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CN118450805A - 富含免疫球蛋白的乳级分 - Google Patents

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CN118450805A
CN118450805A CN202280081255.8A CN202280081255A CN118450805A CN 118450805 A CN118450805 A CN 118450805A CN 202280081255 A CN202280081255 A CN 202280081255A CN 118450805 A CN118450805 A CN 118450805A
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whey
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李维为
C·T·E·多特蒙
C·康内特
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FrieslandCampina Nederland BV
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Abstract

一种用于获得富含免疫球蛋白，优选富含IgA和IgM的乳级分的方法，该方法包括以下步骤：(a)使脱脂乳经受微滤步骤，产生富含胶束酪蛋白的MF渗余物和富含乳清蛋白的MF渗透物，(b)使该MF渗余物经受酪蛋白沉淀或奶酪制造方法，从而产生富含酪蛋白的级分和乳清级分，(c)使步骤b)中获得的该乳清级分经受微滤和/或阴离子交换色谱，从而获得富含免疫球蛋白的乳级分。

Description

富含免疫球蛋白的乳级分
本发明涉及具有高免疫球蛋白含量的乳级分、其生产和用途。
在哺乳动物后代能够消化其他来源的食物之前，乳是它们的唯一营养源。所有泌乳动物的初乳和乳都含有免疫球蛋白(Ig)，免疫球蛋白为后代提供针对微生物病原体和毒素的免疫保护，并保护乳腺免受感染。牛乳和人乳中主要类别的免疫球蛋白是IgG、IgA和IgM，这些免疫球蛋白在结构和生物活性上有所不同。IgG可细分为IgG1和IgG2；IgA可细分为IgA1和IgA2。
免疫球蛋白的分子量不同。单体IgG的质量为约150kDa(精确重量取决于来源动物)，二聚体IgA为约400kDa，并且IgM为约900kDa，其显著高于主要乳清蛋白的重量(约14-18kDa)并且显著低于存在于乳中的酪蛋白胶束的重量。
在人乳中，主要的Ig是IgA。基于总Ig含量，人母乳含有约85wt％-90wt％的IgA、约2wt％-3wt％的IgG、以及约8wt％-10wt％的IgM(J.A.Cakebread等人，J.Agric.Food Chem.[农业食品化学杂志]，63(2015)7311-7316)。人母乳中的总Ig浓度是牛乳中Ig含量的约1.5倍(J.A.van Neerven等人，J.Allergy Clin.Immunol.[变态反应与临床免疫学杂志]，2012年10月，853-858)。
在牛乳中，主要的Ig是IgG。基于总Ig含量，成熟牛乳含有约80wt％的IgG(绝大多数是IgG1)、约10wt％的IgM、以及约10wt％的IgA。
牛初乳的Ig含量比成熟牛乳的Ig含量高得多：初乳的总蛋白含量的70％-80％是Ig，而在成熟牛乳中，Ig仅占总蛋白含量的1wt％-2wt％。初乳中的IgG/IgA比率甚至高于成熟牛乳中的IgG/IgA比率。
通过将至少一种乳清蛋白源、至少一种乳(酪蛋白)蛋白源、至少一种脂质源、至少一种碳水化合物源、维生素和矿物质组合来常规制备婴儿配方乳。牛乳是这些蛋白质、碳水化合物、脂质和维生素的应用来源之一。
