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CN118453590A - 化合物作为cyp2e1抑制剂的应用 - Google Patents

化合物作为cyp2e1抑制剂的应用 Download PDF

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CN118453590A
CN118453590A CN202410494203.4A CN202410494203A CN118453590A CN 118453590 A CN118453590 A CN 118453590A CN 202410494203 A CN202410494203 A CN 202410494203A CN 118453590 A CN118453590 A CN 118453590A
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China
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acid
compound
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cyp2e1
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乔海灵
徐海伟
方艳
郜娜
温强
李书峰
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Suzhou Lingxi Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种化合物作为CYP2E1抑制剂的应用，选自式(I)所示的化合物或其盐作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用。该抑制剂可以用作包括肝癌、胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌和胆囊癌等肿瘤的预防和治疗。同样该抑制剂也可以用作肝损伤、脂肪肝、肝炎、肝纤维化、风湿性和类风湿性关节炎、脓毒症、阿尔兹海默症、缺血性脑卒中、帕金森综合症、高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等其他炎症相关性疾病的预防和治疗。

Description

化合物作为CYP2E1抑制剂的应用
本发明是申请日为2020年09月01日、申请号为202010906508.3、发明名称为“化合物作为CYP2E1抑制剂的应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及炎症相关性疾病防治的靶点及药物领域，具体涉及一种化合物作为CYP2E1抑制剂的应用。
背景技术
目前已公认，许多疾病的发生与炎症相关，如肿瘤(肝癌、宫颈癌、鼻咽癌、结直肠癌、胶质瘤等)和非肿瘤类疾病(阿尔兹海默症、震颤麻痹综合征、脑卒中、动脉硬化、糖尿病等)，上述与炎症相关的疾病可统称为炎症相关性疾病(inflammation mediated disease,IMD)。一般认为，长期非可控性炎症微环境与炎症相关疾病的发生有关。
肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的作用至关重要，近10多年来，肿瘤微环境(tumourmicroenvironment，TME)研究发展迅速。2010年，美国加州大学Karin M教授在《Cell》上撰文指出，肿瘤微环境中的免疫和炎症与肿瘤发生发展有密切关系。近年来在TME的免疫研究方面取得了突破性进展，靶向肿瘤微环境的免疫治疗药物PD-1和PD-L1已成功用于临床，成为广谱抗肿瘤药。在该领域做出杰出原创性贡献的美国免疫学家詹姆斯·艾利森(JamesP.Allison)和日本免疫学家本庶佑(Tasuku Honjo)荣获2018年诺贝尔生理学或医学奖。
慢性非可控性炎症是肿瘤微环境的重要特征。以肝癌为例，肝癌通常起源于肝炎和肝硬化，肝癌细胞外基质细胞除了一般肿瘤微环境的组成因素外，肝星状细胞也是其重要组成部分，激活肝星状细胞可导致胶原沉积。酒精滥用、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染等因素造成的持续性肝损伤可导致缺氧和慢性非可控性炎症形成，这是肝癌肿瘤微环境的重要特征。
肿瘤发生发展与肿瘤微环境密切相关，靶向肿瘤微环境药物已成为肝癌治疗的有效手段，如免疫节点抑制剂PD-1和PDL-1以及血管生成抑制剂贝伐单抗等。靶向肿瘤微环境药物一般均具有广谱抗肿瘤作用，如抗血管生成药贝伐单抗可用于治疗结直肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌，卵巢癌、宫颈癌和肝癌等，免疫检查点抑制剂PD-1、PDL-1可用于治疗黑素瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、消化道肿瘤、妇科肿瘤、泌尿系统肿瘤、骨髓瘤和淋巴瘤等。
靶向肿瘤微环境中免疫和血管生成药物的成功为肿瘤等研究提供了成功借鉴。诚然，传统抗炎药如COX-2抑制剂等非甾体抗炎药在解热、镇痛、抗炎抗风湿等方面发挥了巨大作用，但对炎症相关性肿瘤却并未显现出令人满意的疗效，目前尚无靶向肿瘤炎性微环境的抗肿瘤药物。究其原因，可能与慢性非可控性炎症微环境中存在尚未发现的炎症新靶点有关。
细胞色素P450 2E1(cytochrome P450，CYP2E1)是一种主要存在于肝细胞内质网的蛋白质，本申请人发现其含量在肝细胞色素P450(CYP450)中占比最高约为24.8％。CYP2E1主要功能是代谢作用，参与药物、前致癌物和环境毒物的生物转化，如可代谢活化85种以上外源性物质生成肝脏毒性或致癌性物质，包括致癌物亚硝胺、苯、1，3-丁二烯等，CYP2E1与亚硝胺、甲苯、氯仿、丙酮及烟草特异性致癌物NNK等。
CYP2E1代谢活化作用与肿瘤等炎症相关疾病有密切关系。以肝癌为例，肝癌的发生与肝炎病毒、亚硝胺、黄曲霉毒素、酒精等多种因素有关。亚硝胺(N-nitrosamine)属强致癌物，在体内需经CYP2E1代谢活化生成致癌物质，进而与DNA形成加合物而引发肝癌。我国的传统饮食中亚硝胺含量多超标，如熟肉制品、腊肉、火腿以及腌菜等，流行病学研究证明，食物中亚硝胺的含量与肝癌的发生密切相关。动物实验发现，CYP2E1基因敲除小鼠可以显著抑制二乙基亚硝胺引发小鼠肝癌。提示CYP2E1可能通过影响体内亚硝胺代谢活化而影响肝癌的发生。
CYP2E1致炎作用与肿瘤等炎症相关性疾病关系密切。CYP2E1具有明显的致炎作用，参与了众多炎症相关性疾病的发生发展。CYP2E1与肝癌、胶质瘤、鼻咽癌、膀胱癌和胆囊癌等炎症相关性肿瘤有关，同时，CYP2E1还与肝损伤、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化等肝脏疾病，以及类风湿性关节炎、脓毒症、阿尔兹海默症、高脂血症、糖尿病和缺血性脑卒中等其他炎症相关性疾病的发生发展有关。CYP2E1可增强Kupffer细胞内TNF-α的释放，导致肝细胞炎性坏死。对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型小鼠，抑制CYP2E1活性，可通过降低TNF-α表达、恢复内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性等防治；cyp2e1敲除鼠可明显抑制慢性酒精暴露诱发的炎症反应，CYP2E1抑制剂烯丙基硫醚可通过抑制CYP2E1而减少IL-1β和IL-12释放，防治非酒精性脂肪性肝炎。
CYP2E1的致炎作用与促进氧化应激和脂质过氧化有关。CYP2E1促进产生活性氧(ROS)，诱导氧化应激和脂质过氧化等，引发肝细胞炎症、凋亡和肝纤维化。肝细胞CYP2E1高表达，可促进ROS产生。ROS可激活肿瘤坏死因子家族的细胞表面分子Fas配体，产生蛋白酶联反应，使细胞裂解和凋亡。凋亡的肝细胞能促进炎性细胞聚集，诱导产生TNF-α、IL-6等多种炎性因子，引起肝脏炎症和脂肪性肝炎。CYP2E1可还影响花生四烯酸(AA)代谢，促进肝癌细胞的侵袭转移。研究发现，CYP2E1主要通过活性氧和脂质过氧化产物来增加AA毒性。CYP2E1和AA通过ROS过氧化作用引起细胞内Ca2+的释放而激活磷脂酶A2(PLA2)，促进产生AA。在肝癌细胞中，AA在环氧合酶2(COX-2)的作用下转化成前列腺素2(PGE2)，与细胞膜上G蛋白耦联的EP受体结合，激活EGFR/Met信号途径，引起肝癌细胞侵袭转移。
近年来，本申请人建立了包括127余例正常人肝和102例肝癌患者肝硬化肝的较大肝标本库，对CYP450的生理和病理进行了较为系统的研究。发现CYP2E1个体差异较大约10倍以上，肝癌患者CYP2E1代谢活性明显增高约2.13倍，阳性率约44.6％，且CYP2E1活性与患者术后生存期呈明显负相关，CYP2E1阳性与阴性者的生存期分别为238天和612天，且CYP2E1活性增高是肝癌发生发展的独立风险因素。采用大鼠原发性肝癌模型证明，CYP2E1的先天活性(造模前)与肝癌发生呈现良好的因果关系，即CYP2E1先天活性越高，越易发生肝癌。提示CYP2E1可能是肝癌防治的新靶点，推测靶向肿瘤炎性微环境中新靶点CYP2E1的药物可能对炎症相关性疾病具有广谱防治作用。
总之，CYP2E1通过代谢活化作用和致炎作用，参与了众多炎症相关性疾病的发生和发展，因此抑制CYP2E1的活性对相关疾病的防治具有重要意义。因此研究CYP2E1的抑制剂有非常重要的理论和实际意义。
目前尚无用于临床的CYP2E1特异性抑制剂。目前研究报道的具有CYP2E1抑制作用的化合物或药物，包括4-甲基吡唑、双硫仑、二乙基二硫代氨基甲酸酯、异硫氰酸、邻甲苯海明和氯美噻唑等，大多对CYP2E1抑制作用的选择特异性较差，毒性较大，因此多用于基础研究。目前尚无用于临床的CYP2E1特异性抑制剂。因此，基于CYP2E1在诸如肝脏疾病等众多疾病发生发展中的作用，迫切需要展开CYP2E1抑制剂的筛选及合成工作。
发明内容
本发明一方面公开了一种化合物作为CYP2E1抑制剂的应用，选自式(I)所示的化合物或其盐作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用。
