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CN118436618A - 信使rna疫苗及其用途 - Google Patents

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CN118436618A
CN118436618A CN202410557594.XA CN202410557594A CN118436618A CN 118436618 A CN118436618 A CN 118436618A CN 202410557594 A CN202410557594 A CN 202410557594A CN 118436618 A CN118436618 A CN 118436618A
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lipids
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lipid
antigen
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S·卡夫
Z·帕特尔
A·萨罗德
Y·张
F·德罗莎
M·哈特莱因
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Abstract

本发明特别提供了用于体内有效负载的有效递送的含核酸的纳米颗粒的调配方法和组合物，以使得所述方法和组合物可以用于产生mRNA疫苗。

Description

信使RNA疫苗及其用途
本申请是申请号为201980044654.5、申请日为2019年5月29日、发明名称为“信使RNA疫苗及其用途”的中国发明专利申请的分案申请，原中国发明专利申请为国际申请号为PCT/US2019/034474的PCT国际申请的国家阶段申请，该PCT国际申请要求2018年5月30日提交的美国临时专利申请号62/678,225的优先权，该临时专利申请据此以引用的方式整体并入。
背景技术
疫苗是治疗或预防各种疾病的最重要药物之一。疫苗是一种诱导针对特定疾病的主动获得性免疫的生物学组合物。传统上，疫苗通常含有类似于致病性微生物的试剂，并且通常由病毒或其他微生物或者它们的表面蛋白的弱化或杀死形式制成。所述试剂刺激人体的免疫系统，以产生抗体或细胞因子，所述抗体或细胞因子识别和破坏将来可能遇到的与该试剂相关联的任何微生物。疫苗可以是预防性的或治疗性的。
发明内容
本发明提供了一种基于信使RNA递送的改进的和非常规形式的疫苗，所述疫苗有望成为用于治疗和预防各种疾病的更安全、更有效和更具成本效益的疫苗。
在一个方面，本发明提供了一种用于诱导体内免疫应答的方法，所述方法以足以诱导抗原特异性T细胞应答和/或抗原特异性抗体应答的给药方案，通过将包含编码抗原的mRNA的信使RNA(mRNA)组合物施用于受试者来进行。在一些实施方案中，mRNA被包封于脂质纳米颗粒(LNP)中。在一些实施方案中，组合物是疫苗组合物。
在一些实施方案中，组合物是皮下施用的。在一些实施方案中，组合物是皮内施用的。在一些实施方案中，组合物是肌肉内施用的。在一些实施方案中，组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，组合物不是静脉内施用的。
在另一个方面，本发明提供了一种在体内递送疫苗的方法，所述方法包括将包封于LNP中的包含编码抗原的mRNA的疫苗组合物施用于受试者，并且其中所述疫苗组合物通过肌肉内或皮下施用。在多个实施方案中，疫苗组合物以足以诱导抗原特异性T细胞应答和/或抗原特异性抗体应答的给药方案施用。
在一些实施方案中，由mRNA编码的抗原是蛋白质或肽。
在一些实施方案中，包含编码一种或多种多肽的一种或多于一种mRNA的组合物得以递送。
在一些实施方案中，合适的给药方案包括注射单剂量。在一些实施方案中，合适的给药方案包括定期施用多剂量。
在一些实施方案中，单剂量或多剂量(单独或共同)的范围为约0.1μg-100mgmRNA。在一些实施方案中，单剂量或多剂量(单独或共同)的范围为约0.1μg-50mg mRNA、约0.1μg-25mg mRNA、约0.1μg-10mg mRNA、约0.1μg-5mg mRNA、约0.1μg-1mg mRNA或约0.1μg-100μgmRNA。在一些实施方案中，单剂量为或者多剂量(单独或共同)选自0.1μg、0.3μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、25μg、50μg或100μg。
在一些实施方案中，单剂量或多剂量(单独或共同)的范围为约0.01μg/kg-10mg/kg(mRNA/体重)。在一些实施方案中，单剂量或多剂量(单独或共同)的范围为约0.01μg/kg-8mg/kg、约0.01μg/kg-6mg/kg、约0.01μg/kg-5mg/kg、约0.1μg/kg-5mg/kg、约0.1μg/kg-1mg/kg或约0.1μg/kg-0.5mg/kg(mRNA/体重)。
在一些实施方案中，多剂量包含相同的单独剂量的mRNA。在一些实施方案中，多剂量包含不同的单独剂量的mRNA。
在一些实施方案中，多剂量中的每剂间隔1-3周注射一次。在一些实施方案中，多剂量中的每剂每周注射一次。在一些实施方案中，多剂量中的至少两剂在3周内注射。在一些实施方案中，多剂量按以下排程注射：在第0周施用第1剂，在第3周施用第2剂，以及在第5周施用第3剂。
在一些实施方案中，mRNA的长度为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb或15kb。在一些实施方案中，mRNA包含未经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种经修饰的核苷酸包含假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、4’-硫代尿苷、4’-硫胞苷和/或2-硫代胞苷。
在一些实施方案中，mRNA包含5’非翻译区(5’UTR)和/或3’非翻译区(3’UTR)。
在一些实施方案中，纳米颗粒是基于脂质的或基于聚合物的纳米颗粒。在一些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是脂质体。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和/或一种或多种PEG化的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种PEG化的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种PEG化的脂质。如本文所用，术语“PEG化的脂质”和“PEG修饰的脂质”可互换使用。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种PEG化的脂质。在一些实施方案中，PEG化的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。在一些实施方案中，PEG化的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质的至少5％。在一些实施方案中，PEG化的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质的约5％。在一些实施方案中，PEG化的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质的10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少或者3％或更少。在一些实施方案中，PEG化的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质的5％或更少。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质选自由以下各项组成的组：cKK-E12、OF-02、C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、ICE(基于咪唑)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、3-(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)-6-(4-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)丁基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标23)、3-(5-(双(2-羟基十二烷基)氨基)戊-2-基)-6-(5-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)戊-2-基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标24)以及它们的组合。在一些实施方案中、至少一种阳离子脂质选自CCBene、ICE、ML-2、C12-200或DLin-SS-DMA。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括ICE。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括ML-2。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括CCBene。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种辅助脂质。在一些实施方案中，辅助脂质选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种基于胆固醇的脂质。在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质选自DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基羧酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人.BioTechniques23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。
在一些实施方案中，组合物的施用引起由mRNA编码的抗原在受试者的淋巴结中表达。在一些实施方案中，组合物的施用引起由mRNA编码的抗原在受试者的淋巴细胞中表达。
在一些实施方案中，组合物的施用引起抗原特异性抗体应答。在一些实施方案中，抗原特异性抗体应答通过抗原特异性抗体在血清中的存在来测量。
在一些实施方案中，组合物的施用引起抗原特异性T细胞应答。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞应答通过细胞因子应答来测量。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞应答通过脾细胞中的IFN-γELISPOT来测量。
在一些实施方案中，抗原特异性抗体应答和/或抗原特异性T细胞应答在施用后至少24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或1个月可检测。
本发明的一个方面提供了一种治疗疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括根据上文所述的方法将信使RNA(mRNA)递送至需要治疗的受试者。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本公开中所用，术语“包括”以及该术语的变化形式，诸如“包含”(“comprising”和“comprises”)，并不旨在排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本专利申请中使用的，术语“约”和“大约”作为等价物使用。这两个术语均旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
在下述详细描述、附图和权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应理解，详细描述、附图和权利要求书虽然指出了本发明的实施方案，但仅以说明性方式而非限制性方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
这些附图用于说明的目的，而非限制。
图1A和B描绘了三种不同的脂质组合物在体内人促红细胞生成素(hEPO)mRNA递送中的功效的比较数据，如通过测量血清中的hEPO蛋白所表示。
图2描绘了体内人促红细胞生成素(hEPO)mRNA递送的三种不同途径的功效的比较数据，如通过测量血清中的hEPO蛋白所表示。
图3描绘了不同小鼠组织中的FFL表达的图像，该图像显示了针对FFL表达的组织特异性富集的递送途径的比较。
图4描绘了不同小鼠组织中的FFL表达的图像，该图像显示了针对FFL表达的组织特异性富集的不同阳离子脂质的比较。
图5描绘了再混合和传统脂质体形成方法的比较。再混合组合物引起在所用的多种阳离子脂质中的示例性hEPO表达的更高表达水平。
图6描绘了再混合调配物在淋巴结中的富集表达。
定义
为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义阐述在整个本说明书中。
佐剂：如本文使用的，术语“佐剂”指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。
