5-8)로 pH를 조절하면서, 적당한 농도(통상 0.01-1.0%)의 처리약제 예를 들면, 포르말린, 글루타르알데히드, 페놀, 옥소, 산무수물, 담즙산 등의 계면활성 작용물질 등을 서서히 가하고, 적정 온도(예를 들면 5℃)로 보온처리한다. 처리후, 투석 등 공지의 방법에 의해, 처리약제를 제거하여, 잔존 톡신활성을 측정한다. 필요에 따라, 감독화톡신의 사용온도, 예를 들면 37℃로 다시 보온하고, 톡신활성이 복귀하지 않는 것을 확인한다. 이렇게 하여, 감독화톡신이 얻어진다. 이 방법은, 종래부터 널리 실시되어 온 톡소이드화의 방법에 준하는 것으로, 대량 제조에도 적합하다. 그러나, 톡신활성이 복귀되지 않는 처리방법이 바람직하다. 그를 위한 방법으로서, 감독화처리제, 예를 들면 포르말린의 농도에 적합한 양의 리진을 첨가하는 방법, 또는 감독화처리후, 환원처리를 하는 방법 등이 공지이다.

[2] 물리적 방법

톡신을 적당한 농도로 완충액에 용해하고, 산성 pH(예를 들면 pH2-4), 알칼리 pH(예를 들면 pH8-11) 등, 톡신활성을 통상 잃게 되는 pH로 조절하면서, 소정의 온도로 보온처리한다. 또는, 톡신활성을 통상 잃게 되는 온도(예를 들면 40℃ 이상)로 조절하면서, 보온처리한다. 또는, 소정의 적당한 파장의 음파, 전자파 등의 조사처리를 한다. 처리도중과 처리후, 시료의 잔존 톡신활성을 측정한다. 필요에 따라, 감독화톡신을 적당한 온도, 예를 들면 37℃로 다시 보온하고, 톡신활성이 복 귀하지 않는 것을 확인한다. 면역증강활성이 있는 것을 확인하고, 감독화톡신을 얻을 수 있다. 또한, 화학적 처리와 물리적 처리는, 적절히 조합시켜 사용할 수 있다.

잔존 톡신활성의 확인방법

잔존 톡신활성의 측정은, 공지의 방법에 의한다(예를 들면, 일본 국립예방위생연구소 학우회편집, "백신핸드북", 마루젠, 1994년. 무라타료스케외 편집"단백독소"상권, 하권, 고단샤 사이엔테이픽, 1972년 등). 그 방법을 분류하면, 효소활성측정법, 동물세포의 생리적 응답측정법, 실험동물의 생리적 응답측정법, 또는 실험동물의 생사판정법 등으로 나뉜다. 구체적인 측정방법은 톡신에 따라 다르지만, 예를 들면 이하와 같은 지표를 예시할 수 있다. 이들 지표의 구체적인 측정방법은 공지이다. 또한, 톡신활성의 비교를 이들 지표로 한정하는 것은 아니지만, 감독화 전후의 톡신활성의 비교는 동일한 지표를 토대로 하여 행해야 하는 것은 말할 것도 없다.

(세균 톡신)

콜레라톡신, 병원성 대장균 이열성 톡신

ADP-리보실화 효소활성

cAMP의 축적

Y-1세포의 변형

마우스의 체중감소

CHO세포의 신장(伸長)

백일해톡신

ADP-리보실화 효소활성

CHO세포의 신장

백혈구 증다활성

히스타민 증감활성

마우스의 체중감소

CHO세포의 신장

디프테리아톡신

ADP-리보실화 효소활성

몰모트의 생존

토끼피부 감작활성

파상풍톡신

ADP-리보실화 효소활성

몰모트의 사망

토끼피부 감작활성

포도상구균α톡신, 포도상구균β톡신

용혈활성

시가톡신

용혈활성

녹농균 엔테로톡신A

ADP-리보실화 효소활성

장염비브리오균 내열성 용혈톡신

ADP-리보실화 효소활성

용혈활성

(진균톡신)

칸디톡신, 푸미가톡신,

마우스 사망활성

(동물톡신)

사독

콜린에스테라제활성

콜린에스테라제 저해활성

포스포리파제A2활성

혈액응고활성

혈소판응집활성

항보체활성

봉독

N-아세틸글루코사미니다아제활성

히알루로니다아제활성

톡신활성의 측정에 있어서는, 어느 한 측정방법으로 잔존 톡신활성이 인정되지 않더라도, 다른 방법으로는 다른 결과가 되는 경우도 있다. 예를 들면, 감독화 콜레라톡신의 잔존활성을 ADP-리보실화 효소활성으로 측정한 결과에서 실질적으로 제로이더라도, Y-1세포 형태변화법으로는 톡신활성을 검출한 예가 있다(예를 들면 K. Komase et al., Vaccine 16, 248-254, 1998). 또한, 대장균 이열톡신의 N말단으로부터 7번째를 리진잔기로 치환한 재조합 변이체에서는, ADP-리보실화 효소활성은 실질적으로 제로였지만 설사 야기성을 인정한 예가 있다. 즉, 대장균 이열톡신의 톡신활성은 ADP-리보실화 효소활성으로 대표되지만, 다른 기구에 의한 작은 제2의 톡신활성이 있어, 재조합 변이체에 있어서 제1의 활성이 현저히 낮아진 후에는, 제2의 톡신활성이 상대적으로 커지기 때문에 검출되는 것으로 생각된다. 일반적으로, 생세포나 생체를 사용하는 측정방법으로는 톡신활성이 보다 예민하게 검출되는 경향이 있다. 이 배경에는, 상기의 기구가 있는 것으로 추정된다.

따라서, 톡신활성의 비교는 생세포나 생체의 응답을 토대로 한 예민한 방법으로 행하는 것이 일반적으로는 보다 확실하다. 또 잔존 톡신활성은 복수의 측정방법에 의해 평가하는 것이 바람직하다. 본 출원의 실시예에서는, 콜레라톡신의 잔존 톡신활성은, 수용체 결합활성법, Y-1세포 형태변화법, 마우스 족종장법(足腫腸法) 및 마우스 복강내 투여법 등을 병용하여 평가했다. 또 항톡신항체를 이용하는 효소면역 측정법(ELISA)도, 톡신활성의 지표로서 유용하다. 어느 것으로 하던지, 원칙으로서 그 톡신활성을 예민하게 반영하는 지표를 토대로, 1/2000 이하의 톡신활성이 되도록 처리하는 것이 중요하다.

