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CN118401658A - 调节pcsk9的方法及其用途 - Google Patents

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CN118401658A
CN118401658A CN202280078159.8A CN202280078159A CN118401658A CN 118401658 A CN118401658 A CN 118401658A CN 202280078159 A CN202280078159 A CN 202280078159A CN 118401658 A CN118401658 A CN 118401658A
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CN
China
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pcsk9
gene
dna
dcas9
protein
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Application number
CN202280078159.8A
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周昌阳
孙怡迪
彭文博
毛少帅
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Yijie Lico Singapore Ltd.
Original Assignee
Yijielike Shanghai Biotechnology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本公开提供了用于体内靶向减少或消除PCSK9基因产物的基于CRISPR/Cas9的融合分子和引导RNA。本公开还涉及制剂、其生产方法和使用方法。

Description

调节PCSK9的方法及其用途
相关申请
本申请要求于2021年11月26日提交的PCT申请号PCT/CN2021/133681的优先权和权益，其内容通过引用整体并入本文。
通过引用序列表并入
与本申请相关的序列表XML以XML文件格式通过电子方式提供，并通过引用并入本说明书。含有序列表XML的XML文件的名称是“EPIG-001_001WO_SequenceListing_ST26”。该XML文件的大小为220,215字节，创建于2022年11月1日。
背景技术
可被定制来靶向哺乳动物细胞中的任何基因的工程化DNA结合蛋白使生物医学研究取得了快速进展，并且是用于基因治疗的理想平台。RNA引导的CRISPR-Cas9系统已成为用于可编程靶向基因调控的有前景平台。无催化活性的“死亡”Cas9(dCas9)与Kruppel相关盒(KRAB)结构域的融合产生合成阻遏物，其能够在细胞培养实验中高度特异性且有效地调节或沉默靶基因。
然而，使用合成的dCas9-KRAB融合蛋白对内源基因的持续调节和沉默，给体内治疗的应用带来了挑战。合成阻遏物超过了病毒载体递送方法的包装尺寸限制。安全性、毒性、免疫原性和脱靶效应是限制合成阻遏物在体内使用的其他挑战。本领域需要用于产生遗传工程合成基因阻遏物和所述合成基因阻抑物的体内递送以用作治疗剂的替代方法。本公开解决了本领域中这种尚未满足的需求。
发明内容
本公开提供了一种用于在细胞中调节(例如减少或消除)前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)基因产物的表达的方法，所述方法包括在所述细胞中引入下述物质的步骤：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，从而调节(例如减少或消除)所述细胞中PCSK9基因产物的表达。
本公开提供了一种调节(例如减少或消除)受试者中PCSK9基因产物的表达的体内方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，从而调节(例如减少或消除)所述受试者中PCSK9基因产物的表达。
本公开提供了一种调节(例如减少)受试者中低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，从而调节(例如减少)所述受试者中的LDL胆固醇。
本公开提供了一种治疗或缓解受试者中PCSK9相关疾病的症状的方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，从而治疗或缓解所述受试者中的PCSK9相关疾病的症状。
本公开提供了一种扩增PCSK9基因产物的表达减少的细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤：i)将包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子或编码所述融合分子的核酸序列引入到多个细胞中，其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰；ii)扩增所述多个细胞以产生具有稳定减少PCSK9基因产物的表达减少的多个修饰细胞，其中，相对于未引入所述基因表达调节剂的细胞，所述多个修饰细胞的PCSK9基因产物表达减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％，并且其中所述细胞是肝细胞。在某些实施方式中，所述PCSK9基因产物表达的减少是瞬时减少。在某些实施方式中，所述PCSK9基因产物表达的减少是稳定减少。
在某些实施方式中，所述PCSK9调控元件是核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘子元件、边界元件或基因座控制区。
在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰所述PCSK9基因的转录起始位点上游位于300bp以内。
在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约300bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内和所述转录起始位点下游300bp以内。
在某些实施方式中，所述至少一个核苷酸的修饰是DNA甲基化。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)、DNA去甲基化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或其部分。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)或其部分。在某些实施方式中，所述DNA甲基转移酶是DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。在某些实施方式中，所述DNMT3A包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述DNMT3L包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括基于锌指蛋白的转录因子或其部分。在某些实施方式中，所述基于锌指蛋白的转录因子是Kruppel相关抑制盒(KRAB)。在某些实施方式中，所述KRAB包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶或其部分以及基于锌指蛋白的转录因子或其部分。在某些实施方式中，所述DNA甲基转移酶选自DNMT3A和DNMT3L及其组合，并且所述基于锌指蛋白的转录因子是KRAB。
在某些实施方式中，所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。在某些实施方式中，所述至少一种DNA结合蛋白是dCas9。在某些实施方式中，所述dCas9包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)dCas9、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)dCas9、香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)dCas9、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9、固氮螺菌属(Azospirillum)(例如菌株B510)dCas9、嗜重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)dCas9、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)dCas9、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)dCas9、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(例如菌株DSM 16511)dCas9、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)(例如菌株CF89-12)dCas9、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(例如菌株LMD-9)dCas9。在某些实施方式中，所述dCas9包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合分子包含与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者融合的所述至少一种基因表达调节剂。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂与所述至少一种DNA结合蛋白直接融合。在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂通过非调节剂、第二调节剂或接头与所述至少一种DNA结合蛋白间接融合。在某些实施方式中，所述融合分子包含在C-端末端上融合有KRAB并在N-端末端上融合有DNMT3A和DNMT3L的dCas9。在某些实施方式中，所述融合分子包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合分子还包含至少一个核定位序列。在某些实施方式中，所述至少一个核定位序列与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者直接融合。在某些实施方式中，所述至少一个核定位序列通过接头与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者间接融合。
在某些实施方式中，所述编码融合分子的核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)。在某些实施方式中，所述编码融合分子的核酸序列是信使核糖核酸(mRNA)。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括引入至少一个单一引导RNA(sgRNA)或编码所述sgRNA的DNA的步骤，所述sgRNA与所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的DNA序列互补，从而将所述融合分子靶向所述PCSK9基因或PCSK9调控元件。在某些实施方式中，所述sgRNA包含SEQ ID NO：27-95或98-108的核酸序列。
在某些实施方式中，所述融合分子被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被配制在同一脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被配制在不同脂质体或脂质纳米颗粒中。
在某些实施方式中，所述脂质体或脂质纳米颗粒包含可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、PEG化脂质(0％-30％，摩尔比)、支持性脂质(5％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)。在某些实施方式中，所述可电离脂质选自pH响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质。
在某些实施方式中，所述融合分子被配制在AAV载体中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被配制在AAV载体中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被配制在同一AAV载体中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被配制在不同AAV载体中。
在某些实施方式中，所述融合分子通过局部注射、系统性输注或其组合递送到所述细胞。
在某些实施方式中，所述受试者是人。
在某些实施方式中，所述PCSK9相关疾病是高动脉粥样硬化性心血管疾病。在某些实施方式中，所述PCSK9相关疾病是高胆固醇血症。在某些实施方式中，所述细胞是肝细胞。
本公开提供了一种sgRNA，其包含SEQ ID NO：27-95或98-108中任一者的核酸序列。本公开提供了一种DNA序列，其编码本文公开的sgRNA中的任一者。
本公开提供了一种药物组合物，其包含：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，其中所述融合分子靶向PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的基因组区域，其中所述至少一种基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶(DNMT)、DNA去甲基化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或其部分、或基于锌指蛋白的转录因子或其部分，或其组合，并且其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
在某些实施方式中，所述PCSK9调控元件是转录起始位点、核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘子元件、边界元件或基因座控制区。
在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游300bp以内。
在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约300bp以内。在某些实施方式中，所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内和所述转录起始位点下游300bp以内。
在某些实施方式中，所述至少一个核苷酸的修饰是DNA甲基化。在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)或其部分。在某些实施方式中，所述DNA甲基转移酶是DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。在某些实施方式中，所述DNMT3A包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述DNMT3L包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括基于锌指蛋白的转录因子或其部分。在某些实施方式中，所述基于锌指蛋白的转录因子是Kruppel相关抑制盒(KRAB)。在某些实施方式中，所述KRAB包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶或其部分以及基于锌指蛋白的转录因子或其部分。在某些实施方式中，所述DNA甲基转移酶选自DNMT3A和DNMT3L及其组合，并且所述基于锌指蛋白的转录因子是KRAB。在某些实施方式中，所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
在某些实施方式中，所述至少一种DNA结合蛋白是dCas9。在某些实施方式中，所述dCas9包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)dCas9、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)dCas9、香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)dCas9、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9、固氮螺菌属(Azospirillum)(例如菌株B510)dCas9、嗜重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)dCas9、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)dCas9、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)dCas9、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(例如菌株DSM 16511)dCas9、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)(例如菌株CF89-12)dCas9、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(例如菌株LMD-9)dCas9。在某些实施方式中，所述dCas9包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合分子包含与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者融合的所述至少一种基因表达调节剂。
在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂与所述至少一种DNA结合蛋白直接融合。在某些实施方式中，所述至少一种基因表达调节剂通过非调节剂、第二调节剂或接头与所述至少一种DNA结合蛋白间接融合。
在某些实施方式中，所述融合分子包含在C-端末端上融合有KRAB并在N-端末端上融合有DNMT3A和DNMT3L的dCas9。在某些实施方式中，所述融合分子包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合分子还包含至少一个核定位序列。在某些实施方式中，所述至少一个核定位序列与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者直接融合。在某些实施方式中，所述至少一个核定位序列通过接头与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者间接融合。
在某些实施方式中，所述编码融合分子的核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)。在某些实施方式中，所述编码融合分子的核酸序列是信使核糖核酸(mRNA)。
在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含与所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的DNA序列互补的至少一个单一引导RNA(sgRNA)。在某些实施方式中，所述sgRNA包含SEQ ID NO：27-95或98-108的核酸序列。
在某些实施方式中，所述融合分子被包装在脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被包装在脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被包装在同一脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被包装在不同脂质体或脂质纳米颗粒中。
在某些实施方式中，所述脂质体或所述脂质纳米颗粒包含可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、PEG化脂质(0％-30％，摩尔比)、支持性脂质(5％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)。在某些实施方式中，所述可电离脂质选自pH响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质。
在某些实施方式中，所述融合分子被包装在AAV载体中。在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被包装在AAV载体中。在某些实施方式中，所述融合分子所述融合分子和所述sgRNA被包装在同一AAV载体中。
在某些实施方式中，所述融合分子和所述sgRNA被包装在不同AAV载体中。
附图说明
图1A是示出了靶向小鼠PCSK9表达的“EPICAS”(也被称为“CRISPRoff”)双质粒系统和sgRNA平铺式筛选设计的示意图。第一质粒(“催化蛋白”质粒或“融合分子”质粒)编码在CAG启动子控制之下的DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB以及被2A元件分开的GFP标志物。第二质粒(“sgRNA”质粒)具有在U6启动子控制之下的sgRNA支架以及在CMV启动子控制之下的mCherry标志物。平铺式筛选的sgRNA靶向小鼠PCSK9蛋白编码序列(CDS)的转录起始位点(TSS)上游+250bp。