动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。
抗原：如本文所用，抗原是诱导免疫应答的蛋白质或肽，并且抗原由所施用的mRNA编码。通常，抗原是引发免疫应答的外源物。在这种情况下，抗原本质上可以是蛋白质，但是也可以是非蛋白质实体，诸如毒素、小分子或核酸。出于本文讨论的目的，抗原是指由所施用的mRNA编码的、引发或预期引发免疫应答的蛋白质、或多肽是抗原。
大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。
递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mRNA的递送涵盖其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其他组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。
包封：如本文所用，术语“包封”或语法等同形式是指将单独的mRNA分子限制在纳米颗粒内的过程。
表达：如本文使用的，核酸序列的“表达”指mRNA翻译成多肽，将多个多肽组装成完整蛋白质(例如酶)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本专利申请中，术语“表达”和“产生”以及语法等价物可互换使用。
半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如核酸或蛋白质的浓度或活性的数量下降到在一段时间的开始时所测量的值的一半所需的时间。
改进、增加或减少：如本文使用的，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等价物指示相对于基线测量的值，所述基线测量例如在本文所述的治疗开始之前相同个体中的测量，或在不存在本文所述的治疗的情况下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量。“对照受试者”是患有与正在接受治疗的受试者相同形式的疾病的受试者，其与正在接受治疗的受试者大约相同的年龄。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。
局部分布或递送：如本文使用的，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等价物指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mRNA编码的蛋白质(例如酶)在细胞内或伴随有限分泌被翻译且表达，其避免进入患者的循环系统。
信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA二者。mRNA可以含有一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生和任选地纯化，化学合成等。在适当情况下，例如在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，诸如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰的类似物等。除非另有说明，否则mRNA序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；插入型碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5-N-亚磷酰胺键)。
患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后。
药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与合理的受益/风险比相称在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的物质。
皮下施用：如本文所用，术语“皮下施用”或“皮下注射”是指向皮下组织进行推注，所述皮下组织是皮肤和肌肉之间的组织层。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，该患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有疾病或障碍或对疾病或障碍敏感，但是可以或可以不显示出该疾病或障碍的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或性质的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。
全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法上的等效物是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统(例如血液)完成。与“局部分布或递送”的定义形成对比。
靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。
治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、障碍和/或病症或对疾病、障碍和/或病症敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟该疾病、障碍和/或病症的症状发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于使特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、转佳、减轻，抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病关联的病理的风险，可以向未表现出疾病体征和/或仅表现出疾病早期体征的受试者施用治疗。
疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种”是指旨在产生免疫应答的组合物，例如编码抗原(例如，致病因子的组分)的mRNA的施用。出于本发明的目的，可以在暴露于致病因子之前、期间和/或之后，在一些实施方案中，在暴露于所述因子之前、期间和/或之后立即进行疫苗接种。在一些实施方案中，疫苗接种包括疫苗接种组合物在时间上适当地间隔开的多次施用。
具体实施方式
本发明特别提供了用于mRNA疫苗递送的改进的方法和组合物。
在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
在本发明的一个方面，提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法。所述方法包括以足以诱导抗原特异性T细胞应答或抗原特异性抗体应答的给药方案施用包含编码抗原的mRNA的组合物。在一些实施方案中，组合物是皮下施用的。在一些实施方案中，组合物是皮内施用的。在一些实施方案中，组合物是肌肉内施用的。
在本发明的一个方面，提供了一种用于体内递送疫苗的方法。所述方法包括将包封于脂质纳米颗粒中的包含编码抗原的mRNA的疫苗施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，组合物是皮下施用的。在一些实施方案中，组合物是皮内施用的。在一些实施方案中，组合物是肌肉内施用的。
信使RNA(mRNA)疫苗
mRNA疫苗是新颖的，并且与现有的基于细胞的疫苗(使用活的、减毒的或杀死的病原体或类毒素疫苗)相比，提供了很多优点。除安全性之外，mRNA疫苗还具有成本效益，并且提供灵活的设计平台。编码抗原的mRNA可以涉及诱导特异性免疫应答，因此可以用于开发针对多种疾病(包括感染和癌症)的多种治疗性和预防性mRNA疫苗。
针对感染的疫苗
对于大量感染性病原体，已经建立了疫苗候选物。通常，疫苗是至少部分模拟致病因子从而引发哺乳动物宿主的免疫应答的因子。通常，疫苗是生物制剂，诸如热杀死的、辐照的或者减毒的致病性生物、活的减毒微生物、蛋白质或肽抗原、缀合的抗原、毒素或微生物表面蛋白或它们的片段。但是，编码蛋白质或肽抗原的mRNA是诱导针对疾病的免疫应答的安全和有效的方法。如上文所讨论，可以通过将mRNA包封在包含合适脂质(在后面的部分中讨论)的脂质体中来有效地递送mRNA从而在体内表达。因此，这种编码抗原肽或蛋白质的mRNA可以用于在体内产生疫苗。哺乳动物宿主针对疫苗组分而产生的免疫应答继而旨在保护宿主免受病原体的后续攻击，因为宿主的免疫系统针对病原体的攻击进行了初免。换句话说，宿主系统具有病原体的免疫记忆(适应性免疫应答的组分)。这个过程称为预防性疫苗接种。另外，疫苗可以加强现有感染中的宿主免疫系统，例如，通过针对新的和未被广泛认可的微生物抗原(次优势抗原)重定向免疫应答，然后诱导强免疫应答，从而消除病原体。这类疫苗应答可以归类为治疗性疫苗。
针对病原体的免疫应答可以分为几个阶段。首先，人体(或哺乳动物系统)与新病原体的相遇，尤其是通过外露表面(诸如皮肤或者呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的内部粘膜表面)的接触，引起通过模式识别分子的活化实现的非特异性先天免疫应答。模式识别分子包括许多生殖系编码的受体，这些受体专门用于区分微生物和宿主细胞表面，或者感染的细胞和正常的细胞。吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)在它们的表面上表达模式识别分子，并且主要负责先天免疫应答中的病原体识别、杀死和消除。在这种情况下，吞噬细胞还加工抗原并且将抗原呈递给循环淋巴细胞，以产生更具特异性的抗原靶向免疫应答，也称为适应性免疫应答。在这个阶段，活化的淋巴细胞在淋巴结中成熟为表达用于识别抗原的受体的抗原特异性T细胞，以使得当效应细胞毒性T细胞与第二组细胞表面分子、主要组织相容性复合物分子或MHC一起存在时，效应细胞毒性T细胞能够识别和杀死表达该抗原的细胞；并且辅助T细胞活化系统以产生T细胞记忆和体液免疫应答。体液免疫应答包括在几天的过程中通过克隆表达和分化产生的抗体分泌性B细胞，在此期间，先天免疫继续发挥作用。细胞毒性T细胞的克隆扩增也在淋巴器官(诸如淋巴结)中迅速发生，并且通过暴露于抗原而增加。活化的T细胞产生多种细胞因子，诸如干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，它们被认为是T细胞活化的标志。最终，抗原特异性T细胞以及随后抗体被释放到血液中并且被募集到感染部位。成功的疫苗会产生快速而强大的细胞毒性T细胞应答、强抗体应答和持久的免疫记忆。
癌症疫苗
癌症被认为是一种免疫疾病，并且癌症免疫疗法已成为当今研究和开发的焦点。在癌症免疫疗法中，开发了加强针对癌症抗原的免疫系统以及通过针对抗原的活化细胞毒性T细胞来消除肿瘤的疫苗。一类癌症抗原是涉及致癌病毒的病毒性抗原，例如爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)抗原(诸如与淋巴瘤和鼻咽癌相关的EBV1和EBV2)、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原(诸如与宫颈癌(CC)相关的HPV16)、与肝细胞癌(HCC)相关的乙型肝炎病毒(HBV)抗原和丙型肝炎病毒(HCV)抗原、与成人T细胞白血病/淋巴瘤相关的1型人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV-1)以及与卡波西氏肉瘤相关的人疱疹病毒8(HHV-8)等等。
在另一个方面，癌细胞表达的抗原通常是非癌性细胞或组织不表达的。此类抗原包括但不限于乳腺癌中存在的上皮肿瘤抗原(ETA)、RAS家族成员p-53和其他活化的RAS抗原、卵巢癌抗原BRCA1和BRCA2、恶性黑素瘤细胞中存在的黑素瘤相关抗原(MAGE)、骨髓性白血病中存在的BCR-ABL融合基因产物、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、皮肤黑素瘤和结肠直肠癌中存在的BRAF抗原、针对非小细胞肺癌的上皮生长因子受体(EGFR)、结肠直肠癌和非小细胞肺癌中存在的KRAS、神经母细胞瘤和非小细胞肺癌中存在的神经元特异性烯醇化酶、神经母细胞瘤中存在的NY-ESO 1、黑素瘤中存在的T细胞识别的黑素瘤相关抗原(MART-1)、非小细胞肺癌中存在的程序性死亡配体1(PD-L1)、前列腺癌中存在的前列腺特异性抗原(PSA)、尿激酶纤溶酶原活化物(UPA)、乳腺癌中存在的纤溶酶原活化物抑制剂(PAI-1)等等，几乎所有这些抗原都是突变的内源性蛋白质。这些内源性癌症抗原不会以类似于病毒抗原的方式(即与将抗原归类为外源性的MHC-1分子结合)由抗原呈递细胞(APC)呈递，但是细胞毒性T细胞能够分化和鉴定突变的自身抗原，并且具有寻找和破坏携带突变抗原的细胞的固有性质。所以，癌症免疫疗法的当前目标是实现针对突变抗原的细胞毒性T细胞的最佳活化。可以绘制患者与自己的癌症相关的特异性突变的图谱，并且将该图谱用于产生疫苗，诱导患者自身的细胞毒性T细胞，以产生必要的免疫应答，从而破坏肿瘤细胞。mRNA疫苗可以成为肽疫苗的安全和具有成本效益的替代品，以便实现这种个体化医疗。对癌症患者中存在的突变的泛基因组扫描和分析可以用于特异性设计编码含有该突变的抗原或表位的mRNA，当体内施用时，所述mRNA将在细胞表面上产生翻译产物。这将引导针对突变抗原的免疫应答。在此过程中，细胞毒性T细胞攻击肿瘤细胞，所述肿瘤细胞固有地表达突变抗原。进行泛基因组测序分析、突变分析、表位作图和分析以及设计用于疫苗接种的合适的肽所涉及的方法和方案是本领域的技术人员已知的。