상기 감독화톡신에 보존제나 안정제, 또는 공지의 아쥬반트를 더 조합시켜 본 발명에 의한 아쥬반트가 구성된다. 아쥬반트의 안전성은, 일반적으로 반복 측정함으로써 판정된다. 또 안전성의 평가에 있어서는, 그 지표의 하나로 생물세포나 생체를 사용하는 측정방법을 채용하는 것이 바람직하다. 이들 방법에 더하여, 실험동물에 투여하여 급성 독성을 조사하는 일반적인 안전성 시험법을 병용하는 것은 말할 것 까지도 없다. 또 경구투여, 경피투여 및 경비투여에 있어서의 안전성의 지표로서 피부자극성이나 점막자극성에 문제가 없는 것을 확인하는 것도 중요하다.

아쥬반트활성

본 발명에 있어서는, 감독화처리에 의해 톡신활성을 1/2000 이하로 하는 한편으로, 아쥬반트활성을 유지한 감독화톡신을 아쥬반트로서 이용한다. 상기 [1]에 있어서 규정한 유지해야 할 3종의 아미노산잔기를 갖춘 톡신을 이용하면, 아쥬반트효과를 높게 유지할 수 있는 가능성이 높다. 그러나, 톡신활성의 저하를 위한 처리를 통하여, 아쥬반트활성이 저하되어 있는지의 여부는, 항상 확인할 필요가 있다. 아쥬반트활성은, 활성을 비교해야 할 물질을 면역항원과 함께 동물에 면역하여, 면역항원에 대한 항체가의 상승을 관찰함으로써 확인할 수 있다. 면역동물의 계통이나 면역항원 등의 조건을 통일하여 비교하면, 아쥬반트활성을 비교할 수 있다.

사용형태

본 발명의 감독화톡신을 백신의 유효성분으로서 사용하는 사용형태는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 공지의 여러 가지 적절한 사용형태에 적용할 수 있다. 예를 들면 물리적 혼합이나 항원단백질과의 화학적 결합물로 할 수 있다. 또한, 리보솜 등의 캐리어에 백신과 함께 내포시키는 것도 가능하다.

본 발명의 감독화톡신은 공지의 아쥬반트 하나 이상과 동시에 사용할 수 있다. 실시예 5에는 본 발명의 감독화 콜레라톡신과 공지의 아쥬반트의 하나 대장균 이열성 톡신 B서브유닛과의 혼합사용의 예를 나타냈다. 감독화톡신 아쥬반트는 대장균 이열톡신 B서브유닛과의 혼합사용에 있어서도 점막 면역활성을 유발하고, 또한, 상승효과가 인정되었다. 당업자라면 공지의 방법을 사용하는 시행실험에 의해, 바람직한 조합을 발견할 수 있다. 그 결과, 항원의 양을 저하시키거나, 다른 한쪽의 아쥬반트의 양을 저하시켜, 바람직하지 않은 부반응을 저하시키고, 바람직한 면역반응을 증강시킬 수 있다.

백신

본 발명에 의한 아쥬반트를 토대로, 신규 백신제제가 제공된다. 본 발명의 백신제제는, 아쥬반트와 면역항원으로 되고, 협의 및 광의의 백신을 포함한다. 즉, 1) 인간 및 동물에 감염되는 바이러스, 세균, 진균, 원충, 그 밖의 미생물에 유효한 협의의 백신을 포함한다. 그 일부를 예시하면, 인플루엔자백신, 백일해백신, 정제백일해 디프테리아 파상풍 혼합백신, 일본뇌염백신, A형간염백신, B형간염백신, 로타백신, 홍역백신, 풍진백신, 유행성 이하선염백신, 홍역 풍진 유행성 이하선염 3종 혼합백신, 홍역 풍진 2종 혼합백신 및 헤모피루스 인플루엔자백신 등의 각종 백신을 들 수 있다. 더 나아가서는, 결핵백신, 다제내성 황색포도상 구균(MRSA)백신, 헬리코박터 ·피롤리백신, 출혈성 대장균(EHEC)백신, 살모넬라백신, 클라미디어백신, 마이코플라즈마백신, 에이즈백신, 말라리아백신, 콕시듐백신 또는 주혈흡충백신을 포함한다. 2) 더욱이 광의의 백신으로서, 암백신, 불임백신, 위궤양백신, 당뇨병백신 및 동맥경화증백신 등 비감염증의 예방이나 치료에 유효한 백신을 포함한다. 백신의 접종방법으로서는 주사, 경구, 경피, 경비, 그 밖의 방법이 가능하다.

이들 백신은 제조방법에 의해 분류되는 여러 가지 백신을 포함한다. 즉, 약독화 생백신, 불활화백신, 콤포넌트백신, DNA를 토대로 하는 백신 등을 포함한다. DNA를 토대로 하는 백신중에는, 플라스미드 등의 캐리어에 짜 넣은 DNA 단편을 포함하는 백신 외에, 리보자임이나 안티센스올리고누클레오티드 등을 병용하는 백신이 포함된다. 이들 백신은, 치료용, 또는 예방용으로 사용된다. 또한, 백신의 효과에 있어서 유효한 항원성분을 유전자조작기술을 응용하여 재조합 생물세포에 생산시킨 것을 사용하는 재조합 백신도 포함된다. 이들 백신은 단미(單味)백신이더라도 혼합백신이더라도 좋다. 이들 백신의 제조방법이나 사용형태를 예시하면 다음과 같다.

·인플루엔자백신; 발육계란, 또는, 베로세포(Vero cells) 등 동물세포 배양기술에 의해 증식시킨 바이러스를 에테르, 계면활성화제 등으로 분해 정제하여 얻은, 또는 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 적혈구응집소(HA), 뉴라미니다아제(NA), 핵 단백질(NP), 매트릭스단백질(M) 또는 그 일부 등을 포함하는 주사용, 또는 경구, 경피, 경비용 스플릿백신. 또는, 이들 단백질의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 경비접종용 DNA 백신.

·백일해백신; 백일해균을 배양한 배양액 또는 균체로부터 염석, 초원심분리 등을 사용해 추출하여, 포르말린으로 무독화한 불활화백신, 또는, 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 백일헤균독소(PT), 적혈구응집소(FHA), 69K 막단백질, 또는, 그 일부 등을 포함하는 재조합 백신.