图1B是示出了在用催化蛋白质粒和单个PCSK9 sgRNA质粒转染小鼠AML12细胞系后的相对mRNA表达的条形图。每组n＝3个生物学平行样。
图1C是示出了在用催化蛋白质粒和各种PCSK9 sgRNA质粒的混合物转染小鼠AML12细胞系后的相对mRNA表达的条形图。
图1D是示出了在用催化蛋白质粒和各种PCSK9 sgRNA质粒的混合物转染小鼠Ai9原代肝细胞后的相对mRNA表达的条形图。
图2A是示出了EPICAS mRNA质粒设计的示意图。EPICAS ORF包含DNMT3A-DNMT3L-dCas9-KRAB表达盒。可以将质粒在XbaI和BpiI限制性位点处消化，以形成线性化质粒。
图2B是从EPICAS mRNA质粒表达的纯化的mRNA的电泳图。
图2C是示出了Snrpn-GFP报告系统的示意图。
图2D是示出了在用Snrpn sgRNA或非靶向sgRNA转染后8天或用Snrpn sgRNA转染后30天、150天和400天的Snrpn-GFP表达的一系列流式细胞术图。
图2E是示出了在用Snrpn sgRNA或非靶向sgRNA(NT-sgRNA)转染后8天或用SnrpnsgRNA转染后30天、150天和400天的GFP-off的细胞的百分比的折线图。
图2F是使用亚硫酸氢盐PCR分析获得的Snrpn基因座的DNA甲基化水平的示意图。示出了在转染后8天，CRISPRoff靶向和非靶向细胞之间Snrpn基因座的亚硫酸氢盐测序分析。每一行代表一个单个克隆和测序读出，每一列指示了一个特定基因组位置。白点代表未甲基化的CpG二核苷酸，黑点代表甲基化的CpG二核苷酸。下图表示在Snrpn基因座的13个位置处的甲基化。
图2G是在转染后400天，在CRISPRoff靶向和非靶向细胞之间Snrpn基因座的亚硫酸氢盐测序分析的示意图。圆圈的背面区域代表每个CpG二核苷酸的甲基化的平均程度(n＝9个测序读出)。
图2H是示出了通过体外转录获得的CRISPRoff mRNA的纯度的毛细管凝胶电泳。
图2I是示出了在CRISPRoff转染后70和90天时，GFP-off的细胞的百分比的一系列图。
图3A是脂质纳米颗粒(LNP)设计的示意图。表观遗传学CRISPR/Cas元件和sgRNA元件可以被LNP包封。
图3B是示出了含有EPICAS的LNP的透射电子显微镜图像。
图3C是示出了LNP的尺寸分布的图。
图3D是示出了通过肌肉内注射用脂质纳米颗粒递送到小鼠肝细胞的萤光素酶mRNA的体内荧光成像的一系列照片。
图3E是用于递送含有EPICAS mRNA和小鼠PCSK9靶向sgRNA的LNP的体内实验设计的示意图。将LNP通过注射到尾侧静脉中施用到C57CB/6J小鼠，并在注射后5天分析PCSK9基因表达。
图3F是示出了在用PBS或含有EPICAS mRNA和靶向小鼠PCSK9的sgRNA的LNP注射后，小鼠PCSK9的相对mRNA表达的条形图。
图4A是用于猴PCSK9的sgRNA平铺式筛选设计的示意图。平铺式筛选的sgRNA靶向猴PCSK9蛋白编码序列(CDS)的转录起始位点(TSS)上游+250bp。
图4B是示出了在用催化蛋白质粒和单个PCSK9 sgRNA质粒转染猴细胞后相对mRNA表达的条形图。
图5A是示出了靶向人PCSK9的sgRNA平铺式筛选的实验设计的示意图。
图5B是示出了在用靶向人PCSK9 TSS上游300bp和下游300bp区域的各种sgRNA转染人PCSK9报告细胞系后PCSK9的平均荧光强度率的一系列条形图。左侧的图示出了转染后72小时的结果。右侧的图示出了转染后120小时的结果。
图5C是示出了在用靶向人PCSK9 TSS上游300bp和下游300bp区域的各种sgRNA转染人PCSK9报告细胞系后72小时PCSK9的平均荧光强率的一系列图。
图5D是示出了使用各种PCSK9靶向sgRNA，在用EPICAS双质粒系统转染后PCSK9mRNA表达的一系列图。左侧的图示出了在用各种sgRNA转染后48小时内源表达人PCSK9的Hep3B细胞系中的PCSK9 mRNA表达。右侧的图示出了在用各种sgRNA转染人PCSK9报告细胞系后120小时PCSK9的平均荧光强度率。
图6A是示出了小鼠肝脏的荧光染色的图像。示出了tdTomato染色(CRISPRoffmRNA)和DAPI染色。表现出tdTomato荧光的细胞的高比例显示了LNP介导的CRISPRoff mRNA在小鼠肝脏中的功效。
图6B是示出了在LNP介导的CRISPRoff mRNA递送后小鼠器官的图像。萤光素酶成像显示了CRISPRoff mRNA被定位到肝脏。
图6C是示出了在施用后6h、12h、24h和48h通过萤光素酶成像获得的Luc mRNA-LNP的体内分布的一系列图像。
图6D是示出了野生型小鼠肝脏中的Pcsk9 mRNA水平的图。在用指定剂量(mg RNA/kg体重)的具有CRISPRoff mRNA和Pcsk9靶向sgRNA的LNP制剂治疗后一周，评估相对mRNA表达水平。对于PBS而言n＝5，对于LNP制剂组而言n＝6。mg/kg(MPK)。
图6E是示出了在用指定剂量(mg RNA/kg体重)的具有CRISPRoff mRNA和Pcsk9靶向sgRNA的LNP制剂治疗的小鼠的血液中Pcsk9的蛋白质水平的图。对于PBS而言n＝5，对于LNP制剂组而言n＝6。
图6F是示出了在用3mg/kg含有CRISPRoff mRNA和Pcsk9靶向sgRNA的LNP制剂治疗后2、4、6和8周时小鼠血液中Pcsk9的蛋白质水平。对于每组而言n＝4。
图6G是部分肝切除术(PHx)和肝再生实验的示意图。
图6H是示出了在PHx或假手术后7天小鼠中的肝Pcsk9 mRNA水平的比较的图。
图6I是示出了在PCSK9基因的启动子处CpG二核苷酸的靶向亚硫酸氢盐测序分析的图。每个CpG二核苷酸处的甲基化水平通过来自4或3个生物学平行样的平均β值进行量化。对于PBS、假手术和PHx而言n＝4、3和4。PHx，部分肝切除术。P值通过学生t-检验来计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图7A是在高脂肪饮食(HFD)小鼠中通过表观基因组编辑进行的Pcsk9阻遏的示意图。
图7B是示出了在用PBS、4mg/kg或6mg/kg含有CRISPRoff mRNA和Pcsk9靶向sgRNA的LNP制剂治疗后7天HFD小鼠的血液中Pcsk9的相对蛋白质水平的图。mg/kg(MPK)。
图7C是示出了在治疗后14天HFD小鼠的血液中Pcsk9的相对蛋白质水平的图。
图7D是示出了在治疗之前和之后HFD小鼠中血浆LDL-C水平的比较的图。每组n＝5个生物学平行样。P值通过学生t-检验计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图8A是两个组中基因的log2转换的TPM的散点图。标记的点与PCSK9基因相对应。数据代表三个独立生物学平行样的平均值。
图8B是靶基因Pcsk9的上游和下游1Mb内的基因表达变化的图示。x轴表示每个基因的基因组位置。
图8C是示出了在CRISPRoff和PBS治疗的小鼠之间全基因组上差异甲基化的CpG的曼哈顿图。-log10(p-值)大于0的点指示在CRISPRoff治疗的小鼠中基因座的甲基化水平较高，-log10(p-值)小于0的点指示在PBS治疗的小鼠中甲基化水平较高。箭头标记了Pcsk9的基因组位置。
图8D是Pcsk9的上游和下游1kb内的甲基化变化的图示。x轴表示基因组位置。y轴表示-log(p-值)。红点指示在PCSK9基因的从转录起始位点到其终止密码子末端的范围以内，蓝点指示在该范围以外。被两种sgRNA靶向的前间区序列位点被标记为“sgRNA7”和“sgRNA9”。
图8E是示出了预测的sgRNA依赖性脱靶基因和靶基因的基因表达变化的火山图。x轴表示通过DESeq2获得的所指示基因的log2变换的倍数变化，y轴表示log10变换的调整P值。每组n＝3个生物学平行样。
图9A是示出了包封CRISPRoff和Pcsk9靶向sgRNA的LNP的尺寸分布的图。
图9B是包封CRISPRoff和Pcsk9靶向sgRNA的LNP的Cryo-EM图像。
图9C示出了用不同剂量的包封CRISPRoff的LNP处理的PCSK9基因上的CpG二核苷酸的靶向亚硫酸氢盐测序分析的图。每个CpG二核苷酸处的甲基化水平通过来自4或3个生物学平行样的平均β值进行量化。每组n＝3。mg/kg(MPK)。
图9D是示出了在用3或6mg/kg LNP包封的CRISPRoff治疗之前和之后4天和7天，小鼠中天冬氨酸转氨酶(ALT)、丙氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和白蛋白(ALB)的血液水平的绝对值的一系列图。每组n＝6。P值通过学生t-检验来计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图10A示出了全转录组基因的基因表达变化的火山图。代表Pcsk9的点被指明。
图10B示出了在PCSK9基因两侧50kb基因组窗口内的甲基化水平的比较的图。x轴上方的条形表示甲基化水平大于0.5的基因座，x轴下方的条形表示甲基化水平小于0.5。被两种sgRNA靶向的前间区序列位点被标记为“sgRNA7”和“sgRNA9”。
图10C是示出了所指示基因的甲基化和基因表达水平的log2变换的倍数变化的条形图，显示了CRISPRoff和PBS治疗的小鼠之间基因表达水平的统计显著性。
图10D是示出了所指示基因的甲基化和基因表达水平的log2变换的倍数变化的条形图，显示了CRISPRoff和PBS治疗的小鼠之间甲基化水平的统计显著性。每组n＝3个生物学平行样。
具体实施方式
本公开通过提供基因工程改造的融合分子(例如DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB融合分子)用于细胞中的基因产物(例如PCSK9)的靶向减少或消除以用于体内基因治疗，克服了与当前技术相关的问题。本公开的基因工程改造的融合分子可用于治疗遗传性疾病，包括例如肝脏疾病、与高胆固醇相关的疾病和与胆固醇(例如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇)失调相关的疾病。因此，还提供了制备基因工程融合分子及其用于体内递送的药物制剂(例如脂质纳米颗粒制剂)的方法。
I.定义
本文所使用的术语“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括与调控元件可操作连接的起始和终止信号，包括能够在施用所述核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。所述编码序列可以是被密码子优化的。
本文所使用的术语“互补”或“互补的”对于核酸而言，可以是指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。“互补性”是指两个核酸序列之间共享的特性，使得当将它们彼此反向平行对齐时，每个位置处的核苷酸碱基将是互补的。
术语“校正”、“基因组编辑”和“恢复”是指改变编码突变蛋白、截短蛋白或完全不编码蛋白的突变基因，从而获得全长功能性或部分全长功能性蛋白的表达。校正或恢复突变基因可以包括利用诸如同源性定向修复(HDR)的修复机制，用不具有所述突变的基因的拷贝代替所述基因的具有所述突变的区域或代替整个突变基因。校正或恢复突变基因还可以包括通过在基因中产生双链断裂，然后使用非同源末端连接(NHEJ)进行修复，来修复引起提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的移码突变。NHEJ可以在修复过程中添加或删除至少一个碱基对，这可以恢复正确的阅读框并消除提前终止密码子。校正或恢复突变基因还可以包括破坏异常剪接受体位点或剪接供体序列。校正或恢复突变基因还可以包括通过两种核酸酶对同一DNA链的同时作用来删除非必需基因区段，以便通过移除两个核酸酶靶位点之间的DNA并通过NHEJ修复DNA断裂来恢复正确的阅读框。
本文所使用的术语“供体DNA”、“供体模板”和“修复模板”是指包括感兴趣基因的至少一部分的双链DNA片段或分子。供体DNA可以编码全功能性蛋白或部分功能性蛋白。
本文所使用的术语“移码”或“移码突变”可互换使用，并且是指一种基因突变类型，其中一个或多个核苷酸的添加或缺失导致mRNA中密码子的阅读框发生偏移。阅读框的偏移可能导致蛋白质翻译时氨基酸序列的改变，如错义突变或提前终止密码子。
本文所使用的术语“功能性”和“全功能性”描述具有生物活性的蛋白质。“功能性基因”是指转录成mRNA的基因，所述mRNA被翻译成功能性蛋白。
本文所使用的术语“融合蛋白”是指通过两个或更多个基因的共价或非共价连接直接或间接产生的嵌合蛋白，这些基因最初编码单独的蛋白质。在某些实施方式中，所述融合基因的翻译产生具有衍生自每个原始蛋白质的功能特性的单个多肽。
本文所使用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够在细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。
在本文中可互换使用的术语“同源定向修复”或“HDR”是指当细胞核中存在同源DNA片段时(主要在细胞周期的G2和S期)，细胞中修复双链DNA损伤的机制。HDR使用供体DNA模板来指导修复，并可用于对基因组产生特定序列变化，包括整个基因的靶向插入。如果供体模板与位点特异性核酸酶一起提供，例如与基于CRISPR/Cas9的系统一起提供，那么细胞机制将通过同源重组修复断裂，其在DNA切割存在下增强几个数量级。当同源DNA片段不存在时，可能代之以发生非同源末端连接。
本文所使用的术语“基因组编辑”是指改变基因。基因组编辑可以包括校正或恢复突变基因。基因组编辑可以包括敲除基因，例如突变基因或正常基因。基因组编辑可用于通过改变感兴趣的基因来治疗疾病。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，本文所使用的术语“相同的”或“同一性”是指序列在特定区域内具有特定百分率的相同残基。所述百分率可以如下计算：最佳比对两个序列，在指定区域内比较两个序列，确定两个序列中出现相同残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以所述指定区域中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分率。在两个序列长度不同或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基被包括在计算的分母中，但不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动执行，或者通过使用诸如BLAST或BLAST 2.0的计算机序列算法来执行。可以通过已知的方法容易地计算出相关肽的同一性。此类方法包括但不限于在下述文献中描述的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo et al,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)，所述文献整体通过引用并入本文。
当在本文中使用时，本文中可互换使用的术语“突变基因”或“突变的基因”是指已发生可检测突变的基因。突变基因发生了变化，例如遗传物质的丢失、获得或交换，其影响基因的正常传递和表达。本文所使用的“被破坏的基因”是指具有引起提前终止密码子的突变的突变基因。被破坏的基因的产物相对于全长的未被破坏的基因产物被截短。
本文所使用的术语“表观遗传学修饰调节剂”是指通过表观遗传学修饰(例如通过组蛋白乙酰化或甲基化，或靶基因的调控元件例如启动子、增强子或转录起始位点处的DNA甲基化)靶向基因表达的试剂。染色质重塑和DNA甲基化是调控基因转录的两个主要机制。特定的表观遗传学标记(例如DNA甲基化)在结构上或生物化学上指导基因转录或基因沉默/阻遏。例如，调控转录活性的区域的DNA甲基化改变基因表达而不改变构成基础的DNA序列。使用表观遗传学修饰(例如DNA甲基化)的转录调控允许靶向调节基因表达，而不影响其他基因产物的表达。
本文所使用的术语“非同源末端连接(NHEJ)途径”是指在不需要同源模板的情况下通过直接连接断裂末端来修复DNA中的双链断裂的途径。NHEJ对DNA末端的模板独立重新连接是一个随机的、容易出错的修复过程，在DNA断点处引入随机的微插入和微缺失(插入缺失)。这种方法可用于故意破坏、缺失或改变靶基因序列的阅读框。NHEJ通常使用被称为微同源物的短同源DNA序列来指导修复。这些微同源物通常存在于双链断裂末端上的单链悬突(overhang)中。当悬突完全相容时，NHEJ通常准确地修复断裂，然而也可能发生导致核苷酸丢失的不精确修复，但其在悬突不相容时更为常见。
本文所使用的术语“正常基因”是指未发生变化例如遗传物质的丢失、获得或交换的基因。正常基因经历正常的基因传递和基因表达。
本文所使用的术语“核酸酶介导的NHEJ”是指在核酸酶例如cas9切割双链DNA后启动的NHEJ。
本文所使用的术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也涵盖所描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本相同的核酸及其互补体。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。核酸可以是单链或双链，或者可以含有具有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA两者)、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
本文所使用的术语“可操作连接”是指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制之下。启动子可以位于在其控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与该启动子和它在所述启动子来源的基因中控制的基因之间的距离大致相同。正如本领域中已知的，可以在不损失启动子功能的情况下容许该距离的变化。
本文所使用的术语“部分功能性”描述了由突变基因编码的具有比功能性蛋白更低但比非功能性蛋白更高的生物活性的蛋白质。在一个实施方式中，部分功能性蛋白显示出低于相应的功能性蛋白的生物活性的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的生物活性。
本文所使用的术语“提前终止密码子”或“框外终止密码子”是指DNA序列中的无义突变，其在野生型基因中通常未发现的位置处产生终止密码子。提前终止密码子可能导致蛋白质被截短或与蛋白质的全长版本相比更短。
本文所使用的术语“启动子”或“核心启动子”是指能够在细胞中赋予、激活或增强核酸表达的合成或天然衍生的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强核酸的表达和/或改变核酸的空间表达和/或者时间表达。启动子还可以包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距离转录起始位点多达几千个碱基对的位置。启动子可以源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物在内的来源。启动子可以组成型地或相对于发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或对外部刺激例如生理胁迫、病原体、金属离子或诱导剂做出响应差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵基因启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子和CMV IE启动子。
本文所使用的术语“靶基因”是指编码已知或推定基因产物的任何核苷酸序列。靶基因可以是涉及遗传疾病或紊乱的突变基因。
本文所使用的术语“靶区域”是指位点特异性核酸酶被设计与之结合的靶基因的区域。
本文所使用的术语“转基因”是指含有从一种生物体分离并引入到不同生物体中的基因或含有基因序列的遗传物质。或者，术语“转基因”也指化学合成并引入到生物体中的基因或遗传物质。这种非天然DNA区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白质的能力，或者它可以改变转基因生物体的遗传密码的正常功能。转基因的引入具有改变生物体的表型的潜力。
本文所使用的术语“变体”在用于核酸时是指(i)参比核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参比核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参比核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参比核酸、其互补序列或与其基本上相同的序列杂交的核酸。对于肽或多肽而言，“变体”的氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同，但保留至少一种生物活性。
变体也可以是指具有与保留至少一种生物活性的参比蛋白质的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代，即将氨基酸用具有相似性质(例如亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸代替，在本领域中被认为通常涉及微小的变化。正如本领域中所理解的，这些微小的变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)，其整体通过引用并入本文。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑因素。在本领域中已知，具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面中，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情况下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性。可以用彼此的亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受到该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察结果相一致，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸、特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，正如由疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭示的。