人们一直期望生产与人母乳尽可能相似的婴儿配方乳。因此，为实现此目标，人们期望增加婴儿配方乳中的活性免疫球蛋白含量和IgA含量。因此，本发明的目的之一是提供具有高IgA相对于IgG的比率的乳级分；因此，将该乳级分添加到婴儿配方乳中将满足上述期望。
获得乳清蛋白的有效方式涉及将脱脂乳微滤成富含酪蛋白的渗余物和富含乳清蛋白的渗透物。
由微滤产生的富含乳清蛋白的渗透物(即血清蛋白级分)可以用于通过使所述渗透物经受超滤以除去乳糖、灰分和水，随后进行(喷雾)干燥来制造血清蛋白浓缩物(SPC)。
通过使渗余物经受蒸发和(喷雾)干燥，可以从富含酪蛋白的渗余物中获得胶束酪蛋白分离物(MCI)。该MCI可以用于例如生产软奶酪，如马苏里拉奶酪和菲达奶酪。该奶酪制造方法中的乳清级分通常被认为是废物，尽管事实上它含有大量的Ig。因此，本发明的另一个目的是使该乳清级分内的Ig发挥价值。
在微滤期间，大多数IgG最终进入血清蛋白级分。另一方面，酪蛋白级分除了含有不可忽略的IgG部分之外，还含有大多数IgA和IgM。
本发明涉及一种用于使保留在富含酪蛋白的MF渗余物中的免疫球蛋白发挥价值的方法。
更特别地，本发明涉及乳级分，其包含相对于总蛋白含量范围为10wt％至40wt％的免疫球蛋白含量(定义为IgG+IgA+IgM的总含量)和范围为25wt％-60wt％，优选45wt％-60wt％的(IgA+IgM)/IgG重量比。
本发明还涉及一种用于获得富含Ig(优选富含IgA和IgM)的乳级分的方法，该方法包括以下步骤：
a)使脱脂乳经受微滤步骤，产生富含胶束酪蛋白的MF渗余物和富含乳清蛋白的MF渗透物，
b)使该MF渗余物经受酪蛋白沉淀和/或奶酪制造方法，从而产生富含酪蛋白的级分和乳清级分，
c)使步骤b)中获得的该乳清级分经受微滤和/或阴离子交换色谱，从而获得富含免疫球蛋白的乳级分。
本发明方法中的第一步涉及脱脂乳的微滤。术语“脱脂乳”是指动物乳，优选牛乳，其已经脱脂并且可以任选地已经预处理——例如巴氏灭菌、稀释、超滤、浓缩、脱矿质、和/或经受碳水化合物水平降低——条件是酪蛋白与乳清蛋白的原始百分比基本上保持不变。
使脱脂乳经受微滤以获得富含酪蛋白的渗余物和富含乳清蛋白的渗透物。这是一个众所周知的方法。
可以使用各种类型的微滤膜，包括螺旋卷式膜、陶瓷膜和中空纤维膜。微滤膜对于水、矿物质和乳糖应该是可渗透的，它对于乳清蛋白应该是至少部分可渗透的，并且对于酪蛋白和脂肪应该具有高保留率。合适的微滤膜典型地具有0.85至0.5μm，更典型地0.1至0.2μm的孔径。
微滤步骤优选地在4℃-15℃或50℃-55℃，更优选10℃-15℃或50℃-52℃范围内的温度下进行。
错流流速优选高流速：优选地，对于螺旋卷式膜，在0.10-0.25m/s的范围内，对于中空纤维膜，在1.0-2.4m/s的范围内，并且对于陶瓷膜，在5.0-7.0m/s的范围内。
如果期望的话，可以在微滤之前调节乳的pH，以便调节分子和膜上的离子电荷。pH优选地在5.6-6.2、更优选地5.6-6.0并且最优选地5.6-5.8的范围内。
跨膜压力(TMP)优选地尽可能地低，更优选地在0.25-1巴的范围内。
为了进一步改善免疫球蛋白之间的分离，需要渗滤。
使该MF渗余物经受酪蛋白沉淀和/或奶酪制造方法，以便降低该MF渗余物的酪蛋白含量。
酪蛋白沉淀方法涉及添加酸以诱导酪蛋白凝固，从而产生酸性酪蛋白级分(酪蛋白凝块)和酸性乳清级分。酸优选地选自HCl、H2SO4和柠檬酸。
例如，可以向脱脂乳中添加1M H2SO4，在40℃-45℃下充分搅拌，直至达到4.3-4.6范围内的pH。搅拌酸化的乳直至凝块完全形成。然后通过例如袋式过滤或离心从乳清中除去凝块。
奶酪制造方法优选地涉及(i)任选地在干燥和再悬浮该MF渗余物之后，将脂肪源添加到该MF渗余物中，(ii)随后添加凝固剂和酸化剂，以及(iii)凝固以获得富含酪蛋白的级分(奶酪或奶酪前体)和乳清级分。
合适的脂肪源是无水乳脂肪、无水乳脂肪级分、牛油、黄油、脂肪含量在30wt％至80wt％范围内的奶油、以及这些中的两种或更多种的混合物，其中无水乳脂肪和奶油是优选的脂肪源。