·백일해 디프테리아 파상풍 혼합백신; 백일해백신에 디프테리아톡소이드 및 파상풍톡소이드를 혼합한 주사용, 또는 경구, 경피, 경비용 3종 혼합백신.

·일본뇌염백신; 마우스뇌 내에서 증식한 바이러스, 또는 베로세포 등 동물세포 배양기술에 의해 증식한 바이러스를 초원심분리 또는 에틸알코올 등을 사용하여 바이러스입자를 정제한 후, 포르말린으로 불활성화 한 것, 또는 유전자조작이나 화학합성 등에 의해 얻은 항원단백질을 포함하는 백신.

·B형간염백신; B형간염 캐리어의 혈액을 원재료로 하여, 염석, 초원심분리를 사용하여 HBs 항원을 분리 정제한 플라즈마백신, 또는 유전자조작이나 화학합성 등에 의해 얻은 항원부위 등을 포함하는 재조합 백신.

·홍역백신; 닭태아세포 등의 배양세포, 또는, 발육계란에서 증식시킨 약독바이러스 생백신, 또는, 바이러스의 일부, 또는, 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 감염방어항원을 포함하는 재조합 백신.

·풍진백신; 닭태아세포 등의 배양세포, 또는, 발육계란에서 증식시킨 바이러스, 또는, 그 일부, 또는, 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 감염방어항원을 포함하는 백신.

·유행성 이하선염백신; 집토끼세포 등의 배양세포 또는 발육계란에서 증식시킨 바이러스, 또는, 그 일부, 또는, 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 감염방어항원을 포함하는 약독 생백신.

·홍역 풍진 유행성 이하선염 혼합백신; 홍역백신, 풍진백신, 유행성 이하선염백신을 혼합한 3종 혼합백신.

·홍역 풍진 혼합백신; 홍역백신, 풍진백신을 혼합한 2종 혼합백신.

·로타백신; MA104세포 등 배양세포로 증식시킨 바이러스, 또는 환자의 대변으로부터 얻은 바이러스, 또는, 그 일부, 또는 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 감염방어항원을 포함하는 백신.

·마이코플라즈마백신; 마이코플라즈마 증식용 배지에서 증식한 마이코플라즈마, 또는, 그 일부, 또는, 유전자조작이나 화학합성 등에 의해 얻어진 감염방어항원을 포함하는 백신.

·에이즈백신; 배양세포로 증식시킨 바이러스 또는 환자로부터 얻은 바이러스, 또는, 그 일부, 또는 유전자조작이나 화학합성에 의해 얻은 감염방어항원을 포함하는 백신, 또는 유효한 DNA 단편을 포함하는 DNA 백신.

·H.피롤리백신; 배양한 H.피롤리 균체의 파쇄물, 또는, H.피롤리 배양물로부터 분리된 우레아제, 열쇼크단백질, 독소 등을 항원으로 하는 백신, 또는, 유전자 재조합기술에 의해 생산된 이들 항원단백질로 된 주사용 또는 경구, 경피 및 경비접종 용 백신.

백신의 성상

상기 백신은 액상 또는 분말상으로 제공된다.

이들 백신은 본 발명의 감독화톡신과 함께 투여될 때는 액상 쪽이 비강내 투여(비강내 스프레이, 적하, 도포 등)나 주사의 경우에 적합한 경우가 많다. 더욱이 비강내 투여인 경우는, 분말 스프레이방식도 가능하다. 또한, 본 발명에 의한 백신제제에는, 공지의 안정제나 방부제를 배합할 수 있다. 안정제로서는, 0.2% 정도의 젤라틴이나 덱스트란, 0.1-1.0%의 글루타민산나트륨, 또는 약 5%의 젖당이나 약 2%의 소르비톨 등이 사용된다. 방부제로서는, 0.01% 정도의 치메로살이나 0.5% 정도의 페녹시에탄올, 0.1% 정도의 베타 프로피노락톤 등이 공지이다.

감독화톡신의 혼합비율

본 발명에 의한 백신에 있어서의 항원과 감독화톡신의 혼합비율로서, 1:0.0001∼1:10000(중량비)을 예시할 수 있다. 이 범위는 일반적인 범위로서, 백신의 종류에 따라 바람직한 비율을 결정하여 사용한다. 그를 위해 필요한 방법은, 당업자에게 공지이다. 실시예에 나타낸 천연톡신의 감독화체를 포함하는 본 발명에 의한 아쥬반트는, 천연체와 동일한 사용량으로 동일한 레벨의 면역증강활성을 나타낸다. 한편, 공지의 재조합 변이체에서는, 천연톡신과 동일한 레벨의 면역증강활성을 달성하기 위해 보다 많은 접종이 필요로 해지는 것이 많다.

감독화톡신의 혼합법

본 발명의 백신제제는, 상기 백신에 본 발명의 감독화톡신 아쥬반트를 소정의 양비로 혼합함으로써 조제된다. 조제는 엄밀일 무균적으로 행해야만 한다. 각각의 원재료도 무균적으로 조제된다. 백신작용 이외에 필요가 없는 파이로젠이나 알레르겐으로 되는 교잡단백질은 가능한 한 제거해 두는 것이 요망된다. 당업자에게 있어서, 그를 위해 필요한 방법은 공지이다. 본 발명의 백신제제는, 백신항원과 본 발명의 감독화톡신을 각각 따로따로 조제, 제제화해 두고, 필요할 때 혼합한 후에 접종하던가, 또는, 따로 따로, 거의 동시에 투여한다고 하는 방법에 의해서도, 효과를 발휘시킬 수 있다.

백신접종법

본 발명에 의한 백신의 사용방법은 공지의 어떤 방법도 사용할 수 있다.

접종량은 마우스의 경우, 비강내에서 5 μL∼50 μL, 인간의 경우는 비강내 투여, 주사 어느 쪽의 경우도 0.1∼1.0 mL가 바람직하다. 경피접종에서는, 백신조성물을 담체에 유지시켜, 피부에 접촉시킴으로써 접종이 행해진다. 백신조성물에 있어서의 항원단백질의 양은, 일반적으로 1투여당 0.1 ng∼100 mg, 바람직하게는 1 ㎍∼1 mg 정도이다. 한편, 아쥬반트는, 사용되는 면역항원의 종류나 사용량에 따라, 적절한 배합량이 결정된다. 백신조성물을 유지시키는 담체에는, 린트(lint)천과 같은 흡수성의 담체나, 또는 연고나 스프레이로서 도포하기 위한 공지의 담체를 사용할 수 있다.

