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CN115461042A - 制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法 - Google Patents

制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法 Download PDF

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CN115461042A
CN115461042A CN202080096153.4A CN202080096153A CN115461042A CN 115461042 A CN115461042 A CN 115461042A CN 202080096153 A CN202080096153 A CN 202080096153A CN 115461042 A CN115461042 A CN 115461042A
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mrna
lnp
lipid
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empty
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CN202080096153.4A
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F·德罗萨
A·萨罗德
N·V·蒙托亚
P·帕特尔
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Translation Bio Co
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Abstract

本发明提供了一种用于进行脂质纳米颗粒调配和mRNA包封的改进方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括将预先形成的脂质纳米颗粒的溶液与包封mRNA的脂质纳米颗粒组合的步骤，产生活体内mRNA编码蛋白质表达效力增加的组合物。

Description

制备负载MRNA的脂质纳米颗粒的改进方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月20日提交的美国临时申请第62/951,784号的优先权和权益，其内容在此通过引用整体并入。
背景技术
信使RNA疗法(MRT)正在成为治疗多种疾病的越来越重要的方法。MRT涉及向需要所述疗法的患者施用信使RNA(mRNA)，以在患者体内产生由所述mRNA编码的蛋白质。通常将脂质纳米颗粒用于包封mRNA以用于mRNA的有效体内递送。
为了改进脂质纳米颗粒递送，许多努力集中于鉴定可能影响mRNA的细胞内递送和/或表达的组合物和新方法，并且能够适用于可扩展的和有成本效益的制造工艺。此外，现在正适当考虑与脂质介导的mRNA递送相关的组合物的安全性和耐受性。最近的报告表明，脂质体的效力和耐受性之间存在反比关系(Roursgaard M.等人,Toxicology InVitro,2016,36:164-171)。因此，在设计成功的治疗方案时有必要在安全性和有效性之间取得适当的平衡。然而，现有的方法需要相当大的改进来满足这些要求。
发明内容
本发明尤其提供一种制备包含负载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物的改进方法。本发明基于惊人的发现，即本发明的mRNA-LNP组合物在体内诱导比先前已知的mRNA-LNP组合物高得多的蛋白质表达。本发明尤其提供制备包含mRNA-LNP的组合物的方法(称为过程C)，其包括以下步骤：(a)将预先形成的空LNP与mRNA混合以形成mRNA-LNP，和(b)将步骤(a)中生成的mRNA-LNP与预先形成的脂质纳米颗粒组合以形成mRNA-LNP组合物。过程C的步骤(a)也称为过程B，如US 2018/0153822中所述，其通过引用整体并入。
在某些实施方案中，在步骤(b)中与mRNA-LNP组合的预先形成的脂质纳米颗粒是空LNP。在一些实施方案中，在步骤(b)中与mRNA-LNP组合的预先形成的脂质纳米颗粒与步骤(a)中的空LNP相同。
申请人发现，通过本文所述的方法生成的mRNA-LNP组合物是显著有效的，即，与通常通过将脂质与mRNA混合制备的混合物传统形成的mRNA-LNP相比，在体内引起高得多的蛋白质表达。申请人还发现，与单独使用步骤(a)形成的mRNA-LNP(过程B)相比，通过本文所述的方法生成的mRNA-LNP组合物显著有效。此外，通过本文所述的方法生成的mRNA-LNP组合物具有更高或相当的耐受性，尽管效力显著更高。因此，在一个实施方案中，由于mRNA-LNP组合物的更高效力，本发明的改进方法允许向受试者施用较低量的mRNA，以获得mRNA的治疗益处。在一个实施方案中，通过本发明的改进方法形成的mRNA-LNP组合物活表现出与例如单独在步骤(a)中生成的mRNA-LNP相当的体内耐受性。在一些实施方案中，体内耐受性通过诱导肝脏耐受性标记物酶天冬氨酸转氨酶(AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)来确定。因此，在一个实施方案中，由本文所述的本发明形成的LNP组合物表现出比先前已知的mRNA-LNP更高的耐受性(即，更低的AST和/或ALT水平)。
本发明特别适用于使用较低量的用于治疗用途的mRNA来制造mRNA-LNP，从而增加mRNA治疗产品的治疗指数(t.i)。
因此，在一个方面，本发明提供一种制备包封mRNA的脂质纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：(a)混合包含预先形成的空脂质纳米颗粒和mRNA的溶液，使得形成包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)，和(b)将步骤(a)中形成的mRNA-LNP与预先形成的LNP组合，得到包含mRNA-LNP的组合物。在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP是空LNP，也就是说，其不包含任何mRNA或其他多核苷酸。
在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的LNP具有相同的脂质调配物。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的LNP具有不同的脂质调配物。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的LNP包含相同的阳离子脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的LNP包含不同的阳离子脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和/或步骤(b)中的预先形成的LNP不含阳离子脂质。在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP不含阳离子脂质。
在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的空LNP包含在LNP中以相同比率组合的相同脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的空LNP包含相同的脂质，但在LNP中以不同的比率组合。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的空LNP包含除阳离子脂质以外的不同脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的空LNP包含除阳离子脂质以外的相同脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和步骤(b)中的预先形成的空LNP包含不同的脂质。
在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和/或步骤(b)中的预先形成的空LNP包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和/或步骤(b)中的预先形成的空LNP包含一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，步骤(a)中的预先形成的空LNP和/或步骤(b)中的预先形成的空LNP还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)和/或步骤(b)之前首先混合脂质以形成空LNP的步骤。
在一些实施方案中，在步骤(b)中以在20:1至1:20、10:1至1:10、5:1至1:5、3:1至1:3或2:1至1:2范围内的比率组合mRNA-LNP和预先形成的LNP。在一些实施方案中，在步骤(b)中以为或大于20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20的比率组合mRNA-LNP和预先形成的LNP。
在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP各自具有直径在约75-150nm范围内的平均尺寸。在一些实施方案中，mRNA-LNP和预先形成的LNP各自具有直径小于100nm的平均尺寸。在一些实施方案中，组合物的总脂质与总mRNA的比率在20:1至1:1、10:1至1:1、5:1至1:1、5:1至2:1或4:1至2:1的范围内，或大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1或20:1。
在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20的N/P比率。因此，在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约2的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约3的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约4的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约8的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约9的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约10的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约11的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约12的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约13的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约14的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约15的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约16的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约17的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约18的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约19的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约20的N/P比率。
在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1至约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1至约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1至约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1至约4的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1至约3的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约1至约2的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约2至约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约2至约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约2至约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约2至约4的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约2至约3的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约3至约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约3至约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约3至约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约3至约4的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约4至约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约4至约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约4至约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约5至约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约5至约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的组合物具有约6至约7的N/P比率。
N/P比率可以通过多种方式实现。例如，在一些实施方案中，制造包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物的方法包括(a)在允许以约2的N/P比率形成mRNA-LNP的条件下，将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA混合；和(b)将步骤(a)中的形成的mRNA-LNP与预先形成的LNP以约2的N/P比率组合，产生包含约4的N/P比率的mRNA-LNP的组合物。在其他实施方案中，制造包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物的方法包括：(a)在允许以约2的N/P比率形成mRNA-LNP的条件下，将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA混合；和(b)将步骤(a)中形成的mRNA-LNP与预先形成的LNP以约4的N/P比率组合，产生包含约6的N/P比率的mRNA-LNP的组合物。在另外的实施方案中，制造包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物的方法包括：(a)在允许以约4的N/P比率形成mRNA-LNP的条件下，将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA混合；(b)将步骤(a)中形成的mRNA-LNP与预先形成的LNP以约2的N/P比率组合，产生包含约6的N/P比率的mRNA-LNP的组合物。在一些实施方案中，包含在图1的步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约1、约2、约3、约4、约5、约6或约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20的N/P比率。因此，在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约1的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约2的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约3的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约4的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约8的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约9的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约10的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约11的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约12的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约13的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约14的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约15的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约16的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约17的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约18的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约19的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(a)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约20的N/P比率。
在一些实施方案中，包含在图1的步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20的N/P比率。因此，在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约1的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约3的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约4的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约5的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约6的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约7的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约8的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约9的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约10的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约11的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约12的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约13的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约14的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约15的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约16的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约17的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约18的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约19的N/P比率。在一些实施方案中，包含在步骤(b)中形成的脂质纳米颗粒的组合物具有约20的N/P比率。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的mRNA以5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.9mg/ml、0.8mg/ml、0.7mg/ml、0.6mg/ml、0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，mRNA以不大于3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.9mg/ml、0.85mg/ml、0.8mg/ml、0.75mg/ml、0.7mg/ml、0.65mg/ml、0.6mg/ml、0.55mg/ml、0.5mg/ml、0.45mg/ml、0.4mg/ml、0.35mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在于溶液中。
在一些实施方案中，通过将溶解在乙醇中的脂质与水性溶液混合来形成预先形成的脂质纳米颗粒。
在一个方面，本发明提供了一种包含根据本发明的方法制造的包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)和空脂质纳米颗粒(LNP)的组合，其中mRNA-LNP和空LNP包含相同的阳离子脂质。在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP具有相同的脂质调配物。在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP具有不同的脂质调配物。
在一些方面，本发明提供了包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)和空脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，其中mRNA-LNP和/或空LNP不含阳离子脂质。在一些实施方案中，空LNP不含阳离子脂质。在一些实施方案中，空LNP不含阳离子脂质。在一些实施方案中，mRNA-LNP和/或空LNP包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，mRNA-LNP和/或空LNP包含一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，mRNA-LNP和/或空LNP还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。