优选地在高于脂肪源的融化温度的温度下将脂肪源添加到MF渗余物或重悬浮的干燥渗余物中。
酸化的目标pH优选地在4.8至5.7、更优选地在4.9至5.5的范围内。合适的酸化剂包括发酵剂培养物(细菌酸化剂；将乳糖转化为乳酸)、酸、酸味剂(例如葡萄糖酸δ内酯或GDL)以及这些中的两种或更多种的组合。最常见的发酵剂培养物包括嗜热型发酵剂，典型地来自CSK公司、科汉森公司(Chr.Hansen)或杜邦公司(DuPont)的发酵剂。科汉森公司的嗜热型发酵剂包括冷冻培养物STI-02、STI-03、STI-04和STI-06，以及冻干培养物STI-12、STI-13和STI-14。也可以使用嗜温型发酵剂。
合适的凝固剂在本领域是已知的，并且包括例如小牛皱胃酶、发酵产生的皱胃酶和微生物皱胃酶。小牛皱胃酶的实例包括CSK公司生产的Kalase和科汉森公司生产的Naturen。发酵产生的皱胃酶的实例包括DSM公司的Fromase和CSK公司的Milase。微生物皱胃酶的实例为科汉森公司的Chy-Max和DSM公司的Maxiren。其他凝固剂包括胃蛋白酶和植物来源的各种蛋白水解酶。
随后使在所述酪蛋白沉淀或奶酪制造方法之后剩余的乳清级分(即分别是酸性乳清级分或奶酪乳清级分)经受微滤步骤和/或阴离子交换色谱步骤，从而产生富含免疫球蛋白的乳级分。
该微滤步骤用具有50-100nm范围内孔径或500-800kDa范围内截留分子量(MWCO)的膜进行。
孔径是通过气-液孔隙测定法(也称为毛细管流动孔隙测定法(CFP))以全氟醚作为润湿液体来测定的。
MWCO是一个实验测定的参数，该参数表示某种溶质分子的分子量——在这种情况下：葡聚糖(2000ppm水溶液)——被膜截留的水平为90％。该测定中的跨膜压力为约30psi，葡聚糖截留通过总有机碳(TOC)测定来测量。
具有如上定义的孔径或MWCO的膜对于IgG的至少一部分是可渗透的，但对于IgA和IgM可渗透性较差。因此，所得渗余物——即根据本发明的乳级分——相对于IgG将富含IgA和IgM。
优选地在将乳清级分酸化至4-5范围内的pH之后进行微滤。用于微滤的错流流速对于螺旋卷式膜优选为0.10-0.25m/s，或者对于陶瓷膜优选为5-7m/s。所施加的温度优选地是10℃-15℃。优选地通过所述微滤将乳清级分浓缩至至少为10的体积浓度因子(VCF)，优选随后用等体积的渗滤水进行至少一个渗滤步骤。来自微滤步骤的渗余物富含Ig，尤其是IgA和IgM。
可以用各种类型的树脂(包括弱离子交换树脂和强离子交换树脂)并且使用各种反荷离子进行阴离子交换色谱。
术语‘弱’离子交换和‘强’离子交换在本领域中通常是已知的。一旦离子交换剂达到平衡，强离子交换剂将不会显著释放其基质上的电荷，并且因此可以使用宽pH范围——通常从强酸性pH至强碱性pH。强阴离子交换树脂通常以存在季铵基团为特征。
弱离子交换剂具有它们将维持它们的电荷的更特定的pH值范围，通常在弱阴离子交换材料的情况下为酸性至约中性pH。弱阴离子交换基团通常以不存在季铵基团为特征。常见的弱阴离子交换基团是叔胺基团。
在优选的实施例中，使用强阴离子交换树脂，更优选地具有季铵基团的阴离子交换树脂(例如，Q琼脂糖大珠粒)。更优选地，阴离子交换树脂是Cl-形式。
优选地通过首先将乳清级分的pH调节至6.5-7.0来进行阴离子交换色谱。通过穿过柱，乳清级分富含Ig，尤其是IgA和IgM；杂质蛋白如β-乳球蛋白结合到树脂上，并且可以通过用低pH或高电导率的缓冲液(例如1M NaCl)冲洗而从柱中洗脱出来。
还可以通过首先进行微滤，将渗余物的pH调节至6.5-7.0，然后将所述渗余物加载到阴离子交换柱上来将微滤和阴离子交换色谱相组合，以进一步富集Ig。这样的组合允许Ig的进一步富集，最多可达奶酪制造或酪蛋白沉淀后乳清级分的Ig的约6-8倍。
所得产物(在本文中称为“乳级分”)具有相对于总蛋白含量范围为10wt％至40wt％的免疫球蛋白的总含量和范围为25wt％-60wt％，优选45wt％-60wt％的(IgA+IgM)/IgG重量比。