다음에 예시하는 백신은, 효과면에서, 또는, 접종조작면에서, 경구접종, 경피접종 또는 경비접종이 강하게 요망되고 있다. 즉, 인플루엔자백신, 백일해백신, 디프테리아백신, 로타백신, 홍역백신, 풍진백신, 유행성 이하선염백신, 헬리코박터 ·피롤리백신, 출혈성 대장균(EHEC)백신, 클라미디어백신, 마이코플라즈마백신, 콕시듐백신, 에이즈백신, 말라리아백신 및 주혈흡충백신 등에서는 이들 접종방법이 요망되고 있다.

이들 백신은, 단독으로 접종되는 경우도 있고, 백일해 ·디프테리아 ·파상풍 3종 혼합백신, 또는, 홍역 ·풍진 2종 혼합백신과 같이, 복수의 백신을 혼합하여, 동시에 접종하는 방법을 채용할 수도 있다. 경구접종, 경비접종이 요망되는 이유는, 하나는, 기도나 소화관의 점막이 감염초기의 중요한 부위이기 때문이다. 적절한 면역증강활성이 강한 아쥬반트를 포함하는 백신의 접종에 의해, 국소점막에 있어서의 면역기구를 유발하여, 가능한 한 감염초기에 방어효과를 발휘시키는 것이 가능해진다. 또는, 말라리아백신과 같이, 반드시 충분한 의료시설을 기대할 수 없는 지역에서 사용될 기회가 많은 것이 예상되는 백신에 대해서는, 의사나 간호사 등 전문 의료기술자의 도움 없이도 접종이 가능한 접종방법으로서, 경구접종, 경피접종 및 경비접종 등이 요망되기 때문이다. 더욱이 경피접종이 요망되는 이유로서, 부작용 등이 발생했을 때, 필요에 따라 백신접종을 중단할 수 있는 것 등을 들 수 있다.

도면의 간단한 설명

도1은, 감독화 콜레라톡신의 강글리오시드 GM1로의 결합능을 나타내는 그래프이다.

콜레라톡신을 포르말린처리에 의해 감독화하여, 본 발명의 아쥬반트를 제조하는 도중에 실시한, 감독화 확인시험예를 나타낸다. 도중, 세로축은, 수용체인 강글리오시드 GM1로의 결합능(ELISA의 OD/410 nm)을, 가로축은, 톡신농도(ng/mL)를 나타낸다.

도2는, 2차응답에 의한 비강점막에 있어서의 항 인플루엔자바이러스 항체산생에 대한 감독화 콜레라톡신의 증강작용을 나타내는 그래프이다.

본 발명의 백신제제중, 백신으로서 인플루엔자백신을 사용한 것을 경비접종했을 때의 비강세액중의 항체가를 나타낸다. 세로축은 여러 가지 조건으로 처리한 감독화 콜레라톡신을 나타내고, 가로축은 비강세액중의 항 HA IgA 항체농도(㎍/mL)를 나타낸다.

도3은, 2차응답에 의한 혈청중의 항 인플루엔자바이러스 항체산생에 대한 감독화 콜레라톡신의 증강작용을 나타내는 그래프이다.

본 발명의 백신제제중, 백신으로서 인플루엔자백신을 사용한 것을 경비접종했을 때의 혈청중의 항체가를 나타낸다. 세로축은 여러 가지 조건으로 처리한 감독화 콜레라톡신을 나타내고, 가로축은 혈청중의 항 HA IgG 항체농도(㎍/mL)를 나타낸다.

도4는, 감독화톡신의 면역증강활성을 나타내는 그래프이다.

잔존 톡신활성이 다른 콜레라톡신을 아쥬반트로서 포함하는 본 발명의 인플루엔자백신을 경비접종하여, 2차응답에 있어서의 비강세액중, 또는 혈청중의 항체가를 나타낸다. 세로축은, 천연 콜레라톡신을 사용한 대조구의 항 HA IgA 항체가에 대한, 감독화 콜레라톡신을 사용한 시험구의 비강세액중의 항 HA IgA 항체가의 상대값(■) 및 천연 콜레라톡신을 사용한 대조구의 항 HA IgG 항체가에 대한, 감독화 콜레라톡신을 사용한 시험구의 혈청중의 항 HA IgG 항체가의 상대값(Ｏ)을 나타내고, 가로축은 천연톡신의 활성에 대한, 시험에 사용한 감독화 콜레라톡신의 잔존 톡신활성의 상대값(Y-1세포 형태변화법으로 측정)을 나타낸다.

도5는, 두개의 아쥬반트의 상승효과를 나타내는 그래프이다.

아쥬반트로서, 본 발명의 감독화 콜레라톡신 및 공지의 대장균 이열톡신 B서브유닛을 병용하여, 이들을 포함하는 인플루엔자백신을 경비접종했을 때의 면역응답을 나타낸다. 세로축은 시험에 사용한 아쥬반트의 종류와 양을 나타내고, 가로축은 면역응답을 마우스 족종장법으로 측정한 결과를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 조금도 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 콜레라톡신의 조제

콜레라톡신은 Finkelstein등의 방법〈R. A. Finkelstein et al. J. Infect. Dis., 121, Suppl., S63, 1970)에 준하여 제조했다.

톡신생산성 콜레라균(Vibrio chorela 이나바형 569B주)을 Finkelstein등의 반합성 카자미노산배지(글루코오스첨가 액체배지)에서 30℃, 20시간 배양했다. 배양후, 배양상청을 콜레라톡신분자(분자량 8.6만)가 통과하는 한외여과막을 통과시켰다. 통과액에 소량의 수산화알루미늄겔을 가하여 톡신을 흡착시키고, 원심에 의해 모았다. 30-35℃로 가온하면서, 10% 인산-10% 구연산염(pH7.6)으로 용출하고, 용출액을 0.1M 구연산염 수용액에 대해 투석했다. 그 후, DEAE-세파덱스의 컬럼에 통탑(通塔)하고, 0.1-0.2M 식염수첨가 인산완충액(이하 PBS라 생략한다)으로 용출했다. 다음에 세파덱스 G-75의 컬럼에 통탑하여, PBS로 용출했다. 얻어진 시료를 겔 전기영동법에 의해 조사한 결과, 콜레라톡신만의 염색대가 관찰되었다. 순도는 약 95%였다. 수량(收量)은 배양액 100 L에서 250 mg이었다.