在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP以在20:1至1:20、10:1至1:10、5:1至1:5、3:1至1:3或2:1至1:2的范围内的比率存在。在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP以为或大于20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20的比率存在。
在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP各自具有直径在约75-150nm范围内的平均尺寸。在一些实施方案中，mRNA-LNP和空LNP各自具有直径小于100nm的平均尺寸。
在一些实施方案中，组合物的mRNA总量与脂质总量的比例在20:1至1:1、10:1至1:1、5:1至1:1、5:1至2:1或4:1至2:1的范围内，或大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1或20:1。
在一些实施方案中，mRNA编码蛋白质或肽。
在一个方面，本发明提供了一种递送用于体内蛋白质表达的mRNA的方法，其包括向受试者施用如前述段落中所述的本发明的组合物。
在一些实施方案中，在向受试者施用组合物后由mRNA编码的蛋白质或肽的表达水平与由施用有相同的mRNA-LNP但没有空LNP的相同量的mRNA编码的蛋白质或肽的表达水平相比增加，与肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)的表达水平相当。
在一些实施方案中，蛋白质或肽的表达水平增加至少20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在一个方面，本发明提供一种制造用于治疗用途的mRNA组合物的方法，所述方法包括包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)，所述方法包括：(a)将预先形成的空脂质纳米颗粒的储备液分成两部分；(b)将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)的第一部分与mRNA在允许形成mRNA-LNP的条件下混合；(c)将步骤(b)中形成的mRNA-LNP与步骤(a)中的空LNP的第二部分组合，产生包含mRNA-LNP的组合物。
在下述详细描述、附图和权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应理解，详细描述、附图和权利要求书虽然指出了本发明的实施方案，但仅以说明性方式而非限制性方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1是过程C的示例性示意图。过程C包括用于生成包含高效mRNA和LNP的组合物的步骤(a)和步骤(b)。过程C的步骤(a)也被称为过程B。
图2是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的体内效力的示例图。在施用通过过程B或过程C制备的mRNA-LNP后6小时和24小时，测量小鼠血清中的人EPO表达。对于通过过程C制备的mRNA-LNP，指示了空LNP的脂质组分。
图3是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的耐受性的示例图。在施用通过过程B或过程C制备的mRNA-LNP后24小时，测量肝酶AST和ALT的水平。对于通过过程C制备的mRNA-LNP，指示了空LNP的脂质组分。
图4A是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的体内效力的示例图。在施用mRNA-LNP后24小时，测量小鼠血清中的人EPO表达。为了比较通过过程B与过程C制备的mRNA-LNP的效力，通过mRNA或脂质的量来调节施用于小鼠的mRNA-LNP的量。图4B是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的耐受性的示例性图。为了比较通过过程B与过程C制备的mRNA-LNP的耐受性，通过mRNA或脂质的量来调节施用于小鼠的mRNA-LNP的量。图5A是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的体内效力的示例图。在以相当的mRNA和脂质的量施用mRNA LNP后，测量小鼠血清中的人OTC表达。图5B是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的体内耐受性的示例图。在以相当的mRNA和脂质的量施用通过过程B或过程C制备的mRNA-LNP后，测量肝酶AST和ALT的水平。
图6A是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP在相当的脂质:mRNA比率下的体内效力的示例图。还提供了通过具有从图1的步骤(a)或步骤(b)中衍生的可互换脂质:mRNA含量的制剂获得等效的累积脂质:mRNA比(N/P比率)的过程C衍生的LNP之间的比较。图6B是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的体内耐受性的示例图。在以相当的mRNA和脂质的量施用通过过程B或过程C制备的mRNA-LNP后，测量肝酶AST和ALT的水平。
图7A是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP在相当的脂质∶mRNA比率下的体内效力的示例图。在以相当的mRNA和总脂质的量施用mRNA LNP(包含通过过程B或过程C制备的作为阳离子脂质的cHSe，或包封mRNA的LNP与作为阳离子脂质的cHSe和通过过程C制备的作为阳离子脂质的ML-2的组合)后，测量小鼠血清中的人OTC表达。图7B是比较通过过程B和过程C制备的mRNA-LNP的体内耐受性的示例图。在以相当的mRNA和总脂质的量施用mRNA-LNP(包含通过过程B或过程C制备的作为阳离子脂质的cHSe，或包封mRNA的LNP与作为阳离子脂质的cHSe和通过过程C制备的作为阳离子脂质的ML-2的组合)后，测量肝酶AST和ALT的水平。
定义
为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义阐述在整个本说明书中。本文所引用的用于描述本发明的背景技术并提供关于其实施的附加细节的出版物和其他参考材料以引用方式并入本文。
氨基酸如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中通常发现的二十种标准I-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代物。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或用其他化学基团取代来修饰，这些化学基团可以改变肽的循环半衰期，而不会对其活性产生不利影响。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或多种翻译后修饰，诸如与一种或多种化学实体(例如，甲基基团、乙酸根基团、乙酰基基团、磷酸根基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。无论所述术语是指游离氨基酸还是肽的残基，从使用所述术语的上下文将是显而易见的。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。
大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非所述数字超过可能值的100％)。
组合：如本文所用，术语“组合”与混合或掺混可互换使用。组合是指将具有不同性质的离散LNP颗粒组合在同一溶液中，例如组合mRNA-LNP和空LNP，以获得mRNA-LNP组合物。在一些实施方案中，两种LNP的组合以被组合的组分的特定比率执行。在一些实施方案中，从组合获得的所得组合物具有不同于其组分中的任何一者或两者的特性。
递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mRNA的递送涵盖其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质表达且分泌到患者的循环系统(例如，血清)内，并且全身分布且被其他组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。在一些实施方案中，递送是肺部递送，例如，包括雾化。
功效：如本文所用，术语“功效”或语法等同形式是指与编码相关蛋白质或肽的mRNA的递送有关的生物学相关终点的改进。在一些实施方案中，生物学终点是在施用之后的某些时间点针对氯化铵攻击的保护。
包封：如本文所用，术语“包封”或其语法等同项是指将核酸分子限制在纳米颗粒内的过程。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽，将多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)组装成完整蛋白质(例如，抗体)，和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如，抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及其语法等同项可互换使用。
改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照受试者(或多个对照受试者)的测量值的值。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。
杂质：如本文使用的，术语“杂质”是指在限定量的液体、气体或固体内，与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为污染物。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，所述术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)与最初生产时(无论是天然的和/或在实验环境中)与其相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初与其相关联的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过99％。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则所述物质是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。
脂质体：如本文使用的，术语“脂质体”指任何层状、多层或固体纳米颗粒囊泡。通常，如本文使用的，脂质体可通过混合一种或多种脂质或者通过混合一种或多种脂质和聚合物来形成。在一些实施方案中，适于本发明的脂质体含有一种或多种阳离子脂质和任选地一种或多种非阳离子脂质、任选地一种或多种基于胆固醇的脂质和/或任选地一种或多种PEG修饰的脂质。
局部分布或递送：如本文使用的，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等同项是指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mRNA编码的肽或蛋白质(例如酶)在细胞内或伴随有限分泌被翻译且表达，其避免进入患者的循环系统。
信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA二者。mRNA可以含有一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生和任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则mRNA序列的显示方向为5’至3’。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷、2-硫代胞苷、假尿苷和5-甲基胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；改性糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。
N/P比率：如本文所用，术语“N/P比率”是指脂质纳米颗粒中的阳离子脂质中的带正电的分子单元相对于包封于脂质纳米颗粒内的mRNA中的带负电的分子单元的摩尔比。因此，N/P比率可以计算为脂质纳米颗粒中阳离子脂质的摩尔数相对于包封在所述脂质纳米颗粒内的mRNA中磷酸基团的摩尔数的比率。在一些实施方案中，其中阳离子脂质分子包括超过一个可电离基团，诸如超过一个胺基，N/P比率可以计算为脂质纳米颗粒中阳离子脂质的可电离基团的摩尔数例(例如，诸如胺基的数目)相对于包封在所述脂质纳米颗粒内的mRNA中磷酸基团的摩尔数的比率。
核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上是指掺入或可以掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是由磷酸二酯键掺入或可以由磷酸二酯键掺入多核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯骨架以外的类似物。例如，所谓的“肽核酸”被认为在本发明的范围内，所述术语是本领域已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并形式和/或编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列和/或RNA可包括内含子。核酸可从天然来源纯化，使用重组表达系统产生且任选地纯化，化学合成等。适当时，例如在化学合成的分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另外指明，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；插入型碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中，本发明特别涉及“未修饰的核酸”，它意指未经化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，核苷酸T和U在序列描述中可互换使用。
患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后形式。
药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与合理的受益/风险比相称在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的物质。
药学上可接受的盐：药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中详细描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是氨基与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用所属领域中所用的其他方法(诸如离子交换)形成的盐。其他药学可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括当适当时使用抗衡离子，诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。其他药学上可接受的盐包括由胺的季铵化形成的盐，所述季铵化使用适当的亲电试剂例如卤代烷进行，以形成季铵化烷基化氨基盐。
效力：如本文所用，术语“效力”或语法等同项是指mRNA编码的蛋白质或肽的表达水平和/或所得生物效应。
盐：如本文所用，术语“盐”是指确实由或可能由酸与碱之间的中和反应产生的离子化合物。
全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等同形式是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统(例如血流)完成。与“局部分布或递送”的定义形成对比。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，所述患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有或易患有疾病或病症，但是可以显示出或可以不显示出所述疾病或病症的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。
靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。
治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、病症和/或病况或对疾病、病症和/或病况敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、病症和/或病况的症状发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。
治疗指数：如本文所用，“治疗指数”是药物在血液中变得有毒时的浓度与其有效时的浓度的比率。治疗指数越大，药物越安全。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用于使特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病有关的病理的风险，可以向未表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者施用治疗。
产率：如本文所用，术语“产率”是指与作为起始材料的总mRNA相比，包封后回收的mRNA的百分比。在一些实施方案中，术语“回收率”与术语“产率”可互换使用。
具体实施方式
本发明提供了一种用于制造包封在脂质纳米颗粒(LNP)调配物中的mRNA以用于产生mRNA治疗组合物的改进方法，使得所述组合物在体内诱导mRNA编码的蛋白质的显著更高表达，而不引起应激的肝酶生物标记物的升高。在一些实施方案中，本发明提供了包含LNP和mRNA的组合物，所述组合物在施用于受试者时在体内诱导显著更高水平的mRNA表达，而不改变受试者的耐受性或应激水平。通过肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)的升高来确定耐受性或应激。在一些实施方案中，特定调配物提供了制造优点，诸如制造过程的容易性，例如，利用常见预先形成的LNP储备溶液等。
包封mRNA的脂质体的形成–过程C
本申请至少部分基于令人惊讶的发现，即当通过将步骤(a)中的mRNA与预先形成的空LNP混合而形成的mRNA-LNP与步骤(b)中的预先形成的LNP进一步组合以形成mRNA-LNP组合物时，所得组合物的效力与步骤(a)的mRNA-LNP相比显著增加。这尤其令人惊讶，因为即使在预先形成的LNP是空的(即，不包含mRNA)并且包含与mRNA-LNP相同的脂质组分时，也观察到效力增加。类似地，当预先形成的LNP包封编码独特且不相关的蛋白质的mRNA时，观察到所得组合物的更高效力。此外，即使在预先形成的LNP仅包含已知是多核苷酸转染的弱促进剂的中性脂质的情况下，也观察到mRNA编码的蛋白质的表达增加。
本申请基于另一个令人惊讶的发现，即来自步骤(b)的所得组合物不会比步骤(a)的mRNA-LNP引起受试者耐受性或应激水平的更大改变。通过测量肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的表达的变化，可以证明受试者耐受性的改变或应激水平的增加。通常，AST和/或ALT水平升高指示组织损伤和肝损伤，并且常规测量以确定药物相关的耐受性。基于上述本发明的方法，所得mRNA-LNP组合物包含比步骤(a)中处理的mRNA-LNP更高比例的脂质体(或脂质)。尽管现有技术报道显示脂质体的肝脏耐受性较低，但通过本发明方法生成的mRNA-LNP组合物实际上显示出较高的肝脏耐受性。通过本发明的方法生成的mRNA-LNP组合物不会引起小鼠中AST或ALT的改变增加。因此，鉴于现有的知识，观察到的结果是出乎意料的。
因此，在不损害体内耐受性的情况下可实现增加的mRNA-LNP组合物的效力的事实是本发明方法在治疗设计方面的突出优点。
本发明的这个方面允许至少两个显著优点，(i)提供每剂量的mRNA治疗组合物中较低量的mRNA，或降低给药频率，以实现相同的生物效应，从而增加组合物的治疗指数；(ii)开发一个简单、灵活、可扩展和/或高通量的制造方法，其中一个或多个预先形成的LNP可以批量制备，并且可用于多个混合和组合步骤以实现如本发明中所述的所需调配物。
本发明提供了一种方法，其中通过将mRNA与预先形成的空LNP混合而制备的mRNA-LNP与预先形成的LNP进一步组合，其中本发明的所得mRNA-LNP组合物导致mRNA编码的蛋白质的体内表达增加。在一些方面，此方法是制造方法，所述方法包括以下步骤：(a)在允许形成mRNA-LNP的条件下将预先形成的空LNP与mRNA混合；(b)将步骤(a)中形成的mRNA-LNP与预先形成的LNP组合，从而制造包含包封mRNA的脂质纳米颗粒的组合物。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒至少包含阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以包含中性脂质，具有或不具有阳离子脂质。
在一些实施方案中，mRNA编码蛋白质或肽。
在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP是空LNP。在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP包含mRNA。在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP包含编码蛋白质或肽的mRNA。在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP包含与步骤(a)中形成的mRNA-LNP中相同的编码相同蛋白质或多肽的mRNA。在一些实施方案中，步骤(b)中的预先形成的LNP包含编码与步骤(a)中形成的mRNA-LNP不同的蛋白质或多肽的不同mRNA。
在一些实施方案中，步骤(a)中的空LNP和步骤(b)中的预先形成的LNP是不同的异质脂质纳米颗粒。例如，步骤(a)中的空LNP可以包含阳离子脂质HGT-5003(也称为CCBene)，并且步骤(b)中的预先形成的LNP包含阳离子脂质ICE。在另一个实例中，步骤(a)中的空LNP可以包含阳离子脂质ICE，并且步骤(b)中的预先形成的LNP包含阳离子脂质DOTAP。在又一个实例中，步骤(a)中的空LNP可以包含阳离子脂质HGT-4001，并且步骤(b)中的预先形成的LNP包含阳离子脂质ckk-E12(也称为ML2)。适用于LNP的各种脂质和用于生成所述脂质的方法在以下相应章节中描述，并且本文涵盖形成LNP的脂质的任何组合。