免疫球蛋白的总含量定义为IgG+IgA+IgM的总含量，通过如R.L.Valk-Weebera，T.Eshuis-de Ruiter，L.Dijkhuizen和S.S.van Leeuwen，International Dairy Journal[国际乳制品杂志]，第110卷，2020年11月，104814)所述的牛IgG ELISA定量装置来测定。通过众所周知的Kjeldahl氮分析方法并应用6.38的Kjeldahl因子来测量总蛋白含量。
根据本发明的富含免疫球蛋白的乳级分特别适合用作生产营养组合物、特别是配方乳的成分。配方乳选自下组：婴儿配方乳、较大婴儿配方乳和成长型配方乳。因此，本发明进一步涉及营养组合物、典型地用于儿童的营养组合物，例如配方乳、特别是婴儿配方乳、较大婴儿配方乳或成长型配方乳。
营养组合物、特别是配方乳，可通过将富含免疫球蛋白的乳级分与至少一种脂质源、碳水化合物源、维生素和矿物质组合来制备。
脂质源可以是适合在配方乳中使用的任何脂质或脂肪。优选的脂肪源包括乳脂肪、红花籽油、蛋黄脂质、菜籽油、橄榄油、椰子油、棕榈仁油、大豆油、鱼油、棕榈油酸、高油酸葵花籽油和高油酸红花籽油、以及含有长链多不饱和脂肪酸的微生物发酵油。在一个实施例中，使用无水乳脂肪。脂质源也可以是源自这些油例如棕榈油精、中链甘油三酯，和脂肪酸例如花生四烯酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、亚麻酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸等的酯的级分形式。可以添加少量的含有大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的油，如鱼油或微生物油。脂肪源优选地具有约5∶1至约15∶1；例如约8∶1至约10∶1的n-6与n-3脂肪酸比率。在一个特定方面，配方乳包含油混合物，该油混合物包含被酯化为三酰基甘油的棕榈酸，例如其中在三酰基甘油的sn-2位置被酯化的棕榈酸的量为总棕榈酸的20重量％至60重量％并且在三酰基甘油的sn-1/sn-3位置被酯化的棕榈酸的量为总棕榈酸的40重量％至80重量％。
优选地存在于配方乳中的维生素和矿物质的实例为维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉碱。矿物质通常以盐的形式添加。
优选地存在于配方乳中的碳水化合物的实例为乳糖、不可消化的低聚糖(如低聚半乳糖(GOS)和/或低聚果糖(FOS))和人乳低聚糖(HMO)。
如有必要，营养组合物可含有乳化剂和稳定剂，如大豆卵磷脂、单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯等。配方乳还可以含有可能具有有益效果的其他物质，如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。
实例
实例1
使用孔径大小为0.1μm的螺旋卷式膜使脱脂乳流(含有270ppm IgG，30ppm IgA和24ppm IgM并且具有3.9wt％的总蛋白浓度(Ig含量，相对于总蛋白：0.84wt％))经受微滤。在15℃下进行微滤。浓缩和渗滤后，收集MF渗余物(MCI)。
所得MF渗余物(MCI)含有约500ppm IgG，170ppm IgA和100ppm IgM，并且总蛋白浓度为14.7％。MF渗余物中相对于总蛋白的Ig含量为0.52％，即低于脱脂乳的Ig含量，这是由于IgG渗透穿过膜。另一方面，(IgA+IgM)/IgG比率从脱脂乳中的约22wt％增加到MF渗余物中的约58wt％。
接下来，在42℃下，使用2M H2SO4将MF渗余物酸化至pH＝4.3。通过使溶液静置约30分钟来形成凝块。然后使用100μm的袋式过滤器将凝块从乳清中除去。所得乳清级分仍然具有相同含量的Ig，但总蛋白含量降低至1.3wt％，导致基于总蛋白的总Ig含量为6wt％。