还可以利用这种方法来发现患者中的优势和次优势抗原。已经观察到在慢性感染和癌症二者中，某些抗原在初始免疫应答的产生中发挥优势作用。但是不久之后，就建立了对这种优势抗原的耐受性，从而减弱了免疫应答。未显示出初始优势抗原应答(通常称为次优势抗原)的抗原的基因组分析和鉴定现在可以用于产生新的和再生的免疫应答。
mRNA疫苗优于肽疫苗的一个优点是mRNA疫苗绕过了接受宿主的HLA匹配。
在mRNA疫苗设计的合成方法中，可以扫描病原体蛋白质组以寻找具有疫苗潜力的抗原标志。(可以使用Uniprot Consortium(http://www.uniprot.org/)访问蛋白质组数据库)。这可以对新病原体(诸如寨卡病毒)有效。这种类型的反向疫苗学已用于鉴定许多新型肽疫苗候选物。通过基因组学和蛋白质组学的组合，还从幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中鉴定了新型肽疫苗(参见，例如，Etz等人.,PNAS.2002,99(10)6573-6578)。潜在的抗原候选物是否可以成功产生免疫应答，可以通过各种形式的细胞表面展示适当表达潜在抗原的文库以及进行调理作用和抗体结合测试来验证。用于疫苗抗原开发的示例性有用数据库包括：ImMunoGeneTics信息系统(URL：www.imgt.org)；Epitome数据库(URL：www.rostlab.org/services/epitome)、免疫表位数据库和分析资源(www.iedb.org)；Immunet数据库(immunt.cn/ced/index.php)；HIV数据库(www.hiv.lanl.gov/content/immunology)(关于免疫遗传学和免疫信息学)。
所以，从上文讨论可以清楚地看出，mRNA疫苗向淋巴结递送的富集可以使疫苗进入活化和初始淋巴细胞，以进行淋巴细胞增生以及抗原特异性T细胞和B细胞产生。与广泛免疫活化相反，抗原活化的这种定位的毒性也较小。
信使RN4A(mRNA
本发明可以用于递送编码适合用作本文所述的疫苗的抗原的任何mRNA。如本文所用，mRNA是将信息从DNA携带到核糖体以翻译编码的蛋白质的RNA类型。可以根据多种已知方法中的任一种来合成mRNA。例如，可以经由体外转录(IVT)来合成根据本发明的mRNA。简言之，IVT通常用含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷酸三磷酸库、可包括DTT和镁离子的缓冲系统、以及适当的RNA聚合酶(例如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂执行。确切条件将根据具体应用而改变。
在一些实施方案中，可以在调配和包封之前纯化体外合成的mRNA，以除去不期望的杂质(包括在mRNA合成过程中使用的各种酶和其他试剂)。
本发明可以用于递送各种长度的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度等于或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb范围内的体外合成的mRNA。
本发明可以用于递送未经修饰的mRNA或者含有通常增强稳定性的一个或多个修饰的mRNA。在一些实施方案中，修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸主链以及5’和/或3’非翻译区(UTR)。
在一些实施方案中，mRNA的修饰可以包括RNA的核苷酸的修饰。根据本发明的经修饰的mRNA可以包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mRNA可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、Q核苷、β-D-甘露糖基-Q核苷、怀丁苷和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域的技术人员已知的，例如来自美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，这些专利的全部公开内容以引用的方式包括于本文中。
在一些实施方案中，mRNA可以含有RNA主链修饰。通常，主链修饰是其中包含在RNA中的核苷酸主链的磷酸酯经化学修饰的修饰。示例性的主链修饰通常包括但不限于来自甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼烷磷酸酯、带正电荷的胍基团等的修饰，其意指通过其他阴离子、阳离子或中性基团替换磷酸二酯键。
在一些实施方案中，mRNA可以含有糖修饰。典型的糖修饰是其包含的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自以下的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱胺-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸)或叠氮三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。
在一些实施方案中，mRNA可以含有核苷酸碱基的修饰(碱基修饰)。含有碱基修饰的经修饰的核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的例子包括但不限于2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-脱氮腺苷5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄苷5'-三磷酸。
通常，mRNA合成包括在5'末端上添加“帽”和在3'末端上添加“尾”。帽的存在对于提供针对大部分真核细胞中发现的核酸酶的抗性是重要的。“尾”的存在作用于保护mRNA免于核酸外切酶降解。
因此，在一些实施方案中，mRNA包含5'帽结构。5'帽通常按以下方式添加：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸除去一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸，产生5'-5'反向三磷酸键；然后通过甲基转移酶对鸟嘌呤的7-氮进行甲基化。2’-O-甲基化也可以出现在7-甲基鸟苷三磷酸残基之后的第一碱基和/或第二碱基处。帽结构的实例包括但不限于m7GpppNp-RNA、m7GpppNmp-RNA和m7GpppNmpNmp-RNA(其中m表示2’-O-甲基残基)。
在一些实施方案中，mRNA包括3'多聚(A)尾结构。mRNA的3'末端上的多聚A尾通常包含约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约10至100个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸、或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施方案中，mRNA包括3'多聚(C)尾结构。mRNA的3'末端上合适的多聚C尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸、或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。多聚C尾可加入多聚A尾中或可取代多聚A尾。
在一些实施方案中，mRNA包括5'和/或3'非翻译区。在一些实施方案中，5'非翻译区包括影响mRNA的稳定性或翻译的一种或多种元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5'非翻译区可为长度约50至500个核苷酸。
在一些实施方案中，3'非翻译区包括多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的定位稳定性的蛋白质的结合位点、或miRNA的一个或多个结合位点中的一种或多种。在一些实施方案中，3'非翻译区可为长度50至500个核苷酸或更长。
帽结构
在一些实施方案中，mRNA包括5'帽结构。5'帽通常按以下方式添加：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸除去一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸，产生5'-5'反向三磷酸键；然后通过甲基转移酶对鸟嘌呤的7-氮进行甲基化。帽结构的例子包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。
天然存在的帽结构包含7-甲基鸟苷，它经由三磷酸桥连接至第一个转录核苷酸的5'-末端，产生m7G(5')ppp(5')N的二核苷酸帽，其中N是任何核苷。在体内，盖通过酶促法添加。将帽加入核中且由酶鸟苷酰转移酶催化。帽对RNA的5'末端的添加在转录起始后立即发生。末端核苷通常是鸟苷，并且与所有其他核苷酸相反定向，即G(5')ppp(5')GpNpNp。
通过体外转录产生的mRNA的常见帽是m7G(5')ppp(5')G，它已被用作通过T7或SP6RNA聚合酶在体外转录中的二核苷酸帽，以获得在5'-末端具有帽结构的RNA。用于加帽mRNA的体外合成的主要方法采用预先形成的m7G(5')ppp(5')G(“m7GpppG”)形式的二核苷酸作为转录起始物。
迄今为止，体外翻译实验中所用的合成二核苷酸帽的通常形式是抗反向帽类似物(“ARCA”)或经修饰的ARCA，它通常是其中2'或3'OH基团被-OCH3替代的经修饰的帽类似物。
另外的帽类似物包括但不限于选自由以下各项组成的组的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如，GpppG)；二甲基化帽类似物(例如，m2, 7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如，m2,2,7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(例如，m7Gpppm7G)或反向帽类似物(例如，ARCA；m7,2'OmeGpppG、m72'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸衍生物)(参见，例如，Jemielity,J.等人.,“Novel‘anti-reverse’cap analogs withsuperior translational properties”,RNA,9:1108-1122(2003))。
在一些实施方案中，合适的帽是经由三磷酸桥连接至第一个转录核苷酸的5'-末端的7-甲基鸟苷酸(“m7G”)，产生m7G(5')ppp(5')N，其中N是任何核苷。在本发明的实施方案中所用的m7G帽的优选的实施方案是m7G(5')ppp(5')G。
在一些实施方案中，帽是Cap0结构。帽0结构缺少与碱基1和2连接的核糖的2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，帽是Cap1结构。帽1结构在碱基2处具有2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，帽是Cap2结构。帽2结构具有与碱基2和3两者附着的2'-O-甲基残基。
许多m7G帽类似物是本领域已知的，其中很多是可商购获得的。这些包括上文所述的m7GpppG，以及ARCA 3'-OCH3和2'-OCH3帽类似物(Jemielity,J.等人.,RNA,9:1108-1122(2003))。用于本发明的实施方案的另外的帽类似物包括N7-苄基化二核苷四磷酸类似物(在Grudzien,E.等人.,RNA,10:1479-1487(2004)中有所描述)、硫代磷酸帽类似物(在Grudzien-Nogalska,E.,等人.,RNA,13:1745-1755(2007)中有所描述)以及在美国专利号8,093,367和8,304,529中描述的帽类似物(包括生物素酰化的帽类似物)，这些专利以引用的方式并入本文。
尾结构
通常，“尾”的存在作用于保护mRNA免于核酸外切酶降解。人们认为聚A尾可以稳定天然信使和合成有义RNA。因此，在某些实施方案中，可以将长的聚A尾添加至mRNA分子，从而使RNA更稳定。多聚A尾可使用各种领域公认的技术添加。例如，可以使用多聚A聚合酶将长多聚A尾添加至合成或体外转录的RNA中(Yokoe,等人Nature Biotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体也可编码长多聚A尾。另外，多聚A尾可通过直接从PCR产物转录而加入。多聚A也可用RNA连接酶连接到有义RNA的3'末端(参见例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual，第2版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring HarborLaboratory Press：1991版))。
在一些实施方案中，mRNA包括3'尾结构。通常，尾结构包括poly(A)和/或poly(C)尾。mRNA的3'末端的多聚-A或多聚-C尾通常包含分别地至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸、或至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，多聚-A或多聚-C尾可分别为约10至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如约10至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸或约20至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施方案中，尾结构包括具有本文所述的各种长度的多聚(A)和多聚(C)尾的组合。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的腺苷核苷酸。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的胞嘧啶核苷酸。