在一个实施方案中，步骤(b)中生成的mRNA-LNP组合物可以包含第一脂质纳米颗粒和第二脂质纳米颗粒；其中第一脂质纳米颗粒和第二脂质纳米颗粒具有相同的脂质组合物，其中至少一些第一脂质纳米颗粒包含mRNA。在一个实施方案中，步骤(b)中生成的mRNA-LNP组合物可以包含第一脂质纳米颗粒和第二脂质纳米颗粒；其中第一脂质纳米颗粒和第二脂质纳米颗粒具有不同的脂质组合物。例如，mRNA-LNP组合物可以包含含有阳离子脂质ICE的第一脂质纳米颗粒和含有阳离子脂质DOTAP的第二脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，在步骤(b)中生成的mRNA-LNP组合物可以包含含有阳离子脂质C12-200的第一脂质纳米颗粒和含有阳离子脂质DLinKC2DMA的第二脂质纳米颗粒。因此，本文涵盖适用于产生如下文相应章节中所述的LNP的各种脂质的任何组合。
在一些实施方案中，步骤(a)的空LNP或步骤(b)的预先形成LNP都不包含阳离子脂质。在一些实施方案中，空LNP或预先形成的LNP包含中性脂质和/或PEG修饰的脂质。
包封过程
如本文所用，用于形成mRNA负载的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的方法与术语“mRNA包封”或其语法变体可互换使用。在一些实施例中，通过将mRNA溶液与脂质溶液混合来形成mRNA-LNP，其中在混合之前，将mRNA溶液和/或脂质溶液加热至高于环境温度的预定温度(参见已公布的美国申请第US 2011/0244026号，其公开内容在此通过引用整体并入)。
通常，任何所需脂质可以以适用于形成mRNA-LNP的任何比率混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和/或PEG化的脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种PEG化的脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括一种或多种中性脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种PEG化的脂质。
在一些实施方案中，将mRNA溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液混合到溶液中，使得mRNA变成被包封在脂质纳米颗粒中。这种溶液也被称为调配物或包封溶液。通过将预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA混合来包封mRNA的方法先前已描述于已公布的美国申请第US 2018/0153822号中，所述申请整体并入。
合适的调配物或包封溶液包括溶剂，诸如乙醇。例如，合适的调配物或包封溶液包括约10％乙醇、约15％乙醇、约20％乙醇、约25％乙醇、约30％乙醇、约35％乙醇或约40％乙醇。在一些实施方案中，合适的调配物或包封溶液包括溶剂，诸如异丙醇。例如，合适的调配物或包封溶液包括约10％异丙醇、约15％异丙醇、约20％异丙醇、约25％异丙醇、约30％异丙醇、约35％异丙醇或约40％异丙醇。
在一些实施方案中，合适的调配物或包封溶液包括溶剂，诸如二甲基亚砜。例如，合适的调配物或包封溶液包括约10％二甲基亚砜、约15％二甲基亚砜、约20％二甲基亚砜、约25％二甲基亚砜、约30％二甲基亚砜、约35％二甲基亚砜或约40％二甲基亚砜。
在一些实施方案中，合适的调配物或包封溶液也可以含有缓冲剂或盐。示例性的缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。示例性的盐可以包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，可以将用于制备这种新型纳米颗粒调配物的空的预先形成的脂质纳米颗粒调配物在10％海藻糖溶液中稳定地冷冻。
在一些实施方案中，在添加mRNA期间不存在乙醇、柠檬酸盐缓冲液和其他去稳定剂，并且因此所述调配物不需要任何进一步的下游加工。在一些实施方案中，通过此新颖方法制备的脂质纳米颗粒调配物由海藻糖溶液中的预先形成的脂质纳米颗粒组成。缺乏去稳定剂和海藻糖溶液的稳定性增加了按比例增加调配物和生产包封mRNA的脂质纳米颗粒的容易度。
在一些实施方案中，通过将溶解在乙醇中的脂质与水性溶液(脂质溶液)混合来形成空的预先形成的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG脂质。在一些实施方案中，脂质还含有一种或多种胆固醇脂质。在一些实施方案中，脂质存在于乙醇储备溶液中。通过将那些脂质混合而形成预先形成的脂质纳米颗粒。通常，在一些实施方案中，将含有溶解的脂质的脂质溶液和水性溶液或缓冲溶液混合到溶液中，使得脂质可以形成没有mRNA的纳米颗粒(即空的预先形成的脂质纳米颗粒)。
脂质溶液
根据本发明，脂质溶液含有适用于形成用于包封mRNA的脂质纳米颗粒的脂质混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液是基于乙醇的。例如，合适的脂质溶液可以含有溶解在纯乙醇(即，100％乙醇)中的期望脂质的混合物。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于异丙醇的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于二甲基亚砜的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是合适溶剂(包括但不限于乙醇、异丙醇和二甲基亚砜)的混合物。
合适的脂质溶液可以含有各种浓度的所需脂质的混合物。例如，合适的脂质溶液可以含有总浓度为约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或100mg/ml的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以含有总浓度在约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml或1.0-5mg/ml范围内的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以含有总浓度为至多约100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml或10mg/ml的所需脂质的混合物。
任何所需脂质可以任何适用于包封mRNA的比率混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和/或PEG化的脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种PEG化的脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括一种或多种中性脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种PEG化的脂质。
在一些实施方案中，可以将用于制备本发明的纳米颗粒调配物的空的(即，不含mRNA的)预先形成的脂质纳米颗粒调配物在约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的海藻糖溶液中稳定地冷冻。在一些实施方案中，将mRNA添加至空的脂质纳米颗粒中可以产生不需要任何下游纯化或加工并且可以以冷冻形式稳定地储存的最终调配物。
mRNA溶液
可以在溶液中提供mRNA以与脂质溶液混合，使得可以将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。合适的mRNA溶液可以是含有待以低于1mg/ml的各种浓度包封的mRNA的任何水性溶液。例如，合适的mRNA溶液可以含有浓度为或小于约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml的mRNA。
通常，合适的mRNA溶液还可以含有缓冲剂和/或盐。一般来讲，缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度可以在约0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9至12mM的范围内。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
示例性的盐可包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，mRNA溶液中盐的合适浓度可以在约1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM的范围内。在合适的mRNA溶液中的盐浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。
在一些实施方案中，合适的mRNA溶液可以具有在约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5.、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5范围内的pH。在一些实施方案中，合适的mRNA溶液可以具有等于或不大于约3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3和6.5的pH。
可以使用各种方法来制备适用于本发明的mRNA溶液。在一些实施方案中，可以将mRNA直接溶解在本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可以通过在与脂质溶液混合以进行包封之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液。在一些实施方案中，可以通过在与脂质溶液混合以进行包封之前立即将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液。在一些实施方案中，合适的mRNA储备溶液可以在水中含有浓度为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、or 1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml的mRNA。
在一些实施方案中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性的泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。
通常，以比mRNA储备溶液的流速更大的流速混合缓冲溶液。例如，可以比mRNA储备溶液的流速大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的流速混合缓冲溶液。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：首先通过将柠檬酸盐缓冲液与mRNA储备溶液混合来产生mRNA溶液。在某些实施方案中，合适的柠檬酸盐缓冲液含有约10mM柠檬酸盐、约150mM NaCl、pH为约4.5。在一些实施方案中，合适的mRNA储备溶液含有浓度为或大于约1mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml或约100mg/ml的mRNA。
在一些实施方案中，以在约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟或4800-6000ml/分钟之间范围内的流速混合柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，以约220ml/分钟、约600ml/分钟、约1200ml/分钟、约2400ml/分钟、约3600ml/分钟、约4800ml/分钟或约6000ml/分钟的流速混合柠檬酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，以在约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟或约480-600ml/分钟之间范围内的流速混合mRNA储备溶液。在一些实施方案中，以约20ml/分钟、约40ml/分钟、约60ml/分钟、约80ml/分钟、约100ml/分钟、约200ml/分钟、约300ml/分钟、约400ml/分钟、约500ml/分钟或约600ml/分钟的流速混合mRNA储备溶液。
在一些实施方案中，以在约100-6000ml/分钟(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟或60-420ml/分钟)之间范围内的流速混合缓冲溶液。在一些实施方案中，以为或大于约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟或6000ml/分钟的流速混合缓冲溶液。
在一些实施方案中，以在约10-600ml/分钟(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟或约480-600ml/分钟)之间范围内的流速混合mRNA储备溶液。在一些实施方案中，以为或大于约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟或600ml/分钟的流速混合mRNA储备溶液。
在一些实施方案中，使用泵系统将预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA混合。在一些实施方案中，泵系统包含无脉冲流量泵。在一些实施方案中，泵系统是齿轮泵。在一些实施方案中，合适的泵是蠕动泵。在一些实施方案中，合适的泵是离心泵。在一些实施方案中，使用泵系统的方法是大规模进行的。例如，在一些实施方案中，所述方法包括使用如本文所述的泵将至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mg mRNA的溶液与预先形成的脂质纳米颗粒的溶液混合，以产生包封在脂质纳米颗粒中的mRNA。在一些实施方案中，将mRNA与预先形成的脂质纳米颗粒混合的过程提供了根据本发明的组合物，所述组合物含有至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mg的包封的mRNA。
在一些实施方案中，以在约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟或约850-1000ml/分钟的范围内的流速混合包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液。在一些实施方案中，以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟或约1000ml/分钟的流速混合包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液。
在一些实施方案中，将mRNA以在约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟或约850-1000ml/分钟范围内的流速混合在溶液中。在一些实施方案中，将mRNA以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟或约1000ml/分钟的流速混合在溶液中。
在一些实施方案中，使用泵系统进行将包封mRNA的脂质纳米颗粒与预先形成的脂质颗粒组合的步骤。可使用泵进行此类组合。在一些实施方案中，以在约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟或约850-1000ml/分钟范围内的流速将包封mRNA的脂质纳米颗粒与预先形成的脂质纳米颗粒混合。在一些实施方案中，将mRNA以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟或约1000ml/分钟的流速混合在溶液中。
在一些实施方案中，在不存在任何泵的情况下进行脂质纳米颗粒和mRNA的混合。
在一些实施方案中，根据本发明的方法包括将一种或多种溶液加热(即，将来自热源的热量施加至溶液)至高于环境温度的温度(或维持在高于环境温度的温度下)的步骤，所述一种或多种溶液是包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的混合溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前加热mRNA溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间加热以下中的一种或多种：包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后加热脂质纳米颗粒包封的mRNA的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液被加热到的温度(或一种或多种溶液所维持的温度)为或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些实施方案中，将一种或多种溶液加热到的温度在约25-70℃、约30-70℃、约35-70℃、约40-70℃、约45-70℃、约50-70℃或约60-70℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液被加热到的高于环境温度的温度为约65℃。
在一些实施方案中，根据本发明的方法包括将包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的混合溶液中的一种或多种维持在环境温度下(即，不将来自热源的热量施加至溶液)。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前将mRNA溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者维持在环境温度下的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间将以下中的一种或多种维持在环境温度下：包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后将脂质纳米颗粒包封的mRNA维持在环境温度下的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为或小于约35℃、30℃、25℃、20℃或16℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所述维持的环境温度在约15-35℃、约15-30℃、约15-25℃、约15-20℃、约20-35℃、约25-35℃、约30-35℃、约20-30℃、约25-30℃或约20-25℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为20-25℃。
在一些实施方案中，根据本发明的方法包括在环境温度下进行以下步骤：将包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液和包含mRNA的溶液混合以形成包封mRNA的脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化的纳米颗粒具有小于约150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒都具有小于150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的尺寸。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在50-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在50-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在80-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在80-150nm范围内的尺寸。
在一些实施方案中，根据本发明的方法导致大于约90％、95％、96％、97％、98％或99％的包封率。在一些实施方案中，根据本发明的方法导致大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的mRNA回收率。
在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20的比率组合。将脂质纳米颗粒组合的方法如上文所述用于将脂质纳米颗粒与mRNA混合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以20:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以19:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以15:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以10:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以9:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以8:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以7:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以6:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以5:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以4:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以3:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以2:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:1的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:2的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:3的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:4的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:5的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:6的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:7的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:8的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:9的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:10的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:12的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:15的比率组合。在一些实施方案中，包封mRNA的脂质纳米颗粒与方法的步骤(b)中的预先形成的脂质颗粒以1:20的比率组合。
纯化