当在本文中使用时，本文所使用的术语“载体”是指含有复制原点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，例如DNA质粒。
本文所使用的术语“基因转移”、“基因递送”和“基因转导”是指用于将特定核苷酸序列(如DNA或RNA)、融合蛋白、多肽等可靠插入到靶细胞中的方法或系统。
本文所使用的术语“腺相关病毒(AAV)载体”、“AAV基因治疗载体”和“基因治疗载体”是指具有功能性或部分功能性ITR序列和转基因的载体。本文所使用的术语“ITR”是指反向末端重复序列(ITR)。ITR序列可以衍生自腺相关病毒血清型，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5和AAV-6。然而，ITR不必须是野生型核苷酸序列，并且可以被改变(例如通过核苷酸的插入、缺失或取代)，只要所述序列保留功能以提供功能性拯救、复制和包装即可。AAV载体的一个或多个AAV野生型基因、优选为rep和/或cap基因可以被全部或部分缺失，但保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列的功能是例如拯救、复制和包装AAV病毒粒子或颗粒。因此，“AAV载体”在本文中定义为至少包括那些将转基因插入到受试者的细胞中所需的序列。任选地包括那些对于病毒的复制和包装而言必需采取顺式的序列(例如功能性ITR)。
本文所使用的术语“基因疗法”是指治疗患者的方法，其中将多肽或核酸序列转移到患者的细胞中，以便调节特定基因的活性和/或表达。在某些实施方式中，所述基因的表达被抑制。在某些实施方式中，所述基因的表达被增强。在某些实施方式中，所述基因表达的时间或空间模式被调节。
所述“转基因”可以含有转基因序列或天然或野生型DNA序列。所述转基因可以成为灵长类动物受试者基因组的一部分。转基因序列可以是部分或完全物种异源的，即转基因序列或其部分可以来自不同于其被引入的细胞的物种。
本文所使用的术语“稳定维持的”是指转基因受试者(例如人或非人灵长类动物)通过多代细胞维持其至少一种转基因元件(即所需的元件)的特征。例如，所述术语旨在涵盖最初转染的细胞的许多细胞分裂周期。术语“稳定转染”或“稳定转染的”是指将外源DNA引入并整合到细胞的基因组中。术语“稳定转染子”是指已将外源DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。
本文所使用的术语“编码……的转基因”、“编码……的核酸分子”、“编码……的DNA序列”和“编码……的DNA”是指脱氧核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸链的顺序或序列。例如，这些脱氧核糖核苷酸的顺序可以决定沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，所述DNA序列可以编码所述氨基酸序列。
本文所使用的术语“野生型”(wt)是指当从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因是在种群中最常观察到的基因，因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或“突变体”是指当与野生型基因或基因产物相比时在序列和/或功能特性方面表现出修饰(即改变的特征)的基因或基因产品。值得注意的是，可以分离到天然存在的突变体，其通过与野生型基因或基因产物相比获得改变的特征来鉴定。
本文所使用的术语“转染”是指细胞对外来核酸(例如DNA或RNA)的摄取。当外源核酸(DNA或RNA)被引入到细胞膜内部时，细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域中是公知的(参见例如Graham et al.,Virol.,52:456(1973)；Sambrook et al.,MolecularCloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York(1989)；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,(1986)；and Chu etal.,Gene 13:197(1981)，其整体通过引用并入本文)。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分例如基因转移载体和其他核酸分子引入到适合的受体细胞中。
本文所使用的术语“稳定转染”和“稳定转染的”是指将外来DNA引入并整合到被转染细胞的基因组中。术语“稳定转染子”是指已将外来DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。
本文所使用的术语“瞬时转染”或“瞬时转染的”是指将外来DNA引入到细胞中，其中所述外来DNA未能整合到被转染细胞的基因组中，并作为附加体维持。在此期间，所述外来DNA受到控制染色体中内源基因的表达的调控。术语“瞬时转染子”是指已摄入外来DNA但未能整合该DNA的细胞。本文所使用的术语“转导”表示通过复制缺陷型病毒载体例如通过重组AAV病毒颗粒，在体内或体外将DNA分子递送到受体细胞。
本文所使用的术语“受体细胞”是指已被携带所选的感兴趣的核苷酸序列的核酸构建体或载体转染或转导，或能够被其转染或转导的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，无论所述子代在形态或遗传构成上是否与原始亲本相同，只要所选的核苷酸序列存在即可。受体细胞可以是基因治疗颗粒和/或基因治疗载体已被施用到的受试者的细胞。
本文所使用的术语“重组DNA分子”是指由通过分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成的DNA分子。
本文所使用的术语“调控元件”是指可以控制核酸序列的表达的遗传元件。例如，启动子是一种有助于启动可操作连接的编码区的转录的调控元件。其他调控元件是剪接信号、多腺苷酸化信号、终止信号等。
术语DNA“控制序列”被统称为调控元件，例如启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制原点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们共同提供受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。这些控制序列并非所有都需要存在。
本文所使用的术语“增强子”是指包含多个激活因子和阻遏物结合位点的非编码DNA序列。增强子的长度范围为50bp到1500bp，可以位于启动子上游5’的近端、受调控基因的任何内含子内，也可以位于远端、邻近基因的内含子中或远离基因座的基因间区域，或在不同染色体上的区域。一种以上的增强子可以与启动子相互作用。同样，增强子可以在没有连锁限制的情况下调节一个以上的基因，并且可以“跳过”邻近的基因来调节更远的基因。转录调控可能涉及位于与启动子所在染色体不同的染色体上的元件。邻近基因的近端增强子或启动子可以作为招募更多远端元件的平台。所用的增强子和启动子相对于它们可操作连接的基因可以是“内源的”、“外源的”或“异源的”。“内源性”增强子/启动子是与基因组中给定基因自然相关的增强子/启动子。“外源”或“异源”增强子或启动子是通过遗传操作(即分子生物学技术)与基因并列放置的增强子或启动子，使得该基因的转录由连接的增强子/启动子指导。
本文所使用的术语“绝缘子”或“绝缘子元件”是指阻断增强子和启动子之间的相互作用的遗传边界元件。通过位于增强子和启动子之间，绝缘子可以抑制它们随后的相互作用。绝缘子可以决定增强子可影响的基因组。当染色体上的两个相邻基因具有非常不同的转录模式并且其中一个基因的诱导或抑制机制不干扰相邻基因时，就需要绝缘子。还发现绝缘子聚集在拓扑关联域(TAD)的边界处，并且可能在将基因组划分为“染色体邻域”即发生调控的基因组区域中发挥作用。绝缘体活性被认为主要通过由包括CTCF在内的蛋白质介导的DNA的3D结构实现。绝缘子可能通过多种机制发挥作用。许多增强子形成DNA环，使它们在转录激活过程中在物理上靠近启动子区域。绝缘子可能会促进DNA环的形成，从而阻止启动子-增强子环的形成。屏障绝缘子可以防止异染色质从沉默基因向活跃转录基因扩散。
本文所使用的术语“基因座控制区(locus control region)”是指能够增强远端染色质位点处连接基因的表达的长距离顺式调节元件。其以拷贝数依赖的方式发挥作用，并且具有组织特异性，如红细胞中3-球蛋白基因的选择性表达。通过LCR和基因近端元件(例如启动子、增强子和沉默子)可以改变基因的表达水平。LCR通过募集染色质修饰、共激活因子和转录复合物发挥作用。它的序列在许多脊椎动物中是保守的，特定位点的保守可能表明其功能的重要性。
本文所使用的术语“沉默子”或“阻遏物”可互换使用，是指能够结合转录调节因子并阻止基因表达为蛋白质的DNA序列。沉默子是一种序列特异性元件，可对其特定基因的转录产生负面影响。沉默子元件可以位于DNA中的许多位置。最常见的位置是在目标基因的上游，它可以帮助抑制基因的转录。该距离在基因上游的约-20bp到-2000bp之间可能有较大变化。某些沉默子位于基因本身的内含子或外显子内的启动子下游。在mRNA的3’非翻译区(3'UTR)中也发现了沉默子。DNA中的沉默子主要有两种类型，即经典沉默子元件和非经典负调节元件(NRE)。在经典沉默子中，基因被沉默子元件主动抑制，主要是通过干扰通用转录因子(GTF)组装。NRE被动抑制基因，通常是通过抑制基因上游的其他元件。
本文所使用的术语“组织特异性”是指调控元件或控制序列例如启动子、增强子等，其中核酸序列在特定细胞类型或组织中的表达显著更高。
表达载体上“剪接信号”的存在通常导致重组转录物的表达水平更高。剪接信号介导从初级RNA转录物中去除内含子，并由剪接供体和受体位点组成(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(1989),pp.16.7-16.8，其整体通过引用并入本文)。常用的剪接供体和受体位点是来自SV40的16S RNA的剪接接头。
转录终止信号通常存在于多腺苷酸化信号的下游，长度为几百个核苷酸。本文所使用的术语“poly A位点”或“poly A序列”表示指导新生RNA转录物的终止和多腺苷酸化两者的DNA序列。重组转录物的有效多腺苷酸化是合乎需要的，因为缺少poly A尾部的转录物是不稳定的并且会被快速降解。表达载体中使用的poly A信号可能是“异源的”或“内源的”。内源poly A信号是天然存在于基因组中给定基因的编码区的3'末端的信号。异源polyA信号是从一个基因中分离并可操作地连接到另一个基因的3'末端的信号。一种常用的异源poly A信号是SV40 poly A信号。SV40 poly A信号被包含在237bp的BamHI/BclI限制性片段上，并指导终止和多腺苷酸化两者(Sambrook et al.,同上，16.6-16.7，其整体通过引用并入本文)。
本文所使用的术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指人和非人类动物。本公开的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本文所定义的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是融合蛋白、多肽、核酸、脂质纳米颗粒、脂质体、AAV颗粒或病毒颗粒的量或剂量，其能够产生足够量的所需蛋白质，以所需方式调节所述蛋白质的活性，从而为临床干预提供缓解工具。在某些实施方式中，如本文所述的被转染的融合蛋白、多肽、核酸、AAV颗粒或病毒颗粒的治疗有效量或剂量足以抑制被所述融合蛋白/基因治疗构建体靶向的基因。
本文所使用的术语“治疗”例如疾病，是指患有疾病、具有患疾病的风险和/或经历疾病症状的受试者(例如人类)，在一个实施方式中，当施用例如本文所描述的融合分子或编码所述融合分子的核酸和/或gRNA或编码所述gRNA的核酸时，与从未施用所述融合分子或编码所述融合分子的核酸和/或所述gRNA或编码所述gRNA的核酸的情况相比，将遭受更轻微的症状和/或将更快地恢复。
II.DNA结合蛋白
在根据本公开的如本文所定义的方法和组合物的某些实施方式中，所述DNA结合蛋白(例如DNA靶向剂)包括(DNA)核酸酶，例如可以以序列特异性方式靶向DNA或可以以序列特异性方式定向或指示靶向DNA的核酸酶，例如CRISPR-Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶。在某些实施方式中，所述DNA结合蛋白是源自CRISPR-Cas系统的DNA核酸酶。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统
在某些实施方式中，核酸结合蛋白是(修饰的)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统。转录激活因子样效应物(TALE)可以被工程化改造以结合实际上任何所需DNA序列。使用TALEN系统的基因组编辑的示例性方法可以例如在下述文献中找到：CermakT.Doyle EL.Christian M.Wang L.Zhang Y.Schmidt C,et al.Efficient design andassembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNAtargeting.Nucleic Acids Res.2011；39:e82；Zhang F.Cong L.Lodato S.KosuriS.Church GM.Arlotta PEfficient construction of sequence-specific TALeffectors for modulating mammalian transcription.Nat Biotechnol.2011；29:149-153，以及美国专利号8,450,471、8,440,431和8,440,432，其中每一篇均整体通过引用并入本文。
作为进一步的指导，但不限于此，天然存在的TALE或“野生型TALE”是由多种变形菌物种分泌的核酸结合蛋白。TALE多肽含有由高度保守的单体多肽的串联重复序列构成的核酸结合结构域，所述单体多肽的长度主要为33、34或35个氨基酸，彼此之间主要在氨基酸位置12和13上不同。在某些实施方式中，所述核酸是DNA。
本文所使用的术语“多肽单体”或“TALE单体”用于指称TALE核酸结合结构域内高度保守的重复多肽序列，术语“重复可变双残基”或“RVD”用于表示多肽单体的第12和13位处高度可变的氨基酸。
正如在整个本公开中提供的，RVD的氨基酸残基使用氨基酸的IUPAC单字母代码来描述。包含在DNA结合结构域内的TALE单体的一般性表示为X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35，其中下标表示氨基酸位置，X表示任何氨基酸。X12X13表示RVD。在某些多肽单体中，第13位的可变氨基酸缺失或不存在，并且在此类多肽单体中，RVD由单个氨基酸组成。在此类情况下，RVD可以可选地被表示为X*，其中X表示X12，并且(*)表示X13不存在。所述DNA结合结构域包含TALE单体的几个重复，这可以被表示为(X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35)z，其中在有利实施方式中，z为至少5至40。在另一个有利实施方式中，z为至少10至26。TALE单体具有核苷酸结合亲和性，其由RVD中氨基酸的同一性决定。例如，RVD为NI的多肽单体优先与腺嘌呤(A)结合，RVD为NG的多肽单体优先与胸腺嘧啶(T)结合，RVD为HD的多肽单体优先与胞嘧啶(C)结合，并且RVD为NN的多肽单体优先与腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)两者结合。在本公开的又一个实施方式中，RVD为IG的多肽单体优先与T结合。因此，TALE的核酸结合结构域中多肽单体重复的数量和顺序决定了其核酸靶特异性。在本公开的更进一步的实施方式中，RVD为NS的多肽单体识别所有四种碱基对，并且可以与A、T、G或C结合。TALE的结构和功能被进一步描述在例如下述文献中：Moscou et al.,Science 326:1501(2009)；Boch et al.,Science326:1509-1512(2009)；和Zhang et al.,Nature Biotechnology 29:149-153(2011)，其每一篇均整体通过引用并入本文。在某些实施方式中，靶向通过结合多核酸的TALEN片段来实现。在某些实施方式中，靶向结构域包含无催化活性的TALEN或其核酸结合片段或由其组成。
锌指核酸酶(ZFN)系统
在某些实施方式中，所述核酸结构蛋白(例如DNA结合蛋白)包含(修饰的)锌指核酸酶(ZFN)系统或由所述系统组成。所述ZFN系统使用通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶，其可以被工程化以靶向所需的DNA序列。使用ZFN的基因组编辑的示例性方法可以在例如美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185和6,479,626中找到，其每一篇均整体通过引用并入本文。作为进一步的指导，但不限于此，人工锌指(ZF)技术涉及ZF模块阵列，以靶向基因组中新的DNA结合位点。ZF阵列中的每个指模块靶向三个DNA碱基。各个锌指结构域的定制阵列被组装成ZF蛋白(ZFP)。ZFP可以包含功能性结构域。通过将ZF蛋白与IIS型限制性酶FokI的催化结构域融合，开发了第一种合成的锌指核酸酶(ZFN)。(Kim,Y.G.etal.,1994,Chimeric restriction endonuclease,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,883-887；Kim,Y.G.et al.,1996,Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions toFokI cleavage domain.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,1156-1160)。通过使用成对的ZFN异二聚体，其各自靶向由短间隔区分开的不同核苷酸序列，可以在降低脱靶活性的情况下获得提高的切割特异性。(Doyon,Y.et al.,2011,Enhancing zinc-finger-nucleaseactivity with improved obligate heterodimeric architectures.Nat.Methods 8,74-79)。ZFP也可以被设计为转录激活因子和阻遏物，并已被用于靶向多种生物体中的许多基因。在某些实施方式中，所述靶向结构域包含结合核酸的锌指核酸酶或其核酸结合片段或由其组成。在某些实施方式中，所述结合核酸的锌指核酸酶(其片段)是无催化活性的。
大范围核酸酶
在某些实施方式中，所述核酸结构蛋白(例如DNA结合蛋白)包含(修饰的)大范围核酸酶，其是以大的识别位点(12-40个碱基对的双链DNA序列)为特征的内切脱氧核糖核酸酶。使用大范围核酸酶的示例性方法可以在美国专利号8,163,514、8,133,697、8,021,867、8,119,361、8,119,381、8,124,369和8,129,134中找到，其每一篇均整体通过引用并入本文。在某些实施方式中，靶向通过结合多核酸的大范围核酸酶片段来实现。在某些实施方式中，靶向通过结合多核酸的无催化活性的大范围核酸酶(片段)来实现。因此，在特定实施方式中，所述靶向结构域包含结合核酸的大范围核酸酶或其核酸结合片段，或由其组成。
CRISPR-Cas系统
在某些实施方式中，所述核酸结构蛋白(例如DNA结合蛋白)和单一引导RNA序列源自CRISPR-Cas系统。本公开提供了基于CRISPR/Cas9的工程化改造的系统，用于基因组编辑和治疗遗传疾病。所述基于CRISPR/Cas9的工程化改造的系统可以被设计成靶向任何基因(例如PCSK9)，包括与遗传疾病、肝病和胆固醇例如LDL失调有关的基因。本公开提供了一种CRISPR-Cas系统，其包含具有所需特异性和活性(例如减少或消除了PCSK9基因产物的表达)的基因工程改造的Cas蛋白和/或引导RNA。所述基于CRISPR/Cas9的系统可以包括Cas9蛋白、突变的Cas9蛋白或Cas9融合蛋白(例如DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB融合分子)和至少一种sgRNA(例如PCSK9 sgRNA)。所述Cas9融合蛋白可以例如包括与Cas9的内源结构域(例如DNMT3A、DNMT3L或KRAB)具有不同活性的结构域。
一般而言，Cas蛋白(在本文中可以与CRISPR蛋白、CRISPR酶、CRISPR-Cas蛋白、CRISPR-Cas酶、Cas、CRISPR效应物或Cas效应蛋白互换使用)和/或引导序列是CRISPR-Cas系统的组分。CRISPR-Cas系统或CRISPR系统统指参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或有活性的部分tracrRNA)、tracr-mate序列(在内源CRISPR系统的情况下涵盖“正向重复”和tracrRNA加工的部分正向重复)、引导序列(在内源CRISPR系统的情况下也被称为“间隔区”)或本文中使用的术语“RNA”(例如的RNA，例如CRISPR RNA和反式激活(tracr)RNA或单一引导RNA(也被称为sgRNA；嵌合RNA))或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