在一些实施方案中，调节多聚A或多聚C尾的长度，以控制本发明的经修饰的有义mRNA分子的稳定性，并且因此控制蛋白质的转录。例如，因为多聚A尾的长度可影响有义mRNA分子的半衰期，所以可调节多聚A尾的长度，以修饰mRNA对核酸酶的抗性水平，且从而控制靶细胞中的多核苷酸表达和/或多肽产生的时间过程。
5’和3’非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，mRNA包括5'和/或3'非翻译区。在一些实施方案中，5'非翻译区包括影响mRNA的稳定性或翻译的一种或多种元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5'非翻译区可为长度约50至500个核苷酸。
在一些实施方案中，3'非翻译区包括多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的定位稳定性的蛋白质的结合位点、或miRNA的一个或多个结合位点中的一种或多种。在一些实施方案中，3'非翻译区可为长度50至500个核苷酸或更长。
示例性的3'和/或5’UTR序列可源自稳定的mRNA分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加感觉mRNA分子的稳定性。例如，5’UTR序列可包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以改善核酸酶抗性和/或改善多核苷酸的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hGH)或其片段的序列包括在多核苷酸(例如mRNA)的3'末端或非翻译区，以进一步稳定多核苷酸。通常，这些修饰相对于未修饰的对应物改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如，半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的耐受性而进行的修饰。
虽然在一些实施方案中体外转录反应所提供的mRNA是所期望的，但是在本发明的范围内设想了mRNA的其他来源，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的mRNA。
本发明可以用于递送编码许多蛋白质的mRNA。适用于本发明的mRNA的非限制性实例包括编码肽或蛋白质疫苗的mRNA。
示例性mRNA序列
在一些实施方案中，本发明提供了将编码靶蛋白的mRNA递送至受试者以治疗靶蛋白缺陷的方法和组合物。示例性mRNA序列如下所示。
构建体设计：
X-mRNA编码序列-Y
5'和3'UTR序列
X(5'UTR序列)＝
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQID NO:1)
Y(3’UTR序列)＝
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCC CUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAA UUAAGUUGCAUCAAGCU(SEQ ID NO:2)
或
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU(SEQ ID NO:3)
在一些实施方案中，合适的mRNA编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合至另一个蛋白质的靶蛋白的全长、片段或部分(例如，N或C末端融合体)。在一些实施方案中，融合至mRNA(编码靶蛋白的全长、片段或部分)的蛋白质编码信号或细胞靶向序列。
脂质纳米颗粒
根据本发明，mRNA可以被包封或复合在纳米颗粒中。在一些实施方案中，纳米颗粒也称为“递送媒介物”、“转移媒介物”或语法等同形式。
根据各种实施方案，合适的纳米颗粒包括但不限于基于聚合物的载体，诸如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成来源的外泌体、天然、合成和半合成的板层体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶体颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、基于淀粉的传递系统、胶束、乳剂、类脂质体、多域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)、干粉调配物、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽和其他载体标签。
在一些实施方案中，mRNA包封在一种或多种脂质体内。如本文使用的，术语“脂质体”指任何层状、多层或固体纳米颗粒囊泡。通常，如本文使用的，脂质体可通过混合一种或多种脂质或者通过混合一种或多种脂质和聚合物来形成。因此，如本文使用的，术语“脂质体”涵盖基于脂质和聚合物两者的纳米颗粒。在一些实施方案中，适用于本发明的脂质体含有阳离子、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG修饰的脂质。
PEG化的脂质
在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含一种或多种PEG化的脂质。例如，本发明还设想了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生化的脂质(例如衍生化的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))的使用。设想的PEG修饰的脂质包括但不限于长度为最多5kDa的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条C6-C20长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的或PEG化的脂质是PEG化的胆固醇或PEG-2K。在一些实施方案中，特别有用的可交换脂质是具有较短的酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。
PEG修饰的磷脂和衍生化的脂质可以占脂质体中的总脂质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。
阳离子脂质
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在选定pH(诸如生理pH)下具有净正电荷的许多脂质和类脂质物类中的任一者。在文献中已描述了几种阳离子脂质，其中许多是商购可得的。
用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO 2010/144740中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/149140中所述的可电离阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地选自由以下各项组成的组：氢、任选地取代的不同饱和或不饱和的C1-C20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20酰基；其中L1和L2各自独立地选自由以下各项组成的组：氢、任选地取代的C1-C30烷基、任选地取代的不同不饱和的C1-C30烯基和任选地取代的C1-C30炔基；其中m和o各自独立地选自由以下各项组成的组：零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
(HGT-5000)
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(“HGT5001”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
(HGT-5001)
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
(HGT-5002)
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开WO2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118725中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118724中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括具有通式14,25-二-十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中RL的每个实例独立地是任选地取代的C6-C40烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/184256中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立为1至6；每个RA独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个RB独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶标23”：
(靶标23)
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/004202中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人.,Nature Communications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，这些文献以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/199952中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/004143中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/075531中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中L1或L2中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-；并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；Ra是H或C1-C12烷基；R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；R4是C1-C12烷基；R5是H或C1-C6烷基；并且x为0、1或2。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/117528中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/049245中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：
及其药学上可接受的盐。对于这四个通式中的任一者，R4独立地选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR；Q选自由以下各项组成的组-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2012/170889中所述的可切割阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
其中R1选自由以下各项组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中R2选自由以下两个通式之一组成的组：
并且其中R3和R4各自独立地选自由以下各项组成的组：任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4001”：
(HGT4001)
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4002”：
(HGT4002)
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4003”：
(HGT4003)
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4004”：
(HGT4004)
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4005”：
(HGT4005)
及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人.Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，该专利以引用的方式并入本文)。适用于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸二-十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油烯基氧基-N-[2-(精胺-羧胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(“DOSPA”)(Behr等人.Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。