在一些实施方案中，纯化和/或浓缩空的预先形成的脂质纳米颗粒或mRNA-LNP。可以使用各种纯化方法。在一些实施方案中，通过切向流过滤(TFF)方法纯化脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，通过基于重力的正向流过滤(NFF)纯化脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，通过任何其他合适的过滤方法纯化脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，通过离心纯化脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，通过色谱方法纯化脂质纳米颗粒。
递送媒介物
根据本发明，如本文所述的编码蛋白质或肽(例如，蛋白质或肽的全长、片段或部分)的mRNA可以作为裸RNA(未包装)或通过递送媒介物递送。如本文中所用，术语“递送媒介物”、“转运媒介物”、“纳米颗粒”或语法等同项可互换使用。
递送媒介物可以与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合调配，或在药物组合物中调配，在所述药物组合物中所述递送媒介物与合适的赋形剂混合。用于调配和施用药物的技术可见于“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”MackPublishing Co.,Easton,Pa.，最新版。特定的递送媒介物根据其促进将核酸转染至靶细胞的能力来选择。
在一些实施方案中，编码至少一种蛋白质或肽的mRNA可以通过单一递送媒介物递送。在一些实施方案中，编码至少一种蛋白质或肽的mRNA可以通过一种或多种递送媒介物递送，每种递送媒介物具有不同的组成。在一些实施方案中，一种或多种mRNA被包封于相同的脂质纳米颗粒内。
在一些实施方案中，所述一种或多种mRNA被包封于单独的脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是空的。
根据各种实施方案，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的载体，例如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成衍生的外来体两者、天然的、合成和半合成板层体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、淀粉基递送系统、胶束、乳液、类脂质体(noisome)、多结构域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)、干粉制剂、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽和其他载体标签。还考虑使用生物纳米胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装件作为合适的转移媒介物。(Hum.Gene Ther.2008年9月；19(9):887-95)。
脂质体递送媒介物
在一些实施方案中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒。如本文所用，脂质体递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)通常被表征为具有内部水空间的微观囊泡，所述内部水空间通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，诸如包含空间上分开的亲水性和疏水性结构域的合成或天然来源的脂质(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性物质(例如，聚合物囊泡、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，脂质体递送媒介物通常用于将所需核酸(例如，mRNA)转运至靶细胞或组织。在一些实施方案中，纳米颗粒递送媒介物是脂质体。在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质或一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质体包含不超过四种不同的脂质组分。在一些实施方案中，脂质体包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是脂质体，其包含四种不同的脂质组分，即阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇和PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与PEG修饰的脂质的摩尔比分别为约30-60:25-35:20-30:1-15。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是包含三种不同脂质组分的脂质体，即阳离子脂质(通常是基于甾醇的阳离子脂质)、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质的摩尔比分别为大约60:35:5。
在一些实施方案中，非阳离子脂质是DOPE。在一些实施方案中，非阳离子脂质是DEPE。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DMG-PEG2K。
阳离子脂质
如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定pH(诸如生理pH)下具有净正电荷的多种脂质物质中的任何一种。
用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO 2010/144740中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003790277450000391
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/149140中所述的可电离阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000401
或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的不同饱和或不饱和的C1-C20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20酰基；其中L1和L2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的C1-C30烷基、任选地取代的不同不饱和的C1-C30烯基和任选地取代的C1-C30炔基；其中m和o各自独立地选自由以下项组成的组：零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003790277450000402
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(“HGT5001”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003790277450000411
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：
Figure BDA0003790277450000412
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开WO2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000413
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118725中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000421
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118724中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000422
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括具有通式14,25-二-十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，所述专利公开中的每个通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000431
或其药学上可接受的盐，其中RL的每个实例独立地是任选地取代的C6-C40烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000432
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000441
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000442
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000451
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/184256中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000452
或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立为1至6；每个RA独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个RB独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶标23”：
Figure BDA0003790277450000461
(靶标23)
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/004202中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000462
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000471
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000472
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，所述临时专利申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000473
或其药学上可接受的盐，其中每个R1和R2独立地是H或C1-C6脂族；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个A独立地是共价键或亚芳基；每个L1独立地是酯、硫酯、二硫键或酸酐基团；每个L2独立地是C2-C10脂族；每个X1独立地是H或OH；以及每个R3独立地是C6-C20脂族。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000481
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000482
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000483
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人,,Nature Communications(2014)5:4277中描述的阳离子脂质，其通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000491
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/199952中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000492
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000493
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000501
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000502
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000503
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000504
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000511
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000512
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000513
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000514
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000521
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000522
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000523
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/004143中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000531
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000532
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000533
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000534
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000535
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000541
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000542
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000543
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000544
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000551
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000552
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000553
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000561
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000562
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000563
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000564
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000571
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/075531中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000572
或其药学上可接受的盐，其中L1或L2中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-；并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；Ra是H或C1-C12烷基；R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5 C(＝O)R4；R4是C1-C12烷基；R5是H或C1-C6烷基；并且x为0、1或2。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/117528中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000581
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000582
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000583
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/049245中所述的阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：
Figure BDA0003790277450000591
及其药学上可接受的盐。对于这四个通式中的任一者，R4独立地选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR；Q选自由以下项组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000592
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000601
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000602
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000603
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，所述专利公开中的每个通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000604
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000611
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000612
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000613
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2012/170889中所述的可切割阳离子脂质，所述专利公开通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：
Figure BDA0003790277450000614
其中R1选自由以下项组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中R2选自由以下两个通式之一组成的组：
Figure BDA0003790277450000621
并且其中R3和R4各自独立地选自由以下项组成的组：任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4001”：
Figure BDA0003790277450000622
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质，“HGT4002”：
Figure BDA0003790277450000623
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质，“HGT4003”：
Figure BDA0003790277450000631
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质，“HGT4004”：
Figure BDA0003790277450000632
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4005”：
Figure BDA0003790277450000633
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括可裂解的阳离子脂质，如国际申请第PCT/US2019/032522号中所述并通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为美国临时申请第PCT/US2019/032522号中所述的通式中的任一者或结构(1a)–(21a)和(1b)–(21b)和(22)–(237)中的任一者。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I')的结构的阳离子脂质，
Figure BDA0003790277450000634
其中：
RX独立地为-H、-L1-R1或–L5A-L5B-B’；
L1、L2和L3中的每个独立地为共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NRL-；
每个L4A和L5A独立地为-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NRL-；
每个L4B和L5B独立地为C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基或C2-C20亚炔基；
每个B和B’为NR4R5或5元至10元含氮的杂芳基；
每个R1、R2和R3独立地为C6-C30烷基、C6-C30烯基或C6-C30炔基；
每个R4和R5独立地为氢、C1-C10烷基；C2-C10烯基；或C2-C10炔基；并且
每个RL独立地为氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基。
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，其为国际申请第PCT/US2019/032522号的化合物(139)，具有以下化合物结构：
Figure BDA0003790277450000641
(“18:1碳尾核糖脂质”)。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，所述专利通过引用并入本文)。适于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸二-十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油烯基氧基-N-[2-(精胺-羧胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(“DOSPA”)(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。