根据本申请的第一方面，提供了一种化合物作为CYP2E1抑制剂的应用，
选自式(I)所示的化合物或其盐作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用；其中，
其中，R1选自氢、C1-C10的烷基、环氧烷基中的任一种；
R2选自氢、取代的C1-C10的烷基I、式O-1所示的取代基、式O-2所示的取代基、式O-3所示的取代基中的任一种；
R21、R22、R23、R24独立地选自氢、烷氧基、卤素、C1-C3的烷基、C6-C10的芳基中的至少一种；
R25选自羟基、烷氧基中的任一种；
R3选自氢、C1-C10的烷基、取代的C1-C10的烷基II中的至少一种。
优选地，所述环氧烷基选自环氧丁烷基。
优选地，R1选自氢、C1-C4的烷基、环氧烷基中的任一种。
优选地，R3选自氢、C1-C4的烷基、取代的C1-C4的烷基II中的至少一种。
可选地，式I所示化合物是作为CYP2E1抑制剂的应用。
可选地，所述取代的C1-C10的烷基I中的取代基选自取代的氨基I、式M-1所示的取代基、式M-2所示的取代基中的至少一种；
可选地，所述取代的氨基I中的取代基选自C6-C10的芳基、取代的C1-C3的烷基III中的至少一种。
优选地，所述取代的C1-C3的烷基III中的取代基选自C6-C10的芳基。
可选地，所述取代的C1-C10的烷基II中的取代基选自取代的氨基II、式M-3所示的取代基、式M-4所示的取代基中的至少一种；
可选地，所述取代的氨基II中的取代基选自取代的C1-C3的烷基IV；
所述取代的C1-C3的烷基IV中的取代基选自吡啶基、卤素中的至少一种。
可选地，所述抑制剂选自式(I)所示的化合物或它们药学上可接受的盐，其中，
其中，R1选自氢、C1-C10的烷基、环氧烷基中的至少一种；
R2选自氢、取代的C1-C10的烷基I、取代的羰基、取代的亚胺基中的至少一种；
R3选自氢、C1-C10的烷基、取代的C1-C10的烷基II中的至少一种。
可选地，所述取代的C1-C10的烷基I中的取代基选自卤素、取代的氨基I、式M-1所示的取代基、式M-2所示的取代基中的至少一种；
所述取代的羰基中的取代基选自取代的C1-C10的烯基；
所述取代的亚胺基中的取代基选自羟基、C1-C3的烷氧基中的至少一种。
可选地，所述取代的氨基I中的取代基选自C1-C10的芳基、取代的C1-C3的烷基III中的至少一种；
优选地，所述取代的C1-C3的烷基III中的取代基选自C1-C10的芳基。
可选地，所述取代的C1-C10的烯基中的取代基选自C1-C10的芳基、取代的C1-C10的芳基中的至少一种；优选地，所述取代的C1-C10的芳基中的取代基选自C1-C3的烷氧基、卤素、C1-C3的烷基中的至少一种。
可选地，所述取代的C1-C10的烷基II中的取代基选自取代的氨基II、式M-3所示的取代基、式M-4所示的取代基中的至少一种；
可选地，所述取代的氨基II中的取代基选自取代的C1-C3的烷基IV；
所述取代的C1-C3的烷基IV中的取代基选自吡啶基、卤素中的至少一种。
可选地，以下化合物中的至少一种作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用；
可选地，以下化合物中的至少一种作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用；
优选地，以下化合物中的至少一种作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用；
可选地，式(I)所示的化合物和酸反应得到所述式(I)所示的化合物的酸式盐；
所述酸选自无机酸、有机酸中的至少一种。
可选地，所述无机酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸中的至少一种；
所述有机酸选自乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、树脂酸、马来酸、富马酸、水杨酸、乙酰水杨酸中的至少一种。
可选地，式(I)所示的化合物的结构式为式(I)所示的化合物的盐酸盐的晶型A的X-射线粉末衍射图谱包括3个或3个以上选自下组的2θ值：8.4±0.2°、13.1±0.2°、14.8±0.2°、16.6±0.2°、24.1±0.2°、27.2±0.2°、30.5±0.2°、31.8±0.2°、33.5±0.2°、35.4±0.2°、35.7±0.2°；
式(I)所示的化合物的盐酸盐的晶型A的DSC-TGA图显示其在70℃～220℃之间有一明显吸热峰，在80℃～170℃热分解。
可选地，式(I)所示的化合物的结构式为
式(I)所示的化合物的硫酸盐的晶型B的X-射线粉末衍射包括5个或5个以上选自下组的2θ值：10.1±0.2°、15.1±0.2°、16.0±0.2°、16.7±0.2°、19.2±0.2°、19.9±0.2°、23.4±0.2°、24.0±0.2°、25.8±0.2°、26.5±0.2°、28.9±0.2°、30.3±0.2°、32.2±0.2°；
式(I)所示的化合物的硫酸盐的晶型B的DSC-TGA图显示其在30℃～85℃、90℃～160℃、215℃～330℃之间至少有一个吸热峰，在150℃～350℃热分解。
可选地，制备式(I)所示的化合物作为抑制剂的方法至少包括下述方法中的任一种；
方法一：将含有化合物A、非质子性溶剂和格氏试剂的原料，在-20～25℃下反应0.5～3h，即可得到CYP2E1抑制剂A；
所述化合物A选自具有式II所示结构式的化合物中的至少一种：
所述CYP2E1抑制剂A选自具有式III所示结构式的化合物中的至少一种：
方法二：将含有式III所示结构式的化合物与氨水在碱源I的存在下反应，即可得到CYP2E1抑制剂B；
所述CYP2E1抑制剂B选自具有式III-1所示结构式的化合物中的至少一种：
方法三：将含有式III所示结构式的化合物与芳香醛类化合物在碱源II的存在下，25～100℃反应2～8h，即可得到CYP2E1抑制剂C；
所述CYP2E1抑制剂C选自具有式III-2所示结构式的化合物中的至少一种：
方法四：将含有式III所示结构式的化合物、胺类化合物及还原剂在酸源的存在下反应，即可得到CYP2E1抑制剂D；
所述胺类化合物选自苯胺、苄胺中的至少一种；
所述CYP2E1抑制剂D选自具有式III-3所示结构式的化合物中的至少一种：
可选地，所述方法二至少包括如下步骤：将含有式III所示结构式的化合物、乙醇和氨水在碱源I的存在下反应，即可得到CYP2E1抑制剂B。
可选地，在所述方法一中，所述非质子性溶剂选自四氢呋喃、乙醚中的至少一种；所述格氏试剂选自甲基溴化镁、甲基氯化镁中的至少一种；
在所述方法二中，所述碱源I选自氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的至少一种；
在所述方法三中，所述碱源II选自氢氧化钠、氢氧化钾、叔丁醇钾、甲醇钠、氟化钾中的至少一种；所述芳香醛类化合物选自对甲氧基苯甲醛、临甲氧基苯甲醛、间甲氧基苯甲醛、对氯苯甲醛、临氯苯甲醛、间氯苯甲醛、对苯基苯甲醛、对异丙基苯甲醛、3,4-二氟苯甲醛中的至少一种；
在所述方法四中，所述酸源选自甲酸，乙酸，盐酸中的至少一种；
所述还原剂选自氰基硼氢化钠、硼氢化钠、氢化铝锂中的至少一种。
可选地，在所述方法一中，所述化合物A和格氏试剂的摩尔比为1:1～1:3；
在所述方法二中，式III所示结构式的化合物与氨水的摩尔比为1:1～1:6；
在所述方法三中，式III所示结构式的化合物与芳香醛类化合物的摩尔比为1:1～1:5；
在所述方法四中，式III所示结构式的化合物与还原剂的摩尔比为1:1～1:5。
可选地，所述化合物A通过以下方法获得：
将含有化合物A-1、缩合剂、N,O-二甲羟胺盐酸盐和非质子性溶剂的原料，在碱源III的存在下，20～60℃反应10～20h，即可得到所述化合物A。
所述化合物A-1选自具有式II-1所示结构式的化合物中的至少一种：
可选地，所述缩合剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、碳酸二月桂酯、N,N-羰基二咪唑、二环己基羰亚胺和N-(4-羧基苯基)马来酰亚胺中的至少一种；
所述碱源III选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的至少一种。
可选地，化合物A-1、缩合剂、N,O-二甲羟胺盐酸盐的摩尔比为1:1:1～1:5:5。
可选地，所述化合物A-1的获得至少包括以下步骤：
将含有化合物A-2的原料在碱源IV的存在下水解，得到混合物，然后使用酸源调节混合物的pH至2～3，即可得到所述化合物A-1；
所述化合物A-2选自具有式II-2所示结构式的化合物中的至少一种：
可选地，所述碱源IV选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。
可选地，所述酸源选自浓盐酸；
所述使用酸源调节混合物的pH至2～3在10～50℃下进行。
可选地，式(I)所示的化合物的酸式盐的制备方法至少包括：
将含有式(I)所示的化合物和溶剂A的物料，-20～80℃反应0.5～10小时，即可得到所述式(I)所示的化合物的酸式盐；
优选地，式(I)所示的化合物的酸式盐的制备方法至少包括：
将含有式(I)所示的化合物和溶剂A的物料，-15～60℃反应1～4小时，即可得到所述式(I)所示的化合物的酸式盐。
进一步优选地，式(I)所示的化合物的酸式盐的制备方法至少包括：
将含有式(I)所示的化合物和溶剂A的物料，-10～40℃反应1～4小时，即可得到所述式(I)所示的化合物的酸式盐。
本发明也提供了一种CYP2E1抑制剂SMI0的酸式盐，所述酸式盐为SMI0与有机酸或无机酸反应得到。
可选地，所述有机酸选自乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、树脂酸、马来酸、富马酸、水杨酸或乙酰水杨酸中的一种。
可选地，所述无机酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸或磷酸中的一种。
本发明也提供了一种CYP2E1抑制剂SMI0的酸式盐的制备方法，所述方法包括如下步骤：分别制备SMI0和酸在可溶溶剂中的溶液体系，按照SMI0与酸性溶液中酸的摩尔比为1：0.5～3混合两个体系，反应温度为-20～80℃，反应时间0.5～10小时，生成目标产物，减压旋干溶剂即得SMI0酸式盐。