一般而言，CRISPR系统的特征在于在靶序列位点处促进CRISPR复合物形成的元件(在内源CRISPR系统的情况下也被称为前间隔序列)。在本公开的工程化系统中，正向重复序列(direct repeat)可以包括天然存在的序列或非天然存在的序列。本公开的正向重复序列不限于天然存在的长度和序列。此外，本公开的正向重复序列可以包括核苷酸的插入，例如适体或与衔接蛋白结合的序列(用于与功能结构域结合)。在某些实施方式中，含有例如插入的正向重复序列一个末端大致是短DR的前半部分，并且该末端大致是所述短DR的后半部分。
在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”或“靶多核苷酸”是指引导序列被设计与其具有互补性的序列，其中靶序列和引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包括任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方式中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
通常，引导序列(或间隔序列)可以是与靶多核苷酸序列具有足够互补性，以与所述靶序列杂交并指导CRISPR复合物与所述靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在某些实施方式中，当使用适合的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其相应的靶序列之间的互补性程度等于或大于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
在某些实施方式中，可以通过引入错配例如1个或多个错配，例如间隔序列和靶序列之间的1或2个错配(包括所述错配沿着间隔区/靶的位置)，来利用切割效率的调节。例如，双重错配越靠近中心(即不在3'或5')，对切割效率的影响就越大。因此，通过选择错配沿着间隔区的位置，可以调节切割效率。例如，如果希望靶的切割小于100％(例如在细胞群体中)，则可以在间隔序列中引入间隔区与靶序列之间的1个或更多个，例如优选2个错配。所述错配位置沿着间隔区越靠近中心，切割百分率越低。
CRISPR-Cas系统或其组分可用于在靶基因座或核酸序列中引入一个或多个突变。所述突变可以包括通过引导RNA或sgRNA在细胞的每个靶序列处引入、缺失或取代一个或多个核苷酸。所述突变可以包括通过引导RNA在所述细胞的每个靶序列处引入、缺失或取代1-75个核苷酸。
通常，在内源CRISPR-Cas系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致在所述靶序列中或附近(例如距其1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对以内)的切割，但可能取决于例如二级结构，特别是在RNA靶的情况下。在某些情况下，在内源CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致在所述靶序列中或附近(例如距其1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对以内)一条或两条链(如果适用)的切割。
在某些实施方式中，所述引导RNA(能够将Cas引导到靶基因座)可以包含(1)能够与真核细胞中的靶基因座(多核苷酸靶基因座，例如RNA靶基因座)杂交的引导序列；(2)正向重复(DR)序列，其存在于单个RNA、即sgRNA(以5'至3'方向排列)或crRNA中。
关于CRISPR-Cas系统、其组分和此类组分的递送的一般性信息，包括在本公开的实践中有用的所有方法、材料、递送媒介物、载体、颗粒、AAV及其制备和使用，包括量和制剂，参考下述文献：美国专利号8,999,641、8,993,233、8,945,839、8,932,814、8,906,616、8,895,308、8,889,418、8,889,356、8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945和8,697,359；美国专利公开号US 2014-0310830、US 2014-0287938 A1、US 2014-0273234 A1、US2014-0273232 A1、US 2014-0273231 A1、US2014-0256046 A1、US 2014-0248702 A1、US2014-0242700 A1、US 2014-0242699 A1、US 2014-0242664 A1、US 2014-0234972 A1、US2014-0227787 A1、US 2014-0189896 A1、US 2014-0186958、US 2014-0186919 A1、US2014-0186843 A1、US 2014-0179770 A1、US 2014-0179006 A1、US 2014-0170753；欧洲专利EP 2784162 B1和EP 2771468 B1；欧洲专利申请EP 2771468、EP 2764103和EP 2784162；以及PCT专利公开WO 2021/183807A1(PCT/US2021/021973)、WO 2014/093661(PCT/US2013/074743)、WO 2014/093694(PCT/US2013/074790)、WO 2014/093595(PCT/US2013/074611)、WO 2014/093718(PCT/US2013/074825)、WO 2014/093709(PCT/US2013/074812)、WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO 2014/093635(PCT/US2013/074691)、WO 2014/093655(PCT/US2013/074736)、WO 2014/093712(PCT/US2013/074819)、WO 2014/093701(PCT/US2013/074800)、WO 2014/018423(PCT/US2013/051418)、WO 2014/204723(PCT/US2014/041790)、WO 2014/204724(PCT/US2014/041800)、WO2014/204725(PCT/US2014/041803)、WO2014/204726(PCT/US2014/041804)、WO 2014/204727(PCT/US2014/041806)、WO 2014/204728(PCT/US2014/041808)、WO 2014/204729(PCT/US2014/041809)，其中每一篇均整体通过引用并入本文。
Cas蛋白
所述Cas蛋白(例如工程化Cas蛋白)可以具有与对应的野生型Cas蛋白基本上相同(例如80％至100％之间、90％至100％之间、95％至100％之间、98％至100％之间、99％至100％之间、99.9％至100％之间或约100％)的核酸酶活性。在某些情况下，所述工程化Cas蛋白具有比对应的野生型Cas蛋白更高(例如高出至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)的核酸酶活性。
可选地或此外，所述Cas蛋白(例如工程化Cas蛋白)可以具有比对应的野生型Cas蛋白高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的特异性。在特定实例中，所述Cas蛋白(例如工程化Cas蛋白)可以具有比对应的野生型Cas蛋白高至少30％的特异性。本文所使用的术语Cas的“特异性”可以对应于中靶多核苷酸切割事件的数目或百分率相对于包括中靶和脱靶事件在内的所有多核苷酸切割事件的数目或百分率。Cas蛋白的活性和特异性与下述文献中描述的一致：Hsu PDet al.,DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9nucleases,NatBiotechnol.2013Sep；31(9):827-832；和Slaymaker IM,et al.,Rationally engineeredCas9 nucleases with improved specificity,Science.2016Jan l；351(6268):84-88，所述文献也描述了用于检测Cas蛋白的活性和特异性的方法的实例，并整体通过引用并入本文，并且在本文中别处详细描述。
在某些实施方式中，所述Cas蛋白(例如其RuvC结构域)可以向上游(相对于PAM)滑动一个碱基，并产生交错切口，其可以被填充并导致单个碱基的复制(即+1插入)。+1插入位置的实例描述在Zuo,Z.,and Liu,J.(2016).Cas9-catalyzed DNA Cleavage GeneratesStaggered Ends:Evidence from Molecular Dynamics Simulations.ScientificReports 6,37584中。在某些实施方式中，所述工程化Cas蛋白具有与对应的野生型Cas蛋白不同的+1插入频率。例如，当鸟嘌呤存在于相对于PAM的-2位置中时，+1插入频率高于当胸苷、胞苷或腺嘌呤存在于相对于PAM的-2位置中时的+1插入频率。在某些情况下，+1插入依赖于人类细胞中的宿主机制。在某些实例中，所述Cas蛋白可以产生交错切口。所述交错切口可以是1个bp或1个核苷酸的5'的悬突部分。所述交错切口可以是1个bp或1个核苷酸的3'的悬突部分。
编码Cas的核酸分子可以被密码子优化。在这种情况下，密码子优化的序列的一个实例是为了在真核生物中表达而优化的序列，例如人类(即为在人类中表达而优化的序列)，或为了在本文所讨论的另一种真核生物、动物或哺乳动物中表达而优化的序列；参见例如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中的SaCas9人密码子优化的序列。尽管这是优选的，但应当理解其他实例也是可能的，并且为除了人类以外的宿主物种的密码子优化或为特定器官的密码子优化是已知的。在某些实施方式中，编码Cas的酶编码序列为在特定细胞例如真核细胞中表达而密码子优化。所述真核细胞可以是特定生物体的细胞或源自特定生物体，例如哺乳动物，包括但不限于人类或非人真核生物或本文所讨论的动物或哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、狗、牲畜或非人哺乳动物或灵长类动物。在某些实施方式中，可以排除可能导致人或动物遭受痛苦而对它们没有任何实质性医疗益处的用于修饰人类的种系遗传特性的过程和/或用于修饰动物的遗传特性的过程，以及由此类过程产生的动物。通常，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子取代天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)并同时维持天然氨基酸序列，来修饰核酸序列以在感兴趣的宿主细胞中增强表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏好。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，所述翻译效率进而据信取决于被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性等。细胞中所选tRNA的数量优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可以基于密码子优化对基因进行定制，用于给定生物体中的最佳基因表达。密码子使用表容易获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上的“密码子使用数据库”中，并且这些表可以通过多种方式进行调整。参见Nakamura,Y.,et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:statusfor the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000)。用于对特定序列进行密码子优化以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，例如Gene Forge(Aptagen；Jacobus，PA)也是可用的。在某些实施方式中，编码Cas的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个或所有密码子)对应于特定氨基酸的最频繁使用的密码子。
在某些实施方式中，所述Cas蛋白可以具有核酸切割活性。所述Cas蛋白可以具有RNA结合和DNA切割功能。在某些实施方式中，Cas可以在靶序列或其附近的位置处，例如在靶序列内和/或靶序列的互补体内或与靶序列相关的序列处，例如在距靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对以内，指导一条或两条核酸链的切割。在某些实施方式中，所述Cas蛋白可以在靶序列内和/或靶序列的互补体内或与靶序列相关的序列处和/或距靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对以内，指导一条或两条链的超过一个切割(例如1、2、3、4、5个或更多个切割)。在某些实施方式中，所述切割可以是平端的，即产生平末端。在某些实施方式中，所述切割可以是交错的，即产生黏性末端。
在某些实施方式中，载体编码一种靶向核酸的Cas蛋白，其可以相对于相应的野生型酶发生突变，使得突变的靶向核酸的Cas蛋白缺少切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力，例如HNH结构域中的改变或突变，以产生基本上缺少所有DNA切割活性的突变Cas，例如突变酶的DNA切割活性大约不超过非突变形式的酶的核酸切割活性的25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低；实例可以是与非突变形式相比，所述突变形式的核酸切割活性为零或可忽略不计。对于酶而言，本文所使用的术语“衍生”是指衍生酶在很大程度上基于野生型酶(在与野生型酶具有高度序列同源性的意义上)，但它已以本领域已知或本文中所述的某种方式进行了突变(修饰)。
通常，在内源核酸靶向系统的情况下，核酸靶向复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种靶向核酸的效应蛋白复合的引导RNA或crRNA)的形成导致所述靶序列中或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对以内)的DNA链的切割。本文所使用的术语“与感兴趣的靶基因座相关的序列”是指在靶序列附近的序列(例如在距所述靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对以内，其中所述靶序列被包含在感兴趣的靶基因座内)。
应当理解，效应蛋白是基于酶或衍生自酶，因此在某些实施方式中术语“效应蛋白”当然包括“酶”。然而，也应当理解，在某些实施方式中，根据需要，效应蛋白可以具有DNA或RNA结合活性，但不一定具有切割或缺刻活性，包括死Cas蛋白功能。
在某些实施方式中，Cas蛋白可以形成诱导型系统的组分。所述系统的可诱导性将允许使用某种形式的能量对基因编辑或基因表达进行时空控制。所述能量的形式可以包括但不限于电磁辐射、声能、化学能和热能。诱导型系统的实例包括四环素诱导型启动子(Tet-On或Tet-Off)、小分子双杂交转录激活系统(FKBP、ABA等)或光诱导型系统(植物光敏色素、LOV结构域或隐花色素)。在一个实施方式中，所述CRISPR效应蛋白可以是光诱导型转录效应物(LITE)的一部分，以序列特异性的方式指导转录活性的变化。光诱导型转录效应物的组分可以包括CRISPR效应蛋白、光响应性细胞色素异二聚体(例如来自拟南芥)和转录激活/阻遏结构域。诱导型DNA结合蛋白的进一步实例及其使用方法被提供在US 61/736465和US 61/721,283以及WO 2014018423A2中，其整体通过引用并入本文。
在某些实施方式中，突变的Cas可以具有一个或多个导致脱靶效应降低的突变，例如，例如在与引导RNA复合时改进的CRISPR酶对靶基因座进行修饰但降低或消除了对脱靶的活性，以及例如在与引导RNA复合时改进的CRISPR酶提高CRISPR酶活性。应当理解，下文所描述的突变酶可用于本文别处描述的根据本公开的任何方法。本文别处描述的任何方法、产品、组合物和用途同样适用于下文进一步详述的突变的CRISPR酶。
可以以各种组合使用以提高或降低相对于脱靶活性的靶向活性和/或特异性、或者提高或降低相对于脱靶结合的靶向结合和/或特异性的方法和突变，可用于补偿或增强为促进其他效果而进行的突变或修饰。此类为促进其他效果而进行的突变或修饰包括对Cas的突变或修饰和/或对引导RNA进行的突变或修饰。本公开的方法和突变用于调节Cas核酸酶活性和/或与化学修饰的引导RNA结合。
在某些实施方式中，本公开的Cas蛋白的催化活性被改变或修饰。应当理解，如果催化活性不同于相应的野生型Cas蛋白(例如未突变的Cas蛋白)的催化活性，则突变的Cas具有改变或修饰的催化活性。催化活性可以通过本领域中已知的手段来确定。例如但不限于，催化活性可以在体外或体内通过测定插入缺失百分率(例如在给定时间后或在给定剂量下)来确定。在某些实施方式中，催化活性提高。在某些实施方式中，催化活性提高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在某些实施方式中，催化活性降低。在某些实施方式中，催化活性降低至少5％，优选地至少10％，更优选地至少20％，例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或(基本上)100％。本文中的一个或多个突变可以使催化活性失活，这可显著降低所有催化活性，将活性降低到低于可检测水平，或降低到没有可测量的催化活性。
所述工程化Cas蛋白的一种或多种特征可能不同于相应的野生型Cas蛋白。此类特征的实例包括催化活性、gRNA结合、Cas蛋白的特异性(例如编辑限定靶的特异性)、Cas蛋白的稳定性、脱靶结合、靶结合、蛋白酶活性、切口酶活性、PFS识别。在某些实例中，工程化Cas蛋白可以包含相应的野生型Cas蛋白的一个或多个突变。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述工程化Cas蛋白的催化活性提高。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述工程化Cas蛋白的催化活性降低。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述工程化Cas蛋白的gRNA结合提高。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述工程化Cas蛋白的gRNA结合降低。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的特异性提高。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的特异性降低。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的稳定性提高。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的稳定性降低。在某些实施方式中，所述工程化Cas蛋白进一步包含一个或多个使催化活性失活的突变。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的脱靶结合提高。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的脱靶结合降低。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的靶结合提高。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述Cas蛋白的靶结合降低。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，所述工程化Cas蛋白具有更高的蛋白酶活性或多核苷酸结合能力。在某些实施方式中，与相应的野生型Cas蛋白相比，PFS识别被改变。
Cas蛋白的实例
Cas蛋白的实例包括I类(例如I型、III型和IV型)和II类(例如II型、V型和VI型)Cas蛋白，例如Cas9、Cas12(例如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d)、Cas13(例如Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d)、CasX、CasY、Cas14、其变体(例如突变形式、截短形式)、其同源物及其直向同源物。术语“直向同源物”和“同源物”在本领域中是公知的。通过进一步的指导，本文所使用的蛋白质的“同源物”是执行与作为其同源物的蛋白质相同或相似的功能的同一物种的蛋白质。同源蛋白可以但不必定在结构上相关，或者仅在结构上部分相关。本文所使用的蛋白质的“直向同源物”是执行与作为其直向同源物的蛋白质相同或相似的功能的不同物种的蛋白质。直向同源蛋白可以但不必定在结构上相关，或者仅在结构上部分相关。
2类Cas蛋白
在某些实施方式中，所述Cas蛋白是2类Cas蛋白，即2类CRISPR-Cas系统的Cas蛋白。2类CRISPR-Cas系统可以是亚型，例如II-A型、II-B型、II-C型、V-A型、V-B型、V-C型或V-U型。在某些实施方式中，所述Cas蛋白是Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c或Cas12d。在某些实施方式中，Cas9可以是SpCas9、SaCas9、StCas9和其他Cas9直向同源物。Cas12可以是Cas12a、Cas12b和Cas12c，包括FnCas12a，或其同源物或直向同源物。CRISPR-Cas系统的定义和示例性成员包括在下述文献中所描述的：Kira S.Makarova and Eugene V.Koonin,Annotation and Classification of CRISPR-Cas systems,Methods Mol Biol.2015；1311:47-75；和Sergey Shmakov et al.,Diversity and evolution of class 2CRISPR-Cas systems,Nat Rev Microbial.2017Mar；15(3):169-182。