실시예 2 콜레라톡신의 감독화

실시예 1에서 얻은 정제 콜레라톡신을 0.01M 생리식염수첨가 PBS(pH7∼8)로 용해했다. 여기에 0.05M의 리진을 가하고, 그 후, 종농도에서 0.1, 0.3, 0.5, 0.6, 0.8 및 1.0%가 되도록, 포르말린을 적하하여, 30-40℃에서 각각 7-96일간 보온했다. 보온 도중에 시료를 채취하여, 채취한 시료를 바로 20배량의 PBS에 대해 투석하여, 포르말린을 제거했다. 그 후, 여과제균하여, 감독화 콜레라톡신을 얻었다. 도중 채취한 시료의 일부를 사용하여, 도중경과를 확인했다. 일례로서, 포르말린처리 12일째의 시료에 대해서, 콜레라톡신 B서브유닛의 수용체인 강글리오시드 GM1로의 결합능(톡신의 표적세포에 대한 결합기능을 갖는 서브유닛, 톡신활성은 A서브유 닛에 의해 초래되고 있다)을 측정하는 방법에 의해 잔존 톡신활성을 측정한 결과를 도1에 나타낸다. 이 결과로부터, 0.3%, 또는 0.5%의 포르말린으로 12일간 처리한 경우에, 강글리오시드 GM1로의 결합능은 각각, 천연체의 약 1/15, 1/100로 저하되는 것을 알 수 있다.

여러 가지 조건으로 감독화처리를 행한 각종 시료의 잔존 톡신활성을 Y-1세포 형태변화법으로 측정했다. 그 결과의 일례를 표2에 나타낸다. 이 결과로부터, 0.3% 및 0.5% 포르말린으로 12∼96일간 처리한 경우, 잔존 톡신활성은 1/1780∼1/114000로 저하되는 것을 알 수 있다. 상기와 같이 조제한 감독화 콜레라톡신을 사용하여, 마우스에 있어서의 급성 독성을 조사했다. 표2에 기재의 잔존 톡신활성이 1/7000 이하인 감독화 콜레라톡신은, 어느 것도 30 mg/kg의 복강내 투여에 있어서 독성의 징후는 인정되지 않았다. 따라서, 35℃, 0.3% 포르말린처리라면, 12일 이상의 처리로 톡신활성 1/2000 이하(마우스 급성 독성을 지표로 한다)로 할 수 있다.

표 2

포르말린처리 콜레라톡신의 잔존 톡신활성

(Y-1세포 형태변화법으로 측정한 결과에 의함)

실시예 3 인플루엔자 HA 백신에 대한 2차 항체산생 증강작용

마우스에 순화(馴化)된 인플루엔자바이러스 PR8주(A/푸에르토 리코(Puerto Rico)/8/34, H1N1형)로부터 조제한 HA 항원을 백신용 항원으로서 사용했다. 아쥬반트에는 감독화 콜레라톡신을 사용했다. 사용한 감독화 콜레라톡신의 잔존 톡신활성은, 1/1780∼1/114000(Y-1세포 형태법에 의한다)이었다. BALB/C마우스(6주 연령, 암컷)를 1군 5마리로 시험에 사용했다. 마우스를 아모발비탈나트륨을 복강내 투여하여 마취했다. 1 ㎍의 백신항원과 1 ㎍의 아쥬반트를 포함하도록 조제한 생리적 식염수첨가 PBS10 μL를 마우스의 한쪽 비공으로부터 적하하여, 경비면역했다. 4주일후 동일한 조건으로 더 2차면역했다. 2차면역 2주일후, 마우스의 혈청과 비강세액을 채취했다.

혈청중의 항 인플루엔자바이러스 항체가는 HI 항체가에 의해 측정했다. 비강세액은, 방혈후 마우스의 좌우 비강으로부터 1 mL의 0.1% 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBS를 관류함으로써 회수했다. 비강세정액중의 HA-IgA 항체량 및 혈청중의 항 HA-IgG 항체량은 효소면역측정법(ELISA)에 의해 측정했다. 항 HA-IgA의 정량시에는, 코팅완충액에 현탁한 HA 백신(5 ㎍/mL) 50 μL로 먼저 EIA 플레이트의 각 웰을 코팅했다. 실온에 2시간 방치후, 트윈 20첨가 PBS(이하 PBS-트윈으로 기록한다)로 플레이트를 세정했다. 다음에, 비특이반응을 억제하기 위해, 1% BSA 및 0.1% NaN₃를 포함하는 PBS, 100 μL로 각 웰을 코팅했다. 4℃에 하룻동안 방치후, PBS-트윈으로 세정했다. 이 웰에 적당히 희석한 비강세정액시료 100 μL를 분주하고, 수시간 후에 반응액을 제거하여 PBS-트윈으로 세정했다. 다음에 각 웰에 100 μL의 1% BSA 및 0.1% NaN₃를 포함하는 PBS로 희석한 알칼리포스파타제 표지 염소 항 마우스 IgAα사슬 특이항체(또는 알칼리포스파타제 표지 염소 항 마우스 IgG 항체)를 분주했다. 실온에 1시간 방치후에 세정했다. 마지막으로, 각 웰에 10% 디에탄올아민완충액(pH9.8)으로 용해한 p-니트로페닐인산(1 mg/mL; 시그마사제)을 가하여 발색시켰다. 실온에서 20∼30분 방치후, 발색을 플레이트 리더를 사용하여 OD(405 nm)로 측정했다.

도2는 실시예 2에서 조제한 감독화 콜레라톡신을 아쥬반트에 사용한 인플루엔자백신의, 2차응답에 의한 비강세액중의 항 인플루엔자 HAIgA 항체산생에 대한 영향을 나타낸 것이다. 아쥬반트 무첨가 백신을 비강내 접종했을 때에는, 항 HA- IgA 항체의 역가는 낮았다. 이에 대해, 감독화 콜레라톡신첨가 백신으로 1차, 2차접종한 그룹에서는 비강세액중의 항 HA-IgA 항체가의 현저한 상승이 관찰되었다. 그 항체가는 대조로서 사용한 동용량의 천연체 콜레라톡신의 경우와 동등했다.