可选地，所述反应中所选用的有机溶剂包括醚类，醇类，酯类，腈类，酮类，卤代烷烃，烷烃或芳烃有机溶剂中的一种或多种任意比例的混合物。优选所述可溶溶剂为甲醇，乙腈，丙酮，乙酸乙酯、乙醇、乙醚。
可选地，所述反应中SMI0与酸性溶液中酸的摩尔比为1:0.5～3，优选1:1～2。
可选地，所述反应中反应温度随试剂或溶剂等的变化而变化，但反应温度通常在-20～80℃，优选-15～60℃，更优选-10～40℃。反应时间也随着试剂或温度的变化而变化，通常反应时间0.5～10小时，优选1～4小时。
本发明也提供了一种CYP2E1抑制剂SMI0的盐酸盐的晶型A，所述晶型A的X-射线粉末衍射包括3个或3个以上选自下组的2θ值：8.4±0.2°、13.1±0.2°、14.8±0.2°、16.6±0.2°、24.1±0.2°、27.2±0.2°、30.5±0.2°、31.8±0.2°、33.5±0.2°、35.4±0.2°、35.7±0.2°。同时，DSC-TGA图显示其在70℃～220℃之间有一明显吸热峰，在80℃～170℃热分解。
本发明也提供了一种CYP2E1抑制剂SMI0的硫酸盐的晶型B，所述晶型B的X-射线粉末衍射包括5个或5个以上选自下组的2θ值：10.1±0.2°、15.1±0.2°、16.0±0.2°、16.7±0.2°、19.2±0.2°、19.9±0.2°、23.4±0.2°、24.0±0.2°、25.8±0.2°、26.5±0.2°、28.9±0.2°、30.3±0.2°、32.2±0.2°。同时，DSC-TGA图显示其在30℃～85℃、90℃～160℃、215℃～330℃之间至少有一个吸热峰，在150℃～350℃热分解。
可选地，所述CYP2E1抑制剂作为活性物质，用于治疗肝损伤、脂肪肝、肝炎和肝纤维化的药物。
可选地，所述CYP2E1抑制剂用于预防和治疗肝脏疾病的试剂盒。
可选地，所述CYP2E1抑制剂在治疗或预防炎症相关性肿瘤的药物的活性成分中的应用；
所述炎症相关性肿瘤包括肝癌、胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌和胆囊癌中的至少一种。
可选地，所述CYP2E1抑制剂在治疗或预防炎症相关性疾病的药物的活性成分中的应用；所述炎症相关性疾病包括肝损伤、脂肪肝、肝炎、肝纤维化、风湿性和类风湿性关节炎、脓毒症、阿尔兹海默症、缺血性脑卒中、帕金森综合症、高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病中的至少一种。
本发明中优选的CYP2E1抑制剂如下表所示:
可选地，本申请中CYP2E1抑制剂SMI0SMI7
SMI16以及SMI20的合成方法具有以下合成路线：
其中，反应条件：a在碱性条件下水解，酸化；
b在碱和缩合剂存在下与N,O-二甲羟胺盐酸盐反应；
c在低温条件下，无水非质子性溶剂中与格氏试剂反应；
d在碱性条件下，加热与芳香醛发生羟醛缩合反应；
e在碱性条件下与氨发生反应；
f在弱酸条件及还原剂与胺类发生反应。
可选地，条件a中所述的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾等中的一种，酸可以是盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸等中的一种或者混合物，所用的溶剂为甲醇、乙醇、丙醇等水溶性溶剂中的一种和水的混合物，反应温度从10度到50度；
可选地，条件b中所述的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种，缩合剂可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、碳酸二月桂酯、N,N-羰基二咪唑和N-(4-羧基苯基)马来酰亚胺等中的一种，反应温度从20度到60度，所用的溶剂为四氢呋喃、乙醚等非质子性溶剂中的一种。
可选地，条件c中所述反应温度从-20度到25度，所用的溶剂为四氢呋喃、乙醚等非质子性溶剂中的一种，化合物3与格氏试剂的当量比为1:1～1:3。
可选地，条件d中所述的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、叔丁醇钾、甲醇钠、氟化钾等中的一种，反应温度从25度到100度，溶剂为甲醇、乙醇、丙醇等水溶性溶剂中的一种。
可选地，条件e中所述中的碱可以是氢氧化钾，氢氧化钠，碳酸钠，吡啶，三乙胺，N,N-二异丙基乙胺等中的一种，溶剂为甲醇、乙醇等水溶性溶剂中的一种和水的混合物。
可选地，条件f中所述的酸可以是甲酸，乙酸，盐酸等有机或者无机酸中的一种或者混合物，溶剂为甲醇、乙醇、丙醇等水溶性溶剂中的一种。
本申请中，C1-C10指所包含的碳原子数。对所述“取代烷基”、“取代芳基”的碳原子限定，是指烷基、芳基本身所含的碳原子数，而非取代后的碳原子数。如C1-C10的取代烷基，指碳原子数为1～10的烷基上，至少一个氢原子被取代基取代。
本申请中，“烷基”是由烷烃化合物分子上失去任意一个氢原子所形成的基团。所述烷烃化合物包括直链烷烃、支链烷烃、环烷烃、带有支链的环烷烃。
本申请中，“烯基”是由烯烃化合物分子上失去任意一个氢原子所形成的基团。所述烷烃化合物包括直链烷烃、支链烷烃、环烷烃、带有支链的环烷烃。
本申请中，“芳基”是芳香族化合物分子上失去芳香环上一个氢原子所形成的基团；如甲苯失去苯环上甲基对位的氢原子所形成的对甲苯基。
本申请中，“呋喃基”是呋喃化合物分子上失去任意一个氢原子所形成的基团。
本申请中，“亚胺基”是氨分子中去掉两个氢原子后，剩下的二价基团，结构式为NH＝。
本申请中，“吡啶基”是吡啶化合物分子上失去任意一个氢原子所形成的基团。
本申请中，“环氧烷基”是环氧化合物分子上失去任意一个氢原子所形成的基团。
附图说明
图1是化合物SMI0的核磁氢谱图；
图2是化合物SMI7的核磁氢谱图；
图3是化合物SMI16的核磁氢谱图；
图4是化合物SMI20的核磁氢谱图；
图5是SMI0盐酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱(XRPD)；
图6是SMI0盐酸盐晶型A的的差示扫描量热分析和热重分析图谱(DSC-TGA)；
图7是SMI0硫酸盐晶型B的X-射线粉末衍射图谱(XRPD)；
图8是SMI0硫酸盐晶型B的的差示扫描量热分析和热重分析图谱(DSC-TGA)；
图9是化合物SMI0对人肝代谢氯唑沙宗抑制作用的双倒数作图；
图10是化合物SMI0对人肝CYP2E1代谢氯唑沙宗抑制作用的基于双倒数作图基础上的二次作图；
图11是21个小分子化合物对CYP2E1体外代谢活性的抑制作用作图；
图12是化合物SMI0对大鼠CYP2E1体内代谢二乙基亚硝胺的抑制作用作图；
图13是化合物SMI0对二乙基亚硝胺所致大鼠肝损伤模型的抑制作用作图；
图14是化合物SMI0对高脂饮食所致小鼠肝脏脂肪变、肝炎模型的抑制作用作图；其中，A,肝炎模型各组小鼠肝脏代表图片；B，炎症相关组织病理学表现；H&E，苏木素伊红染色；Masson，Masson染色；Oil red，油红O染色；LCA，白细胞常见抗原染色；
图15是化合物SMI0抑制高脂饮食所致小鼠肝脏脂肪变、肝炎模型的相关参数的量化作图；其中，A,肝炎模型各组动物肝脏系数；B，各组动物脂肪变性评分；C，各组动物Masson染色评分；D，各组动物油红O染色面积百分比；E，各组动物LCA评分；
图16是化合物SMI0对高脂饮食所致小鼠肝纤维化模型的抑制作用作图；其中，A,肝纤维化模型各组小鼠肝脏代表图片；B，炎症及肝纤维化相关组织病理学表现；H&E，苏木素伊红染色；Masson，Masson染色；Oil red，油红O染色；
图17是化合物SMI0抑制高脂饮食所致小鼠肝纤维化模型的相关参数的量化作图；其中，A,肝纤维化模型各组动物肝脏系数；B，各组动物脂肪变性评分；C，各组动物Masson染色评分；D，各组动物油红O染色面积百分比；
图18是化合物SMI0对二乙基亚硝胺所致大鼠肝纤维化模型的抑制作用作图；其中，A,肝纤维化模型各组大鼠肝脏代表图片；B，肝纤维化相关组织病理学表现；H&E，苏木素伊红染色；Masson，Masson染色；α-SMA，α平滑肌肌动蛋白；Collagen I,I型胶原蛋白；
图19是化合物SMI0抑制二乙基亚硝胺所致大鼠肝纤维化模型的相关参数的量化作图；其中，A,肝纤维化模型各组动物肝脏系数；B，各组动物Ishark评分；C，各组动物Masson染色评分；D，各组动物α-SMA组化评分；E，各组动物Collagen I组化评分；
图20是cyp2e1基因敲除对Walker256细胞肝脏原位种植大鼠肝癌模型的抑制作用作图；
图21是化合物SMI0对肝癌细胞株H22细胞肝脏原位种植小鼠肝癌模型的抑制作用作图；
图22是CYP2E1在胶质瘤患者瘤旁组织中较高表达水平作图；
图23是cyp2e1基因敲除对胶质瘤GL261细胞脑原位种植小鼠胶质瘤模型的抑制作用作图；
图24是化合物SMI0对胶质瘤GL261细胞脑原位种植小鼠胶质瘤模型的抑制作用作图；其中，A，各组小鼠脑部大体图；B，各组小鼠脑组织HE染色代表图；C，各组小鼠部肿瘤体积；D，SMI0对GL261细胞的体外抑制作用。
图25是化合物SMI0对卵巢癌ID-8细胞卵巢原位种植小鼠卵巢癌模型的抑制作用作图；其中，A，各组小鼠卵巢及肿瘤大体图；B，各组小鼠总瘤重；C，SMI0对ID-8细胞的体外抑制作用。
图26是化合物SMI0对卵巢癌ID-8细胞小鼠腹腔移植瘤的抑制作用作图；其中，A，各组小鼠体重；B，各组小鼠腹水体积。
图27是化合物SMI0抑制完全佛氏佐剂所致大鼠类风湿性关节炎模型的足部大体图；
图28是化合物SMI0抑制完全佛氏佐剂所致大鼠类风湿性关节炎模型的相关参数的量化作图；其中，A，各组大鼠不同时间的足肿胀率；B，24h大鼠足肿胀率图；C，36h大鼠足肿胀率图；D，48h大鼠足肿胀率图；
图29是化合物SMI0抑制完全佛氏佐剂所致大鼠类风湿性关节炎模型的量效关系作图；其中，A，不同时间点的大鼠足肿胀率量效关系图；B，24h量效关系图；C，36h量效关系图，D，48h量效关系图；
图30是化合物SMI0抑制脂多糖所致大鼠脓毒血症模型体温改变的抑制作用作图；其中，A，各组大鼠不同时间点体温；B，第4h各组大鼠体温；C，第5h各组大鼠体温；D，第6h各组大鼠体温；