适用于本发明的组合物和方法的额外示例性阳离子脂质还包括：1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基1-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰氧基-N,N-二甲基丙基胺(“DLinDAP”)；1,2-N,N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(“DLin-K-XTC2-DMA”)；和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见WO 2010/042877，所述专利通过引用并入本文；Semple等人，Nature Biotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.,等人,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.,等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。
在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基1-4-二甲基氨基乙基1-[1,3]-二氧戊环(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以mol％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以mol％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。
非阳离子/辅助脂质
在一些实施方案中，脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH诸如生理pH下携带净负电荷的多种脂质物质中的任何一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或它们的混合物。
在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，即在调配和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。
在一些实施方案中，此类非阳离子脂质可以单独使用，但是优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。
在一些实施方案中，非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的摩尔比(mol％)存在。在一些实施方案中，总非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的摩尔比(摩尔％)存在。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以大于约5摩尔％、大于约10摩尔％、大于约20摩尔％、大于约30摩尔％或大于约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以大于约5摩尔％、大于约10摩尔％、大于约20摩尔％、大于约30摩尔％或大于约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比不超过约5摩尔％、不超过约10摩尔％、不超过约20摩尔％、不超过约30摩尔％或不超过约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以不超过约5摩尔％、不超过约10摩尔％、不超过约20摩尔％、不超过约30摩尔％或不超过约40摩尔％。
在一些实施方案中，非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的重量比(重量％)存在。在一些实施方案中，总非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的重量比(重量％)存在。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以大于约5重量％、大于约10重量％、大于约20重量％、大于约30重量％或大于约40重量％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以大于约5重量％、大于约10重量％、大于约20重量％、大于约30重量％或大于约40重量％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比不超过约5重量％、不超过约10重量％、不超过约20重量％、不超过约30重量％或不超过约40重量％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以不超过约5重量％、不超过约10重量％、不超过约20重量％、不超过约30重量％或不超过约40重量％。
基于胆固醇的脂质
在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基羧酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油酰胺基-丙基)哌嗪(Gao,等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利第5,744,335号)，或咪唑胆固醇酯(ICE)，其具有以下结构，
Figure BDA0003790277450000691
在实施方案中，基于胆固醇的脂质是胆固醇。
在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约1％至约30％或约5％至约20％的摩尔比(mol％)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以大于约5摩尔％、大于约10摩尔％、大于约20摩尔％、大于约30摩尔％或大于约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以不超过约5摩尔％、不超过约10摩尔％、不超过约20摩尔％、不超过约30摩尔％或不超过约40摩尔％。
在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可以以脂质体中存在的总脂质的约1％至约30％或约5％至约20％的重量比(wt％)存在。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以大于约5重量％、大于约10重量％、大于约20重量％、大于约30重量％或大于约40重量％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以不超过约5重量％、不超过约10重量％、不超过约20重量％、不超过约30重量％或不超过约40重量％。
PEG修饰的脂质
在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种PEG化的脂质。
例如，本发明还设想了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生化的脂质(诸如，衍生化的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺))单独或优选地与其他脂质调配物(它包含转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒))一起组合的使用。
设想的PEG修饰的脂质包括但不限于长度为至多5kDa的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条C6-C20长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的或PEG化的脂质是PEG化的胆固醇或PEG-2K。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且还可以提供延长循环寿命和增加脂质-核酸组合物至靶组织的递送的手段(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或可以选择其以在体内迅速地从调配物中交换出来(参见美国专利第5,885,613号)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。
本发明的PEG修饰的磷脂和衍生化的脂质可以按摩尔比计占脂质体转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％、或约2％。在一些实施方案中，一种或多种PEG修饰的脂质占以摩尔比计总脂质的约4％。在一些实施方案中，一种或多种PEG修饰的脂质占以摩尔比计总脂质的约5％。在一些实施方案中，一种或多种PEG修饰的脂质占以摩尔比计总脂质的约6％。
两亲性嵌段共聚物
在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含两亲嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆(poloxamer))。
各种两亲性嵌段共聚物可用于实践本发明。在一些实施方案中，两亲性嵌段共聚物也称为表面活性剂或非离子表面活性剂。
在一些实施方案中，适用于本发明的两亲聚合物选自泊洛沙姆
Figure BDA0003790277450000711
泊洛沙明(poloxamine)
Figure BDA0003790277450000712
聚氧乙烯乙二醇脱水山梨醇烷基酯(聚山梨醇酯)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
泊洛沙姆
在一些实施方案中，合适的两亲性聚合物为泊洛沙姆。例如，合适的泊洛沙姆具有以下结构：
Figure BDA0003790277450000713
其中a为10与150之间的整数，并且b为20与60之间的整数。例如，a为约12并且b为约20，或者a为约80并且b为约27，或者a为约64并且b为约37，或者a为约141并且b为约44，或者a为约101并且b为约56。
在一些实施方案中，适于本发明的泊洛沙姆具有约10至约150个环氧乙烷单元。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约10至约100个环氧乙烷单元。
在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆84。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆101。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆105。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆108。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆122。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆123。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆124。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆181。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆182。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆183。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆184。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆185。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆188。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆212。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆215。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆217。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆231。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆234。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆235。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆237。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆238。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆282。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆284。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆288。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆304。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆331。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆333。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆334。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆335。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆338。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆401。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆402。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆403。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为泊洛沙姆407。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆为它们的组合。
在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约4,000g/mol至约20,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约1,000g/mol至约50,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约1,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约2,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约3,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约4,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约5,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约6,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约7,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约8,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约9,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约10,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约20,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约25,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约30,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约40,000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆具有约50,000g/mol的平均分子量。
其他两亲性聚合物
在一些实施方案中，两亲聚合物是泊洛沙胺，例如tetronic 304或tetronic 904。
在一些实施方案中，两亲性聚合物为聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，诸如具有3kDa、10kDa或29kDa分子量的PVP。
在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚(Brij)、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇以及它们的衍生物。在一些实施方案中，两亲性聚合物为聚山梨醇酯，诸如PS 20。
在一些实施方案中，两亲聚合物为聚乙二醇醚(Brij)、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇或它们的衍生物。
在一些实施方案中，两亲性聚合物为聚乙二醇醚。在一些实施方案中，合适的聚乙二醇醚为式(S-l)的化合物：
Figure BDA0003790277450000741
或其盐或异构体，其中：
t为1与100之间的整数；
R1BRIJ独立地是C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；和任选地，R5PEG的一个或多个亚甲基独立地被以下替换：C3-10碳环亚基、4至10元杂环亚基、C6-10亚芳基、4至-10元杂亚芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NR C(O)N(R)-、-C(O)O--OC(O)-、-OC(O)O--OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O--C(O)S--SC(O)-、-C(＝NRN)-、—C(＝NR)N(R)—、-NRNC(＝NRN)--NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O--OS(O)O--OS(O)2--S(O)2O--OS(O)2O--N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)--N(RN)S(O)N(RN)--OS(O)N(RN)--N(RN)S(O)0--S(O)2--N(RN)S(O)2--S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)--OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-；并且
RN的每个示例独立地是氢、C1-6烷基或氮保护基团。
在一些实施方案中，R1BRIJ是烷基。例如，聚乙二醇醚为式(S-la)的化合物：
Figure BDA0003790277450000742
或其盐或异构体，其中S为1与100之间的整数。
在一些实施方案中，R1BRIJ是烯基。例如，合适的聚乙二醇醚为式(S-lb)的化合物：
Figure BDA0003790277450000743
或其盐或异构体，其中S为1与100之间的整数。
典型地，两亲聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其临界胶束浓度(CMC)的量存在于调配物中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其CMC约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的量存在于混合物中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其CMC约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％的量存在于混合物中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其CMC约55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％的量存在于混合物中。
在一些实施方案中，调配物中存在的两亲聚合物(例如泊洛沙姆)的原始量的小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％在去除后保留。在一些实施方案中，残余量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)在去除后保留在调配物中。如本文所用，残余量意指在组合物中基本上所有物质(本文所述的两亲性硅聚合物，诸如泊洛沙姆)被去除之后的剩余量。残余量可使用已知技术定性或定量地检测。使用已知技术可能无法检测到残余量。
在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于3％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于2.5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于2％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于1.5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于1％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于0.5％(例如，小于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含少于0.01％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物含有残余量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)。如本文所用，残余量意指在组合物中基本上所有物质(本文所述的两亲性硅聚合物，诸如泊洛沙姆)被去除之后的剩余量。残余量可使用已知技术定性或定量地检测。使用已知技术可能无法检测到残余量。
聚合物
在一些实施方案中，使用聚合物作为载体，单独或与包括本文所述的各种脂质的其他载体组合，调配合适的递送媒介物。因此，在一些实施方案中，如本文所用，脂质体递送媒介物还涵盖包含聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PLL、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当存在PEI时，其可为分子量范围为10kDa至40kDa的支化PEI，例如25k Da的支化PEI(Sigma#408727)。