도3은 상기 시험에 있어서의, 혈철중 항 HA IgG 항체산생에 대한 영향을 나타낸 것이다. 감독화톡신은 혈청중의 HA 항체가를 아쥬반트 무첨가의 경우보다도 15배 정도 상승시켰다. 그러나, 항체가는 대조로서 사용한 천연체 콜레라톡신의 경우의 반정도였다. 이들 결과로부터, 감독화 콜레라톡신은, 예를 들면 국소 면역증강을 필요로 하는 백신의 아쥬반트로서 유용한 것을 알 수 있다.

실시예 4 고도 감독화톡신의 아쥬반트활성

아쥬반트로서 잔존 톡신활성이 천연체의 1/2000 이하인 여러 가지 다른 감독화 콜레라톡신을 사용했다. 실시예 2와 동일한 시험을 복수회 실시하여, 마우스 비강세액중의 항 HA-IgA 및 혈중 IgG 항체가를 측정했다. 시험 마다의 항체가를, 양성 대조로서 사용한 동용량의 천연체 콜레라톡신의 경우의 항체가에 대한 상대값으로 환산했다. 이 상대값을 세로축에, 사용한 감독화톡신의 감독화율(천연체에 대한 상대 잔존활성)을 가로축에 그래프화 했다(도4). 잔존 톡신활성이 천연체의 1/2000 이하(1/2000≒4^-5.46)의 많은 감독화톡신이, 동용량의 천연체 콜레라톡신에 필적하는 높은 항체산생 증강작용을 나타내는 것이 명확하다. 특히 경비접종에 의한 항원특이적 점막 IgA의 증강에 대해, 1/2000 이하의 잔존 톡신활성을 갖는 것으로 감독화 전의 톡신과 동등, 또는 그 이상의 유효성을 나타내는 것이 확인되었다.

실시예 5 두개의 아쥬반트의 병용

아쥬반트로서 포르말린처리로 감독화한 콜레라톡신(Y-1세포 형태변화법에 의한 잔존 톡신활성 1/1048000) 및 톡신활성이 약한 것이 이미 확립되어 있는 대장균 이열톡신 B서브유닛(미처리)을 동시에 사용했다. 실시예 3과 동일하게 실시하여, 인플루엔자바이러스에 대한 세포성 면역응답을, 마우스 족종장법으로 측정했다. 결과는 도5에 나타내는 바와 같았다. 대장균 이열톡신 B서브유닛 1 ㎍과 감독화 콜레라톡신을 0.1 ㎍, 0.01 ㎍을 동시에 사용하는 조건하에서는, 동량의 감독화 콜레라톡신을 단독 사용했을 때 보다, 면역응답은 명확히 증강되었다. 이 결과는, 감독화톡신과 별도의 아쥬반트를 동시에 사용하는 방법에 의해, 감독화톡신의 사용량을 더욱 낮게 억제할 수 있는 것을 나타낸다.

실시예 6 각종 감독화톡신의 조제와 항체산생 증강작용

키타사토연구소제 디프테리아백신과 백일해백신을 제조하는 방법(키타사토연구소편저 ·발행, 「백신제조기술 교본」, 1986)에 준하여, 각각, 디프테리아톡신과 백일해톡신을 조제했다. 실시예 2와 동일한 방법으로 감독화한 이들 톡신을 알루미늄겔에 흡착시켜 실험에 사용했다. 또한, 시판의 포도상구균α톡신(시그마사제), 장염비브리오 내열톡신(시그마사제)을 구입하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 감독화하여 그대로 사용했다. 대장균 이열톡신의 재조합 변이체 LTR(7)K(N말단으로 부터 7번째의 알기닌잔기를 리진잔기로 치환한 것)는, 고마세등의 방법(K. Komase et al., Vaccine 16, 248-254, 1998)으로 조제했다. 이렇게 해서 5종류의 감독화톡신을 얻었다. 실시예 3에 있어서의 감독화 콜레라톡신 대신에, 상기한 바와 같이 조제한 감독화톡신을 적당한 농도로 사용하는 것 이외에는 실시예 3의 조작에 따라 인플루엔자백신에 있어서의 면역 증강효과를 조사했다. 표3에는 감독화톡신의 잔존 톡신활성의 상대값(천연체에 대한 감독화율)과 함께, 그 결과를 나타낸다.

이 결과로부터, 천연톡신, 재조합 변이체톡신의 어느 것도, 본 발명을 구성하는 아쥬반트는 경비접종루트로 투여된 인플루엔자백신에 대해, 면역증강활성이 있는 것을 알 수 있었다.

표3

각종 감독화톡신의 항체산생 증강작용

실시예 7 백일해 디프테리아 파상풍 혼합백신-감독화 콜레라톡신제제(점비제):

백일해 디프테리아 파상풍 혼합백신과, PBS에 용해하여 여과멸균한 감독화 콜레라톡신(천연체와 비교한 톡신활성은 약 1/100000)을 혼합하여, 20 μL중에 혼합백신이 단백질질소로서 50 ㎍과 감독화 콜레라톡신 5 ㎍을 포함하도록 조제했다. 이것에 방부제(0.005% 치메로살)를 가하고, 적당한 용기에 적정량 분주하여, 백일해 디프테리아 파상풍 혼합백신-감독화 콜레라톡신 경비투여제로 했다. 본 제품은 10℃ 이하의 냉하고 어두운 곳에 저장했다.

상기와 같이 조제한 백일해 디프테리아 파상풍 혼합백신 및 감독화톡신을 포함하는 백신을 각 군의 마우스에 접종하고, 더욱이, 4주일후에 동량의 백신을 추가접종하여, 그 2주일후의 항체산생을 조사했다. 항 백일해톡신항체, 항 디프테리아톡신항체, 항 파상풍톡신항체의 역가(국제단위)는, 백신만이 접종된 마우스에 있어서는 각각, 2.0단위 이하, 2.0단위 이하 및 1.5단위 이하였다. 한편, 감독화톡신을 포함하는 백신접종군에서는, 각각, 88.6, 61.8, 그리고 75.5단위였다. 시험성적으로부터, 아쥬반트 무첨가 백신이 접종된 마우스에 비해, 감독화톡신을 포함하는 백신접종군에서는, 어느 쪽의 항원에 대해서도, 항체산생량이 높은 것을 알 수 있다.