图31是化合物SMI0抑制脂多糖所致小鼠脓毒血症模型体温改变的抑制作用作图；其中，A，各组小鼠不同时间点体温；B，第6h各组小鼠体温；C，第12h各组小鼠体温；D，第24h各组小鼠体温；
图32是化合物SMI0对脂多糖所致小鼠脓毒血症模型肾功能和新功能损伤的改善作用作图；其中，A，各组小鼠24h血清尿素氮水平；B，各组小鼠24h血清肌酐水平；C，各组小鼠24h肌酸激酶水平；D，各组小鼠24h血清乳酸脱氢酶水平；
图33是化合物SMI0改善链脲佐菌素所致的大鼠阿尔兹海默症模型的认知功能障碍作图；其中，A，各组大鼠不同训练时间点下的潜伏期；B，各组大鼠平台象限区域花费时间；C，各组大鼠穿越平台次数；
图34是化合物SMI0对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的抑制作用作图；
图35是化合物SMI0抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的脑梗死和脑水肿作图；其中，A，大鼠脑梗死率；B，大鼠脑水肿率；
图36是化合物SMI0降低高脂饮食所致ApoE-/-小鼠高血脂模型的血脂水平作图；
图37是化合物SMI0抑制高脂饮食所致ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块形成的抑制作用作图；其中，A，各组动物斑块总面积；B，各组动物油红O面积占斑块总面积百分比；
图38是化合物SMI0降低高脂饮食和链脲佐菌素所致的大鼠糖尿病的血糖水平作图；其中，A，各组大鼠空腹血糖；B，糖耐量实验下各组大鼠不同时间点血糖；C，糖耐量实验各组大鼠曲线下面积；
图39是CYP2E1在膀胱癌癌旁组织中较高表达水平作图；
图40是CYP2E1在胆囊癌瘤旁组织中较高表达水平作图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
本申请实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中CYP2E1抑制剂合成采用的高分辨质谱仪，美国Waters公司，Q-Tof micro型。
本申请实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中CYP2E1抑制剂合成采用核磁共振仪，德国Bruker公司，DPX-400型。
本申请实施例10、实施例11和实施例12中测定CYP2E1体内、外的抑制作用采用高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司，型号为Agilent 1260。
本申请实施例14中小鼠胶质瘤模型的制备采用脑立体定位仪，上海普辛仪器科技有限公司，型号为ZR-09。
实施例1人肝微粒体制备
采用差速离心法，肝标本取出解冻，称重。按1:4(W/V)比例加入50mM Tris-HCl(pH＝7.0)(含150mMKCl，2mM EDTA)缓冲液，用玻璃匀浆器研磨制成肝匀浆。于4℃9000×g离心20min，取上清液于4℃100000×g离心60min；所得沉淀重悬于4mL 0.15M Tris-HCl(pH＝7.6)中，于4℃100000g再离心60min；取沉淀按1:2(W/V)比例加入0.25M蔗糖重悬液，最终每克肝组织制备2mL微粒体混悬液，分装后先保存于液氮中过夜，次日转移至-80℃长期保存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。用Bradford方法测定微粒体蛋白含量(mg/mL)。
肝损伤患者与正常人的肝微粒体均采用本方法。
实施例2SMI0的合成
4-甲基噻唑-5-甲酸乙酯(1mol)和NaOH(1.6mol),溶剂用乙醇和水的混合溶液，室温下过夜反应，TLC检测(纯乙酸乙酯)，反应完全后，将乙醇减压蒸干，用浓硫酸将pH调至2-3，抽滤后得固体，洗涤，干燥。4-甲基噻唑-5-甲酸(1mol)和DDC(1mol)于无水四氢呋喃中室温搅拌，活化2-3h后，加入二甲羟胺盐酸盐(1.2mol)，滴加三乙胺(1.5mol)室温过夜搅拌，TLC检测(PE：EA＝3:1)。反应完全后，将四氢呋喃减压蒸干，加乙酸乙酯萃取三遍，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两边，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压蒸干。产物(1mol)溶于无水四氢呋喃中，氮气保护，置于冷阱中预冷，控制温度在-10～15℃，滴加格氏试剂CH3MgCl(1.5mol)，TLC检测反应(PE:EA＝3:1)，反应完全后用饱和NH4Cl淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压蒸干。粗品通过减压蒸馏得到纯品。产物的核磁检测数据如下(如图1所示)：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(s,1H),2.80(s,3H),2.60(s,3H).
实施例3化合物SMI7的合成
取盐酸羟胺(3mmol)于圆底烧瓶中，加入3mL乙醇，室温25℃搅拌10min，加入1MNaOH溶液3mL，然后加入SMI0(3mmol)，油浴80℃回流，TLC监测反应完全后，10％稀盐酸中和反应液，水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤除去硫酸镁，将滤液真空下浓缩，硅胶柱层析分离，洗脱剂及其比例为石油醚：乙酸乙酯＝1:2，得到化合物SMI7，产物的核磁检测数据如下(如图2所示)：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.50(s,2/3H),11.48(s,1/3H),9.09(s,1/3H),8.95(s,2/3H),2.57(s,2/3H),2.53(s,1/3H),2.28(s,1/3H),2.26(s,2/3H).
实施例4化合物SMI16的合成
取3,4-二氯苯甲醛(1mmol)于圆底烧瓶中，加入2mL无水乙醇，50℃搅拌溶解，加入3M KOH 30μL溶液，然后加入SMI0(1mmol)，50℃搅拌，TLC监测反应完全后，10％稀盐酸中和反应液，水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤除去硫酸镁，将滤液真空下浓缩，硅胶柱层析分离，洗脱剂及其比例为石油醚:乙酸乙酯＝2:1，得到化合物SMI16，产物的核磁检测数据如下(如图3所示)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),7.68(d,J＝11.2Hz,2H),7.51(d,J＝8.3Hz,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,1H),7.19(d,J＝15.5Hz,1H),2.86(s,3H).
实施例5化合物SMI20的合成
取苯胺(2mmol)和SMI0(2mmol)于圆底烧瓶中，加入3mL无水乙醇，室温25℃搅拌10min,再加入BH3CNNa(2mmol)及醋酸(1mmol)，室温25℃下搅拌，TLC监测反应完成后，10％稀盐酸中和反应液，水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，抽滤除去硫酸镁，将滤液真空下浓缩，硅胶柱层析分离，洗脱剂及其比例为石油醚:丙酮＝4:1，得到化合物SMI20，产物的核磁检测数据如下(如图4所示)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(s,1H),7.13(t,J＝7.7Hz,2H),6.71(t,J＝7.2Hz,1H),6.51(d,J＝7.9Hz,2H),4.74(q,J＝6.2Hz,1H),4.00(s,1H),2.50(s,3H),1.56(d,J＝6.6Hz,3H).
实施例6SMI0盐酸盐的合成
取SMI0(1g，7.08mmol)于圆底烧瓶中，加入5mL乙醇使其溶解，常温搅拌下缓慢滴加1mol/L盐酸-乙醇溶液11mL反应1小时。减压浓缩，冷却析晶，过滤，用0.5mL冷无水乙醇洗涤，干燥后得白色固体1.06g，收率85％，纯度99.8％(HPLC)，熔程160～162℃。化合物SMI0盐酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱(XRPD)如图5所示，差示扫描量热分析和热重分析图谱(DSC-TGA)如图6所示。
实施例7SMI0硫酸盐的合成
取SMI0(1g，7.08mmol)于圆底烧瓶中，加入5mL乙醇使其溶解，常温搅拌下缓慢滴加入1mol/L硫酸-乙醇溶液8mL反应1小时。蒸干溶剂，再用少量甲醇重结晶，析出黄色固体0.85g，收率70％，纯度99.5％(HPLC)。化合物SMI0硫酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱(XRPD)如图7所示，差示扫描量热分析和热重分析图谱(DSC-TGA)如图8所示。
实施例8CYP2E1代谢活性的抑制作用的测定
选用氯唑沙宗为探针底物，检测待测抑制剂对正常人混合肝微粒体CYP2E1代谢活性的抑制作用(IC50，半数抑制浓度；Ki，抑制常数；IC50越小，Ki越小，抑制剂的抑制强度越高)，确定待测抑制剂对人肝微粒体CYP2E1的抑制作用。
抑制CYP2E1作用IC50的确定
孵育体系总体积为100μL，孵育体系包括底物、不同浓度的抑制剂、肝微粒体蛋白和磷酸盐缓冲液，37℃水浴反应。预孵育5min后加还原型辅酶启动反应，30min后冰浴终止反应。在具体实验中，可以根据需要来选择抑制剂的浓度。
在本实施例中，孵育体系包括62.5μM的氯唑沙宗，100mM(pH＝7.4)的磷酸盐缓冲液，0.3mg/mL的肝微粒体蛋白，1mM的NADPH。
在其他优选的实施例中，孵育体系可以包括7.8～1000μM的氯唑沙宗为底物。肝微粒体蛋白的浓度可以是0.1～0.5mg/mL。可以根据需要使用50mM～100mM的磷酸盐缓冲液，或者50mM～100mM Tris-HCL缓冲液。
还可以使用NADPH再生系统。优选的，孵育体系包括62.5μM的氯唑沙宗，100mM(pH＝7.4)的磷酸盐缓冲液，0.3mg/mL的肝微粒体蛋白，1mM的NADPH。