Cas蛋白接头
在某些实例中，所述Cas蛋白包含至少一个RuvC结构域和至少一个HNH结构域。所述Cas蛋白可以进一步包含连接RuvC结构域和HNH结构域的第一和第二接头结构域。Cas9中连接HNH和RuvC结构域的第一接头(L1)和第二接头(L2)被描述在下述研究中：Nishimasu,H.et al.“Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target RNA”Cell 156(Feb.27,2014):935-949和Ribeiro,L.et al.(2018)“Protein engineeringstrategies to expand CRISPR-Cas9 applications”International Journal ofGenomics Volume2018,Article ID 1652567(doi.org/10.1155/2018/1652567)。Ribeiro的图1示出了Cas9的整体组织、结构和功能，其具体通过引用并入本文。具体而言，图1A示出了SpCas9的结构域组织的示意图，指示了本文所描述的包括接头L1(跨越第765-780位氨基酸)和L2(跨越第906-918位氨基酸)在内的HNH和RuvC结构域的遗传结构。
类似地，当参比第一和第二接头结构域时，可以利用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)的结构域组织。在一个方面，接头1结构域区域跨越第481-519位残基，并将RuvC-II结构域连接到SaCas9中的HNH结构域。在某些实施方式中，接头2区域跨越第629-649位残基，并连接SaCas9的RuvC-III结构域和HNH结构域。因此，在Cas9直向同源物中所述第一和/或第二接头结构域可以被突变，并且可以参考对应于野生型SaCas9的氨基酸的氨基酸残基。参见，Nishimasu,Cell.2015Aug 27；162(5):1113-1126；doi:10.1016/j.cell.2015.08.007，其通过引用并入本文。具体而言，Nishimasu的图1、S1-S3详细描述了Cas9蛋白的结构域组织，并具体通过引用并入本文以供参考。
第一和第二接头可以包含约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个或更多个氨基酸。第一和第二接头可以对应于野生型接头。在某些方面，第一和第二接头可以在第一和/或第二接头中包含一个或多个突变。在一个方面，第一和/或第二接头包含一个或多个提高Cas9蛋白的特异性的突变。
在某些实施方式中，连接Cas9的HNH和RuvC结构域的接头L1和L2含有野生型氨基酸序列。在某些实施方式中，连接HNH和RuvC结构域的接头含有一个或多个氨基酸的突变。在一个示例性实施方式中，第一接头(L1)含有对应于SpCas9的氨基酸T769I的突变，和/或所述第二接头(L2)含有对应于SpCas9的氨基酸G915M的突变。在一个示例性实施方式中，一个或多个接头突变例如T769I和G915M赋予了对Cas9蛋白的改进的特异性。
在一个实施方式中，第一和第二接头中的一个或多个突变可以与所述Cas9蛋白的其他部分中的一个或多个突变组合，用于进一步改进特异性和/或保持与野生型Cas9蛋白基本上等同的活性，正如本文中描述的。在一个实施方式中，接头中的突变和/或Cas蛋白内的附加突变可以利用本文详述的方法来鉴定，其增强/改进特异性并基本上保持野生型Cas9的野生型活性。
2类II型Cas蛋白(例如Cas9)
在某些实施方式中，所述Cas蛋白可以是2类II型CRISPR-Cas系统的Cas蛋白(II型Cas蛋白)。在某些实施方式中，所述Cas蛋白可以是2类II型Cas蛋白，例如Cas9。在某些实施方式中，所述基于CRISPR/Cas9的系统可以包括Cas9蛋白或其片段、Cas9融合蛋白、编码Cas9蛋白或其片段的核酸或编码Cas9融合蛋白的核酸。所谓“Cas9(CRISPR相关蛋白9)”是指与NCBI登录号NP_269215具有至少约85％的氨基酸同一性并具有RNA结合活性、DNA结合活性和/或DNA切割活性(例如核酸内切酶或切口酶活性)的多肽或其片段。“Cas9功能”可以通过多种测定法中的任一者来定义，包括但不限于基于荧光偏振的核酸结合测定法、基于荧光偏振链入侵测定法、转录测定法、EGFP破坏测定法、DNA切割测定法和/或Surveyor测定法，例如本文中所描述的。所谓的“Cas 9核酸分子”是指编码Cas 9多肽或其片段的多核苷酸。示例性的Cas9核酸分子序列被提供在基因组序列号NC_002737处。在某些实施方式中，本文公开了Cas9、例如化脓性链球菌(S.pyogenes)(SpCas9)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)(SaCas9)中天然存在的Cas9或其变体的抑制剂。Cas9使用前间隔序列邻近基序(PAM)序列和引导RNA(gRNA)与靶DNA的碱基配对来识别外来DNA。Cas9在任何基因组位点处诱导靶向链断裂的相对容易性使得能够在多种细胞类型和生物体中进行高效的基因组编辑。Cas9衍生物也可用作转录激活因子/阻遏物。
在某些情况下，所述CRISPR-Cas蛋白是Cas9或其变体。在某些实例中，Cas9可以是野生型Cas9，包括任何天然存在的细菌Cas9。Cas9直向同源物通常共有3-4个RuvC结构域和一个HNH结构域的一般组织。最靠5'端的RuvC结构域切割非互补链，HNH结构域切割互补链。所有符号均参照引导序列。5'RuvC结构域中的催化残基通过将感兴趣的Cas9与其他Cas9直向同源物(来自化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR基因座、嗜热链球菌(S.thermophilus)CRISPR基因座1、嗜热链球菌(S.thermophilus)CRISPR基因座3和新凶手弗朗西斯菌(Franciscilla novicida)II型CRISPR基因座)进行同源性比较来鉴定，并将保守的Asp残基(D10)突变成丙氨酸，以将Cas9转变成互补链切割酶。因此，所述Cas酶可以是野生型Cas9，包括任何天然存在的细菌Cas9。CRISPR、Cas或Cas9酶可以是密码子优化的，或者是修饰的版本，包括任何嵌合体、突变体、同源物或直向同源物。在本公开的另一个方面，Cas9酶可以包含一个或多个突变，并且可以用作与或不与功能性结构域融合的通用DNA结合蛋白。
所述突变可以是人工引入的突变或功能获得或功能丧失突变。在某些实施方式中，所述转录激活结构域可以是VP64。在某些实施方式中，所述转录阻遏物结构域可以是KRAB或SID4X。本公开的其他方面涉及与结构域融合的突变的Cas9酶，所述结构域包括但不限于核酸酶、转录激活因子、阻遏物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑物、去甲基化酶、DNA甲基转移酶、隐花色素、光诱导/可控结构域或化学诱导/可控结构域。本公开可以涉及sgRNA或tracrRNA或允许增强这些RNA在细胞中的性能的引导或嵌合引导序列。这种II型CRISPR酶可以是任何Cas酶。在某些情况下，所述Cas9酶来自或衍生自SpCas9或SaCas9。本文所使用的术语“衍生的”对于酶而言是指衍生的酶在很大程度上基于野生型酶(在与野生型酶具有高度序列同源性的意义上)，但其已以本领域中已知或本文中所述的某种方式进行突变(修饰)。在一个实例中，所述突变可以包括第一连接结构域、第二连接结构域和/或蛋白质的其他部分中的一个或多个突变。高度序列同源性可以包括相对于野生型酶至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
Cas酶可以是鉴定的Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶享有同源性的酶的通用类别。在某些情况下，所述Cas9酶来自或衍生自SpCas9(化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9)或saCas9(金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9)。“StCas9”是指来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的野生型Cas9(UniProt ID：G3ECR1)。类似地，“SpCas9”是指来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的野生型Cas9(UniProtID：Q99ZW2)。本文所使用的术语“衍生的”对于酶而言是指衍生的酶在很大程度上基于野生型酶(在与野生型酶具有高度序列同源性的意义上)，但其已以本领域中已知或本文中所述的某种方式进行突变(修饰)。应当理解，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另有明确说明。如上所述，本文中使用的许多残基编号参照来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)中II型CRISPR基因座的Cas9酶。
在特定实施方式中，所述效应蛋白是来自或源自下述属的生物体的Cas9效应蛋白：链球菌属(Streptococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、硝酸盐裂解菌属(Nitratifractor)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、细小棒菌属(Parvibaculum)、罗氏菌属(Roseburia)、奈瑟菌属(Neisseria)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Sphaerochaeta、乳杆菌属(Lactobacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、棒状杆菌属(Corynebacter)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、红细菌属(Rhodobacter)、李斯特菌属(Listeria)、Paludibacter、梭菌属(Clostridium)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Clostridiaridium、纤毛菌属(Leptotrichia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、军团菌属(Legionella)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、Methanomethyophilus、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、创伤球菌属(Helcococcus)、钩端螺旋体属(Letospira)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫弯曲杆菌属(Desulfonatronum)、丰佑菌科(Opitutaceae)、肿块芽孢杆菌属(Tuberibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短小芽孢杆菌属(Brevibacilus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)或氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、硝酸盐裂解菌属(Nitratifractor)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、细小棒菌属(Parvibaculum)、罗氏菌属(Roseburia)、奈瑟菌属(Neisseria)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Sphaerochaeta、乳杆菌属(Lactobacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、棒状杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体属(Treponema)、产线菌属(Filifactor)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、支原体属(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、Flaviivola、黄杆菌属(Flavobacterium)、Sphaerochaeta、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Roseburia)、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、硝酸盐裂解菌属(Nitratifractor)、支原体属(Mycoplasma)或弯曲杆菌属(Campylobacter)。
在某些实施方式中，所述Cas9蛋白来自或源自选自下述的生物体：变形链球菌(S.mutans)、无乳链球菌(S.agalactiae)、似马链球菌(S.equisimilis)、血链球菌(S.sanguinis)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、空肠弯曲菌(C.jejuni)、大肠弯曲杆菌(C.coli)、卤水硝酸盐裂解菌(N.salsuginis)、N.tergarcus、耳葡萄球菌(S.auricularis)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、脑膜炎奈瑟菌(Nmeningitides)、淋病奈瑟菌(N gonorrhoeae)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、肉毒梭菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、破伤风梭菌(C.tetani)或索氏梭菌(C.sordellii)、土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)1、土拉热弗朗西斯菌诺维亚种(Francisella tularensis subsp.novicida)、阿尔伯普雷沃氏菌(Prevotella albensis)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、蛋白溶解丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteriabacterium)GW2011 GWA2_33_10、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)GW2011 GWC2_44_17、史密斯氏菌属的种SCADC(Smithella sp.SCADC)、氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus sp.)BV3L6、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、候选白蚁甲烷支原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)237、稻田钩端螺旋体(Leptospirainadai)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)3、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)和猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施方式中，Cas9蛋白是来自或源自生物体化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9。
在更优选实施方式中，所述Cas9蛋白源自选自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的细菌物种。在某些实施方式中，所述Cas9源自选自下述的细菌物种：土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)1、阿尔伯普雷沃氏菌(Prevotella albensis)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MC20171、蛋白溶解丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)GW2011 GWA2 33JO、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)GW2011 GWC2_44_17、史密斯氏菌属的种SCADC(Smithella sp.SCADC)、氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus sp.)BV3L6、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、候选白蚁甲烷支原体(Candidatus Methanoplasmatermitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)237、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)3、解糖胨普氏菌(Prevotelladisiens)和猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施方式中，所述Cas9蛋白源自选自氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus sp.)BV3L6、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020的细菌物种。在某些实施方式中，所述效应蛋白源自土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)1的亚种，包括但不限于土拉热弗朗西斯菌诺维亚种(Francisella tularensis subsp.novicida)。
Cas9酶包括但不限于化脓性链球菌(S.pyogenes)血清型M1(UniProtID：Q99ZW2)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9(UniProt ID：J7RUA5)、凸腹真杆菌(Eubacteriumventriosum)Cas9(UniProt ID：A5Z395)、固氮螺菌属(Azospirillum)(菌株B510)Cas9(UniProt ID：D3NT09)、嗜重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)(菌株ATCC 49037)Cas9(UnitProt ID：A9HKP2)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)Cas9(UniProtID：D0W2Z9)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)Cas9(UniProt ID：C7G697)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)(菌株DS-1)Cas9(UniProt ID：A7HP89)、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(菌株DSM 16511)Cas9(UniProt ID：E6WZS9)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)Cas9(UniProt ID：G1UFN3)。