根据各种实施方案，包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG修饰的脂质、基于胆固醇的脂质和/或两亲性嵌段共聚物以及这些组分(脂质)彼此的相对摩尔比的选择基于所选择的脂质的特征、预期靶细胞的性质、待递送核酸的特征。额外的考虑因素包括例如，烷基链的饱和度以及所选脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和耐受性。因此，可相应地调节摩尔比。
不同的脂质组分的比率
用于本发明的合适的脂质体可以包含各种比率的本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、PEG修饰的脂质、两亲性嵌段共聚物和/或聚合物中的任一者中的一者或多者。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含五种且不超过五种纳米颗粒的不同组分。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含四种且不超过四种纳米颗粒的不同组分。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含三种且不超过三种纳米颗粒的不同组分。作为非限制性实例，合适的脂质体调配物可以包含选自以下的组合：cKK-E12(也称为ML2)、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或ICE、DOPE和DMG-PEG2K。
在多个实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)以摩尔比计占脂质体的约30％-60％(例如，约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)的百分比以摩尔比计等于或大于脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。
在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率可以分别地在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与PEG修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:20:10。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与PEG修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:25:5。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与PEG修饰的脂质的比率分别地为大约40:32:25:3。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与PEG修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。
在脂质纳米颗粒包含三种且不超过三种不同脂质组分的实施方案中，总脂质含量的比率(即脂质组分(1):脂质组分(2):脂质组分(3)的比率)可以表示为x:y:z，其中
(y+z)＝100-x。
在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”中的每个表示脂质的三种不同组分的摩尔百分比，并且所述比率是摩尔比。
在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”中的每个表示脂质的三种不同组分的重量百分比，并且所述比率是重量比。
在一些实施方案中，由变量“x”表示的脂质组分(1)是基于甾醇的阳离子脂质。
在一些实施方案中，由变量“y”表示的脂质组分(2)是辅助脂质。
在一些实施方案中，由变量“z”表示的脂质组分(3)是PEG脂质。
在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至10％。
在一些实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，代表脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至10％。
对于具有三种且仅三种不同脂质组分的组合物，变量“x”、“y”和“z”可以是任何组合，只要这三个变量的总和为总脂质含量的100％即可。
mRNA合成
可以根据多种已知方法中的任一种合成根据本发明的mRNA。各种方法描述于已公布的美国申请第US 2018/0258423号中，并且可用于实践本发明，所有这些方法通过引用并入本文。例如，可以经由体外转录(IVT)来合成根据本发明的mRNA。简而言之，IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，所述模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)，DNA酶I，焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而改变。
在一些实施方案中，合适的mRNA序列是编码蛋白质或肽的mRNA序列。在一些实施方案中，针对有效表达人细胞的合适的mRNA序列进行密码子优化。在一些实施方案中，合适的mRNA序列是天然存在的或野生型序列。在一些实施方案中，合适的mRNA序列编码在氨基酸序列中含有一个或多个突变的蛋白质或肽。
本发明可以用于递送各种长度的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、30kb、40kb或50kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-50kb范围内的体外合成的mRNA。
在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mRNA，将DNA模板体外转录。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子，例如T3、T7或SP6启动子，随后是期望mRNA的期望核苷酸序列和终止信号。
核苷酸
根据本发明，各种天然存在的或经修饰的核苷可用于产生mRNA。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然存在的核苷(或未经修饰的核苷酸；例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫尿核苷和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；插入型碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5-N-亚磷酰胺键)。
在一些实施方案中，合适的mRNA可以含有骨架修饰、糖修饰和/或碱基修饰。例如，经修饰的核苷酸可以包括但不限于经修饰的嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，诸如例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、Q核苷、β-D-甘露糖基-Q核苷、怀丁苷和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如，根据美国专利第4,373,071号、美国专利第4,401,796号、美国专利第4,415,732号、美国专利第4,458,066号、美国专利第4,500,707号、美国专利第4,668,777号、美国专利第4,973,679号、美国专利第5,047,524号、美国专利第5,132,418号、美国专利第5,153,319号、美国专利第5,262,530号和第5,700,642号，这些专利的公开内容通过引用整体并入。
在一些实施方案中，mRNA包含一种或多种非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可以包括，例如，5-甲基胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)和/或2-硫代尿苷(“2sU”)。参见，例如，美国专利第8,278,036号或第WO 2011/012316号关于此类残基及其掺入mRNA的讨论。mRNA可以是RNA，其被定义为其中25％的U残基是2-硫代-尿苷且25％的C残基是5-甲基胞苷。使用RNA的教示公开于美国专利公开案US 2012/0195936和国际公开案WO 2011/012316中，其均通过引用整体并入本文。非标准核苷酸残基的存在可使得mRNA比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mRNA更稳定和/或免疫原性更小。在另外的实施方案中，mRNA可以包含一个或多个选自以下的非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶，以及这些修饰和其他核碱基修饰的组合。一些实施方案可以另外包括对呋喃糖环或核碱基的另外的修饰。另外的修饰可以包括，例如，糖修饰或取代(例如，2'-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)中的一者或多者)。在一些实施方案中，RNA可与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰是2'-O-烷基修饰的一些实施方案中，这种修饰可以包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在一些实施方案中，这些修饰中的任一者可以存在于0-100％的核苷酸中——例如，多于0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成核苷酸单独或组合。
在一些实施方案中，mRNA可以包含RNA骨架修饰。通常，骨架修饰是其中RNA中所含核苷酸骨架的磷酸酯被化学修饰的修饰。示例性的骨架修饰通常包括但不限于来自由以下项组成的组的修饰：甲基膦酸酯、甲基磷酸酰胺酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如，胞苷5’-O-(1-硫代磷酸酯))、硼代磷酸酯、带正电荷的胍基等，这意味着用其他阴离子、阳离子或中性基团替换磷酸二酯键。
在一些实施方案中，mRNA可以包含糖修饰。典型的糖修饰是其含有的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自由以下项组成的组的糖修饰：2’-脱氧-2’-氟-寡核糖核苷酸(2’-氟-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸酯、2’-氟-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸酯)、2’-脱氧-2’-脱胺-寡核糖核苷酸(2’-氨基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸酯、2’-氨基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸酯)、2’-O-烷基寡核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-C-烷基寡核糖核苷酸(2’-O-甲基胞苷5’-三磷酸酯、2’-甲基尿苷5’-三磷酸酯)、2’-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2’-阿糖胞苷5’-三磷酸酯、2’-阿糖尿苷5’-三磷酸酯)或叠氮三磷酸酯(2’-叠氮-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸酯、2’-叠氮-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸酯)。
合成后加工
通常，可以在合成后添加5'帽和/或3'尾。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。“尾”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。
通常按如下方式添加5’帽：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)添加到末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；并且然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5’)ppp(5’(A,G(5’)ppp(5’)A和G(5’)ppp(5’)G。额外的帽结构描述于已公布的美国申请第US 2016/0032356号和已公布的美国申请第US 2018/0125989号中，所述申请通过引用并入本文。
通常，尾结构包括poly(A)和/或poly(C)尾。mRNA的3'末端上的poly-A或poly-C尾通常包括分别地至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸或至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，poly A或poly C尾可以分别为约10个至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如，约10个至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500个至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10个至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20个至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸或约20个至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施方案中，尾结构包括具有本文所述的各种长度的poly(A)和poly(C)尾的组合。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的腺苷核苷酸。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的胞嘧啶核苷酸。
如本文所述，5'帽和/或3'尾的添加有助于检测体外合成过程中产生的无效转录物，因为没有加帽和/或加尾，那些过早无效的mRNA转录物的大小可能太小而无法被检测到。因此，在一些实施方案中，在测试mRNA的纯度(例如，存在于mRNA中的无效转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。在一些实施方案中，在如本文所述纯化mRNA之前将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。在其他实施方案中，在如本文所述纯化mRNA之后将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。
根据本发明合成的mRNA无需进一步纯化即可使用。具体而言，根据本发明合成的mRNA可以在不存在除去短聚体的步骤的情况下使用。在一些实施方案中，可以进一步纯化根据本发明合成的mRNA。可以使用各种方法来纯化根据本发明合成的mRNA。例如，可以使用离心、过滤和/或色谱法来进行mRNA的纯化。在一些实施方案中，合成的mRNA通过乙醇沉淀或过滤或色谱、或者凝胶纯化或任何其他合适的方式来纯化。在一些实施方案中，mRNA通过HPLC纯化。在一些实施方案中，mRNA在本领域的技术人员熟知的标准苯酚:氯仿:异戊醇溶液中提取。在一些实施方案中，mRNA使用切向流过滤来纯化。合适的纯化方法包括描述于以下中的那些：已公布的美国申请第US 2016/0040154号、已公布的美国申请第US 2015/0376220号、已公布的美国申请第US 2018/0251755号、已公布的美国申请第US 2018/0251754号、2018年11月8日提交的美国临时申请第62/757,612号和2019年8月26日提交的美国临时申请第62/891,781号，所有这些申请均通过引用并入本文并可用于实践本发明。
在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之前纯化。在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之后纯化。在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之前和之后纯化。
在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过离心纯化。
在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过过滤纯化。
在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过切向流过滤(TFF)纯化。
在一些实施方案中，mRNA在加帽和加尾之前或之后或者在加帽和加尾之前和之后都通过色谱纯化。
对纯化的mRNA的表征
本文所述的mRNA组合物基本上不含污染物，包含短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残余质粒DNA、残余体外转录酶、残余溶剂和/或残余盐。
本文所述的mRNA组合物具有约60％至约100％之间的纯度。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约60％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约65％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约70％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约75％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约80％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约85％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约90％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约91％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约92％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约93％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约94％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约95％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约96％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约97％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约98％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约99％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约100％的纯度。
在一些实施例中，本文所述的mRNA组合物具有小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％和/或小于0.1％的除全长mRNA以外的杂质。杂质包括IVT污染物，例如蛋白质、酶、DNA模板、游离核苷酸、残留溶剂、残留盐、双链RNA(dsRNA)、过早终止的RNA序列(“短聚体”或“短的异常终止RNA种类”)和/或长的异常终止RNA种类。在一些实施方案中，纯化的mRNA基本上不含过程酶。
在一些实施方案中，本发明的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg、小于约2pg/mg、小于约3pg/mg、小于约4pg/mg、小于约5pg/mg、小于约6pg/mg、小于约7pg/mg、小于约8pg/mg、小于约9pg/mg、小于约10pg/mg、小于约11pg/mg或小于约12pg/mg。因此，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约1pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约2pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约3pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约4pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约5pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约6pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约7pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约8pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约9pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约10pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约11pg/mg。在一些实施方案中，纯化mRNA中的残留质粒DNA少于约12pg/mg。
在一些实施方案中，根据本发明的方法去除了超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上所有过早终止的RNA序列(也称为“短聚体”)。在一些实施方案中，mRNA组合物基本上不含过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，mRNA组合物含有少于约5％(例如，少于约4％、3％、2％或1％)的过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，mRNA组合物含有少于约1％(例如，少于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，通过例如高效液相色谱(HPLC)(例如，肩峰或单独的峰)、溴化乙锭、考马斯染色(Coomassie staining)、毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳(例如，存在单独的较低条带)来确定无法检测到的mRNA组成的过早终止的RNA序列。如本文所用，术语“短聚体”、“短的异常终止RNA种类”、“过早终止的RNA序列”或“长的异常终止RNA种类”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短聚体”、“短的异常终止RNA种类”或“过早终止的RNA序列”的长度小于100个核苷酸，长度小于90个、小于80个、小于70个、小于60个、小于50个、小于40个、小于30个、小于20个或小于10个核苷酸。在一些实施方案中，在添加5'-帽和/或3'-poly A尾之后，检测或定量短聚体。在一些实施例中，过早终止的RNA转录物包含少于15个碱基(例如，少于14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或3个碱基)。在一些实施方案中，过早终止的RNA转录物含有约8-15、8-14、8-13、8-12、8-11或8-10个碱基。
