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CN118464887A - 一种用于肝素效价测定的终止液及其应用 - Google Patents

一种用于肝素效价测定的终止液及其应用 Download PDF

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CN118464887A CN202410909827.8A CN202410909827A CN118464887A CN 118464887 A CN118464887 A CN 118464887A CN 202410909827 A CN202410909827 A CN 202410909827A CN 118464887 A CN118464887 A CN 118464887A
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由鹏飞
石峰
咸瑞卿
巩丽萍
杭宝建
陈真
张冬梅
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Shandong Institute for Food and Drug Control
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Abstract

本发明公开了一种用于肝素效价测定的终止液及其应用，属于生物分析技术领域。所述的用于肝素效价测定的终止液为0.05~1.0 mol/L的柠檬酸水溶液。该用于肝素效价测定的终止液用于肝素类药物效价测定，不具有挥发性、腐蚀性和毒性，可以避免对实验人员的危害和对测定仪器的腐蚀，且对反应体系无干扰，终止后结果稳定。

Description

一种用于肝素效价测定的终止液及其应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种用于肝素效价测定的终止液及其应用。
背景技术
肝素类药物是目前临床上广泛使用的抗凝药物，其抗凝机制为与血浆中的抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）等抗凝蛋白结合，抗凝血酶Ⅲ是血浆中一种丝氨酸蛋白酶抑制物，其分子上具有精氨酸残基；凝血因子Xa（FⅩa）和凝血因子Ⅱa（FⅡa）都属于丝氨酸蛋白酶，其活性中心含有丝氨酸残基；抗凝血酶Ⅲ分子上的精氨酸残基可以与这些丝氨酸蛋白酶活性中心的丝氨酸残基结合，“封闭”了这些凝血因子的活性中心而使其失活，从而发挥抗凝作用。
效价测定是肝素类药物的关键质量属性，底物法是近年发展起来的肝素效价测定方法，目前各国药典中肝素效价测定均采用该方法。其原理为以肝素的抗凝血因子活性为基础，肝素在过量的抗凝血酶Ⅲ存在下，与之形成复合物，成为活化的FⅩa和FⅡa的快速抑制剂，剩余的FⅩa 和FⅡa 与含有精氨酸或赖氨酸残基的底物如S-2765 或S-2238发生反应，底物上带的发色基团游离出来呈黄色，最后用终止液终止反应，在405 nm 波长下测其吸光度值，吸光度值的强弱与肝素的浓度呈反比，用量反应平行线法可计算出肝素的量。
目前该方法所用的终止液均为高浓度的醋酸（中国药典为50%醋酸），醋酸具有很强的挥发性和腐蚀性，高浓度醋酸蒸气对实验人员的呼吸道有较大的危害，并且对肝素效价测定所用的仪器具有较强的腐蚀，因此亟需筛选一种安全等效的终止液，目前较为常用的硫酸等终止液对检测结果有干扰，因此需通过对终止液的种类、浓度及终止后结果的稳定性进行系统考察，筛选一种对反应体系无干扰且终止后结果稳定的新型终止液。
发明内容
针对现有技术中肝素类药物效价测定时终止液醋酸浓度高、挥发性和腐蚀性强，对人体产生危害和腐蚀仪器的问题，本发明提供了一种用于肝素效价测定的终止液及其应用，为专门针对肝素类药物抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效价测定的终止液，可避免对实验人员的伤害以及对测定仪器的腐蚀，且对反应体系无干扰且终止后结果稳定。
本发明通过以下技术方案实现：
一种用于肝素效价测定的终止液，所述的用于肝素效价测定的终止液为0.05 ~1.0 mol/L的柠檬酸水溶液。
进一步地，所述的用于肝素效价测定的终止液为0.1~0.25 mol/L的柠檬酸水溶液。
本发明中，所述的用于肝素效价测定的终止液在肝素类药物效价测定中的应用。
进一步地，所述的用于肝素效价测定的终止液针对于肝素类药物抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效价测定。