源自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶作用在靶位点序列处产生双链断裂，所述靶位点序列与引导序列的20个核苷酸杂交，并且在所述靶序列的20个核苷酸之后具有前间隔序列邻近基序(PAM)序列(实例包括NGG/NRG或可以如本文所述确定的PAM)。通过Cas9进行位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性由引导序列、与引导序列部分杂交的tracr序列和PAM序列定义。CRISPR系统的更多方面被描述在Karginov and Hannon,The CRISPR system:small RNA-guided defense inbacteria and archaea,Mole Cell 2010,January 15；37(1):7中。来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)SF370的II型CRISPR基因座含有四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csnl的簇，以及两个非编码RNA元件tracrRNA和被短的非重复序列(间隔区，每个约30bp)隔开的重复序列(正向重复)的特征性阵列。在该系统中，靶向DNA双链断裂(DSB)在四个连续步骤中产生。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，即pre-crRNA阵列和tracrRNA。其次，tracrRNA与pre-crRNA的正向重复序列杂交，然后将其加工成含有各个间隔序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA的间隔区与前间隔序列DNA之间的异源双链体形成，将Cas9引导到由前间隔序列和相应的PAM组成的DNA靶。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，在前间隔序列内产生DSB。由两侧带有两个正向重复序列(DR)的单个间隔区组成的pre-crRNA阵列也被术语“tracr-mate序列”涵盖。在某些实施方式中，Cas9可以组成性存在或诱导性存在或条件性存在或施用或递送。Cas9优化可用于增强功能或开发新功能。可以产生嵌合Cas9蛋白，并且Cas9可用作通用DNA结合蛋白。为Cas9提供的结构信息可用于进一步工程化和优化CRISPR-Cas系统，并且这也可以推断出其他CRISPR酶系统的结构-功能关系，特别是其他II型CRISPR酶或Cas9直向同源物中的结构-功能关系。晶体结构信息(描述在2013年12月12日提交的美国临时申请61/915,251、2014年1月22日提交的61/930,214、2014年4月15日提交的61/980,012；以及Nishimasu et al,“CrystalStructure of Cas9in Complex with Guide RNA and Target DNA,”Cell 156(5):935-949,DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001(2014)中，其每一篇均整体通过引用并入本文)提供了截短和产生可以被并入到诱导型CRISPR-Cas系统中的模块化或多部分CRISPR酶的结构信息。具体而言，提供了化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)的结构信息，并且这可以被外推到其他Cas9直向同源物或其他II型CRISPR酶。Cas9基因存在于几种不同的细菌基因组中，通常与cas1、cas2和cas4基因以及CRISPR盒在同一个基因座中。此外，Cas9蛋白含有可容易地鉴定的C-端区域，其与转座子ORF-B同源，并包括活性RuvC样核酸酶、富含精氨酸的区域。
dCas9
所述Cas9蛋白可以被突变，以便失活核酸酶活性。一种不具备核酸内切酶活性的来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的失活Cas9蛋白(iCas9，也被称为“dCas9”)最近已被gRNA靶向到细菌、酵母和人类细胞中的基因，以通过空间位阻沉默基因表达。本文所使用的“dCas分子”可以是指dCas蛋白或其片段。本文所使用的“dCas9分子”可以是指dCas9蛋白或其片段。本文所使用的术语“iCas”和“dCas”可互换使用，并且是指催化失活的CRISPR相关蛋白。在一个实施方式中，所述dCas分子在DNA切割结构域中包含一个或多个突变。在一个实施方式中，所述dCas分子在RuvC或HNH结构域中包含一个或多个突变。在一个实施方式中，所述dCas分子在RuvC和HNH结构域两者中都包含一个或多个突变。在一个实施方式中，所述dCas分子是野生型Cas分子的片段。在一个实施方式中，所述dCas分子包含来自野生型Cas分子的功能结构域，其中所述功能结构域选自Reel结构域、桥螺旋结构域或PAM相互作用结构域。在一个实施方式中，与相应的野生型Cas分子相比，所述dCas分子的核酸酶活性降低了至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
适合的dCas分子可以衍生自野生型Cas分子。所述Cas分子可以来自I型、II型或III型CRISPR-Cas系统。在一个实施方式中，适合的dCas分子可以衍生自Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9或Cas10分子。在一个实施方式中，所述dCas分子衍生自Cas9分子。所述dCas9分子可以通过例如在Cas9分子中的DNA切割结构域例如核酸酶结构域、例如RuvC和/或HNH结构域处引入点突变(例如取代、缺失或添加)来获得。参见例如，Jinek et al.,Science(2012)337:816-21，其整体通过引用并入本文。例如，在RuvC和HNH结构域中引入两个点突变降低了Cas9核酸酶活性，同时保留Cas9 sgRNA和DNA结合活性。在一个实施方式中，所述RuvC和HNH活性位点内的两个点突变是化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9分子的D10A和H840A突变。或者，可以缺失Cas9分子的D10和H840以使Cas9核酸酶活性失活，同时保留其sgRNA和DNA结合活性。在一个实施方式中，所述RuvC和HNH活性位点内的两个点突变是化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9分子的D10A和N580A突变。
在一个实施方式中，所述dCas分子是按照SEQ ID NO：1编号的金黄色葡萄球菌(S.aureus)dCas9分子，其包含D10和/或N580处的突变。在一个实施方式中，所述dCas分子是按照SEQ ID NO：1编号的金黄色葡萄球菌(S.aureus)dCas9分子，其包含D10A和/或N580A突变。
金黄色葡萄球菌(S.aureus)dCas9
在一个实施方式中，所述dCas9分子是金黄色葡萄球菌(S.aureus)dCas9分子，其包含SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列、与SEQ ID NO：2或3基本上相同的序列(例如序列同一性为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)或相对于SEQ ID NO：2或3具有1、2、3、4、5个或更多个变化(例如氨基酸取代、插入或缺失)的序列或其任何片段。
类似的突变也可以应用于任何其他天然存在的Cas9(例如来自其他物种的Cas9)或工程化Cas9分子。在某些实施方式中，所述dCas9分子包括化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)dCas9分子、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9分子、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9分子、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)dCas9分子、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9分子、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)dCas9分子、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)dCas9分子、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9分子、固氮螺菌属(Azospirillum)(菌株B510)dCas9分子、嗜重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)dCas9分子、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9分子、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)dCas9分子、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)dCas9分子、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(菌株DSM 16511)dCas9分子、海鸥弯曲菌(Campylobacterlari)(菌株CF89-12)dCas9分子、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(菌株LMD-9)dCas9分子或其片段。
在某些实施方式中，本公开提供了一种载体，其包含编码化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9分子、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9分子、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9分子、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)dCas9分子、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9分子、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)dCas9分子、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)dCas9分子、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9分子、固氮螺菌属(Azospirillum)(菌株B510)dCas9分子、嗜重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)dCas9分子、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9分子、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis)dCas9分子、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)dCas9分子、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(菌株DSM 16511)dCas9分子、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)(菌株CF89-12)dCas9分子、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(菌株LMD-9)dCas9分子或其片段的核苷酸。
示例性dCas9蛋白包括但不限于表1中列出的那些。
表1.示例性dCas9蛋白
Cas9融合蛋白
基于CRISPR/Cas9的系统可以包括融合分子(例如DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB)。所述融合分子可以包含至少一种DNA结合蛋白(例如dCas9)和至少一种基因表达调节剂(例如KRAB、DNMT3A、DNMT3L、DNMT3A-DNMT3L融合肽)。在某些实施方式中，所述基因表达调节剂选自基因表达的阻遏物(例如KRAB)、基因表达激活因子或表观遗传学修饰调节剂(例如DNMT3A、DNMT3L、DNMT3A-DNMT3L融合肽)或其组合。基因表达的不同调节剂在本领域中是已知的，参见例如Thakore et al.,Nat Methods.2016；13:127-37，其整体通过引用并入本文。
基因表达的阻遏物
在某些实施方式中，所述基因表达调节剂包括基因表达的阻遏物。所述阻遏物可以是任何已知的基因表达阻遏物，例如选自Kruppel相关盒(KRAB)结构域、mSin3相互作用结构域(SID)、MAX相互作用蛋白1(MXI1)、染色体阴影结构域(chromo shadow domain)、EAR抑制结构域(SRDX)、真核释放因子1(ERFl)、真核释放因子3(ERF3)、四环素阻遏物、lad阻遏物、长春花G-box结合因子1和2、Drosophila Groucho,Tripartite motif-containing 28(TRTM28)、核受体辅阻遏物1、核受体辅阻遏物2的阻遏物或其片段或融合体。
Kruppel相关盒(KRAB)
KRAB结构域是一种转录阻遏结构域，存在于许多基于锌指蛋白的转录因子的N-端部分中。KRAB结构域在通过DNA结合结构域与靶DNA结合时起到转录阻遏物的作用。KRAB结构域富含带电荷氨基酸，并且可以被分为亚结构域A和B。KRAB A和B亚结构域可以被可变的间隔片段分开，并且许多KRAB蛋白仅含有A亚结构域。KRAB A亚结构域中的45个氨基酸的序列已被证明对转录阻遏很重要。B亚结构域本身不阻遏转录，但增强了KRAB A亚结构域的阻遏作用。KRAB结构域招募辅阻遏物KAP1(KRAB相关蛋白-1，也被称为转录中介因子1β、KRAB-A相互作用蛋白和三元基序蛋白28)和异染色质蛋白1(HP1)以及其他染色质调节蛋白，通过异染色质的形成引起转录阻遏。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括包含与KRAB结构域或其片段融合的dCas9分子的融合分子。在一个实施方式中，所述KRAB结构域或其片段与dCas9分子的N-端融合。在一个实施方式中，所述KRAB结构域或其片段与dCas9分子的C-端融合。在一个实施方式中，所述KRAB结构域或其片段与dCas9分子的N-端和C-端两者融合。在一个实施方式中，所述融合分子包含KRAB结构域，其包含SEQ ID NO：22的序列、与SEQ ID NO：22基本上相同(例如具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列或相对于SEQ ID NO：22具有1、2、3、4、5个或更多个变化(例如氨基酸取代、插入或缺失)的序列，或其任何片段。
示例性的KRAB结构域序列
mSin3相互作用结构域(SID)
mSin3相互作用结构域(SID)是一种存在于几种转录阻遏蛋白上的相互作用结构域。它与mSin3的成对两亲性α-螺旋2(PAH2)结构域相互作用，所述结构域是附着到转录阻遏蛋白例如mSin3 A辅阻遏物的转录阻遏结构域。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与mSin3相互作用结构域或其片段融合的dCas9分子。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与四个串联的mSin3相互作用结构域(SID4X)融合的dCas9分子。在一个实施方式中，所述四个串联的mSin3相互作用结构域(SID4X)被融合到dCas9分子的C-端。
MAX相互作用蛋白1(MXI1)
Mxi1是一种MYC的阻遏。Mxi1可能通过竞争结合MYC相关因子X(MAX)来拮抗MYC转录活性，后者与MYC结合并且是MYC发挥作用所必需的。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与Mxi1或其片段融合的dCas9分子。在一个实施方式中，Mxi1被融合到dCas9分子的C-端。
基因表达激活因子
在某些实施方式中，所述基因表达调节剂包括基因表达激活因子。所述激活因子可以是任何已知的基因表达激活因子，例如VP16激活结构域、VP64激活结构域、p65激活结构域、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr病毒)R反式激活因子Rta分子或其片段。可以与dCas9分子一起使用的激活因子在本领域中是已知的。参见例如Chavez et al.,NatMethods.(2016)13:563-67，其整体通过引并入本文。
VP16、VP64、VP160
VP16是一种16个氨基酸的病毒蛋白序列，其将转录激活因子募集到启动子和增强子。VP64是一种包含四个拷贝的VP16的转录激活因子，例如包含通过Gly-Ser接头连接的四个串联拷贝VP16的分子。VP160是一种包含10个VP16拷贝的转录激活因子。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括包含与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝的VP16融合的dCas9分子的融合分子。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与VP64融合的dCas9分子。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与VP160融合的dCas9分子。在一个实施方式中，VP64被融合到dCas9分子的C-端、N-端或N-端和C-端两者。
p65激活结构域(p65AD)
p65AD是F-κΒ转录因子的核形式的65kDa多肽的主要反式激活结构域。人类转录因子p65的示例性序列可以在Uniprot数据库中以登录号Q04206获得。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与p65或其片段例如p65AD融合的dCas9分子。
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)R反式激活因子(Rta)
Rta这种EBV的即刻早期蛋白是一种转录激活因子，其诱导裂解基因表达并触发病毒再激活。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与Rta或其片段融合的dCas9分子。
VP64、p65、Rta融合体
在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与VP64、p65、Rta或其任何组合融合的dCas9分子。三元激活因子VP64-p65-Rta(也被称为VPR)，其中三个转录激活结构域使用短氨基酸接头融合，当与dCas9分子融合时，可以有效地上调靶基因表达。在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括包含与VPR融合的dCas9分子。
协同激活介导物(SAM)
在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括CRISPR-Cas系统，其包含三种组分：(1)dCas9-VP64融合体，(2)在四环和茎环处掺入两个MS2 RNA适体的gRNA，以及(3)MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。这种被命名为协同激活介导物(SAM)的系统汇集了三个激活结构域—VP64、P65和HSFl，并已在Konermann et al.,Nature.2015；517:583-8中进行了描述，其整体通过引用并入本文。
Ldbl自缔合结构域
在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与Ldbl自缔合结构域融合的dCas9分子。Ldbl自缔合结构域募集增强子相关的内源性Ldbl。
表观遗传学修饰调节剂
在一个实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与基因表达调节剂融合的dCas9分子。在某些实施方式中，所述基因表达调节剂包括表观遗传修饰的调节剂。在一个实施方式中，所述融合分子通过表观遗传学修饰，例如通过组蛋白乙酰化或甲基化或在靶基因的调控元件例如启动子、增强子或转录起始位点处的DNA甲基化，来调节靶基因表达。所述调节剂可以是任何已知的表观遗传学修饰调节剂，例如组蛋白乙酰转移酶(例如p300催化结构域)、组蛋白脱乙酰基酶、组蛋白甲基转移酶(如SUV39H1或G9a(EHMT2))、组蛋白去甲基化酶(例如LSD1)、DNA甲基转移酶(例如DNMT3a或DNMT3a-DNMT3L)、DNA去甲基化酶(例如TET1催化结构域或TDG)或其片段。
组蛋白修饰活性
在某些实施方式中，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有组蛋白修饰活性。组蛋白修饰活性可以包括但不限于组蛋白脱乙酰酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白去甲基化酶或组蛋白甲基转移酶活性。
在某些实施方式中，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有组蛋白乙酰转移酶活性。所述组蛋白乙酰转移酶可以是p300或CREB结合蛋白(CBP)蛋白或其片段。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与乙酰转移酶p300或其片段例如p300的催化核心融合的dCas9分子。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与CREB结合蛋白(CBP)蛋白或其片段融合的dCas9分子。
在某些实施方式中，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有组蛋白去甲基化酶活性。例如，所述表观遗传学修饰调节剂可以包括从核酸或蛋白质(例如组蛋白)去除甲基(CH3-)基团的酶。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与Lys特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)或其片段融合的dCas9分子。
在某些实施方式中，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有组蛋白甲基转移酶活性。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与SUV39H1或其片段融合的dCas9分子。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与G9a(EHMT2)或其片段融合的dCas9分子。
DNA去甲基化酶活性