在一些实施方案中，本发明的纯化mRNA基本上不含体外合成中使用的酶试剂，包括但不限于T7 RNA聚合酶、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，根据本发明的纯化mRNA包含少于约5％(例如，少于约4％、3％、2％或1％)的用于体外合成的酶试剂，包括。在一些实施方案中，纯化mRNA包含少于约1％(例如，少于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的用于体外合成的酶试剂，包括。在一些实施方案中，纯化mRNA含有体外合成中使用的不可检测的酶试剂，包括如通过例如银染色、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)和/或毛细管电泳、溴化乙锭和/或考马斯染色所测定。
在各种实施方案中，本发明的纯化mRNA维持高度的完整性。如本文所用，术语“mRNA完整性”一般是指纯化后mRNA的质量。mRNA完整性可以使用本领域熟知的方法，例如通过RNA琼脂糖凝胶电泳来确定。在一些实施方案中，mRNA完整性可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳的带型来确定。在一些实施方案中，与RNA琼脂糖凝胶电泳的参考条带相比，本发明的纯化mRNA显示很少或没有条带。在一些实施方案中，本发明的纯化mRNA具有大于约95％的完整性(例如，大于约96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，本发明的纯化mRNA具有大于98％的完整性。在一些实施方案中，本发明的纯化mRNA具有大于99％的完整性。在一些实施方案中，本发明的纯化mRNA具有大约100％的完整性。
在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的以下特征中的一个或多个：外观、同一性、数量、浓度、杂质的存在、微生物学评估、pH水平和活性。在一些实施方案中，可接受的外观包括基本上不含可见颗粒的澄清无色溶液。在一些实施方案中，通过测序方法评估mRNA的同一性。在一些实施方案中，通过合适的方法，诸如UV分光光度法来评估浓度。在一些实施方案中，合适的浓度在约90％与110％标称(0.9-1.1mg/mL)之间。
在一些实施方案中，评估mRNA的纯度包括评估mRNA完整性、评估残留质粒DNA和评估残留溶剂。在一些实施方案中，通过琼脂糖凝胶电泳评估可接受的mRNA完整性水平。分析凝胶以确定带型和表观核苷酸长度是否与分析参比标准品一致。评估RNA完整性的其他方法包括例如使用毛细管凝胶电泳(CGE)评估纯化的mRNA。在一些实施方案中，如通过CGE确定的纯化的mRNA的可接受纯度是纯化的mRNA组合物具有不超过约55％的长的异常终止/降解种类。在一些实施方案中，通过本领域的方法，例如通过使用qPCR来评估残留质粒DNA。在一些实施方案中，小于10pg/mg(例如，小于10pg/mg、小于9pg/mg、小于8pg/mg、小于7pg/mg、小于6pg/mg、小于5pg/mg、小于4pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg或小于1pg/mg)是可接受的残留质粒DNA水平。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm、9,000ppm、8,000ppm、7,000ppm、6,000ppm、5,000ppm、4,000ppm、3,000ppm、2,000ppm、1,000ppm。因此，在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过9,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过8,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过7,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过6,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过5,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过4,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过3,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过2,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过1,000ppm。
在一些实施方案中，对纯化的mRNA进行微生物学测试，其包括例如细菌内毒素的评估。在一些实施方案中，细菌内毒素<0.5EU/mL、<0.4EU/mL、<0.3EU/mL、<0.2EU/mL或<0.1EU/mL。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.5EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.4EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.3EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.1EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL、1CFU/25mL、1CFU/50mL、1CFU/75mL或不超过1CFU/100mL。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/25mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/50mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFR/75mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有1CFU/100mL。
在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA的可接受pH在5与8之间。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约5的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约6的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约7的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约7的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约8的pH。
在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的翻译保真度。翻译保真度可以通过各种方法评估，并且包括例如转染和蛋白质印迹分析。纯化的mRNA的可接受的特征包括蛋白质印迹上的带型，所述蛋白质印迹以与参照标准品相似的分子量迁移。
在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的传导。在一些实施方案中，纯化的mRNA的可接受的特征包括参考标准品的约50％与150％之间的传导。
还针对Cap百分比和poly A尾长度评估纯化的mRNA。在一些实施方案中，可接受的Cap百分比包括Cap1，面积％：NLT90。在一些实施方案中，可接受的PolyA尾长度为约100-1500个核苷酸(例如，100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个和1000个、1100个、1200个、1300个、1400个或1500个核苷酸)。
在一些实施方案中，还评估纯化的mRNA的任何残留PEG。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于10ng PEG/mg的纯化的mRNA和1000ng PEG/mg的mRNA。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约10ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约100ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约250ngPEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约500ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约750ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约1000ng PEG/mg的纯化的mRNA。
检测和定量mRNA纯度的各种方法是本领域已知的。例如，这类方法包括印迹、毛细管电泳、色谱法、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染、光谱、紫外线(UV)或UPLC或其组合。在一些实施方案中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前，首先通过乙二醛染料使mRNA变性。在一些实施方案中，在加帽或加尾之前表征合成的mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后表征合成的mRNA。
组合物的治疗用途
为了促进体内mRNA的表达，递送媒介物(诸如脂质体)可以与一种或多种额外的核酸、载剂、靶向配体或稳定试剂组合调配，或在药理组合物中调配，在所述药理组合物中所述递送媒介物与合适的赋形剂混合。用于调配和施用药物的技术可见于“Remington’sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，最新版。
在一些实施方案中，组合物包含用递送媒介物包封或复合的mRNA。在一些实施例中，递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒、固体-脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶和纳米凝胶。
考虑到受试者的临床病况、施用部位和方法、施用时间表、受试者的年龄、性别、体重和与本领域普通临床医生相关的其他因素，可以根据当前的医疗实践来施用和给药所提供的负载mRNA的纳米颗颗粒和含有其的组合物。用于本文目的的“有效量”可以通过实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的这类相关考虑来确定。在一些实施方案中，所施用的量有效地实现如所属领域的技术人员选择作为疾病进展、消退或改善的适当量度的症状和其他指标的至少一些稳定、改进或消除。例如，合适的量和给药方案是引起至少瞬时蛋白质(例如酶)产生的那种。
本发明提供了递送用于体内蛋白质生产的mRNA的方法，其包括向需要递送的受试者施用mRNA。在一些实施方案中，通过选自由静脉内递送、皮下递送、口服递送、真皮下递送、眼部递送、气管内注射肺部递送(例如，雾化)、肌内递送、鞘内递送或关节内递送组成的组的递送途径施用mRNA。
合适的施用途径包括例如口腔、直肠、阴道、透粘膜、肺，包括气管内或吸入，或肠内施用；肠胃外递送，包括真皮内、透皮(局部)、肌肉内、皮下、髓内注射；以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内。在一些实施方案中，肌内施用针对选自由骨骼肌、平滑肌和心肌组成的组的肌肉。在一些实施例中，施用导致mRNA递送至肌细胞。在一些实施方案中，施用导致mRNA递送至肝细胞(即，肝脏细胞)。在一个特定实施例中，肌内施用导致mRNA递送至肌细胞。
肺部递送和雾化的额外教导描述于已公布的美国申请第US 2018/0125989号和已公布的美国申请第US 2018/0333457号，这两个申请中的每个通过引用整体并入。
或者或另外，本发明的负载mRNA的纳米颗粒和组合物可以局部而非全身的方式施用，例如，通过将药物组合物直接注射至靶组织中，优选以缓释调配物的形式。根据待靶向组织，可以各种方式影响局部递送。例如，可以吸入含有本发明组合物的气溶胶(用于鼻腔、气管或支气管递送)；例如，可以将本发明的组合物注射到损伤、疾病表现或疼痛的部位；可以以锭剂形式提供组合物，用于口腔、气管或食道应用；可以以液体、片剂或胶囊剂形式供应给胃或肠，也可以以栓剂形式供应给直肠或阴道应用；或者甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射剂递送至眼睛。含有与治疗分子或配体复合的所提供组合物的制剂甚至可以手术方式施用，例如与可允许组合物从植入部位扩散到周围细胞的聚合物或其他结构或物质结合。或者，其可以手术方式施用，而无需使用聚合物或载体。
所提供的本发明方法考虑了治疗有效量的本文所述的治疗剂(例如，mRNA)的单次以及多次施用。治疗剂可以规则间隔施用，取决于受试者状况的性质、严重性和程度。在一些实施方案中，治疗有效量的本发明的治疗剂(例如mRNA)可以定期间隔(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、每两月(每两个月一次)、每月(每个月一次)、每两周(每两周一次)、一月两次、每30天一次、每28天一次、每14天一次、每10天一次、每7天一次、每周、一周两次、每天或连续)周期性地鞘内施用。
在一些实施方案中，提供的脂质体和/或组合物被调配成使其适合于其中包含的mRNA的延长释放。此类延长释放的组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物一天两次、每天或每隔一天施用于受试者。在一优选的实施方案中，本发明的组合物一周两次、一周一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每28天一次、每30天一次、每两周一次、每三周一次或更优选每四周一次、一月一次、一月两次、每六周一次、每八周一次、每隔一月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次或每年施用于受试者。还考虑了为长效施用(例如，肌内、皮下、玻璃体内)而调配的组合物和脂质体，以在延长的时间内递送或释放治疗剂(例如，mRNA)。优选地，所采用的延长释放手段与对mRNA进行的修饰组合，以增强稳定性。
如本文使用的，术语“治疗有效量”在很大程度上基于本发明药物组合物中包含的治疗剂的总量来确定。通常，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善疾病或病症)。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量。通常，施用于有需要的受试者的治疗剂(例如，mRNA)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够容易地根据这些和其他相关因素确定适当剂量。另外，可任选地采用客观和主观测定来确定最佳剂量范围。
治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如根据施用途径、与其他药物试剂的组合而变。另外，用于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；所采用的特定药物试剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所采用的特定蛋白质的施用时间、施用途径和/或排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域中众所周知的相似因素。
在一些实施方案中，治疗有效剂量在约0.005mg/kg体重至500mg/kg体重，例如约0.005mg/kg体重至400mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至300mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至200mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至100mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至90mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至80mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至70mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至60mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至50mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至40mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至30mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至25mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至20mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至15mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至10mg/kg体重的范围内。
在一些实施例中，治疗有效剂量大于约0.1mg/kg体重、大于约0.5mg/kg体重、大于约1.0mg/kg体重、大于约3mg/kg体重、大于约5mg/kg体重、大于约10mg/kg体重、大于约15mg/kg体重、大于约20mg/kg体重、大于约30mg/kg体重、大于约40mg/kg体重、大于约50mg/kg体重、大于约60mg/kg体重、大于约70mg/kg体重、大于约80mg/kg体重、大于约90mg/kg体重、大于约100mg/kg体重、大于约150mg/kg体重、大于约200mg/kg体重、大于约250mg/kg体重、大于约300mg/kg体重、大于约350mg/kg体重、大于约400mg/kg体重、大于约450mg/kg体重、大于约500mg/kg体重。在一特定实施方案中，治疗有效剂量为1.0mg/kg。在一些实施方案中，肌内或静脉内施用1.0mg/kg的治疗有效剂量。
本文还考虑了包含本文公开的一种或多种脂质体的冻干药物组合物和使用此类组合物的相关方法，如例如在2011年6月8日提交的美国临时申请第61/494,882号中所公开的，所述美国临时申请的教示内容以全文引用的方式并入本文中。例如，根据本发明的冻干药物组合物可在施用前复原或可在体内复原。例如，可以将冻干药物组合物调配成合适的剂型(例如，皮内剂型，诸如盘、棒或膜)并施用，使得所述剂型在体内随时间推移被个体的体液再水合。
提供的脂质体和组合物可施用于任何所需组织。在一些实施方案中，通过提供的脂质体或组合物递送的mRNA在其中施用脂质体和/或组合物的组织中表达。在一些实施方案中，递送的mRNA在与其中施用脂质体和/或组合物的组织不同的组织中表达。可以在其中递送和/或表达递送的mRNA的示例性组织包括但不限于肝、肾、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊液。
在一些实施方案中，与治疗前的基线表达水平相比，施用所提供的组合物导致来自受试者的生物样品中的mRNA表达水平增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿液和组织样品(例如，肌肉、肝脏、皮肤成纤维细胞)。在一些实施方案中，与治疗前即刻的基线水平相比，施用所提供的组合物导致mRNA表达水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，与未治疗的受试者中的mRNA表达水平相比，施用所提供的组合物导致mRNA表达水平增加
根据不同的实施方案，可以调节所递送mRNA的表达时间以适应特定的医学需要。在一些实施方案中，由所递送mRNA编码的蛋白质的表达在所提供的脂质体和/或组合物施用后1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和/或96小时是可检测的。在一些实施方案中，由所递送mRNA编码的蛋白质的表达在施用后一周、两周和/或一个月是可检测的。
本发明还提供了递送具有编码感兴趣的肽或多肽的mRNA分子的组合物，用于治疗受试者，例如人类受试者或人类受试者的细胞或经治疗并递送至人类受试者的细胞。
实施例
虽然已根据某些实施方案具体地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明，且不打算对其进行限制。虽然已根据某些实施方案具体地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明，且不打算对其进行限制。
实施例1.组合物#1的脂质纳米颗粒调配方法
此实施例说明了用于包封mRNA的示例性脂质纳米颗粒调配方法。图1中呈现了形成具有高效力和耐受性的负载mRNA的脂质纳米颗粒组合物的方法，称为过程C。过程C包括通过将mRNA与步骤(a)中的预先形成的空脂质纳米颗粒混合来包封mRNA的步骤(下文也称为“过程B”)；以及将步骤(a)的mRNA-LNP与步骤(b)中的预先形成的(空的)LNP组合。因此，过程B(步骤(a))和步骤(b)的完成导致过程C。
通过过程C生成脂质纳米颗粒
步骤(a).mRNA脂质纳米颗粒的制备：此步骤包括通过将预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA混合来包封信使RNA(mRNA)的过程。过程C的步骤(a)也称为过程B，其指的是通过将预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA混合来包封mRNA的过程，如US 2018/0153822中所述，其通过引用整体并入本文。在过程B中可以采用不同的条件，诸如不同的温度(即，加热或不加热混合物)、缓冲液和浓度。使用泵系统将来自步骤(a)的预先形成的空脂质纳米颗粒的所得悬浮液的等分试样与mRNA混合。对于某些阳离子脂质，混合后加热溶液导致更高百分比的含有mRNA的脂质纳米颗粒和更高的mRNA总产量。使用10％海藻糖过滤所得纳米颗粒悬浮液，浓缩并储存在-80℃下。在这个实施例中，编码EPO的mRNA被包封到包含ML2、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的脂质纳米颗粒中。