在本实施例中用1mL乙酸乙酯终止反应。在其他优选的实施例中，还可以使用1mL甲基叔丁基醚、1mL乙醚、100μL甲醇来终止反应。
抑制CYP2E1作用Ki的确定
在确定抑制剂对CYP2E1有较好抑制作用的时候，选取不同浓度的底物和不同浓度的抑制剂，进行体外代谢孵育抑制试验，计算抑制剂对CYP2E1代谢氯唑沙宗的抑制常数Ki。
孵育反应孵育体系总体积为100μL，孵育体系包括底物、不同浓度的抑制剂、肝微粒体蛋白和磷酸盐缓冲液，37℃水浴反应。预孵育5min后加还原型辅酶启动反应，孵育一定时间后冰浴终止反应。
在本实施例中，孵育体系分别包括15.6、31.25、62.5、125、250μM的氯唑沙宗；以上面测定的IC50为依据，按照1/4～4倍的比例，确定抑制剂的不同浓度梯度；100mM(pH＝7.4)的磷酸盐缓冲液，0.3mg/mL的肝微粒体蛋白，1mM的NADPH。
在其他优选的实施例中，孵育体系可以包括7.8～1000μM的氯唑沙宗为底物，更优选的，可以包括15.6～250μM(15.6、31.25、62.5、125和250μM)的氯唑沙宗。肝微粒体蛋白的浓度可以是0.1～0.5mg/mL。可以根据需要使用50mM～100mM的磷酸盐缓冲液，或者50mM～100mM Tris-HCL缓冲液。
还可以使用1mM NADPH或NADPH再生系统中的一种。其中，NADPH再生系统包含1.3mM NADP+,3.3mM 6-磷酸葡萄糖，0.4U/mL葡萄糖脱氢酶，3.3mM氯化镁。
在本实施例中用1mL乙酸乙酯终止反应。在其他优选的实施例中，还可以使用1mL甲基叔丁基醚、1mL乙醚、100μL甲醇来终止反应。
CYP2E1抑制剂选择性的确定
同时，再以正常人混合肝微粒为研究对象，分别选用CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的探针药物，测定待测抑制剂对正常人混合肝微粒体CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4代谢探针药物的体外抑制作用，评价待测抑制剂对CYP2E1抑制作用的选择性。
CYP1A2探针为6.25～800μM非那西丁或27.5～12520μM咖啡因中的一种；
CYP2A6探针为0.156～20μM香豆素或12.5～2000μM尼古丁中的一种；
CYP2B6探针为7.8～500μM安非他酮或0.25～30mM环磷酰胺中的一种；
CYP2C8探针为2.5～80μM紫杉醇或0.125～128μM阿莫地喹中的一种；
CYP2C9探针为31.25～2000μM甲苯磺丁脲或0.1～200μM双氯芬酸中的一种；
CYP2C19探针为3.9～500μM奥美拉唑或1.95～1000μM美芬妥英中的一种；
CYP2D6探针为0.625～96μM右美沙芬或0.0195～80μM普罗帕酮中的一种；
CYP3A4探针为0.39～50μM咪达唑仑或1.98～1000μM睾酮中的一种；
孵育体系总体积为100μL，孵育体系包括底物，不同浓度的抑制剂，肝微粒体蛋白，磷酸盐缓冲液，37℃水浴反应。预孵育5min后加还原型辅酶启动反应，孵育一定时间后冰浴终止反应。
在本实施例种，孵育体系包括62.5μM的氯唑沙宗、2.5μM的香豆素、62.5μM的安非他酮、10μM的紫杉醇、250μM的甲苯磺丁脲、62.5μM的奥美拉唑、20μM的右美沙芬、62.5μM的氯唑沙宗、1.56μM的咪达唑仑中的至少一种，100mM(pH＝7.4)的磷酸盐缓冲液，0.3mg/mL的肝微粒体蛋白，1mM的NADPH。
在其他优选的实施例种，底物可以包括7.8～1000μM的氯唑沙宗为底物。肝微粒体蛋白的浓度可以为0.1～0.5mg/mL。缓冲液可以选自50mM磷酸盐缓冲液、100mM的磷酸盐缓冲液、50mM Tris-HCL缓冲液、100mMTris-HCL缓冲液中的一种。还可以使用1mM NADPH或NADPH再生系统中的一种。
在本实施例中用1mL乙酸乙酯终止反应。在其他优选的实施例中，还可以使用1mL甲基叔丁基醚、1mL乙醚、100μL甲醇来终止反应。
实施例9CYP2E1抑制剂的体外筛选测试结果
SMI0(对2E1抑制IC50：1.64μM，对2A6抑制IC50为76.20μM，对其他CYP酶无明显抑制作用)。
现在参考图9，所有反应采用100μL的孵育体系，氯唑沙宗浓度为15.6,31.2,62.5,125,250μM，SMI0系列浓度为0,0.4638,0.9276,1.855,3.710μM。所有实验均来源于三次独立实验的均值。图9是SMI0化合物对人肝代谢氯唑沙宗抑制作用的双倒数图。显示SMI0化合物是CYP2E1的混合型抑制剂。
现在参考图10，图10是SMI0化合物对人肝CYP2E1代谢氯唑沙宗抑制作用的基于双倒数作图基础上的二次作图。以不同抑制曲线的斜率对SMI0的系列浓度(0,0.4638,0.9276,1.855,3.710μM)做线性回归，直线与横轴交点的绝对值即Ki为0.8970μM。
另参考实施例8具体研究方法，在体外测试了21个小分子化合物(表1)对CYP2E1的抑制作用。结果显示，SMI1和SMI8对CYP2E1有显著性抑制作用，对CYP2E1抑制的IC50分别为7.99和17.03μM。SMI10对CYP2E1有轻微抑制作用，IC50为114.5μM。相对于SMI0、SMI1、SMI8和SMI10，其他小分子对CYP2E1的抑制作用较弱(如图11所示)。
另外选择性研究显示，SMI1抑制CYP2A6的IC50为55.63μM，抑制CYP2C9的IC50为1.86μM。所述21个小分子的结构如表1所示。
表1
实施例10SMI0化合物对CYP2E1体内抑制作用测试结果
实验方法：SMI0化合物对大鼠体内CYP2E1抑制作用的研究采用自身对照交叉给药实验设计，第一轮实验的给药方式为第一周单独腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)50mg/kg(共30只SD大鼠)。间隔一周后，进行第二轮实验，即先对每只大鼠灌胃给予SMI0化合物低剂量或中剂量或高剂量(6mg/kg或30mg/kg或150mg/kg)，5min后再次腹腔注射DEN 50mg/kg(低、中、高剂量分别各10只大鼠)。采血时间为2、7、15、30min及1、2、4、6、9、12、24、36、48、60h。测定上述不同采血时间点下血浆DEN的浓度，求得DEN的毒代动力学参数。血浆DEN的检测方法采用高效液相色谱法，100μL血浆加入10μL高氯酸，涡旋混合3min，12000rpm离心10min，上清10μL进样。流动相为甲醇：水＝50:50，检测波长240nm。
实验结果：以DEN的毒代动力学参数代表CYP2E1活性，分析低、中、高剂量的SMI0化合物对大鼠体内CYP2E1活性的影响。结果发现，与单用DEN的模型组相比，SMI0低、中、高剂量可使DEN清除率CL分别下降(63.98±7.78)％、(79.63±7.29)％、(85.42±3.74)％，抑制率分别为62.43％、80.42％和86.77％(如图12、表2所示，*P<0.05,***P<0.001vs模型组)。同样，SMI0低、中、高剂量可使DEN半衰期t1/2分别延长(133.60±116.80)％、(619.97±363.57)％、(868.70±241.26)％，曲线下面积AUC0-t分别扩大(196.82±73.63)％、(407.70±184.30)％、(529.67±153.72)％，曲线下面积AUC0-∞分别扩大(189.99±67.55)％、(455.90±219.26)％、(626.56±187.15)％。且中剂量SMI0化合物抑制效果显著优于低剂量，高剂量SMI0化合物抑制效果显著优于低剂量和中剂量(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vsSMI0低剂量组；$P<0.05,$$$P<0.001vs SMI0中剂量组)。提示不同剂量SMI0化合物可显著抑制大鼠CYP2E1对DEN的代谢活性，并具有较好的剂量依赖关系。
以上结果表明，SMI0对大鼠体内CYP2E1活性具有显著抑制作用。
表2SMI0化合物抑制CYP2E1体内代谢二乙基亚硝胺的毒代动力学参数
注：表2中的Mean代表均值；SD代表标准差；
Cmax：药峰浓度,给药后出现的血药浓度最高值。该参数是反映药物在体内吸收速率和吸收程度的重要指标。
Tmax：达峰时间,给药后达到药峰浓度所需的时间。该参数反映药物进入体内的速度，吸收速度快则达峰时间短。
Vd：表观分布容积,药物在体内达到动态平衡时体内药量与血药浓度的比例常数，单位一般为L。该参数反映了药物在体内分布广窄的程度，数值越高表示分布越广。表观分布容积在数值上由清除率与末端消除速率的比值得到。
CL：清除率，单位时间内从体内清除的药物表观分布容积数，单位一般为L/h。该参数是反映机体对药物处置特性的重要参数，与生理因素有密切关系。清除率根据剂量与AUC(0-∞)的比值得到。
AUC：药时曲线下面积，血药浓度曲线对时间轴所包围的面积。该参数是评价药物吸收程度的重要指标，反映药物在体内的暴露特性。由于药动学研究中血药浓度只能观察至某时间点t，因此AUC有两种表示方式：AUC(0-t)和AUC(0-∞)，前者根据梯形面积法得到，后者计算式：AUC(0-∞)＝AUC(0-t)+末端点浓度/末端消除速率。
实施例11SMI0化合物抑制二乙基亚硝胺所致大鼠肝损伤
实验方法：利用间断性腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)制备SD大鼠肝损伤模型。模型组为前4周注射腹腔注射DEN 50mg/kg，每周2次，第5～8周每周一次。SMI0干预组分为伴随DEN低、高剂量组和高剂量连续用药组，其中伴随DEN低、高剂量组分别于每次给予DEN前5min灌胃给SMI0化合物30mg/kg和150mg/kg，高剂量连续用药组于第一周开始，每天灌胃给SMI0化合物150mg/kg，直至第8周模型结束。模型结束时，眼眶采血，采用全自动生化分析仪对大鼠血浆肝功能指标进行测定【模型组，n＝10只大鼠；SMI0化合物低剂量组，n＝21只大鼠；(150mg/kg)a，SMI0化合物伴随DEN高剂量组，n＝28只大鼠；(150mg/kg)b，SMI0化合物高剂量连续用药组，n＝24只大鼠】。