在某些实施方式中，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有DNA去甲基化酶活性。例如，所述表观遗传学修饰调节剂可以将甲基转化为羟甲基胞嘧啶作为DNA去甲基化的机制。在某些实施方式中，本文所公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶1(TET1)或其片段融合的dCas9分子。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)或其片段融合的dCas9分子。
DNA甲基化酶活性
在某些实施方式中，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有DNA甲基化酶活性。例如，所述表观遗传学修饰调节剂可以具有甲基化酶活性，其涉及将甲基转移到DNA、RNA、蛋白质、小分子、胞嘧啶或腺嘌呤。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与DNMT3A或其片段融合的dCas9分子。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与DNMT3L或其片段融合的dCas9分子。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与DNMT3L和DNMT3L或其片段融合的dCas9分子。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物包括融合分子，其包含与DNMT3A-DNMT3L融合肽融合的dCas9分子。
DNMT3A
DNMT3L
DNMT3A-DNMT3L融合肽
在一个实施方式中，所述Cas9融合蛋白还包含核定位序列(NLS)，例如融合到Cas9的N-端和/或C-端的LS。
核定位序列在本领域中是已知的。在一个实施方式中，所述NLS包含SEQ ID NO：25或26的氨基酸序列，与SEQ ID NO：25或26基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列，或相对于SEQ ID NO：25或26具有1、2、3、4、5个或更多个变化(例如氨基酸取代、插入或缺失)的序列，或其任何片段。
SEQ ID NO：25(示例性核定位序列)
APKKKRKVGIHGVPAA
SEQ ID NO：26(示例性核定位序列)
KRPAATKKAGQAKKKK
在某些实施方式中，所述基于CRISPR/Cas9的系统可以包括dCas9分子和基因表达调节剂或者编码dCas9分子和基因表达调节剂的核酸。在一个实施方式中，所述dCas9分子和基因表达调节剂被共价连接。在一个实施方式中，所述基因表达调节剂被直接共价融合到dCas9分子。在一个实施方式中，所述基因表达调节剂被间接共价融合到dCas9分子，例如通过非调节剂或接头或通过第二调节剂。在一个实施方式中，所述基因表达调节剂位于所述dCas9分子的N-端和/或C-端处。在一个实施方式中，所述dCas9分子和基因表达调节剂被非共价连接。示例性序列包括但不限于在表2中列出的那些。在某些实施方式中，所述dCas9与至少一种基因表达调节剂之间的接头包含对应于表2中列出的接头的氨基酸序列。
表2.示例性接头序列
在一个实施方式中，所述dCas9分子被融合到第一标签，例如第一肽标签。在一个实施方式中，所述基因表达调节剂被融合到第二标签，例如第二肽标签。在一个实施方式中，第一和第二标签例如第一肽标签和第二肽标签彼此非共价地相互作用，从而使dCas9分子和基因表达调节剂紧密接近。
在一个实施方式中，所述基于CRISPR/Cas9的系统包括融合分子或编码融合分子的核酸。在一个实施方式中，所述融合分子包括包含与基因表达调节剂融合的dCas9的序列。在一个实施方式中，所述dCas9分子包括化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9分子、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9分子、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9分子、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)dCas9分子、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9分子、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)dCas9分子、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)dCas9分子、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9分子、固氮螺菌属(Azospirillum)(菌株B510)dCas9分子、嗜重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)dCas9分子、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9分子、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)dCas9分子、Parvibaculum lavamentivorans dCas9分子、Nitratifractor salsuginis(菌株DSM16511)dCas9分子、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)(菌株CF89-12)dCas9分子、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(菌株LMD-9)dCas9分子或其片段。
在一个实施方式中，所述融合分子是DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB融合分子，其从N-端到C-端包含：直接或间接地(例如通过接头)融合的DNMT3A-DNMT3L融合肽(3A3L)、dCas9肽和KRAB肽结构域。
在一个实施方式中，所述融合分子包含融合分子，其包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列，与SEQ ID NO：97基本上相同(例如序列同一性为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的序列，或相对于SEQ ID NO：97具有1、2、3、4、5个或更多个变化(例如取代、插入或缺失)的序列，或其任何片段。
DNMT3A-DNMT3L(3A3L)-dCas9-KRAB
gRNA
在CRISPR-Cas系统的情况下，本文所使用的术语“引导序列”包括与靶核酸序列具有足够互补性以与靶核酸序列杂交并指导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。所述引导序列可以与靶序列形成双链体。所述双链体可以是DNA双链体、RNA双链体或RNA/DNA双链体。术语“引导分子”、“引导RNA”和“单一引导RNA”在本文中可互换使用，是指基于RNA的分子，其能够与CRISPR-Cas蛋白形成复合物，并包含与靶核酸序列具有足够互补性以与靶核酸序列杂交并指导复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的引导序列。如本文所述，引导分子或引导RNA特别地涵盖具有一个或多个化学修饰(例如通过化学连接两个核糖核苷酸或通过用一个或多个脱氧核糖核苷酸代替一个或多个核糖核苷酸)的基于RNA的分子。
CRISPR-Cas蛋白的引导分子或引导RNA可以包含tracr-mate序列(在内源CRISPR系统的情况下涵盖“正向重复序列”)和引导序列(在内源CRISPR系统的情况下也被称为“间隔区”)。在某些实施方式中，本文所述的CRISPR-Cas系统或复合物不包含tracr序列和/或不依赖于tracr序列的存在。在某些实施方式中，所述引导分子可以包含与引导序列或间隔序列融合或连接的正向重复序列、基本上由其组成或由其组成。
一般而言，CRISPR-Cas系统的特征在于促进在靶序列位点处形成CRISPR复合物的元件。在CRISPR复合物形成的情况下，“靶序列”是指引导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶DNA序列与引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。
在某些实施方式中，所述引导分子的引导序列或间隔区长度为15至50个核苷酸。在某些实施方式中，所述引导RNA的间隔区长度为至少15个核苷酸的长度。在某些实施方式中，所述间隔区长度为15至17个核苷酸、17至20个核苷酸、20至24个核苷酸、23至25个核苷酸、24至27个核苷酸、27至30个核苷酸、30至35个核苷酸或大于35个核苷酸。
在某些实施方式中，所述引导序列的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。
在某些实施方式中，选择引导分子的序列(正向重复序列和/或间隔区)以降低引导分子内的二级结构程度。在某些实施方式中，当最佳折叠时，所述靶向核酸的引导RNA的等于或少于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的核苷酸参与自互补碱基配对。最佳折叠可以通过任何适合的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序是基于计算最小吉布斯自由能。一个此类算法的实例是mFold，如Zuker and Stiegler(NucleicAcids Res.9(1981),133-148)中所描述的。另一种示例性折叠算法是在线网络服务器RNAfold，其在维也纳大学理论化学研究所使用质心结构预测算法开发(参见例如A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23-24和PA Carr and GM Church,2009,NatureBiotechnology 27(12):1151-62)。
如上所述，所述CRISPR/Cas9系统利用提供对基于CRISPR/Cas9的系统的靶向的gRNA。所述gRNA是两个非编码RNA的融合体：crRNA和tracrRNA。所述sgRNA可以通过交换编码20bp的前间隔序列的序列来靶向任何所需的DNA序列，所述前间隔序列通过与所需DNA靶的互补碱基配对赋予靶向特异性。gRNA模拟参与II型效应系统的天然存在的crRNA:tracrRNA双链体。这种双链体可以包括例如42个核苷酸的crRNA和75个核苷酸的tracrRNA，充当Cas9切割靶核酸的引导物。
在本文中可互换使用的术语“靶区域”、“靶序列”或“前间隔序列”是指基于CRISPR/Cas9的系统靶向的靶基因区域。所述基于CRISPR/Cas9的系统可以包括至少一个gRNA，其中所述gRNA靶向不同的DNA序列。所述靶DNA序列可以是交叠的。靶序列或前间隔序列后面是在前间区序列的3'末端处的PAM序列。不同的II型系统具有不同的PAM要求。例如，化脓性链球菌(S.pyogenes)II型系统使用“NGG”序列，其中“N”可以是任何核苷酸。
在某些实施方式中，施用到细胞的gRNA的数量可以是至少1个gRNA、至少2个不同的gRNA、至少3个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA、至少5个不同的gRNA、至少6个不同的gRNA、至少7个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA、至少9个不同的gRNA、至少10个不同的gRNA、至少11个不同的gRNA、至少12个不同的gRNA、至少13个不同的gRNA、至少14个不同的gRNA、至少15个不同的gRNA、至少16个不同的gRNA、至少17个不同的gRNA、至少18个不同的gRNA、至少19个不同的gRNA、至少20个不同的gRNA、至少25个不同的gRNA、至少30个不同的gRNA、至少35个不同的gRNA、至少40个不同的gRNA、至少45个不同的gRNA或至少50个不同的gRNA。
在某些实施方式中，施用到细胞的gRNA的数量可以在至少1个gRNA到至少50个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少45个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少40个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少35个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少30个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少25个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少20个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少16个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少12个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少8个不同的gRNA、至少1个gRNA到至少4个不同的gRNA、至少4gRNAs到至少50个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少45个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少40个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少35个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少30个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少25个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少20个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少16个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少12个不同的gRNA、至少4个不同的gRNA到至少8个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA到至少50个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA到至少45个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA到至少40个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA到至少35个不同的gRNA、8个不同的gRNA到至少30个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA到至少25个不同的gRNA、8个不同的gRNA到至少20个不同的gRNA、至少8个不同的gRNA到至少16个不同的gRNA或8个不同的gRNA到至少12个不同的gRNA之间。
在某些实施方式中，对gRNA进行选择以增加或减少靶基因的转录。在某些实施方式中，所述gRNA靶向靶基因(例如PCSK9)的转录起始位点(TSS)上游的区域，例如靶基因的转录起始位点上游0-1000bp之间的区域。在某些实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的转录起始位点上游0-50bp、0-100bp、0-150bp、0-200bp、0-250bp、0-300bp、0-350bp、0-400bp、0-450bp、0-500bp、0-550bp、0-600bp、0-650bp、0-700bp、0-750bp、0-800bp、0-850bp、0-900bp、0-950bp或0-1000bp之间的区域。在某些实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的转录起始位点上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内的区域。在一个实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的TSS上游0-300bp的区域。
在某些实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的转录起始位点下游的区域，例如靶基因的转录起始位点下游0-1000bp之间的区域。在某些实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的转录起始位点下游0-50bp、0-100bp、0-150bp、0-200bp、0-250bp、0-300bp、0-350bp、0-400bp、0-450bp、0-500bp、0-550bp、0-600bp、0-650bp、0-700bp、0-750bp、0-800bp、0-850bp、0-900bp、0-950bp或0-1000bp之间的区域。在某些实施方式中，所述gRNA靶向所述靶基因的转录起始位点下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内的区域。在一个实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的TSS下游0-300bp的区域。
前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)也可以被称为枯草杆菌蛋白酶/Kexin样蛋白酶PC9。人PCSK9具有1p32.3的细胞遗传学位置，并且基因组坐标在1号染色体正向链上的55,039,548-55,064,852位置处。BSND是正向链上PCSK9上游的基因。人PCSK9的NCBI基因ID为255738，Ref Seq登录号为NM_174936.4，Ref Seq登录号为NP_777596.2，并且Ensembl基因ID为ENSG00000169174。
小鼠PCSK9的基因组位置为4,4C7，并且具有NC_000070.07位置处的4号染色体的基因组序列。BSND是正向链上小鼠PCSK9上游的基因。小鼠PCSK9的NCBI基因ID为100102，Ref Seq登录号为NM_153565.2，Ref Seq登录号为NP_705793.1，并且Ensembl基因ID为ENSMUSG00000044254。
恒河猴(Macaca mulatta)PCSK9的基因组位置为NC_041754.1。ENSMMUG0000005740是正向链上猴PCSK9上游的基因。猴PCSK9的Ref Seq登录号为NM_001112660.1，Ref Seq登录号为NP_001106130.1，并且Ensembl基因ID为ENSMMUG00000005736。
本公开提供了靶向小鼠PCSK9靶基因的sgRNA序列。示例性的sgRNA包括但不限于表3中列出的那些。本公开还提供了靶向人PCSK9的sgRNA序列。示例性的sgRNA包括但不限于表4中列出的那些。本公开还提供了靶向猴PCSK9的sgRNA序列。示例性的sgRNA包括但不限于表5中列出的那些。
表3.示例性的小鼠PCSK9 sgRNA序列
描述 序列 SEQ ID NO：
小鼠PCSK9 sgRNA1 TGGACGCGCAGGCTGCCGGT SEQ ID NO：27
小鼠PCSK9 sgRNA2 CCACCTTCACGTGGACGCGC SEQ ID NO：28
小鼠PCSK9 sgRNA3 GTGGACGCGCAGGCTGCCGG SEQ ID NO：29
小鼠PCSK9 sgRNA4 CTCTCTCTTTCTGAGGCTAG SEQ ID NO：30
小鼠PCSK9 sgRNA5 CACGTGGACGCGCAGGCTGC SEQ ID NO：31
小鼠PCSK9 sgRNA6 TTAAGAGGGGGGAATGTAAC SEQ ID NO：32
小鼠PCSK9 sgRNA7 AACCTGATCCTTTAGTACCG SEQ ID NO：33
小鼠PCSK9 sgRNA8 TCAGAGAGGATCTTCCGATG SEQ ID NO：34
小鼠PCSK9 sgRNA9 GGATCTTCCGATGGGGCTCG SEQ ID NO：35
小鼠PCSK9 sgRNA10 GCGTCATTTGACGCTGTCTG SEQ ID NO：36
小鼠PCSK9 sgRNA11 TCATTTGACGCTGTCTGGGG SEQ ID NO：37
小鼠PCSK9 sgRNA12 GATCCTTTAGTACCGGGGCC SEQ ID NO：38
小鼠PCSK9 sgRNA13 TGCAGCCCAATTAGGATTTG SEQ ID NO：39
表4.示例性的人PCSK9 sgRNA序列
表5.示例性的猴PCSK9 sgRNA序列
在一个实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的启动子区。在一个实施方式中，所述gRNA靶向靶基因的增强子区。gRNA可以被分为靶结合区、Cas9结合区和转录终止区。所述靶结合区与靶基因中的靶区域杂交。设计此类靶结合区的方法在本领域中是已知的，参见例如Doench et al.,Nat Biotechnol.(2014)32:1262-7和Doench et al.,Nat Biotechnol.(2016)34:184-91，其整体通过引用并入本文。设计工具可在例如Feng Zhang实验室的target Finder、Michael Boutros实验室的Target Finder(E-CRISP)、RGEN Tools(Cas-OFFinder)、CasFinder和CRISPR Optimal Target Finder处获得。在某些实施方式中，所述靶结合区的长度可以在约15至约50个核苷酸之间(约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50个核苷酸的长度)。在某些实施方式中，所述靶结合区的长度可以在约19至约21个核苷酸之间。在一个实施方式中，所述靶结合区的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