适用于本发明的组合物和方法的另外的示例性阳离子脂质还包括：1,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',12'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙基胺(“DLinDAP”)；1,2-N,N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(“DLin-K-XTC2-DMA”)；和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见，WO 2010/042877，该专利以引用的方式并入本文；Semple等人.,NatureBiotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.,等人.,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.,等人.,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。
在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。
在一些实施方案中，作为本文所述的阳离子脂质的代替或除本文所述的阳离子脂质之外，可以使用基于甾醇的阳离子脂质。合适的基于甾醇的阳离子脂质是含二烷基氨基、咪唑和胍的基于甾醇的阳离子脂质。例如，某些实施方案涉及包含一种或多种包含咪唑的基于甾醇的阳离子脂质的组合物，所述阳离子脂质例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构(I)所表示。在某些实施方案中，用于递送编码功能蛋白的RNA(例如，mRNA)的脂质纳米颗粒可以包含一种或多种基于咪唑的阳离子脂质，例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构所表示：
在一些实施方案中，脂质体中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。在一些实施方案中，阳离子脂质构成按重量计约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％的脂质体。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，ICE脂质)以摩尔比计占脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。
如本文使用的，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文使用的，短语“阴离子脂质”指在选择的pH，例如生理pH下携带净负电荷的许多脂质物质中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、或它们的混合物。
非阳离子脂质
在一些实施方案中，此类非阳离子脂质可以单独使用，但是优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。在一些实施方案中，非阳离子脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约5％至约90％、或约10％至约70％的摩尔比。在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，即在其下配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。
基于胆固醇的脂质
在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺胆固醇)、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人.BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占合适的脂质溶液中的总脂质的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占合适的脂质溶液中的总脂质的约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35％-40％)。
在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约2％至约30％、或约5％至约20％的摩尔比。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的基于胆固醇的脂质的百分比可以为大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。
本发明还设想了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生化的脂质(诸如，衍生化的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))单独或优选地与其他脂质调配物(它包含转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒))一起组合的使用。设想的PEG修饰的脂质包括但不限于长度为最多SkDa的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条C6-C20长度的烷基链的脂质。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且还可以提供延长循环寿命和增加脂质-核酸组合物至靶组织的递送的手段(Klibanov等人.(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者可以选择它们以在体内迅速地从调配物中交换出来(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰的磷脂和衍生化的脂质可以包含以摩尔比计脂质体转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％、或约2％。
根据各种实施方案，包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰的脂质的选择，以及这些脂质与彼此的相对摩尔比基于所选择的脂质的特征、预期靶细胞的性质、待递送的mRNA的特征。另外的考虑因素包括例如烷基链的饱和度，以及所选脂质的尺寸、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可相应地调节摩尔比。
在一些实施方案中，使用聚合物作为载体，单独或与包括本文所述的各种脂质的其它载体组合，配制合适的递送媒介物。因此，在一些实施方案中，如本文所用，脂质体递送媒介物还涵盖包含聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PLL、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当存在PEI时，它可为分子量范围为10至40kDa的支化PEI，例如25kDa支化PEI(Sigma#408727)。
用于本发明的合适的脂质体可以包含各种比率的本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、PEG修饰的脂质和/或聚合物中的任一者中的一者或多者。作为非限制性实例，合适的脂质体调配物可以包含选自以下的组合：cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或者ICE、DOPE和DMG-PEG2K。
在多个实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)以摩尔比计占脂质体的约30-60％(例如，约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)的百分比以摩尔比计等于或大于脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。
在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率可以分别地在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:20:10。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:25:5。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别地为大约40:32:25:3。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为50:45:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为50:40:10。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为55:40:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为55:35:10。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为60:35:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为60:30:10。
在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE和DOPE的ICE:DOPE摩尔比>1:1。在一些实施方案中，ICE:DOPE摩尔比<2.5:1。在一些实施方案中，ICE:DOPE摩尔比在1:1和2.5:1之间。在一些实施方案中，ICE:DOPE摩尔比为大约1.5:1。在一些实施方案中，ICE:DOPE摩尔比为大约1.7:1。在一些实施方案中，ICE:DOPE摩尔比为大约2:1。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE和DMG-PEG-2K的ICE:DMG-PEG-2K摩尔比>10:1。在一些实施方案中，ICE:DMG-PEG-2K摩尔比<16:1。在一些实施方案中，ICE:DMG-PEG-2K摩尔比为大约12:1。在一些实施方案中，ICE:DMG-PEG-2K摩尔比为大约14:1。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含DOPE和DMG-PEG-2K的DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比>5:1。在一些实施方案中，DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比<11:1。在一些实施方案中，DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为大约7:1。在一些实施方案中，DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为大约10:1。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE、DOPE和DMG-PEG-2K的ICE:DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为50:45:5。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE、DOPE和DMG-PEG-2K的ICE:DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为50:40:10。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE、DOPE和DMG-PEG-2K的ICE:DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为55:40:5。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE、DOPE和DMG-PEG-2K的ICE:DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为55:35:10。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE、DOPE和DMG-PEG-2K的ICE:DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为60:35:5。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ICE、DOPE和DMG-PEG-2K的ICE:DOPE:DMG-PEG-2K摩尔比为60:30:10。