实验结果：与模型组相比，SMI0干预组的白蛋白(ALB2)、胆碱酯酶(CHE2)显著升高，碱性磷酸酶(ALP2S)、谷丙转氨酶(ALTL)、直接胆红素(BILD2)、总胆红素(BILT3)和谷氨酰转肽酶(GGTI2)显著降低；SMI0低剂量组的TP2显著升高，SMI0高剂量伴随用药组和SMI0高剂量连续用药组的GGTI2显著降低(如图13A-图13I所示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组；其中150mg/kga为SMI0高剂量伴随用药组，150mg/kgb为SMI0高剂量连续用药组)。较SMI0低剂量组相比，SMI0高剂量伴随用药组的ALTL、BILD2、BILT3和GGTI2显著降低的，TP2显著升高；SMI0高剂量连续用药组的ALB2显著升高，ALP2S、ALTL、ASTL、BILD2、CHE2、BILT3、GGTI2显著降低(##P<0.01,###P<0.001vs SMI0低剂量组)。较SMI0高剂量伴随用药组相比，SMI0高剂量连续用药组的ALB2显著升高，ALP2S、ALTL、ASTL、BILD2、CHE2、BILT3和GGTI2显著降低($P<0.05，$$$P<0.001vs SMI0高剂量伴随用药组)。提示，SMI0用药可显著改善二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝损伤。
以上结果表明，SMI0对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝损伤具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床肝损伤的防治。
实施例12SMI0抑制高脂饮食所致小鼠肝脏脂肪变、肝炎
实验方法：采用健康雄性C57/6J小鼠给予高果糖高脂高胆固醇饲料喂养制备小鼠肝脏脂肪变、肝炎模型，对照组给予低脂低糖对照饲料喂养。SMI0干预组分为低、高剂量干预组，即分别于模型开始时每天灌胃给予SMI0化合物30mg/kg和150mg/kg，直至22周模型结束。于22周实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死。记录肝重和外观(肝脏色泽、质地、有无结节等)。部分肝脏标本进行HE染色后观察记录各组小鼠脂肪变性评分，Masson染色评价小鼠肝纤维化状态，同时进行油红O染色面积百分比和LCA染色炎症评分。(模型组，n＝8只小鼠；SMI0化合物低剂量组，n＝10只大鼠；SMI0化合物高剂量组，n＝10只大鼠)。
其中，根据以下标准对肝组织HE染色的病理结果进行量化评分，以判断脂肪变的严重程度。
根据以下标准对肝脏组织Masson染色的病理结果进行量化评分，以判断纤维化的严重程度。
实验结果：与对照组相比，模型组肝脏系数、脂肪变程度(脂肪变性Steatosis评分和油红O染色面积百分比)、肝脏炎症水平(LCA阳性细胞染色灶数)均有不同程度的显著升高(如图14A-图14B、图15A-图15E，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs对照组；图14刻度均为100μm)；与模型组相比，SMI0低剂量干预组肝脏系数和脂肪变程度(脂肪变性Steatosis评分和油红O染色面积百分比)均显著降低(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs模型组)，SMI0高剂量干预组脂肪变程度(脂肪变性Steatosis评分和油红O染色面积百分比)和肝脏炎症水平(LCA阳性细胞染色灶数)均显著降低。提示，SMI0化合物可显著降低高脂饮食诱发的肝脏脂肪变和炎症。
以上结果表明，SMI0对高脂饮食所致的小鼠肝脏脂肪变、肝炎具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床脂肪肝和肝炎的防治。
实施例13SMI0抑制高脂饮食所致小鼠肝脏纤维化
实验方法：采用高果糖高脂高胆固醇饲料喂养制备雄性C57/6J小鼠肝脏脂肪变、肝炎模型，对照组给予低脂低糖对照饲料喂养。SMI0干预组分为低、高剂量干预组，即分别于模型开始时每天灌胃给予SMI0化合物30mg/kg和150mg/kg，直至26周模型结束。于26周实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死。记录肝重和外观(肝脏色泽、质地、有无结节等)。部分肝脏标本进行HE染色后观察记录各组小鼠脂肪变性评分，Masson染色评价小鼠肝纤维化状态，同时进行油红O染色面积百分比评分。(模型组，n＝10只小鼠；SMI0化合物低剂量组，n＝10只大鼠；SMI0化合物高剂量组，n＝10只大鼠)。
实验结果：与对照组相比，模型组肝脏系数和反映脂肪变程度指标(脂肪变性评分和油红O染色面积百分比)及反映纤维化程度的指标Masson染色评分均有不同程度的显著升高(如图16A-图16B、图17A-图17D，*P<0.05,**P<0.01vs对照组；图16B中HE和Masson染色刻度为100μm，Oil red染色刻度为50μm)；与模型组相比，SMI0低、高剂量干预组脂肪变程度(脂肪变性评分和油红O染色面积百分比)和纤维化程度(Masson染色评分)(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs模型组)。提示，SMI0化合物可显著降低高脂饮食诱发的小鼠肝纤维化水平。
以上结果表明，SMI0对高脂饮食所致的小鼠肝脏纤维化具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床肝纤维化的防治。
实施例14SMI0化合物抑制二乙基亚硝胺所致大鼠肝纤维化
实验方法：利用间断性腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)制备SD大鼠肝损伤模型。模型组为前4周腹腔注射DEN 50mg/kg，每周2次，第5～12周每周一次。SMI0干预组分为伴随DEN低、高剂量组和高剂量连续用药组，其中伴随DEN低、高剂量组分别于每次给予DEN前5min灌胃给SMI0化合物30mg/kg和150mg/kg，高剂量连续用药组于第一周开始，每天灌胃给SMI0化合物150mg/kg，直至12周模型结束。模型结束时，眼眶采血，采用全自动生化分析仪对大鼠血浆肝功能指标进行测定(模型组，n＝10只大鼠；SMI0化合物低剂量组，n＝21只大鼠；SMI0化合物伴随DEN高剂量组，n＝28只大鼠；SMI0化合物高剂量连续用药组，n＝24只大鼠)。
实验结果：与模型组相比，SMI0干预组的肝脏系数、肝纤维化Ishark评分、肝纤维化Masson染色面积百分比、α-SMA和Collagen I均有不同程度的降低(如图18A-图18B、图19A-图19E所示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs模型组；图18B刻度均为100μm)，且SMI0高剂量(150mg/kgb)连续用药组效果显著优于伴随二乙基亚硝胺高剂量组(150mg/kga)和SMI0低剂量组(##P<0.01,###P<0.001vs SMI0低剂量组；&P<0.05，&&&P<0.001vs伴随SMI0高剂量组)。
以上结果表明，SMI0对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝纤维化具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床肝纤维化的防治。
实施例15SMI0抑制小鼠肝癌发生发展
(1)cyp2e1敲除大鼠移植瘤
实验方法：利用乳腺癌肉瘤细胞株Walker256细胞肝脏原位种植制备SD大鼠肝癌移植瘤模型，细胞浓度为4*106。SD大鼠分模型组和cyp2e1基因敲除组，21天模型结束(模型组，n＝9只大鼠；基因敲除组，n＝8只大鼠)。于实验结束时眼眶采血，记录大鼠体重后处死。记录肝重和外观(肝脏色泽、质地等)。对部分肝脏标本进行HE染色后观察各组大鼠肝脏病变和肿瘤发生情况。
实验结果：与模型组相比，cyp2e1基因敲除组大鼠肝脏肿瘤生长显著抑制，肿瘤增殖抑制率可达82.0％(如图20所示)。提示cyp2e1基因敲除可显著抑制Walker256细胞肝脏原位种植大鼠肝癌移植瘤模型的发生。
(2)SMI0干预小鼠移植瘤
实验方法：利用肝癌细胞株H22细胞肝脏原位种植制备雄性BALB/c小鼠肝癌移植瘤模型，细胞浓度为1.5*105。SMI0干预组分为低、中、高剂量组，分别于造模前两天开始每天灌胃给SMI0化合物3.3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg，直至24天模型结束(模型组，n＝19只小鼠；SMI0化合物低剂量组，n＝19只小鼠；SMI0化合物中剂量组，n＝18只小鼠；SMI0化合物高剂量组，n＝29只小鼠)。于实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死。记录肝重和外观(肝脏色泽、质地等)。对部分肝脏标本进行HE染色后观察各组小鼠肝脏病变和肿瘤发生情况。
实验结果：与模型组相比，SMI0干预组小鼠肝脏H22肿瘤发生率显著降低，由模型组的100％降为SMI0低、中、高剂量组的78.9％、72.2％和68.4％(如图21A～21C、表3所示，*P<0.05,**P<0.01vs模型组)。图20为各小鼠肝脏肿瘤组织图片，若一只小鼠肝脏上有多个肿瘤形成，则将所有肿瘤累积排列在一起，代表一只动物的肿瘤发生情况。测定每只动物肝脏肿瘤累积重量，结果发现模型组各小鼠肝脏均有肿瘤形成，较模型组相比，SMI0干预组肿瘤增殖明显受到抑制。即SMI0干预可显著抑制小鼠肝脏肿瘤的生长，肿瘤增殖抑制率可达71.8％(如图21A～21C、表3所示，*P<0.05,**P<0.01vs模型组)。提示，SMI0用药可显著抑制H22细胞肝脏原位种植小鼠肝癌移植瘤模型的发生和发展。
另外体外抑制实验(图21D)显示，SMI0在0～128μM浓度范围内持续作用于H22细胞48h，均对H22无明显抑制作用。
以上结果表明，SMI0对H22细胞肝脏原位种植小鼠肝癌模型的发生和发展具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床肝癌的防治。
表3SMI0化合物抑制肝癌细胞株H22细胞肝脏原位种植小鼠肝癌模型的相关参数的量化作表
*P<0.05,**P<0.01vs模型组.