실시예 8 파상풍백신-감독화 콜레라톡신제제(경피제):

키타사토연구소제 파상풍톡소이드를 제조하는 방법(키타사토연구소편저 ·발행, 「백신제조기술 교본」, 1986)에 준하여, 파상풍톡소이드를 조제하여, 항원으로 했다. 실시예 1 및 2에 기재의 방법으로 콜레라톡신 및 감독화 콜레라톡신(천연 체에 비교한 톡신활성은 약 1/2500)을 조제하여, 아쥬반트로서 시험에 사용했다. 파상풍톡소이드용액(400 Lf/ml)과 콜레라톡신용액(4 mg/ml) 또는 감독화 콜레라톡신용액(4 mg/ml)을 다른 용량비로 혼합하여, 백신(1 mL)으로 했다. 백신은, 조제후 즉시 천기제(린트 천, 약 2cm×2cm)에 스며들게 하여, 면역에 사용했다.

몰모트(각군 5마리)를 아래와 같이 면역했다. 몰모트의 배부(背部)의 털을 이발기계로 자르고, 탈모크림을 도포하여, 30분후, 몰모트 배부를 씻었다. 다음날, 배부에 시료를 도포한 천기제를 부착하고, 점착테이프로 고정하여 일반적인 방법에 의해 사육했다. 매주 1회, 4주에 합계 4회 부착하여, 부착개시 4주일후에 첫번째 채혈했다. 첫회 면역 6주일후에 5회째의 부착(부스터)을 행하여, 그 1주일후(첫회로부터 7주일후)에 두번째 채혈했다.

혈중 항체가 측정에는, 파상풍항체 측정키트「화혈연(化血硏)」을 사용했다. 파상풍독소 항체가측정의 결과를 표4에 나타낸다. 7주일후, 감독화 콜레라톡신첨가 백신투여군의 항체가는, 무첨가 백신투여군(대조) 보다 항체가가 높았다.

표4

시험군 번호	파상풍 톡소이드 (Lf/천기제)	톡신 (mg/천기제)	4주일후 혈중 항체가 (국제단위/mL)	7주일후 혈중 항체가 (국제단위/mL)
1	100	감독화 콜레라톡신 1.0	3.6	12.3
2	100	감독화 콜레라톡신 0.1	2.6	9.2
3	100	천연 콜레라톡신 1.0	4.1	25.6
4	100	천연 콜레라톡신 0.1	2.6	14.3
5	100	무첨가	2.0 이하	3.1

실시예 9 B형간염백신-감독화 콜레라톡신(주사제):

B형간염백신과, PBS에 용해하여 여과멸균한 감독화 콜레라톡신(천연체와 비 교한 톡신활성은 1/10⁶ 이하)을 포함하는 획분을 혼합하여, 1 mL중에 HBs 항원이 단백질로서 40 ㎍과, 감독화 콜레라톡신 10㎍을 포함하도록 조제했다. 이에 방부제(0,01% 치메로살) 및 안정제(0.2% 돼지 유래 젤라틴)를 가하고, 적당한 용기에 적정량 분주하여, B형간염백신-감독화 콜레라톡신 주사제로 했다. 본 제품은 10℃ 이하의 냉하고 어두운 곳에 저장했다.

상기와 같이 조제한 B형간염백신을 마우스에 접종하여, 3주일후의 혈중 항체산생을 조사했다. 그 결과, 아쥬반트 무첨가 백신이 접종된 마우스에서는, 수동 적혈구응집반응에서, 2^3.6단위였던 것에 대해, 감독화 콜레라톡신을 첨가한 것에서는 2^5.8단위였다.

실시예 10 일본뇌염백신-감독화 콜레라톡신제제(주사제):

일본뇌염백신과, PBS에 용해하여 여과멸균한 감독화 콜레라톡신(천연체와 비교한 톡신활성은 1/100000 이하)을 혼합하여, 1 mL중에 10^7.0 PFU 상당량의 불활화 일본뇌염 바이러스입자와, 감독화 콜레라신 2 ㎍을 포함하도록 조제했다. 이에 안정제(0.2% 돈제 젤라틴)를 가하고, 적당한 용기에 적정량 분주하여, 일본뇌염백신-감독화 콜레라톡신 주사제로 했다. 본 제품은 10℃ 이하의 냉하고 어두운 곳에 저장했다.

상기와 같이 조제한 일본뇌염백신을 1주일 간격으로 2회 마우스에 접종하여, 혈중 항체가를 측정했다. 아쥬반트 무첨가 백신을 접종한 경우에 산생되는 중화항체가는 10^1.8이던데 대하여, 감독화 콜레라톡신을 첨가한 것에서는 10^2.9였다.

실시예 11 홍역 풍진 혼합백신-감독화 콜레라톡신제제(점비제):

홍역 풍진 혼합백신과, PBS에 용해하여 여과멸균한 감독화 콜레라톡신(천연체와 비교한 잔존 톡신활성은 약 1/28500)을 혼합하여, 20 μL중에 각 백신 7 ㎍ 상당량의 바이러스입자와, 감독화 콜레라톡신을 2.5 ㎍ 포함하도록 조제했다. 이에 안정제(0.2% 돈제 젤라틴, 0.1% 글루타민산나트륨, 5% 젖당)를 가하고, 적당한 용기에 적정량 분주하여, 홍역 풍진 혼합백신-감독화 콜레라톡신 점비제로 했다. 본 제품은 10℃ 이하의 냉하고 어두운 곳에 저장했다.

상기와 같이 조제한 홍역 풍진 혼합백신을 3주 간격으로 2회 마우스에 투여하여, 혈중 항체산생을 측정했다. 그 결과, 아쥬반트 무첨가 백신을 투여한 경우에 산생되는 홍역, 풍진의 ELISA 항체가는, 각각은, 0.18, 0.08이었던 것에 대해, 감독화 콜레라톡신첨가 백신은, 각각 0.34, 0.42였다.