用于本发明的组合物中的脂质体转移媒介物可通过本领域目前已知的各种技术制备。各种方法在公开的美国申请号US2011/0244026、公开的美国申请号US2016/0038432和2017年11月1日提交的临时美国申请号62/580,155中有所描述，并且可以被用于实践本发明，所有这些申请均以引用的方式并入本文。
本申请人提交的包括脂质组合物的以下申请据此以引用的方式完全并入：2018年5月16日提交的62/672,194；2018年5月24日提交的62/676,147；以及与本申请同日提交的代理人案号为MRT-2016USP1，名称为Cationic Lipids Comprising a Steroidal Moiety；代理人案号为MRT-2017USP1，名称为Phosphoester Cationic Lipids；代理人案号为MRT-2018USP1，名称为Macrocyclic Lipids；代理人案号为MRT-2019USP1，名称为Vitamin KCationic Lipids；代理人案号为MRT-2022USP1，名称为Vitalipids II；代理人案号为MRT-2023USP1，名称为Vitalipids III；代理人案号为MRT-2024USP1，名称为Vitalipids IV的申请。
荷载mRNA的纳米颗粒
任何所需脂质可以任何适合于包封mRNA的比率混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所期望的脂质的混合物，所述脂质包括阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇和/或PEG化的脂质。
在一些实施方案中，用于将mRNA包封于脂质纳米颗粒中的方法包括混合mRNA溶液和脂质溶液，其中在混合以形成包封mRNA的脂质纳米颗粒之前，将mRNA溶液和/或脂质溶液加热至高于环境温度的预定温度(参见2015年7月2日提交的名称为“Encapsulation ofmessenger RNA”的美国专利申请序列号14/790,562，以及2014年7月2日提交的临时美国专利申请序列号62/020,163，这些专利申请的公开内容据此整体并入)。
在一些实施方案中，用于将mRNA包封于脂质纳米颗粒中的方法包括将预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA结合(参见2016年11月10日提交的美国临时申请序列号62/420,413和2017年11月1日提交的美国临时申请序列号62/580,155，这些临时申请的公开内容据此以引用的方式并入)。在一些实施方案中，将预形成的脂质纳米颗粒与mRNA组合产生脂质纳米颗粒，其显示出改善的细胞内mRNA递送功效。在一些实施方案中，将预形成的脂质纳米颗粒与mRNA组合导致脂质纳米颗粒中包封的mRNA的极高包封效率(即，在90-95％的范围内)。在一些实施方案中，通过泵系统实现了预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA的组合，所述泵系统在整个过程中维持脂质/mRNA(N/P)比率恒定，并且还能够容易地按比例放大。
根据本发明的合适的脂质体可以各种尺寸制备。在一些实施方案中，提供的脂质体可制备得小于先前已知的包封mRNA的脂质体。在一些实施方案中，脂质体的尺寸减小与更有效的mRNA递送相关。适当脂质体尺寸的选择可考虑到靶细胞或组织的位点，以及在一定程度上制备脂质体所用于的应用。
在一些实施方案中，选择合适大小的脂质体以促进由mRNA编码的多肽的全身分布。在一些实施方案中，可能期望限制mRNA对某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，脂质体的大小可设定为使得其尺寸小于肝脏中衬里肝血窦的内皮层的开窗；在这种情况下，脂质体可容易地穿透这种内皮开窗以到达靶肝细胞。
或者或另外，脂质体的尺寸可设定为使得脂质体的尺寸具有足够的直径，以限制或明确地避免分布到某些细胞或组织内。例如，脂质体的尺寸可设定为使得其尺寸大于内衬肝血窦的内皮层的开窗，从而限制脂质体向肝细胞的分布。
在一些实施方案中，脂质体的尺寸由脂质体颗粒的最大直径的长度确定。在一些实施方案中，合适的脂质体的尺寸不超过约250nm(例如不超过约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或50nm)。在一些实施方案中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-250nm(例如，范围为约10-225nm、10-200nm、10-175nm、10-150nm、10-125nm、10-100nm、10-75nm或10-50nm)。在一些实施方案中，合适的脂质体具有的大小范围为约100-250nm(例如，范围为约100-225nm、100-200nm、100-175nm、100-150nm)。在一些实施方案中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-100nm(例如，范围为约10-90nm、10-80nm、10-70nm、10-60nm或10-50nm)。在特定实施方案中，合适的脂质体具有小于约100nm的尺寸。
所属领域已知的各种替代方法可用于测定脂质体群体的大小。一种这样的尺寸测定方法在美国专利第4,737,323号中描述，所述专利以引用的方式并入本文。通过浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生渐进的尺寸减小，降至直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是依赖于剪切能将大脂质体断裂成较小脂质体的另一种方法。在典型的均质化程序中，MLV通过标准乳液均质器再循环，直到观察到选择的脂质体尺寸，通常在约0.1至0.5微米之间。脂质体的尺寸可通过准电光散射(QELS)进行测定，如以引用的方式并入本文的Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)中所述。平均脂质体直径可通过所形成的脂质体的超声处理来减小。间歇性超声处理循环可与QELS评价交替，以指导有效的脂质体合成。
在一些实施方案中，已经鉴定了一种制备含有mRNA的脂质纳米颗粒的方法，所述方法涉及在以下条件下将预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA组合：由于这些组分的添加顺序，所得的调配颗粒显示出改善的效力和功效。组分的混合通过泵系统来实现，所述泵系统在整个过程中维持脂质/mRNA(N/P)比率恒定，并且还能够容易地按比例放大。该方法在2017年11月10日提交的本申请人的国际申请PCT/US17/61113，以及与美国序列号15/809,680(要求2016年11月10日提交的申请号62/420,413的优先权)同日提交的美国申请中有所详细描述，这些申请的全部内容以引用的方式完全并入本文。上面提及的调配方法在本文中通常称为“再混合”调配。
疫苗组合物
本发明的免疫原性组合物可以含有另外的物质，诸如增强疫苗的有效性的佐剂，以及药学上可接受的载剂(包括但不限于润湿剂或乳化剂或缓冲剂)(Remington’sPharmaceutical Sciences,18th edition,Mack Publishing Company,(ed.)1980)。
佐剂
合适的佐剂可以包括但不限于无机盐(例如，AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH(SO4)2、二氧化硅、铝、Ca3(PO4)2、高岭土或碳)、具有或不具有免疫刺激复合物(ISCOM)的多核苷酸(例如，CpG寡核苷酸，诸如Chuang,T.H.等人,(2002)J.Leuk.Biol.71(3):538-44；Ahmad-Nejad,P.等人(2002)Eur.J.Immunol.32(7):1958-68中描述的那些)；聚IC或聚AU酸，具有或不具有CpG的聚精氨酸(在本领域中也称为IC31；参见Schellack,C.等人(2003)Proceedings of the 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology；Lingnau,K.等人(2002)Vaccine 20(29-30):3498-508)、JuvaVaxTM(美国专利号6,693,086)、某些天然物质(例如，来自结核分枝杆菌的蜡D，短小棒状杆菌(Cornyebacteriumparvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)中存在的物质，或布鲁氏菌(Brucella)属成员)、鞭毛蛋白(Toll样受体5配体；参见McSorley,S.J.等人(2002)J.Immunol.169(7):3914-9)、皂苷(诸如QS21、QS17和QS7)(美国专利号5,057,540；5,650,398；6,524,584；6,645,495)、单磷酰基脂质A(具体而言，3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL))、咪喹莫特(在本领域中也称为IQM，并且以商购获得；美国专利号4,689,338；5,238,944；Zuber,A.K.等人(2004)22(13-14):1791-8)；CCR5抑制剂CMPD167(参见Veazey,R.S.等人(2003)J.Exp.Med.198:1551-1562)；以及鲨烯乳剂，即MF59。
在一些实施方案中，佐剂是另一种RNA。
过去在人中广泛使用的佐剂是铝。在一些实施方案中，合适的佐剂是磷酸铝。在一些实施方案中，合适的佐剂是氢氧化铝。在一些实施方案中，合适的佐剂是磷酸铝和氢氧化铝的组合。皂苷及其纯化组分Quil A、弗氏完全佐剂和其他佐剂通常被用于研究和兽医应用中；然而，新的化学定义的制备物，诸如胞壁酰二肽、单磷酰基脂质A、磷脂缀合物，诸如Goodman-Snitkoff等人.J.Immunol.147:410-415(1991)描述的那些，该文献以引用的方式并入本文。
载剂、赋形剂
为了促进体内mRNA的表达，递送媒介物(诸如脂质纳米颗粒，包括脂质体)可以与一种或多种另外的核酸、载剂、靶向配体或稳定试剂组合调配，或者在药理组合物中调配，在所述药理组合物中所述递送媒介物与合适的赋形剂混合。在一些实施方案中，将包封mRNA的脂质纳米颗粒与透明质酸酶同时施用。用于配制和施用药物的技术可在"Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，最新版本中找到。
通常，根据本发明的免疫原性疫苗组合物包含药学上可接受的载剂。通常，药学上可接受的载剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合。载剂和组合物可以是无菌的，并且调配物适合施用方式。组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂或者pH缓冲剂。可以使用任何常见的药物载剂，诸如无菌盐水溶液或芝麻油。介质也可以含有常规药物辅助材料，例如调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等等。
药学上可接受的载剂部分由正在施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，存在多种本发明的免疫原性组合物的合适的调配物。在一些实施方案中，将免疫原性疫苗组合物调配为用于肠胃外(即，肌肉内、皮内或皮下)施用或鼻咽(即，鼻内)施用。通常，用于肠胃外施用的调配物包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些)等等。还可以提供防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、以及惰性气体等等。
一些免疫原性组合物可以潜在地以药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐的形式施用，所述酸加成盐或碱加成盐通过与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应，或者通过与无机碱(诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(诸如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺)反应来形成。
所提供的脂质体包封的或结合的mRNA，以及含有其的组合物，可根据当前的医学实践施用且给药，考虑到受试者的临床状况、施用部位和施用方法、施用的时间安排、受试者的年龄、性别、体重以及与本领域普通技术人员相关的其它因素。用于本文目的的“有效量”可通过如实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的此类相关考虑来确定。在一些实施方案中，所施用的量有效地实现如所属领域的技术人员选择作为疾病进展、消退或改善的适当量度的症状和其它指标的至少一些稳定、改善或消除。例如，合适的量和给药方案是引起至少瞬时蛋白质(例如酶)产生的那种。
可替代地或另外地，脂质体包封的本发明的mRNA和组合物可以以局部而非全身方式施用。
可以通过单剂量或多剂量来实现施用。
本发明提供的方法设想了治疗有效量的本文所述的疫苗接种剂(例如，编码抗原的mRNA)的单次或多次施用。可以定期施用疫苗接种剂，具体取决于受试者病症的性质、严重度和程度，诸如感染的阶段、流行率人口统计学或癌症的阶段。在一些实施方案中，治疗有效量的本发明的疫苗接种剂(例如，编码抗原的mRNA)可以定期施用(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、每两月一次(每两个月一次)、每月一次(每个月一次)、每两周一次(每两个星期一次)、每月两次、每30天一次、每28天一次、每14天一次、每10次一次天、每7天一次、每周一次、每周两次、每日一次或连续不断。