有益效果
（1）本发明中用于肝素效价测定的终止液不具有挥发性、腐蚀性和毒性，可以避免对实验人员的危害和对测定仪器的腐蚀；
（2）本发明中用于肝素效价测定的终止液对反应体系无干扰，且终止后结果稳定。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
下列实施例中使用到溶液的配制：
（1）三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4），简称Tris（pH8.4）：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，乙二胺四醋酸二钠2.8g，聚乙二醇6000 1.0g，加水800mL使溶解，用盐酸调节pH值至8.4，用水稀释至1000mL。
（2）标准品溶液母液：取肝素钠效价测定标准品（中检院，批号140817-201501，2011IU/支）1支，加水溶解并稀释至25mL，混匀，精密量取0.311mL，加水稀释至25mL，混匀，精密量取1mL，加 Tris（pH8.4）稀释至10mL（0.1IU/mL），得标准品溶液母液。
（3）供试品溶液母液：精密吸取肝素钠封管注射液（5mL：500单位）1mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，精密量取1mL，加Tris（pH8.4）稀释至10mL（0.1IU/mL），得供试品溶液母液。
（4）标准品溶液(S1-S4)及供试品溶液(T1-T4)的配制与稀释：
以Tris（pH8.4）配制并稀释S和T的4个不同浓度的溶液，分别为标准品溶液（S1-S4)和供试品溶液(T1-T4)，各剂量间的剂距比为0.7，S和T的浓度范围为0.0168IU/mL～0.049IU/mL，如下表1所示：
表1标准品溶液（S1-S4)及供试品溶液(T1-T4)稀释及浓度表
（5）1IU/mL的抗凝血酶溶液：取抗凝血酶（ATIII）（来源：CHROMOGENIX，货号：82072039，10 IU /支）1支，加Tris（pH8.4）10mL溶解，摇匀，制成1IU/mL的抗凝血酶溶液。
（6）0.25IU/mL的抗凝血酶溶液：取1IU/mL抗凝血酶溶液2mL，加Tris（pH8.4）6mL，制成0.25IU/mL的抗凝血酶溶液。
（7）发色底物S-2238溶液：取发色底物S-2238（来源：CHROMOGENIX，货号：82032439）1瓶，加水13.33mL溶解，摇匀，制成3 mmol/L的溶液；临用前，取3mL，加水11.4mL，摇匀，即得0.625 mmol/L的S-2238溶液。
（8）凝血酶溶液：取人凝血酶（FⅡa）（来源：Sigma，货号：T8885-25VL）1瓶，加Tris（pH8.4）溶解并稀释成5IU/mL的凝血酶溶液。
（9）发色底物S-2765溶液：发色底物S-2765（来源：CHROMOGENIX，货号：82141339）1瓶，加水11.6mL溶解，摇匀，制成3 mmol/L的溶液；临用前，取1mL，加水2mL，摇匀，即得1mmol/L的S-2765溶液。
（10） Xa因子溶液：取Xa因子（FⅩa）（来源：CHROMOGENIX，货号：82098539，71nkat）冻干粉1瓶，加Tris（pH8.4）10mL溶解。
（11）50%醋酸溶液：取冰醋酸50mL，加水50mL混匀，得体积浓度50%的醋酸溶液。
（12）硫酸溶液：浓硫酸加水配制成浓度分别为1mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L、0.05mol/L的硫酸溶液。
（13）磷酸溶液：浓磷酸加水配制成浓度分别为1mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L、0.05mol/L的磷酸溶液。
（14）柠檬酸溶液：柠檬酸加水溶解配制成浓度分别为1mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L、0.05mol/L的柠檬酸溶液。
（15）草酸溶液：草酸加水溶解配制成浓度分别为1mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L、0.05mol/L的草酸溶液。
现结合具体实施例说明：
实施例1
（1）取酶标板按S1, S2, S3, S4顺序加入4种浓度的标准品溶液（S1-S4）25μl，平行加样21组；
（2）每孔加入0.25IU/mL抗凝血酶溶液（ATIII）溶液25μl，混匀，37℃下保温2min；