实施例16SMI0抑制小鼠胶质瘤增殖
(1)临床胶质瘤患者CYP2E1改变
实验方法：以46例正常人为对照，对临床32例胶质瘤患者癌旁组织CYP2E1表达变化进行研究，比较胶质瘤患者癌旁组织CYP2E1含量的改变。
实验结果：免疫组化结果显示，CYP2E1在胶质瘤患者瘤旁组织的表达显著高于正常脑组织中的表达(如图22所示，***P<0.001vs正常脑组织组)。
(2)cyp2e1敲除小鼠移植瘤
实验方法：利用脑胶质瘤细胞株GL261细胞脑原位种植制备雄性C57/6小鼠胶质瘤模型，细胞浓度为1*106。分为模型组和cyp2e1敲除组，约21天模型形成(模型组，n＝10只小鼠；cyp2e1基因敲除组，n＝6只小鼠。于实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死，取脑。对脑组织标本进行HE染色后观察各组小鼠脑组织病变和肿瘤发生情况。
实验结果：与模型组相比，cyp2e1基因敲除可显著抑制小鼠胶质瘤肿瘤生长。(如图23所示，*P<0.05vs野生型模型组)。提示，cyp2e1基因敲除可显著抑制GL261细胞脑原位种植小鼠胶质瘤模型的发生。
(3)SMI0干预小鼠移植瘤
实验方法：利用胶质瘤细胞株GL261细胞脑原位种植制备雄性C57/6小鼠胶质瘤模型，细胞浓度为1*106。SMI0干预组分为低、中、高剂量组，分别于造模前两天开始每天灌胃给SMI0化合物3.3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg，阳性药组为术后第三至七天，第十至十四天每天灌胃给替莫唑胺50mg/kg，21天模型结束。(假手术组，n＝9只小鼠；模型组，n＝10只小鼠；替莫唑胺，n＝11只小鼠；SMI0化合物低剂量组，n＝13只小鼠；SMI0化合物中剂量组，n＝13只小鼠；SMI0化合物高剂量组，n＝13只小鼠)。于实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死，取脑。对脑组织标本进行HE染色后观察各组小鼠脑组织病变和肿瘤发生情况。
实验结果：与模型组相比，SMI0干预可显著抑制小鼠胶质瘤肿瘤的生长，其中SMI0高剂量组抑制效果最好，肿瘤增殖抑制率最高达97.6％(如图24A-图24C所示，*P<0.05vs模型组，**P<0.01vs模型组)。提示，SMI0用药可显著抑制GL261细胞脑原位种植小鼠胶质瘤模型的发生和发展。
另外体外抑制实验(图24D)显示，SMI0在0～128μM浓度范围内持续作用于GL261细胞48h，均对GL261无明显抑制作用。
以上结果表明，cyp2e1基因敲除可显著抑制小鼠胶质瘤的发生和发展，CYP2E1抑制剂SMI0对GL261细胞脑原位种植小鼠胶质瘤的发生和发展具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床胶质瘤的防治。
实施例17SMI0抑制小鼠卵巢癌发生发展
(1)卵巢癌原位移植瘤
实验方法：利用鼠源卵巢癌ID-8细胞株，制备雌性C57/6小鼠卵巢癌原位移植瘤模型，细胞浓度为1x 106。分为模型组和SMI0干预组，干预组于造模前三天开始每天灌胃给SMI0化合物30mg/kg，直至60天模型结束。(模型组，n＝6只小鼠；SMI0化合物30mg/kg，n＝7只小鼠)。于实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死，取卵巢及肿瘤组织。对卵巢组织标本进行HE染色后观察各组小鼠卵巢肿瘤组织和肿瘤发生情况。
实验结果：与模型组相比，SMI0干预可显著抑制小鼠卵巢癌的生长，肿瘤增殖抑制率最高达72.51％(如图25A-图25B所示，*P＝0.014vs模型组)。提示，SMI0用药可显著抑制ID-8卵巢癌原位移植瘤模型的发生和发展。
另外体外抑制实验(图25C)显示，SMI0在0～320μM浓度范围内持续作用于ID-8细胞48h，均对ID-8无明显抑制作用。
(2)卵巢癌腹腔移植瘤
实验方法：利用卵巢癌鼠源ID8细胞株制备雌性C57/6小鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型，细胞浓度为2.5x106。分为模型组和SMI0干预组，干预组于造模前三天开始每天灌胃给SMI0化合物30mg/kg，直至30天模型结束。(模型组，n＝7只小鼠；SMI0化合物30mg/kg，n＝7只小鼠)。于实验结束时眼眶采血，记录小鼠体重后处死，取卵巢组织。对卵巢组织标本进行HE染色后观察各组小鼠卵巢组织病变和肿瘤发生情况。
实验结果：与模型组相比，SMI0化合物30mg/kg干预组小鼠体重显著降低，腹水体积显著减少，即SMI0化合物用药可显著抑制小鼠卵巢癌腹腔移植瘤的腹水形成及肿瘤进展，其中对腹水体积的抑制率达52.82％。(如图26A-图26B所示，*P<0.05vs模型组)。提示，SMI0用药可显著抑制ID-8细胞卵巢癌腹腔移植瘤模型的发生和发展。
以上结果表明，CYP2E1抑制剂SMI0对ID-8卵巢癌原位移植瘤及腹腔移植瘤的发生和发展具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于卵巢癌的防治。
实施例18SMI0抑制完全佛氏佐剂所致大鼠类风湿性关节炎
实验方法：利用完全佛氏佐剂(CFA，0.1mL/大鼠)制备SD大鼠类风湿性关节炎模型。SMI0干预组分为超低剂量组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别为造模前两天开始每天灌胃给予SMI0化合物1mg/kg、6mg/kg、30mg/kg和150mg/kg，阳性对照组为灌胃给予塞来昔布5mg/kg，每组动物各10只。大鼠给予CFA前1天按上述分组和剂量给药，之后每天给药1次，直至第10天模型结束。每只大鼠于右后足足跖部给予CFA，并于每天使用大鼠足肿胀测量仪测量大鼠右后足体积(前3天每12h测量一次)，根据各个时间点大鼠的右后足体积相对于给CFA前的变化计算每只大鼠的足肿胀率，分析各组大鼠之间足肿胀率的差异。
实验结果：与对照组相比，模型组大鼠足部明显肿胀(如图27所示)。与模型组相比，SMI0干预组显著缓解完全佛氏佐剂引起的大鼠足肿胀(图27、图28A-图28D所示，图28B为24h大鼠足肿胀率图，26C为36h大鼠足肿胀率图，28D为48h大鼠足肿胀率图)(***P<0.001vs模型组)。1mg/kg、6mg/kg、30mg/kg、150mg/kg剂量下SMI0化合物在第36h(模型组足肿胀程度达最大值的时间点)对大鼠足肿胀缓解率分别为20.8％,34.2％,44.1％,52.5％。且SMI0剂量与大鼠足缓解率呈现良好的量效关系(P<0.05)(图29A-图29D所示，图29B为24h量效关系，29C为36h量效关系图，29D为48h量效关系图)。提示，SMI0可显著缓解完全佛氏佐剂所致的大鼠类风湿性关节炎模型的足肿胀。
以上结果表明，SMI0对完全佛氏佐剂所致的大鼠类风湿性关节炎具有明显防治作用。提示，SMI0化合物可用于临床风湿性和类风湿性关节炎的防治。
实施例19SMI0抑制脂多糖所致的大鼠、小鼠脓毒症
实验方法：
大鼠：采用单次腹腔注射脂多糖(LPS,5mg/kg)制备SD大鼠脓毒症模型。在给予LPS前30min，模型组大鼠给予生理盐水(0.5mL/kg,i.g.)，阳性对照组大鼠给予塞来昔布(5mg/kg,i.g.)，CYP2E1抑制组大鼠给予SMI0化合物(150mg/kg,i.g.)。给予LPS后每小时测定并记录大鼠体温，直至9h(对照组，n＝8只大鼠；模型组，n＝10只小鼠；塞来昔布组，n＝10只大鼠；SMI0化合物组，n＝10只大鼠)。
小鼠：采用单次腹腔注射脂多糖(LPS,15mg/kg)制备小鼠脓毒症模型。在给予LPS前30min，模型组小鼠给予生理盐水(0.5mL/kg,i.g.)，阳性对照组小鼠给予塞来昔布(5mg/kg,i.g.)，CYP2E1抑制组小鼠给予SMI0化合物(90mg/kg,i.g.)。给予LPS后6h、12h、24h测定并记录小鼠体温，整个实验过程共测定10次。24h时处死动物，采集血样，测定肾功能和心功能相关指标(对照组，n＝8只小鼠；模型组，n＝8只小鼠；塞来昔布组，n＝8只小鼠；SMI0化合物组，n＝10只小鼠)。
实验结果：
大鼠：与对照组相比，模型组大鼠第4h、第5h和第6h体温显著升高；与模型组相比，SMI0化合物用药组和阳性药组可避免LPS诱发的大鼠脓毒症模型的体温升高(图30A-图30D所示，**P<0.01,***P<0.001vs对照组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs模型组)。提示，SMI0干预可显著抑制LPS诱发的大鼠体温升高，可使大鼠体温维持正常。
小鼠：与对照组相比，模型组小鼠第6h、第12h和第24h体温显著降低；与模型组相比，SMI0化合物用药组小鼠可避免LPS诱发的小鼠脓毒症模型的体温降低。与对照组相比，模型组小鼠第6h、第12h和第24h体温与给LPS前相比显著降低(图31A-图31D所示，**P<0.01，***P<0.001vs对照组；&P<0.05，&&&P<0.001vs模型组；##P<0.01，###P<0.001vs塞来昔布组)。同时，与对照组相比，模型组小鼠肾功能指标尿素氮和肌酐、心功能指标肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平显著升高；与模型组相比，SMI0化合物用药组小鼠肾功能和心功能相关指标水平显著降低(图32A-图32D所示，**P<0.01，***P<0.001vs对照组；&&&P<0.001vs模型组；#P<0.01，##P<0.001vs塞来昔布组)。提示，SMI0干预可显著抑制LPS诱发的小鼠体温降低，可使小鼠体温维持正常；同时改善LPS诱发的小鼠脓毒症模型的肾功能和心功能损伤。
以上结果表明，SMI0可避免脂多糖(LPS)诱发的大鼠、小鼠脓毒症模型的体温改变。推测SMI0化合物可用于临床脓毒症的防治。
实施例20SMI0改善链脲佐菌素(STZ)所致大鼠阿尔兹海默症的认知功能障碍
实验方法：利用双侧脑室注射链脲佐菌素(STZ)制备雄性SD大鼠阿尔兹海默症(AD)模型，其中第1天注射STZ(3mg/kg)，第3天注射STZ(1.5mg/kg)。采用脑立体定位仪对双侧脑室(前囱后0.9mm，矢状缝左右1.5mm，脑表面下距离头骨3.8mm)注射STZ。假手术组同样的操作注射相同容积的对照溶剂。低、高剂量防治组分别为造模后第11天开始灌胃给予SMI0化合物10mg/kg、30mg/kg，连续给药21天，在连续给药第14天(即模型第25天)后利用Morris水迷宫连续6天空间定位航行训练，空间定位航行训练结束24小时后进行空间探索实验(每组各15只大鼠)。
实验结果：在Morris水迷宫定位航行实验的第1-6天，与假手术组相比，模型组大鼠潜伏期显著延长；在第2-6天，与模型组相比，SMI0高剂量组大鼠每天潜伏期均显著缩短(表4是SMI0化合物改善链脲佐菌素所致的大鼠阿尔兹海默症模型的认知功能障碍的相关参数的量化作表，如表4和图33A所示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs假手术组，#P<0.05vs模型组)。在第7天空间探索实验中，与假手术组相比，模型组大鼠在原平台所在象限的停留时间和穿越平台次数均显著缩短(**P<0.01，***P<0.001vs假手术组)；与模型组相比，SMI0高剂量组(30mg/kg)大鼠在原平台所在象限的停留时间和穿越平台次数均显著增加(如表4和图33B-图33C所示，#P<0.05vs模型组)；与SMI0低剂量组相比，SMI0高剂量组大鼠穿越平台次数和原平台所在象限的停留时间显著增加(&P<0.05vs低剂量组)。就整体获得学习记忆功能而言，相比于模型组，SMI0高剂量组能够显著改善ICV-STZ诱导的认知障碍，改善率达46.7％；SMI0低剂量组有改善趋势，无明显统计学差异，改善率为32.6％。提示，SMI0可显著改善侧脑室注射链脲佐菌素诱导的认知障碍。