步骤(b).mRNA-LNP组合物的制备：在这个步骤中，来自步骤(a)的mRNA-LNP(过程B产物)然后与来自在步骤(a)之前制备的储备液的额外空脂质纳米颗粒混合。在这个实施例中，制备了三种不同的空脂质纳米颗粒：(1)ML2、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；(2)CCBene、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；(3)DPPC、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K。空LNP的尺寸和PDI如表1中所示。所得组合物包含mRNA-LNP和空LNP，如图1中所示，并且其特征如表2中所示。
表1.空脂质纳米颗粒(LNP)的特征
LNP 尺寸(nm) PDI
空ML2 71 0.12
空CCBene 69 0.13
空DPPC 97 0.19
表2.通过过程C制备的mRNA-LNP的特征
Figure BDA0003790277450001001
实施例2.mRNA-LNP的体内表达
这个实施例说明，通过本发明方法(过程C)产生的脂质纳米颗粒递送的mRNA具有比由过程B形成的mRNA-LNP出乎意料高的体内表达。
在这个实施例中，对小鼠施用单次静脉剂量的包封在通过实施例1中的过程B或过程C制备的脂质纳米颗粒中的人EPO mRNA。在施用后6小时和24小时从这些小鼠中收集血清，并且分析人EPO蛋白水平。如图2中所示，与通过过程B制备的mRNA-LNP相比，通过过程C制备的mRNA-LNP在6小时和24小时均产生更高的EPO表达。此外，这些发现在不同的LNP中是一致的，无论空LNP是否包含阳离子脂质ML2或CCBene，或空LNP是否包含中性脂质DPPC(图2)。更令人惊讶的是，已知在体内导致非常弱的递送和表达的包含中性DPPC(不具有阳离子脂质)的调配物显示出比过程B中的调配物更高水平的EPO表达。这些数据指示当通过本发明的过程C形成mRNA-LNP组合物时，mRNA编码的蛋白质在体内有更高的表达。此外，其显示了多种空脂质纳米颗粒(具有相同或不同的脂质成分)可以导致mRNA编码的蛋白质的表达增强。
实施例3.mRNA-LNP的耐受性
这个实施例显示，根据本发明制备的mRNA-LNP提供了增加的体内耐受性。肝天冬氨酸转氨酶(AST)和转氨酶(ALT)水平通常被测量作为对药物反应的耐受性的决定因素；在肝脏中的表达越高，耐受性水平越低。
在这个实施例中，如实施例2中所述，对小鼠施用单次静脉内剂量的包封在通过过程B或C制备的脂质纳米颗粒中的hEPO mRNA。给药后24小时处死小鼠，并且测定肝酶AST和ALT的水平。如图3中所示，当过程C的空LNP包含阳离子脂质时，施用有通过过程C制备的mRNA-LNP的小鼠的AST水平低于施用有通过过程B制备的mRNA-LNP的小鼠的AST水平。施用有具有通过过程C制备的DPPC空LNP的mRNA-LNP的小鼠的AST水平与施用有通过过程B制备的mRNA-LNP的小鼠的AST水平相当。对于ALT水平观察到相同的趋势。值得注意的是，通过过程C制备的LNP具有比通过过程B制备的LNP更高的脂质:mRNA含量(即N/P比率)。这些数据指示，尽管脂质含量更高，但通过过程C制备的mRNA-LNP在耐受性方面比过程B的那些更好或相当，同时导致mRNA编码的蛋白质的更高表达。
实施例4.通过mRNA或脂质含量比较通过过程B和C形成的mRNA-LNP
在这个实施例中，调节施用于小鼠的mRNA-LNP的剂量，使得施用等量的总脂质或mRNA以用于比较。
对三组小鼠施用静脉内剂量的包封在通过单独的步骤(a)(过程B)或在完成步骤(b)(过程C)后制备的脂质纳米颗粒中的hEPO mRNA。mRNA-LNP的组成如表3中所示。由于过程C包括添加空LNP的步骤，因此通过过程C制备的mRNA-LNP包含更高的脂质含量(表3中的第1组相比于第2组)，即使其含有相同量的mRNA。
表3.hEPO-mRNA LNP的特征
Figure BDA0003790277450001021
为了检验较高的脂质含量是否对体内有影响，第1组小鼠接受通过过程C形成的hEPO mRNA-LNP，第2组小鼠接受通过过程B制备的hEPO mRNA-LNP；每组施用等量的mRNA。第3组小鼠接受通过过程B制备的hEPO mRNA-LNP，其中调节mRNA-LNP，使得第1组和第3组小鼠分别接受等量的通过过程C和过程B制备的mRNA-LNP中的总脂质。因此，与第1组相比，第3组小鼠接受了更高剂量的mRNA。在施用后24小时测量血清中人EPO的表达水平。如图4A中所示，与第2组小鼠相比，第1组小鼠表现出更高的人EPO血清水平，这与前面实施例中显示的结果一致。这意味着即使第1组和第2组小鼠接受了相同量的mRNA，对于mRNA的体内表达，通过过程C制备的mRNA-LNP的比通过过程B更有效。另一方面，与第1组小鼠相比，第3组小鼠表现出相当的、甚至略微更高的hEPO蛋白表达。如表3中所示，与第1组相比，第3组接受更高量的mRNA。
在施用mRNA-LNP后6小时，在相同组的小鼠中测量肝酶ALT(图4B)。如前所示，第1组和第2组小鼠表现出稍低水平的ALT表达，尽管第1组小鼠接受比第2组小鼠更高水平的mRNA-LNP组合物中的脂质体组分。令人惊讶的是，第1组小鼠表现出明显低于第3组小鼠的ALT，尽管事实上两组都接受了包含相同量的总脂质的mRNA-LNP。值得注意的是，第1组和第3组小鼠的脂质组分也是相同的。
综上所述，这些实施例中的数据显示，使用本发明制备的mRNA-LNP组合物(过程C)可以具有显著的优势。通过过程C制备的mRNA-LNP显示出比通过过程B制备的mRNA-LNP更高的效力和更高或相当的耐受性。
实施例5.与过程B相比，过程C形成了更高效力的mRNA-LNP，并且没有相应的耐受性损失
这个实施例显示，根据本发明使用过程C制备的mRNA-LNP提供了更高的体内表达和更高的效力与相当的体内耐受性。肝天冬氨酸转氨酶(AST)和转氨酶(ALT)水平通常被测量作为对药物反应的耐受性的决定因素；在肝脏中的表达越高，耐受性水平越低。
在这个实施例中，如实施例1中所述，对小鼠施用单次静脉剂量的包封在通过过程B或C制备的脂质纳米颗粒中的人OTC mRNA。在24小时时从这些小鼠中收集肝匀浆和血清，并且分别分析人OTC蛋白水平和ALT/AST水平。如图5A中所示，与通过过程B产生的相比，通过过程C制备的mRNA-LNP产生更高的OTC表达。具体地，脂质:mRNA含量，即N/P 2+2过程C的N/P比率(其中“N/P 2+2”是指在图1的步骤(a)(N/P比率＝2)和步骤(b)(N/P比率＝4)结束时LNP的累积N/P比率，作为以空LNP形式添加更多“N”的结果)，比N/P比率为2(“N/P 2”)过程B(仅来自图1的步骤(a)的LNP的N/P比率)具有更高的表达。这是令人惊讶的，因为N/P2+2过程C制剂含有与N/P 2过程B制剂相同量的mRNA。换句话说，仅仅通过添加额外的空LNP，相同量的总mRNA导致更多的蛋白质被表达。OTC在N/P 2+2过程C中的表达与N/P 4过程B相当，但如下所述，在N/P过程B中，如在N/P过程B中所见，N/P 2+2过程C没有相应的耐受性损失。因此，尽管两种调配物含有相同量的脂质(和mRNA)，但添加部分脂质作为空LNP可提耐受性而不影响效力。
给药后24小时处死小鼠，并且测定肝酶AST和ALT的水平。如图5B中所示，施用有通过过程C制备的mRNA-LNP的小鼠中的AST水平低于施用有通过过程B制备的mRNA-LNP的小鼠中的AST水平，如通过N/P 2+2过程C和N/P 4过程B之间的比较所证明。施用有具有通过过程C以4(2+2)的累积N/P比率制备的阳离子脂质cHSe的mRNA-LNP的小鼠中的AST水平与通过(i)具有通过过程B制备的具有相同阳离子脂质的N/P比率为2的LNP和(ii)MC-3对照LNP诱导的AST水平相当。值得注意的是，与通过过程B制备的N/P比率为4的LNP相比，通过过程C制备的累积N/P比率为4(2+2)的LNP表现出更高的耐受性(即AST水平更低)。这些数据指示，就耐受性而言，通过过程C制备的mRNA-LNP比过程B制备的那些更好或相当，同时导致mRNA编码的蛋白质的更高表达。
这些数据指示当通过本发明的过程C形成mRNA-LNP组合物时，mRNA编码的蛋白质在体内有更高的表达。
实施例6.与过程B相比，过程C形成了具有高耐受性的高效mRNA-LNP
这个实施例显示，根据本发明使用过程C制备的mRNA-LNP提供了更高的体内表达和更高的效力与高体内耐受性。肝天冬氨酸转氨酶(AST)和转氨酶(ALT)水平通常被测量作为对药物反应的耐受性的决定因素；在肝脏中的表达越高，耐受性水平越低。
在这个实施例中，如实施例1中所述，对小鼠施用单次静脉剂量的包封在通过过程B或C制备的脂质纳米颗粒中的人OTC mRNA。制备包含不同比例的脂质:mRNA含量(即N/P比率)的mRNA LNP。在24小时时从这些小鼠中收集肝匀浆和血清，并且分别分析人OTC蛋白水平和ALT/AST水平。如图6A中所示，在N/P比率相当的情况下，通过过程C制备的mRNA-LNP导致比通过过程B制备的LNP更高的OTC表达。
观察到，在过程B制剂中，随着N/P比率从2增加到4再增加到6，OTC mRNA表达增加(即，在保持mRNA量相同的同时添加更多的脂质)。在过程C制剂中，与过程B制剂相比，在N/P比率为2或N/P比率为4时，N/P比率为4(在图1的步骤(a)中)和N/P比率为2(在图1的步骤(b)中)导致更高的OTC表达。类似地，与N/P为2或4的过程B制剂相比，N/P为2(在图1的步骤(a)中)和N/P为4(在图1的步骤(b)中)的过程C制剂也导致更高的OTC表达。过程C制剂的累积N/P比率为6，并且两种制剂都实现了相当的mRNA表达水平。因此，在过程C制剂中通过N/P 4+2或N/P2+4实现的累积N/P比率为6导致比通过过程B制备的N/P为2或4的LNP实现的更高的mRNA表达。有趣的是，过程C制剂都没有实现与通过过程B制备的N/P高达6的mRNA表达水平，这表明在一些情况下，优化空LNP与mRNA混合期间的N/P比率可以导致LNP调配物具有增强的效力。不希望被任何特定的理论所束缚，这可能是由于所选择的N/P比率产生了过量的空LNP。换句话说，所得LNP调配物在组成上可能与通过过程C制备的LNP调配物有些相似，但在耐受性方面似乎没有优势(见下文)。
给药后24小时处死小鼠，并且测定肝酶AST和ALT的水平。如图6B中所示，在施用有通过过程B制备的脂质:mRNA含量(即N/P比率)为N/P 4或N/P 6的LNP的小鼠中，AST水平较高，指示耐受性较低。相比之下，施用有通过过程C制备的LNP(可互换地，N/P 4+2或N/P 2+4)的小鼠表现出较低的AST水平，指示与过程B N/P 4或6制剂相比具有高耐受性，与通过过程B和MC-3对照LNP制备的LNP N/P 2制剂具有相当的耐受性。数据还指示，过程C中的LNPN/P比率在过程的两个步骤中可以互换并产生相似的结果。
总的来说，这些数据指示，用本发明的过程C制剂实现了mRNA编码的蛋白质在体内的更高表达，同时具有高耐受性。耐受性高于累积N/P比率相当的过程B LNP制剂。
实施例7.与包含单一脂质的过程B LNP相比，包含通过过程C形成的两种脂质的高效mRNA-LNP显示出高耐受性
这个实施例显示，与通过过程B制备的仅具有cHSe脂质的LNP相比，根据本发明使用过程C制备的包含用cHSe-E脂质制备的LNP与用ML-2脂质制备的LNP的组合的mRNA-LNP提供了更高的体内表达和更高的效力与更高的体内耐受性。肝天冬氨酸转氨酶(AST)和转氨酶(ALT)水平通常被测量作为对药物反应的耐受性的决定因素；在肝脏中的表达越高，耐受性水平越低。
在这个实施例中，如实施例1中所述，对小鼠施用单次静脉剂量的包封在通过过程B或C制备的脂质纳米颗粒中的人OTC mRNA。在这个实施例中，编码EPO的mRNA被包封在包含阳离子脂质cHSe的脂质纳米颗粒中。用阳离子脂质ML-2制备空脂质纳米颗粒。
在24小时时从这些小鼠中收集肝匀浆和血清，并分别分析人OTC蛋白水平以及ALT/AST。如图7A中所示，与通过过程B产生的N/P比率为2或4的LNP相比，通过过程C制备的包含基于cHSe的LNP和基于ML-2的LNP的组合的mRNA-LNP导致更高的OTC表达。
如图7B中所示，与通过过程B制备的N/P比率为4的基于cHSe的LNP相比，观察到耐受性，如通过施用包含基于cHSe的LNP和基于ML-2的LNP的组合的LNP(每种LNP的N/P比率为2，累积导致通过过程C制备的N/P比率为4的LNP调配物)的小鼠中的较低AST水平所指示。通过过程C制备的LNP的耐受性与通过过程B制备的包含基于cHSe的LNP的N/P比率为2的LNP的耐受性相当，但其效力低得多。
总的来说，这些数据指示，用包含两种不同LNP的组合(一组LNP包封mRNA，和另一组空LNP用不同阳离子脂质制备)的本发明的过程C制剂实现了mRNA编码的蛋白质在体内的更高表达，与包含具有相当的N/P比率和相当的效能的单一脂质的过程B LNP制剂相比，具有更高的耐受性。通过使用两种不同的LNP调配物的组合，过程C制剂的效力增加，并且获得了与过程B LNP相当的耐受性与较低的N/P比率。
等效物
本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所描述的本发明的具体实施例的许多等效物。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。

Claims (44)

1.一种制造包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物的方法，所述方法包括
(a)将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA在允许形成mRNA-LNP的条件下混合；
(b)将步骤(a)中形成的所述mRNA-LNP与预先形成的LNP组合，产生所述包含mRNA-LNP的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的所述预先形成的LNP是空LNP。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中的所述预先形成的LNP具有相同的脂质调配物。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中的所述预先形成的LNP具有不同的脂质调配物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA在允许形成mRNA-LNP的条件下以约2的N/P比率混合；
(b)将步骤(a)中形成的所述mRNA-LNP与预先形成的LNP以约2的N/P比率组合，产生包含N/P比率为约4的mRNA-LNP的所述组合物。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA在允许形成mRNA-LNP的条件下以约2的N/P比率混合；
(b)将步骤(a)中形成的所述mRNA-LNP与预先形成的LNP以约4的N/P比率组合，产生包含N/P比率为约6的mRNA-LNP的所述组合物。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA在允许形成mRNA-LNP的条件下以约4的N/P比率混合；
(b)将步骤(a)中形成的所述mRNA-LNP与预先形成的LNP以约2的N/P比率组合，产生包含N/P比率为约6的mRNA-LNP的所述组合物。
8.如权利要求4所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中的所述预先形成的LNP包含不同的阳离子脂质。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中的所述预先形成的LNP包含相同的阳离子脂质。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和/或步骤(b)中的所述预先形成的LNP不含阳离子脂质。
11.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)中的所述预先形成的LNP不含阳离子脂质。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中的所述预先形成的LNP包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。
13.如权利要求1至4和10至11中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中所述预先形成的LNP包含一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中步骤(a)中的所述预先形成的空LNP和步骤(b)中的所述预先形成的LNP还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)和/或步骤(b)之前首先混合脂质以形成空LNP的步骤。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP和所述预先形成的LNP以在20:1至1:20、10:1至1:10、5:1至1:5、3:1至1:3或2:1至1:2的范围内的比率组合。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP与所述预先形成的LNP以为或大于20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20的比率组合。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中提供的所述预先形成的LNP超过所述mRNA-LNP。
19.如权利要求18所述的方法，其中预先形成的LNP:mRNA LNP的比率是或至少是2:1。
20.如权利要求18所述的方法，其中预先形成的LNP:mRNALNP的比率是或至少是3:1。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP和所述空LNP各自具有直径在约75-150nm范围内的平均尺寸。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP和所述空LNP各自具有直径小于100nm的平均尺寸。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物的总脂质与总mRNA的比率在20:1至1:1、10:1至1:1、5:1至1:1、5:1至2:1或4:1至2:1的范围内，或大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1或20:1。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA编码蛋白质或肽。
25.一种包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物，其根据如前述权利要求中任一项所述的方法制造。
26.一种包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)和预先形成的脂质纳米颗粒(LNP)的混合物的组合物，其中所述mRNA-LNP和空LNP包含相同的阳离子脂质。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述预先形成的LNP是空LNP。
28.如权利要求26所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和所述预先形成的LNP具有相同的脂质调配物。
29.如权利要求26所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和所述预先形成的LNP具有不同的脂质调配物。
30.一种包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)和空脂质纳米颗粒(LNP)的混合物的组合物，其中所述mRNA-LNP和/或所述空LNP不含阳离子脂质。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述空LNP不含阳离子脂质。
32.如权利要求28至30中任一项所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和/或所述空LNP包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。
33.如权利要求31或32中任一项所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和/或所述空LNP包含一种或多种中性脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。
34.如权利要求32或33所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和/或所述空LNP还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。
35.如权利要求25至34中任一项所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和所述空LNP以在20:1至1:20、10:1至1:10、5:1至1:5、3:1至1:3或2:1至1:2的范围内的比率存在。
36.如权利要求25至35中任一项所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和所述预先形成的LNP以为或大于20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20的比率存在。
37.如权利要求25至36中任一项所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和所述预先形成的LNP各自具有直径在约75-150nm范围内的平均尺寸。
38.如权利要求25至37中任一项所述的组合物，其中所述mRNA-LNP和所述预先形成的LNP各自具有直径小于100nm的平均尺寸。
39.如权利要求25至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物的总脂质与总mRNA的比率在20:1至1:1、10:1至1:1、5:1至1:1、5:1至2:1、或4:1至2:1的范围内，或大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1或20:1。
40.如权利要求25至39中任一项所述的组合物，其中所述mRNA编码蛋白质或肽。
41.一种递送用于活体内蛋白质表达的mRNA的方法，其包括向受试者施用如权利要求25至40中任一项所述的组合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中在向所述受试者施用所述组合物后由所述mRNA编码的所述蛋白质或肽的表达水平与由施用有相同的mRNA-LNP但没有空LNP的相同量的mRNA编码的所述蛋白质或肽的表达水平相比增加，与肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)的表达水平相当。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述蛋白质或肽的所述表达水平增加至少20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
44.一种制造包含包封mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的组合物的方法，所述方法包括：
(i)将预先形成的空脂质纳米颗粒储备液分成两部分；
(ii)将预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)的第一部分与mRNA在允许形成mRNA-LNP的条件下混合；
(iii)将步骤(ii)中形成的所述mRNA-LNP与步骤(i)中的所述空LNP的第二部分组合，产生包含mRNA-LNP的所述组合物。
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