在一些实施方案中，提供的脂质体和/或组合物被调配成使其适合于其中包含的mRNA的延长释放。此类延长释放的组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一些实施方案中，本发明的组合物每日两次、每日一次或隔日一次施用于受试者。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物每周两次、每周一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每28天一次、每30天一次、每两周一次、每三周一次、或更优选每四周一次、每月一次、每月两次、每六周一次、每八周一次、每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次或每年一次施用于受试者。还考虑了配制用于贮存施用(例如肌肉内、皮下、玻璃体内)的组合物和脂质体，以在长时间内递送或释放mRNA。优选地，所采用的延长释放手段与对mRNA进行的修饰组合，以增强稳定性。
如本文所用，术语“治疗有效量”在很大程度上根据本发明的疫苗组合物中含有的接种剂的总量来确定。一般而言，治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善感染或癌症)。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量。一般而言，施用于有需要的受试者的治疗剂(例如，编码抗原的mRNA)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够容易地根据这些和其他相关因素确定适当剂量。另外，可任选地采用客观和主观测定来确定最佳剂量范围。
在一些实施方案中，疫苗的初免剂量在第0周施用，然后施用一剂或多剂另外的疫苗剂量。在一些实施方案中，在初免剂量后再施用一剂、两剂或三剂疫苗剂量，也称为加强剂量。在一些实施方案中，初免剂量和一剂或多剂加强剂量具有特定的时间间隔。在一些实施方案中，初免剂量和加强剂量间隔一周或间隔两周，或者适用于疫苗和所期望的免疫应答的任何其他间隔施用。在一些实施方案中，两个连续加强剂量之间的时间间隔与初免和加强剂量之间的间隔相同。在一些实施方案中，两个连续加强剂量之间的时间间隔与初免和加强剂量之间的时间间隔不同。
治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的疫苗，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以例如根据施用途径、与其他药物的组合而变化。另外，针对任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于多种因素，包括待治疗的障碍和障碍的严重度；所采用的特定疫苗剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用的时间、施用途径和/或所采用的特定蛋白质的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域熟知的相似因素。
在一些实施方案中，治疗有效剂量的范围为约0.005mg/kg至500mg/kg体重，例如约0.005mg/kg至400mg/kg体重、约0.005mg/kg至300mg/kg体重、约0.005mg/kg至200mg/kg体重、约0.005mg/kg至100mg/kg体重、约0.005mg/kg至90mg/kg体重、约0.005mg/kg至80mg/kg体重、约0.005mg/kg至70mg/kg体重、约0.005mg/kg至60mg/kg体重、约0.005mg/kg至50mg/kg体重、约0.005mg/kg至40mg/kg体重、约0.005mg/kg至30mg/kg体重、约0.005mg/kg至25mg/kg体重、约0.005mg/kg至20mg/kg体重、约0.005mg/kg至15mg/kg体重、约0.005mg/kg至10mg/kg体重。
在一些实施方案中，疫苗的治疗有效剂量大于约0.1mg/kg体重、大于约0.5mg/kg体重、大于约1.0mg/kg体重、大于约3mg/kg体重、大于约5mg/kg体重、大于约10mg/kg体重、大于约15mg/kg体重、大于约20mg/kg体重、大于约30mg/kg体重、大于约40mg/kg体重、大于约50mg/kg体重、大于约60mg/kg体重、大于约70mg/kg体重、大于约80mg/kg体重、大于约90mg/kg体重、大于约100mg/kg体重、大于约150mg/kg体重、大于约200mg/kg体重、大于约250mg/kg体重、大于约300mg/kg体重、大于约350mg/kg体重、大于约400mg/kg体重、大于约450mg/kg体重、大于约500mg/kg体重。在一个特定实施方案中，治疗有效剂量为1.0mg/kg体重。在一些实施方案中，1.0mg/kg体重的治疗有效剂量皮下、肌肉内或静脉内施用。
在一些实施方案中，每剂施用约0.3m g疫苗。在一些实施方案中，施用约0.4m g疫苗。在一些实施方案中，施用约0.5m g疫苗。在一些实施方案中，施用约0.6m g疫苗。在一些实施方案中，施用约0.7m g疫苗。在一些实施方案中，施用约0.8m g疫苗。在一些实施方案中，施用约0.9m g疫苗。在一些实施方案中，施用约1m g疫苗。在一些实施方案中，施用约2mg疫苗。在一些实施方案中，施用约3m g疫苗。在一些实施方案中，施用约4m g疫苗。在一些实施方案中，施用约5m g疫苗。在一些实施方案中，施用约6m g疫苗。在一些实施方案中，施用约7m g疫苗。在一些实施方案中，施用约8m g疫苗。在一些实施方案中，施用约9m g疫苗。在一些实施方案中，施用约10m g疫苗。在一些实施方案中，施用约12、15、20、30、50或100mg疫苗，或它们之间的任何量。在一些实施方案中，每剂施用最多约1mg疫苗。在一些实施方案中，每剂施用最多约10mg疫苗。在一些实施方案中，每剂施用最多约100mg疫苗。
在一些实施方案中，初免剂量和一个或多个后续疫苗剂量的量是相同的。在一些实施方案中，初免剂量和一个或多个后续疫苗剂量的量是不同的。
在一些实施方案中，组合物的施用引起由mRNA编码的抗原在受试者的淋巴结中表达。在一些实施方案中，组合物的施用引起由mRNA编码的抗原在受试者的淋巴细胞中表达。
在一些实施方案中，组合物的施用引起抗原特异性抗体应答。在一些实施方案中，抗原特异性抗体应答通过抗原特异性抗体在血清中的存在来测量。
在一些实施方案中，组合物的施用引起抗原特异性T细胞应答。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞应答通过细胞因子应答来测量。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞应答通过脾细胞中的IFN-γELISPOT来测量。
在一些实施方案中，抗原特异性抗体应答和/或抗原特异性T细胞应答在施用后至少24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或1个月可检测。
本文还考虑了包含本文公开的一种或多种脂质体的冻干药物组合物和使用此类组合物的相关方法，如例如在于2012年6月8日提交的国际专利申请PCT/US12/41663中公开的，所述美国临时申请的教导以引用的方式整体并入本文。例如，根据本发明的冻干药物组合物可在施用前复原或可在体内.复原。例如，可以将冻干的药物组合物调配成适当的剂型(例如，皮内剂型，诸如圆片剂、棒剂或膜剂)并且施用，以使得所述剂型通过个体的体液在体内随时间推移再水化。
提供的脂质体和组合物可施用于任何所需组织。在一些实施方案中，所提供的包含mRNA的脂质体和组合物被皮下递送，并且mRNA在除皮下组织之外的细胞或组织类型中表达。某些组合物引起在除施用部位之外的某些组织中的递送和表达偏差。本发明提供了用于引起淋巴结中的强烈表达的皮下施用的组合物。可以表达递送的mRNA的其他示例性组织包括但不限于肝、肾、心、脾、血清、大脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊液。
在一些实施方案中，与治疗或施用前的基线表达或活性水平相比，所提供的组合物的施用引起所施用的mRNA的表达增加和/或受试者的生物学样品中的其他酶或蛋白质的表达和活性水平升高。在一些实施方案中，与治疗前的基线表达或活性水平相比，所提供的组合物的施用引起细胞因子表达或趋化因子表达增加。例如，刺激和活化细胞毒性T细胞的T细胞疫苗将引起超过基线水平的IFN-γ产生增加。IFN-m和其他细胞因子和趋化因子是本领域熟知的免疫应答或活化标志物。通常，在治疗前立即测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿和组织样品(例如肌肉、肝脏、皮肤成纤维细胞)。在一些实施方案中，与治疗前的基线水平相比，所提供的组合物的施用引起免疫应答标志物水平的表达或活性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，与未治疗的受试者相比，所提供的组合物的施用引起受试者的生物学样品中的mRNA表达或活性水平升高。在一些实施方案中，与未治疗的受试者相比，所提供的组合物的施用引起受试者的生物学样品中的治疗性蛋白质的表达或活性水平升高。
根据各种实施方案，可调整递送的mRNA的表达时机，以适应特定的医学需要。在一些实施方案中，由递送的mRNA编码的蛋白质的表达在所提供的脂质体施用后1、2、3、6、12、24、48、72、96小时、1周、2周或1个月是可检测的。
在一些实施方案中，当施用时治疗有效剂量的所提供的组合物。
本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。
实施方案1.一种诱导体内免疫应答的方法，所述方法包括：
以足以诱导抗原特异性T细胞应答和/或抗原特异性抗体应答的给药方案，将包封于脂质纳米颗粒中的包含编码抗原的信使RNA(mRNA)的组合物施用于有需要的受试者。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述组合物是皮下施用的。
实施方案3.如实施方案1所述的方法，其中所述组合物是皮内施用的。
实施方案4.如实施方案1所述的方法，其中所述组合物是肌肉内施用的。
实施方案5.如实施方案1所述的方法，其中所述组合物不是静脉内施用的。
实施方案6.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物是疫苗组合物。
实施方案7.一种体内递送疫苗的方法，所述方法包括：
将包封于脂质纳米颗粒中的包含编码抗原的信使RNA(mRNA)的疫苗组合物施用于有需要的受试者，其中所述疫苗组合物是肌肉内或皮下施用的。
实施方案8.如实施方案7所述的方法，其中所述疫苗组合物以足以诱导抗原特异性T细胞应答和/或抗原特异性抗体应答的给药方案施用。
实施方案9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述抗原是蛋白质。
实施方案10.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述抗原是肽。
实施方案11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物包含编码一种或多种多肽的一种或多种mRNA。
实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括注射单剂量。
实施方案13.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述给药方案包括定期注射多剂量。
实施方案14.如实施方案12或13所述的方法，其中所述单剂量或所述多剂量的范围为0.1μg-100mg mRNA。
实施方案15.如实施方案12或13所述的方法，其中所述单剂量或所述多剂量的范围为0.1μg-50mg、0.1μg-25mg、0.1μg-10mg、1μg-1mg或1μg-100μg mRNA。
实施方案16.如实施方案12或13所述的方法，其中所述单剂量为或所述多剂量选自0.1μg、0.3μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、25μg、50μg或100μg。
实施方案17.如实施方案12或13所述的方法，其中所述单剂量或所述多剂量的范围为0.01μg/kg-10mg/kg(mRNA/体重)。
实施方案18.如实施方案12或13所述的方法，其中所述单剂量或所述多剂量的范围为0.01μg/kg–8mg/kg、0.01μg/kg–6mg/kg、0.01μg/kg–5mg/kg、0.1μg/kg–5mg/kg、0.1μg/kg–1mg/kg或0.1μg/kg–0.5mg/kg(mRNA/体重)。
实施方案19.如实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述多剂量中的每剂包含相同剂量的mRNA。
实施方案20.如实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述多剂量中的每剂包含不同剂量的mRNA。
实施方案21.如实施方案13-20中任一项所述的方法，其中所述多剂量中的每剂间隔1-3周注射一次。
实施方案22.如实施方案13-20中任一项所述的方法，其中所述多剂量中的每剂每周注射一次。
实施方案23.如实施方案13-20中任一项所述的方法，其中所述多剂量中的至少两剂在3周内注射。
实施方案24.如实施方案13-20中任一项所述的方法，其中所述多剂量按以下排程注射：在第0周施用第1剂，在第3周内施用第2剂，以及在第5周内施用第3剂。