表4SMI0化合物改善链脲佐菌素(STZ)所致大鼠阿尔兹海默症的认知功能障碍相关参数的量化作表
以上结果表明，SMI0 30mg/kg可显著改善链脲佐菌素所致的大鼠阿尔兹海默症模型的认知功能障碍。推测SMI0化合物可用于临床阿尔兹海默症的防治。
实施例21SMI0抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤
实验方法：利用改良的Zea-longa线栓法制备大鼠中动脉阻塞局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型。10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，仰位固定于恒温鼠板上，使大鼠体温维持在36.5℃-37.5℃之间；使用碘伏消毒后，颈部正中切开皮肤，暴露左颈总动脉，分离颈总，颈外，颈内动脉，结扎翼腭动脉。在颈外动脉侧切一小口，将尼龙线栓从切口插入，以分叉口为标记，线拴插入约17mm时小心缓慢推入，约18±0.5mm时可感到阻力，表明尼龙线头端已到达大脑前动脉，扎紧颈外动脉切口，缝合皮肤。缺血2h后，用吸入性七氟烷麻醉大鼠，轻轻缓慢抽出尼龙线直至尼龙线球端退至颈总动脉分叉处，从而实现再灌注。缺血2h再灌注24h，SMI0干预组为再灌注前10min灌胃给予SMI0化合物(150mg/kg)，假手术组和模型组注射等体积对照溶剂。术后2.5h和6h进行神经行为评分，再灌后24h将大鼠断头取脑，进行氯代三苯基四氮唑(TTC)染色，观察脑梗死体积和脑水肿的变化(每组各10只大鼠)。
实验结果：与模型组组相比，SMI0干预组脑梗死体积和脑水肿体积显著降低(如图34、图35A-图35B所示，*P<0.05vs模型组)，其中脑梗死体积由模型组的51.03％降至32.62％，脑水肿体积由模型组的19.25％降为12.63％。SMI0(150mg/kg)用药对脑梗死和脑水肿体积的抑制率分别为36.06％和34.39％。提示，SMI0可显著降低大鼠中动脉阻塞局灶性脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积和脑水肿体积。
以上结果表明，SMI0可显著改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的脑梗死和脑水肿，推测SMI0化合物可用于临床缺血性脑卒中的防治。
实施例22SMI0降低高脂饮食所致ApoE-/-小鼠高血脂的血脂水平
实验方法：以ApoE-/-小鼠为研究对象，利用高脂高胆固醇饲料喂养制备ApoE-/-小鼠高血脂模型。SMI0干预组分为低剂量和高剂量干预组，分别于造模期间每天给予SMI0化合物30mg/kg和150mg/kg，直至16周模型结束。于实验结束时眼眶采血，采用全自动生化分析仪测定各小鼠血清中血脂相关指标水平(每组各8只小鼠)。
实验结果：与对照组相比，模型组小鼠总胆固醇和低密度脂蛋白水平均显著升高(如表5，图36所示，*P<0.05vs对照组)。与模型组相比，SMI0高剂量干预组总胆固醇和低密度脂蛋白显著降低，高密度脂蛋白显著升高(@P<0.05vs模型组)；较模型组相比，SMI0低剂量干预对于高脂饮食诱发的高血脂水平呈现出一定改善作用，但未达到统计学意义。同时，SMI0用药可显著抑制ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块的形成。如HE染色结果显示，与模型组相比，SMI0高剂量组(150mg/kg)显著减少小鼠主动脉根部病变总面积(如图37所示，**P<0.01vs模型组)，油红O染色结果也显示SMI0高剂量组(150mg/kg)显著减少主动脉根部病变总面积(如图37所示，*P<0.05vs模型组)。提示，SMI0 150mg/kg用药可显著改善高脂饮食诱发的小鼠高血脂水平(降低总胆固醇和低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白)，同时抑制ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块的形成。
表5SMI0化合物降低高脂饮食所致小鼠高血脂模型的血脂相关参数的量化作表
以上结果表明，SMI0可显著降低高脂饮食所致的小鼠血脂水平升高和动脉粥样斑块形成。推测SMI0化合物可用于临床高脂血症、动脉粥样硬化和冠心病的防治。
实施例23SMI0降低高脂饮食和链脲佐菌素所致大鼠糖尿病的血糖水平
实验方法：采用高脂饮食加单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ，40mg/kg)制备大鼠糖尿病模型。造模两周后以空腹血糖(FBG)≥16.7mmol/L为成模标准。将成模大鼠按血糖高低均分至各组。其中模型组大鼠给予生理盐水，SMI0低剂量和高剂量干预组分别于每天给予SMI0化合物30mg/kg和150mg/kg。每周定时测定并记录大鼠FBG，直至给药后第六周，每组各10只大鼠。
实验结果：与模型组相比，SMI0低、高剂量干预组大鼠第5、第6周空腹血糖水平均显著降低(*P<0.05vs模型组)(图38A所示)。糖耐量实验结果显示，SMI0低、高剂量干预组可显著改善大鼠的糖耐量(图38B-图38C所示)。提示，SMI0干预可显著改善高脂饮食和链脲佐菌素诱发的大鼠高血糖水平。
以上结果表明，SMI0可显著降低高脂饮食和链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠的血糖水平，推测SMI0化合物可用于临床糖尿病的防治。
实施例24膀胱癌癌旁组织CYP2E1的表达增高
实验方法：以30例正常人为对照，对临床30例膀胱癌患者癌旁组织CYP2E1表达变化进行研究，比较膀胱癌患者癌旁组织CYP2E1含量的改变。
实验结果：免疫组化结果显示，CYP2E1在膀胱癌癌旁组织的表达显著高于正常膀胱组织中的表达(P<0.05)，如图39所示。依据CYP2E1在肝癌和胶质瘤中的表达显著增高和CYP2E1在炎症相关性肿瘤中的作用，及SMI0化合物可显著抑制肝癌和胶质瘤的发生发展，推测膀胱癌癌旁组织增高的CYP2E1表达与膀胱癌的发生有关，SMI0化合物可对膀胱癌的发生发展具有防治作用，SMI0化合物可用于临床膀胱癌的防治。
实施例25胆囊癌癌癌旁组织CYP2E1的表达增高
实验方法：以31例正常人为对照，对临床33例胆囊癌患者癌旁组织CYP2E1表达变化进行研究。
实验结果：免疫组化结果显示，CYP2E1在胆囊癌癌旁组织的表达显著高于正常胆囊组织中的表达(P<0.05)，如图40所示。依据CYP2E1在肝癌和胶质瘤中的表达显著增高和CYP2E1在炎症相关性肿瘤中的作用，及SMI0化合物可显著抑制肝癌和胶质瘤的发生发展，推测胆囊癌癌旁组织增高的CYP2E1表达与胆囊癌的发生有关，SMI0化合物可对胆囊癌的发生发展具有防治作用，SMI0化合物可用于临床胆囊癌的防治。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种化合物或其盐作为CYP2E1抑制剂在制备用于治疗或预防阿尔兹海默症、缺血性脑卒中、帕金森综合症的药物中的应用，其特征在于，选自式(I)所示的化合物或其盐作为抑制剂以CYP2E1为靶点并与其结合，对CYP2E1起抑制作用；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式(I)所示的化合物和酸反应得到所述式(I)所示的化合物相应的酸式盐；
所述酸选自无机酸、有机酸中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸中的至少一种；
所述有机酸选自乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、树脂酸、马来酸、富马酸、水杨酸、乙酰水杨酸中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，式(I)所示的化合物的盐酸盐的晶型A的X-射线粉末衍射图谱包括3个或3个以上选自下组的2θ值：8.4±0.2°、13.1±0.2°、14.8±0.2°、16.6±0.2°、24.1±0.2°、27.2±0.2°、30.5±0.2°、31.8±0.2°、33.5±0.2°、35.4±0.2°、35.7±0.2°；
式(I)所示的化合物的盐酸盐的晶型A的DSC-TGA图显示其在70℃～220℃之间有一明显吸热峰，在80℃～170℃热分解。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，式(I)所示的化合物的硫酸盐的晶型B的X-射线粉末衍射包括5个或5个以上选自下组的2θ值：10.1±0.2°、15.1±0.2°、16.0±0.2°、16.7±0.2°、19.2±0.2°、19.9±0.2°、23.4±0.2°、24.0±0.2°、25.8±0.2°、26.5±0.2°、28.9±0.2°、30.3±0.2°、32.2±0.2°；
式(I)所示的化合物的硫酸盐的晶型B的DSC-TGA图显示其在30℃～85℃、90℃～160℃、215℃～330℃之间至少有一个吸热峰，在150℃～350℃热分解。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式(I)所示化合物的合成方法具有以下合成路线：
其中，反应条件：a在碱性条件下水解，酸化；
b在碱和缩合剂存在下与N,O-二甲羟胺盐酸盐反应；
c在低温条件下，无水非质子性溶剂中与格氏试剂反应。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，条件a中所述的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾等中的一种，酸可以是盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸等中的一种或者混合物，所用的溶剂为甲醇、乙醇、丙醇等水溶性溶剂中的一种和水的混合物，反应温度从10度到50度。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，条件b中所述的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种，缩合剂可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、碳酸二月桂酯、N,N-羰基二咪唑和N-(4-羧基苯基)马来酰亚胺等中的一种，反应温度从20度到60度，所用的溶剂为四氢呋喃、乙醚等非质子性溶剂中的一种。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，条件c中所述反应温度从-20度到25度，所用的溶剂为四氢呋喃、乙醚等非质子性溶剂中的一种，化合物3与格氏试剂的当量比为1:1～1:3；
优选地，所述格氏试剂选自甲基溴化镁、甲基氯化镁中的至少一种。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，式(I)所示的化合物的酸式盐的制备方法至少包括：
将含有式(I)所示的化合物和溶剂A的物料，-20～80℃反应0.5～10小时，即可得到式(I)所示的化合物相应的酸式盐；
优选地，所述溶剂A选自醚类化合物、醇类化合物、酯类化合物、腈类化合物、酮类化合物、卤代烷烃、烷烃、芳烃中的至少一种。
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