（3）每孔加入凝血酶溶液50μl，混匀，37℃下保温2min；
（4）每孔加入发色底物S-2238溶液50μl，混匀，37℃下保温2min；
（5）每组标准品溶液所对应的孔分别加入终止液（醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液、柠檬酸溶液、草酸溶液）50μl终止反应；用酶标仪在405nm处测试吸光度值，并与醋酸溶液测试结果进行比较，结果如下表2所示；分别在终止后 0min、20min、40min测定每孔（醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液、柠檬酸溶液、草酸溶液）的吸光度(Abs)，比较吸光度值的差异，结果如下表3所示：
表2 不同终止液终止后的吸光度测试结果
由表2可知，硫酸溶液、磷酸溶液和草酸溶液作为终止液均对结果（吸光度值）有不同程度的干扰；柠檬酸溶液作为终止液浓度较高或浓度较低时对吸光度值有一定的影响，浓度为0.1mol/L和0.25mol/L与50%醋酸溶液结果一致。
表3不同终止液不同终止是时间的吸光度测试结果
由表3可知，用终止液（0.05 mol/L柠檬酸溶液）终止后，吸光度值随时间不断增加，表明其柠檬酸浓度过低，无法完全终止反应；终止液（柠檬酸浓度0.1mol/L～0.25 mol/L）与终止液（50%醋酸溶液）终止效果相当，读数较稳定。
实施例2
抗Ⅹa因子效价
（1）取3块酶标板，每块板分别按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2顺序加入Tris（pH8.4）、4种浓度的标准品溶液(S1-S4)和4种供试品溶液（T1-T4）溶液25μl，其中B1、B2为空白孔；
（2）每孔加入1IU/mL 抗凝血酶溶液（ATIII）溶液25μl，混匀，37℃下保温2min；
（3）每孔加入Xa因子溶液50μl，混匀，37℃下保温2min；
（4）每孔加入发色底物S-2765溶液50μl，混匀，37℃下保温2min；
（5） 3块酶标板分别加入终止液（50%醋酸溶液、0.1mol/L柠檬酸溶液、0.25mol/L柠檬酸溶液）50μl终止反应；用酶标仪在405nm处测定吸光度(Abs)。
按生物检定统计法（中国药典2020年版四部通则1431）中的量反应平行线原理4.4法实验设计，实验可靠性测验通过者，计算抗Ⅹa活性，平均可信限率FL%（不得大于10%）。比较3种终止液测得肝素抗Ⅹa因子效价结果，结果如下表4所示：
表4不同终止液对样品效价的影响
。
实施例3
抗Ⅱa因子效价
（1）取3块酶标板，每块板分别按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2顺序加入Tris（pH8.4）、4种浓度的标准品溶液(S1-S4)和4种供试品溶液（T1-T4）溶液25μl，其中B1、B2为空白孔；
（2）每孔加入抗凝血酶溶液（ATIII）溶液25μl，混匀，37℃下保温2min；
（3）每孔加入凝血酶溶液50μl，混匀，37℃下保温2min；
（4）每孔加入发色底物S-2238溶液50μl，混匀，37℃下保温2min；
（5） 3块酶标板分别加入终止液（50%醋酸溶液、0.1mol/L柠檬酸溶液、0.25mol/L柠檬酸溶液）50μl终止反应；用酶标仪在405nm处测定吸光度(Abs)
按生物检定统计法（中国药典2020年版四部通则1431）中的量反应平行线原理4.4法实验设计，实验可靠性测验通过者，计算抗Ⅱa活性，平均可信限率FL%（不得大于10%），比较3种终止液测得肝素抗Ⅱa因子效价结果，结果如上表4所示。从表4中可以看出，采用终止液（柠檬酸浓度0.1mol/L～0.25 mol/L）与终止液（50%醋酸）的效价测定结果一致。

Claims (4)

1. 一种用于肝素效价测定的终止液，其特征在于，所述的用于肝素效价测定的终止液为0.05 ~1.0 mol/L的柠檬酸水溶液。
2. 根据权利要求1所述的用于肝素效价测定的终止液，其特征在于，所述的用于肝素效价测定的终止液为0.1~0.25 mol/L的柠檬酸水溶液。
3.一种权利要求1或2所述的用于肝素效价测定的终止液在肝素类药物效价测定中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于肝素效价测定的终止液针对于肝素类药物抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效价测定。
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