实施方案25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含一种或多种经修饰的核苷酸。
实施方案26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含5’非翻译区(5’UTR)和/或3’非翻译区(3’UTR)。
实施方案27.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种PEG脂质。
实施方案28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含至少一种阳离子脂质，所述至少一种阳离子脂质选自由以下各项组成的组：cKK-E12、OF-02、C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、ICE(基于咪唑)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、3-(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)-6-(4-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)丁基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标23)、3-(5-(双(2-羟基十二烷基)氨基)戊-2-基)-6-(5-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)戊-2-基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标24)以及它们的组合。
实施方案29.如实施方案28所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质选自CCBene、ICE、ML-2、C12-200或DLin-SS-DMA。
实施方案30.如实施方案29所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质是ICE。
实施方案31.如实施方案29所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质是ML-2。
实施方案32.如实施方案29所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质是CCBene。
实施方案33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述一种或多种辅助脂质选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))。
实施方案34.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含一种或多种PEG脂质，所述一种或多种PEG脂质选自衍生化的神经酰胺，诸如N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)；具有长度为最多5kDa的聚乙二醇链的PEG修饰的脂质，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条C6-C20长度的烷基链的脂质，PEG化的胆固醇和PEG-2K。
实施方案35.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG修饰的脂质占脂质体中的总脂质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。
实施方案36.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用引起由mRNA编码的所述抗原在所述受试者的淋巴细胞中的表达。
实施方案37.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用引起抗原特异性抗体应答。
实施方案38.如实施方案36所述的方法，其中所述抗原特异性抗体应答通过抗原特异性抗体在血清中的存在来测量。
实施方案39.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用引起抗原特异性T细胞应答。
实施方案40.如实施方案38所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞应答通过脾细胞中的IFN-γELISPOT来测量。
实施例
虽然已根据某些实施例特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但下述实例仅作用于说明本发明的化合物，而不是预期对其进行限制。
脂质材料
除非另外指明，否则以下实施例中所述的调配物含有不同比率的多组分脂质混合物，所述脂质混合物采用一种或多种阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和PEG化的脂质，它们被设计为包封各种核酸材料。用于该方法的阳离子脂质可以包括但不限于cKK-E12(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)、OF-02、靶标23、靶标24、咪唑胆固醇酯(ICE)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、DOTAP(1,2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1,2-二油烯基-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(Heyes,J.；Palmer,L.；Bremner,K.；MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulatednucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人.“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等人.“Lipid-like materials for low-dose in vivogene silencing”PNAS2010,107,1864-1869)、基于二烷基氨基的阳离子脂质、基于咪唑的阳离子脂质、基于胍的阳离子脂质等。辅助脂质可以包括但不限于DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))、DOPC(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、胆固醇等。PEG化的脂质可以包括但不限于长度为最多5kDa的聚(乙二醇)链，所述聚(乙二醇)链共价连接至具有一条或多条C6-C20长度的烷基链的脂质。
mRNA材料
在一些实施方案中，通过从编码基因的质粒DNA模板进行体外转录来合成编码靶蛋白的经密码子优化的信使RNA，随后添加5'帽结构(帽1)(Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249)和3'多聚(A)。每个mRNA产物中存在的5'和3'非翻译区分别以X和Y表示，并且如上文所述定义。
实施例1.不同脂质调配物针对血清中的mRNA表达的单剂量功效比较
使用人促红细胞生成素(hEPO)作为mRNA转染功效的灵敏定量指标，比较了三种不同的脂质调配物ML-2、ML-7和MC3在血清中的hEPO蛋白的表达水平。MC3被认为是某些RNA递送平台的最新调配物。小鼠接受溶于包含ML-2或ML-7或MC3的脂质调配物中的0.3mg/Kg或1mg/Kg mRNA的静脉内施用。分别在施用后6和24小时测量血清中的hEPO蛋白水平。
如图1A和1B所示，如分别在6和24小时所测量，无论剂量如何，ML-2和ML-7均产生更高的血清hEPO水平。这些结果显示，脂质调配物ML-2和ML-7在mRNA递送和表达方面比常规MC3调配物更有效。
实施例2.mRNA递送途径针对血清中的表达蛋白质检测的单剂量功效比较
在该示例性实验中，比较了hEPO mRNA施用的皮内、皮下和肌肉内途径的血清中hEPO蛋白表达。给小鼠皮下或皮内或肌肉内施用1、10或50g hEPO mRNA。在施用后6和24小时测量血清中的血清hEPO蛋白水平。如图2所示，在6和24小时研究的三个施用途径中，肌肉内施用引起所递送的mRNA的血清表达达到最高。
实施例3.mRNA的皮下和皮内递送引起淋巴结中的强烈mRNA表达
在该示例性研究中，使用萤火虫荧光素酶(FFL)作为实验mRNA对小鼠进行皮下、皮内和肌肉内递送途径的单剂量比较。在浓度为0.2mg/mL和剂量为5mL/Kg，或无足够mRNA对照的情况下，给6-8周龄雄性CD1小鼠(N＝13)皮下(SC)或皮内(ID)或肌肉内(IM)施用1mg/Kg FFL mRNA。在施用后24小时，经由2.5mL/Kg腹膜内注射向所有动物给予150mg/Kg(60mg/mL)荧光素。在荧光素施用后15分钟，对所有小鼠实施安乐死，并且用盐水进行全身心内灌注。收集肝、脾、心、肺、肾以及肱、腋窝和腹股沟淋巴结，并准备使用IVIS Lumina设备和方案通过成像进行体内萤光素酶测定。如下文所示，结果表明给药途径影响体内mRNA的递送和表达。
表1显示了在所示的各种组织中以每个治疗组中的平均总荧光表示的结果。在所有递送途径中都发现淋巴结中的FFL mRNA富集。然而，出乎意料的是，与肝和脾相比，通过皮下和皮内途径递送引起腋窝和肱淋巴结中的强烈FFL蛋白表达，而肌肉内递送引起肝、脾、肌肉和腹股沟淋巴结中的优先表达，在腋窝和肱淋巴结中具有中度表达。图3显示了每组中来自代表性小鼠的组织的荧光图像。(组：无mRNA对照、皮下施用、皮内施用和肌肉内施用)。表示各种组织在培养皿上的位置的示意图以图中索引提供，以便通过形状和位置对不同的组织进行鉴定。
表1.
实施例4.使用不同的阳离子脂质进行的FFL LNP的生物分布的评估
在该实施例中，使用如实施例3的研究中所述的方案给小鼠施用FFL-LNP(1mg/Kg)的单次皮下注射，但是在LNP组合物中使用不同的阳离子脂质组分。结果表明，多种调配物引起mRNA的富集并且在淋巴结中出现强烈表达。然而，某些阳离子脂质的使用引起mRNA在淋巴结中的偏差表达，例如，包含ICE(表2中的LNP组合物2)、靶标23(表2中的LNP组合物4和5)、ML2(表2中的LNP组合物1)和CCBene(表2中的LNP组合物8)的组合物引起FFL mRNA在淋巴结中的强烈表达。代表性组织图像如图4所示。具有高荧光的组织以箭头表示。表示各种组织在培养皿上的位置的示意图以图中索引提供，以便通过形状和位置对不同的组织进行鉴定。表2提供了FFL表达产生的各种组织中的平均荧光。
表2.
另外，改进的LNP调配过程适用于增加体内mRNA-LNP表达的效力。该过程包括将一种或多种溶液加热(即，从热源向溶液施加热量)至高于环境温度的温度(或维持在一定温度下)的步骤。如本申请人的先前申请USSN 15/809,680或对应的国际申请PCT/US17/61113中所概述，溶液包含预先形成的脂质纳米颗粒、mRNA以及包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的混合溶液(以下称为再混合调配物)，这两个申请均提交于2017年11月10日，并且均以引用的方式整体并入本文。如图5所示，使用示例性hEPO mRNA作为再混合方案的概念实例，与传统(不加热，未混合的LNP调配物)相比，在多种阳离子脂质组合物中观察到hEPO的更高表达。图6显示了当在mRNA-LNP组合物的施用后24小时以再混合调配物递送时，FFL表达在腋窝和肱淋巴结中的富集。
等效物
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。

Claims (10)

1.一种诱导体内免疫应答的方法，所述方法包括：
以足以诱导抗原特异性T细胞应答和/或抗原特异性抗体应答的给药方案，将包封于脂质纳米颗粒中的包含编码抗原的信使RNA(mRNA)的组合物施用于有需要的受试者。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物是皮下施用的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物是皮内施用的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物是肌肉内施用的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物不是静脉内施用的。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物是疫苗组合物。
7.一种体内递送疫苗的方法，所述方法包括：
将包封于脂质纳米颗粒中的包含编码抗原的信使RNA(mRNA)的疫苗组合物施用于有需要的受试者，其中所述疫苗组合物是肌肉内或皮下施用的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述疫苗组合物以足以诱导抗原特异性T细胞应答和/或抗原特异性抗体应答的给药方案施用。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是蛋白质。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗原是肽。
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