将pH为4.3的乳清级分直接进料到孔径为500kD的螺旋卷式MF(膜面积6.7m2)中。在15℃下进行微滤。使用0.5巴的TMP并且错流流速是80l/min。将乳清浓缩至VCF为12，并用等量的脱矿质水将渗余物渗滤一次。渗余物产物具有基于总蛋白为13wt％的总Ig含量。(IgA+IgM)/IgG比例保持58wt％。
实例2
重复实例1，不同之处在于将乳清级分的pH调节至7，然后将该乳清级分在室温下进行阴离子交换色谱——使用具有季铵官能团和Cl-反荷离子的强阴离子交换树脂，流速为30BV/h(床体积/小时)。将三个床体积的乳清级分进料到该柱中并且从该柱的出口收集。基于总蛋白，收集的产物具有20wt％的总Ig含量，并且(IgA+IgM)/IgG比率(58wt％)没有变化。
之后，用1M NaCl溶液以10BV/h的流速洗脱该柱以便除去结合的杂质；主要是β-乳球蛋白。
实例3
重复实例1，不同之处在于将在实例1结束时获得的MF渗余物中和至pH 7并且按照实例2的程序进行阴离子交换。所得产物具有基于总蛋白为25wt％的总Ig含量。没有观察到(IgA+IgM)/IgG比率(58wt％)的变化。

Claims (11)

1.一种用于获得富含免疫球蛋白，优选富含IgA和IgM的乳级分的方法，该方法包括以下步骤：
a)使脱脂乳经受微滤步骤，产生富含胶束酪蛋白的MF渗余物和富含乳清蛋白的MF渗透物，
b)使该MF渗余物经受酪蛋白沉淀或奶酪制造方法，从而产生富含酪蛋白的级分和乳清级分，
c)使步骤b)中获得的该乳清级分经受微滤和/或阴离子交换色谱，从而获得富含免疫球蛋白的乳级分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在微滤之前，将该脱脂乳的pH调节至以下值，该值在5.6-6.2，更优选5.6-6.0，最优选5.6-5.8范围内。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该奶酪制造方法涉及(i)任选地在干燥和再悬浮该MF渗余物之后将脂肪源添加到该MF渗余物，(ii)随后添加凝固剂和酸化剂，以及(iii)凝固以获得富含酪蛋白的级分和乳清级分。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤b)中获得的该乳清级分经受步骤c)中的微滤之前，将其酸化至4-5范围内的pH。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的该微滤用具有50-100nm范围内孔径或500-800kDa范围内截留分子量(MWCO)的膜进行。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的该微滤用螺旋卷式膜或用陶瓷膜进行，该螺旋卷式膜使用0.10-0.25m/s的错流流速，该陶瓷膜使用5-7m/s的错流流速。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的该微滤在10℃-15℃范围内的温度下进行。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤b)中获得的该乳清级分经受阴离子交换色谱之前，将其酸化至6.5-7范围内的pH。
9.一种乳级分，其包含相对于总蛋白含量范围为10wt％至40wt％的免疫球蛋白含量和范围为25wt％-60wt％，优选45wt％-60wt％的(IgA+IgM)/IgG重量比。
10.一种包含根据权利要求9所述的乳级分的营养组合物，该营养组合物选自婴儿配方乳、较大婴儿配方乳和成长乳。
11.一种用于通过将根据权利要求9所述的乳级分与至少脂肪源、碳水化合物源、乳清蛋白源、以及维生素和矿物质组合来产生根据权利要求10所述的营养组合物的方法。
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