실시예 12 홍역 풍진 혼합백신-감독화 백일해톡신제제(점비제):

실시예 10에 있어서의 감독화 콜레라톡신 대신에 감독화 백일해톡신(실시예 6에서 조제한 것, 천연체와 비교한 톡신활성/CHO세포 변형시험법은 1/100000 이하)을 사용하는 것 이외에는 실시예 11의 조작에 따라 마우스의 혈중항체가를 측정했 다. 아쥬반트 무첨가 백신을 투여한 경우에 산생되는 홍역, 풍진의 ELISA 항체가는, 각각 0.19, 0.070이었던 것에 대해, 감독화 백일헤톡신첨가 백신은, 0.32 및 0.16이었다.

실시예 13 로타백신 -감독화 재조합 대장균 이열톡신 제제(경구, 점비제):

로타백신과, PBS에 용해하여 여과멸균한 감독화 재조합 LTR(7)K(천연체와 비교한 톡신활성은 약 1/260000, 실시예 6과 동일한 것)를 포함하는 획분을 혼합하여, 20 μL중에 로타백신 3.5 ㎍ 상당량의 바이러스입자와, 감독화 재조합 LTR(7)K를 10 ㎍ 포함하도록 조제했다. 이에 방부제(0.01% 치메로살) 및 안정제(0.2% 돼지유래 젤라틴)를 가하고, 적당한 용기에 적정량 분주하여, 로타백신-감독화 LT톡신경구제 및 점비제로 했다. 본 제품은 10℃ 이하의 냉하고 어두운 곳에 저장했다.

상기와 같이 조제한 로타백신을 3주 간격으로 2회 마우스에 투여하여, 혈중 항체산생 역가를 측정했다. 점비접종의 경우, 백신만을 투여한 경우에 산생되는 ELISA 항체가는, 0.072였던 것에 대해, 감독화 LT톡신첨가 백신접종의 경우는, 0.40이었다. 또한, 경구접종의 경우, 아쥬반트 무첨가 백신을 투여한 경우에 산생되는 ELISA 항체가는, 0.020이었던 것에 대해, 감독화 LT톡신첨가 백신접종의 경우는, 0.19였다.

이상의 실시예에 의해 다음 사실이 명확하다.

1. 감독화톡신으로 구성되는 본 발명의 아쥬반트는, 공존하는 인플루엔자백신 항원 등에 대한 항체산생을 증강시킨다.

2. 본 발명에 의한 아쥬반트와 함께 백신항원을 경비접종하는 경우, 혈중 항체산생 뿐 아니라 국소 항체산생도 증강된다.

3. 본 발명의 아쥬반트는, 잔존 톡신활성이 검출한계 이하의 레벨까지 저하되고 있는 경우에도, 항원과 공존하는 경우, 동일한 사용량으로 천연체톡신과 동일한 정도의 면역 증강작용을 나타낸다.

4. 본 발명의 아쥬반트와 공지의 다른 아쥬반트를 병용한 경우, 상승적으로 항체산생이 증강되는 경우가 있다. 바꿔 말하면, 본 발명의 아쥬반트와 적절한 조합의 아쥬반트를 병용하는 방법에 의해, 백신항원의 섭취량을 감소시킬 수 있어, 부반응이 일어날 가능성을 줄일 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 의한 감독화톡신을 포함하는 백신제제는, 안정성이 높은 아쥬반트로서 유용하다. 더욱 본 발명의 아쥬반트를 이용한 백신은, 안전성이 높고 또한 경비접종, 경피접종 또는 경구접종이라는 공지의 방법으로는 효과적인 면역을 기대하기 어려운 접종루트이더라도, 충분한 면역증강활성을 가진 우수한 백신이 된다. 더욱이 본 발명을 토대로 하는 백신은, 실시예에서 나타낸 바와 같이 국소면역이나 세포성 면역의 유도능이 우수한 등, 공지의 아쥬반트로는 달성이 곤란했던 과제를 해결하는 것이다. 더욱이 본 발명은, 천연체의 톡신으로도 안전한 아쥬반트로서 이용하는 것을 가능하게 한다. 그 때문에 톡신의 변이체를 만들어낸다고 하는 어프로치에 비해, 훨씬 용이하게 백신으로의 응용을 실현할 수 있다.

Claims (12)

1. 천연톡신을 구성하는 아미노산서열중, 세린잔기, 글루타민산잔기 및 리진잔기를 보유하고 있는 톡신, 또는 그 서브유닛을 화학적 처리에 의해 감독화하여, 잔존 톡신활성을 천연체의 1/2000 이하로 하고, 천연톡신과 실질적으로 동등한 면역증강활성을 보유하고, 리진 잔기에 포르말린 분자가 결합되어 있는, 감독화톡신을 포함하는 아쥬반트.
2. 제1항에 있어서, 톡신이, 천연톡신의 아미노산서열에 대해 1, 또는 복수의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 및 부가로부터 선택된 적어도 하나의 변이를 포함하는 아미노산서열에 의해 구성된, 아쥬반트활성을 갖는 변이체인 아쥬반트.
3. 제1항에 있어서, 톡신이 천연톡신인 아쥬반트.
4. 제1항에 있어서, 톡신이 세균톡신인 아쥬반트.
5. 제4항에 있어서, 톡신이, 콜레라톡신, 백일해톡신, 병원성 대장균 이열성 톡신, 포도상구균α톡신, 포도상구균β톡신 및 장염비브리오균 내열성 용혈톡신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 톡신인 아쥬반트.
6. 제5항에 있어서, 톡신이 천연 콜레라톡신으로, 포르말린처리에 의해 감독화하여 그 톡신활성을 1/2000 이하로 한 아쥬반트.
7. 제6항에 있어서, 톡신활성이 1/10000 이하인 아쥬반트.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 아쥬반트와 면역항원을 포함하는 백신제제.
9. 제8항에 있어서, 경비접종을 위한 것인 백신제제.
10. 제8항에 있어서, 경구접종을 위한 것인 백신제제.
11. 제8항에 있어서, 경피접종을 위한 것인 백신제제.
12. 제8항에 있어서, 면역항원이, 인플루엔자바이러스, 로타바이러스, 홍역바이럿, 풍진바이러스, 유행성 이하선염바이러스, 에이즈바이러스, 백일해균, 디프테리아균, 헬리코박터 ·피롤리균, 출혈성 대장균(EHEC), 클라미디어원충, 마이코플라즈마원충, 말라리아원충, 콕시듐원충 및 주혈흡충으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단일 또는 복수의 병원미생물의 항원인 백신제제.

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