在一个实施方式中，所述靶结合区与靶基因中的靶区域互补，例如完全互补。在一个实施方式中，所述靶结合区与靶基因中的靶区域基本互补。在一个实施方式中，所述靶结合区包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个与靶基因中的靶区域不互补的核苷酸。
在一个实施方式中，所述靶结合区被工程化改造以提高稳定性或延长半衰期，例如通过在靶结合区中掺入非天然核苷酸或修饰的核苷酸，通过去除或修饰RNA失稳序列元件，通过添加RNA稳定序列元件，或通过增加Cas9/gRNA复合物的稳定性。在一个实施方式中，所述靶结合区被工程化改造以增强其转录。在一个实施方式中，所述靶结合区被工程化改造，以减少二级结构的形成。在一个实施方式中，gRNA的Cas9结合区被修饰，以增强gRNA的转录。在一个实施方式中，gRNA的Cas9结合区被修饰，以改进Cas9/gRNA复合物的稳定性或组装。
递送系统
本公开还提供了用于将本文的系统和组合物的组分引入细胞、组织、器官或生物体的递送系统。递送系统可以包括一个或多个递送媒介物和/或运载物。
运载物
所述递送系统可以包括一个或多个运载物。所述运载物可以包括本文的系统和组合物的一个或多个组分。运载物可以包含下述一者或多者：i)编码一种或几种Cas蛋白的质粒；ii)编码一种或多种引导RNA的质粒，iii)一种或多种Cas蛋白的mRNA；iv)一种或多种引导RNA；v)一种或多种Cas蛋白；vi)其任何组合。在某些实例中，运载物可以包含编码一种或多种Cas蛋白和一种或多种(例如多种)引导RNA的质粒。在某些实施方式中，运载物可以包括编码一种或多种Cas蛋白的mRNA和一种或多种引导RNA。
在某些实例中，运载物可以包括一种或多种Cas蛋白和一种或多种引导RNA，例如采取核糖核蛋白复合物(RNP)的形式。所述核糖核蛋白复合物可以通过本文的方法和系统递送。在某些情况下，所述核糖核蛋白可以利用基于多肽的穿梭剂来递送。在一个实例中，所述核糖核蛋白可使用合成肽递送，所述合成肽包含可操作地连接到细胞穿透结构域(CPD)、富含组氨酸结构域和CPD的内体渗漏结构域(ELD)，例如在WO2016161516中所述。
物理递送
在某些实施方式中，所述运载物可以通过物理递送方法引入细胞。物理方法的实例包括显微注射、电穿孔和流体动力学递送。
显微注射
将运载物直接显微注射到细胞中可以实现高效率，例如高于90％或约100％。在某些实施方式中，显微注射可以使用显微镜和针头(例如直径为0.5-5.0μm)进行，以刺穿细胞膜并将运载物直接递送到细胞内的靶位点。显微注射可用于体外和离体递送。
可以显微注射包含编码Cas蛋白和/或引导RNA、mRNA和/或引导RNA的序列的质粒。在某些情况下，显微注射可用于i)将DNA直接递送到细胞核，和/或ii)将mRNA(例如体外转录的)递送到细胞核或细胞质。在某些实例中，显微注射可用于将sgRNA直接递送到细胞核，并将编码Cas的mRNA递送到细胞质，例如促进Cas的翻译和向细胞核的穿梭。
显微注射可用于产生基因修饰的动物。例如，可以将基因编辑运载物注射到合子中以允许有效的种系修饰。此类方法可以产生带有所需修饰的正常胚胎和足月小鼠幼崽。显微注射也可用于提供细胞基因组内特定基因的瞬时上调或下调，例如使用CRISPRa和CRISPRi。
电穿孔
在某些实施方式中，所述运载物和/或递送媒介物可以通过电穿孔递送。电穿孔可以使用脉冲高压电流在悬浮于缓冲液中的细胞的细胞膜内瞬时打开纳米尺寸的孔，允许流体动力学直径为几十纳米的组分流入细胞。在某些情况下，电穿孔可以用于各种细胞类型，并将运载物高效转移到细胞中。电穿孔可用于体外和离体递送。
电穿孔也可用于通过施加特定电压和试剂，例如通过核转染，将运载物递送到哺乳动物细胞的细胞核中。此类方法包括在下述文献中描述的那些：Wu Y,et al.(2015).Cell Res 25:67-79；Ye L,et al.(2014).Proc Natl Acad Sci USA 111:9591-6；ChoiPS,Meyerson M.(2014).Nat Commun 5:3728；Wang J,Quake SR.(2014).Proc Natl AcadSci 111:13157-62。电穿孔也可以用于体内递送运载物，例如使用Zuckermann M,et al.(2015).Nat Commun 6:7391中描述的方法。
流体动力学递送
流体动力学递送也可用于递送运载物，例如用于体内递送。在某些实例中，流体动力学递送可以通过将含有基因编辑运载物的大体积(8-10％体重)溶液快速推入受试者(例如动物或人类)的血流中来进行，例如对于小鼠而言通过尾静脉。由于血液是不可压缩的，因此大量液体可能导致流体动力学压力的增加，从而暂时增强对内皮细胞和实质细胞的渗透性，允许正常情况下无法穿过细胞膜的运载物进入细胞。这种方法可以用于递送裸露的DNA质粒和蛋白质。所递送的运载物可能富集在肝、肾、肺、肌肉和/或心脏中。
转染
运载物例如核酸，可以通过将核酸引入细胞的转染方法引入细胞。转染方法的实例包括磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状聚合物转染、热激转染、磁转染、脂质体转染、穿刺转染(impalefection)、光转染、专有试剂增强核酸摄取。
递送媒介物
所述递送系统可以包括一种或多种递送媒介物。所述递送媒介物可以将运载物递送到细胞、组织、器官或生物体(例如动物或植物)中。所述运载物可以被包装、携带或以其他方式与递送媒介物缔合。所述递送媒介物可以根据待递送运载物的类型和/或递送是体外和/或体内来选择。递送媒介物的实例包括本文描述的载体、病毒、非病毒媒介物和其它递送试剂。
根据本公开的递送媒介物可以具有小于100微米(μm)的最大维度(例如直径)。在某些实施方式中，所述递送媒介物的最大维度小于10μm。在某些实施方式中，所述递送媒介物可以具有小于2000纳米(nm)的最大维度。在某些实施方式中，所述递送媒介物可以具有小于1000纳米(nm)的最大维度。在某些实施方式中，所述递送媒介物可以具有小于900nm、小于800nm、小于700nm、小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于150nm或小于100nm、小于50nm的最大维度(例如直径)。在某些实施方式中，所述递送媒介物可以具有25nm至200nm之间范围内的最大维度。
在某些实施方式中，所述递送媒介物可以是或包含颗粒。例如，所述递送媒介物可以是或包含纳米颗粒(例如最大维度(例如直径)不超过1000nm的颗粒)。所述颗粒可以以不同形式提供，例如作为固体颗粒(例如金属如银、金、铁、钛、非金属、基于脂质的固体、聚合物)、颗粒的悬液或其组合。可以制备金属、电介质和半导体颗粒以及混合结构(例如核壳颗粒)。
载体
所述系统、组合物和/或递送系统可以包含一种或多种载体。本公开还包括载体系统。载体系统可以包含一种或多种载体。在某些实施方式中，载体是指能够运输与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体包括单链、双链或部分双链的核酸分子，包含一个或多个游离末端、无游离末端(例如环状)的核酸分子，包含DNA、RNA或两者的核酸分子，以及本领域中已知的其他各种多核苷酸。载体可以是质粒，例如可以例如通过标准的分子克隆技术插入额外DNA区段的环状双链DNA环。某些载体可能能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。某些载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。在某些实例中，载体可以是表达载体，例如能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。在某些情况下表达载体可用于在真核细胞中表达。在重组DNA技术中有用的常见表达载体通常采取质粒的形式。
载体的实例包括pGEX、pMAL、pRIT5、大肠杆菌表达载体(例如pTrc、pETlld)、酵母表达载体(例如pYepSecl、pMFa、pJRY88、pYES2和picZ)、杆状病毒载体(例如用于在昆虫细胞如SF9细胞中表达)(例如pAc系列和pVL系列)、哺乳动物表达载体(例如pCDM8和pMT2PC)。
载体可以包含i)Cas编码序列，和/或ii)单个或至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少32个、至少48个、至少50个引导RNA编码序列。在单个载体中，每个RNA编码序列都可以有启动子。可选地或此外，在单个载体中，可以存在控制(例如驱动转录和/或表达)多个RNA编码序列的启动子。
调控元件
载体可以包含一种或多种调控元件。所述调控元件可以可操作地连接到Cas蛋白、辅助蛋白、引导RNA(例如单一引导RNA、crRNA和/或tracrRNA)或其组合的编码序列。术语“可操作连接”意指以允许核苷酸序列表达的方式(例如在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)将感兴趣的核苷酸序列连接到调控元件。在某些实例中，载体可以包含：可操作连接到编码Cas蛋白的核苷酸序列的第一调控元件，以及可操作连接到编码引导RNA的核苷酸序列的第二调控元件。
调控元件的实例包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，例如多腺苷酸化信号和多聚U序列)。此类调控元件被描述在例如Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,AcademicPress,San Diego,Calif(1990)中。调控元件包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的元件，以及那些仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的元件(例如组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可以主要在所需的感兴趣组织例如肌肉、神经元、骨骼、皮肤、血液、特定器官(例如肝脏、胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中指导表达。调控元件也可以以时间依赖性方式，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式指导表达，其可以是也可以不是组织或细胞类型特异性的。
启动子的实例包括一种或多种pol III启动子(例如1、2、3、4、5种或更多种polIII启动子)、一种或多种pol II启动子(例如1、2、3、4、5种或更多种pol II启动子)、一种或多种pol I启动子(例如1、2、3、4、5种或更多种pol I启动子)或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和HI启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子。
病毒载体
所述运载物可以通过病毒递送。在某些实施方式中，使用病毒载体。病毒载体可以包括用于包装到病毒中的病毒衍生的DNA或RNA序列(例如逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)。病毒载体还包含由病毒携带的用于转染到宿主细胞中的多核苷酸。病毒和病毒载体可用于体外、离体和/或体内递送。
腺相关病毒(AAV)
本文的系统和组合物可以通过腺相关病毒(AAV)递送。AAV载体可用于此类递送。AAV属于依赖病毒属细小病毒科，是一种单链DNA病毒。在某些实施方式中，AAV可以提供所提供的DNA的持久来源，因为AAV递送的基因组材料可以无限期存在于细胞中，例如作为外源DNA或具有一些修饰，被直接整合到宿主DNA中。在某些实施方式中，AAV在人类中不引起任何疾病或与任何疾病相关。病毒本身能够高效地感染细胞，同时几乎不会唤起先天性或适应性免疫应答或相关毒性。
可用于本文的AAV的实例包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-8和AAV-9。AAV的类型可以根据待靶向的细胞来选择；例如，可以选择AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合用于靶向脑或神经元细胞；并且可以选择AAV4用于靶向心脏组织。AAV8可用于递送到肝脏。基于AAV-2的载体最初被提议用于CFTR递送到CF气道，其他血清型如AAV-1、AAV-5、AAV-6和AAV-9在各种肺上皮模型中表现出改进的基因转移效率。被AAV靶向的细胞类型的实例被描述在Grimm,D.et al,J.Virol.82:5887-5911(2008)和WO2021/183807A1中，其整体通过引用并入本文。
CRISPR-Cas AAV颗粒可以在HEK 293T细胞中产生。一旦产生了具有特定趋向性(tropism)的颗粒，它们就可以与天然病毒颗粒基本上相同的方式用于感染靶细胞系。这可能允许CRISPR-Cas组分在被感染的细胞类型中持续存在，也是这种递送版本特别适合于需要长期表达的情况的原因。可以使用的AAV的剂量和制剂的实例包括在美国专利号8,454,972和8,404,658中描述的那些。
多种策略可用于使用AAV递送本文的系统和组合物。在某些实例中，可以将Cas和gRNA的编码序列直接包装到一个DNA质粒载体上，并通过一个AAV颗粒递送。在某些实例中，AAV可用于将gRNA递送到先前已被工程化改造以表达Cas的细胞中。在某些实例中，Cas和gRNA的编码序列可以被制造成两个单独的AAV颗粒，用于靶细胞的共转染。在某些实例中，标志物、标签和其他序列可以包装在同一的AAV颗粒中，作为Cas和/或gRNA的编码序列。
慢病毒
本文的系统和组合物可以通过慢病毒递送。慢病毒载体可以用于此类递送。慢病毒是复杂的逆转录病毒，具有在有丝分裂和有丝分裂后的细胞中感染和表达其基因的能力。
慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)，其可以利用其他病毒的包膜糖蛋白靶向广泛的细胞类型；基于马传染性贫血病毒(EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体，其可用于眼部治疗。在某些实施方式中，具有靶向HIV tat/rev共享的共同外显子的siRNA、定位于核仁的TAR诱饵和抗CCR5特异性锤头状核酶的自失活慢病毒载体(参见例如DiGiusto et al.(2010)Sci Transl Med 2:36ra43)可用于和/或适用于本文的核酸靶向系统。
慢病毒可以用其他病毒蛋白例如水泡性口炎病毒的G蛋白制成假型。在这样做的过程中，慢病毒的细胞嗜性可以根据需要进行改变，使其范围或宽或窄。在某些情况下，为了提高安全性，第二代和第三代慢病毒系统可能将必需基因分开到三个质粒中，这可能会降低活病毒颗粒在细胞内意外重建的可能性。
在某些实例中，利用整合能力，慢病毒可用于创建包含各种基因修饰的细胞的文库，例如用于筛选和/或研究基因和信号传导通路。
腺病毒
本文的系统和组合物可以通过腺病毒递送。腺病毒载体可以用于此类递送。腺病毒包括具有含有双链DNA基因组的二十面体核衣壳的非包膜病毒。腺病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞。在某些实施方式中，腺病毒不整合到宿主细胞的基因组中，这可用于在基因编辑应用中限制CRISPR-Cas系统的脱靶效应。
非病毒媒介物
所述递送媒介物可以包括非病毒媒介物。通常，能够递送核酸和/或蛋白质的方法和媒介物可用于递送本文的系统和组合物。非病毒媒介物的实例包括脂质纳米颗粒、细胞穿透肽(CPP)、DNA纳米线团、金纳米颗粒、链球菌溶血素0、多功能包膜型纳米器件(MEND)、脂质包被的介孔二氧化硅颗粒和其他无机纳米颗粒。
脂质颗粒
所述递送媒介物可以包括脂质颗粒，例如脂质纳米颗粒(LNP)和脂质体。
脂质纳米颗粒(LNP)
LNP可以将核酸包封在阳离子脂质颗粒(例如脂质体)内，并且可以相对容易地递送到细胞。在某些实例中，脂质纳米颗粒不含任何病毒组分，这有助于将安全性和免疫原性降至最低。脂质颗粒可用于体外、离体和体内递送。脂质颗粒可用于各种规模的细胞群体。
在某些实例中，LNP可用于递送DNA分子(例如包含Cas和/或gRNA的编码序列的那些)和/或RNA分子(例如Cas的mRNA、gRNA)。在某些情况下，LNP可用于递送Cas/gRNA的RNP复合物。
在某些实施方式中，LNP用于递送mRNA和gRNA，例如包含DNMT3A-DNMT3L(3A-3L)-dCas9-KRAB和至少一种靶向PCSK9的sgRNA的mRNA融合分子。
LNP的组分可以包括阳离子脂质1,2-dilineoyl-3-dimethylammonium-propane(DLinDAP)、1,2-dilinoleyloxy-3-N,N-dimethylaminopropane(DLinDMA)、1,2-dilinoleyloxyketo-N,N-dimethyl-3-aminopropane(DLinK-DMA)、l,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[l,3]-dioxolane(DLinKC2-DMA)、(3-o-[2-(methoxypolyethyleneglycol 2000)succinoyl]-1,2-dimyristoyl-sn-glycol(PEG-S-DMG)、R-3-[(ro-methoxy-poly(ethylene glycol)2000)carbamoyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine(PEG-C-DOMG)及其任何组合。LNP的制备和包封可改编自Conway et al,Molecular Therapy,vol.27,no.4,pages 866-877,Apr.2019和Rosin etal,Molecular Therapy,vol.19,no.12,pages 1286-2200,Dec.201。
在某些实施方式中，LNP可以包含可电离脂质。在某些实施方式中，可电离脂质包括但不限于pH响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质。在某些实施方式中，可电离脂质包括在某些条件例如但不限于pH、温度或光下电离的阳离子脂质和阴离子脂质。在某些实施方式中，所述LNP的可电离脂质的摩尔比为20％至约70％(例如约20％至约70％、约20％至约65％、约20％至约60％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约20％至约25％、约30％至约70％、约30％至约65％、约30％至约60％、约30％至约55％、约30％至约50％、约30％至约45％、约30％至约40％、约30％至约35％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％、约40％至约55％、约40％至约50％、约40％至约45％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％、约50％至约55％、约60％至约70％或约60％至约65％)。在某些实施方式中，所述LNP的可电离脂质的摩尔比为约45％至约50％。
在某些实施方式中，LNP可以包含PEG化脂质。在某些实施方式中，所述LNP的PEG化脂质的摩尔比为0％至约30％(例如约0％至约30％、约0％至约25％、约0％至约20％、约0％至约15％、约0％至约10％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约10％至约15％、约20％至约30％或约20％至约25％)。在某些实施方式中，所述LNP的PEG化脂质的摩尔比为约1％。
在某些实施方式中，LNP可以包含支持性脂质。在某些实施方式中，所述LNP的支持性脂质的摩尔比为5％至约50％(例如约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约5％至约25％、约5％至约20％、约5％至约15％、约5％至约10％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约10％至约15％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约20％至约25％、约30％至约50％、约30％至约45％、约30％至约40％、约30％至约35％、约40％至约50％、约40％至约45％、约30％至约50％、约30％至约45％、约30％至约40％、约30％至约35％、约40％至约50％或约40％至约45％)。在某些实施方式中，所述LNP的支持性脂质的摩尔比为约9％。
在某些实施方式中，LNP可以包含胆固醇。在某些实施方式中，所述LNP的胆固醇的摩尔比为10％至约50％(例如约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约10％至约15％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约20％至约25％、约30％至约50％、约30％至约45％、约30％至约40％、约30％至约35％、约40％至约50％或约40％至约45％)。在某些实施方式中，所述LNP的胆固醇的摩尔比为约40％至约45％。
在某些实施方式中，LNP可以包含可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、PEG化脂质(0％-30％，摩尔比)、支持性脂质(30％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)的混合物。在某些实施方式中，所述LNP可以包含可电离脂质(45-50％，摩尔比)、PEG化脂质(1％，摩尔比)、支持性脂质(9％，摩尔比)和胆固醇(40-50％，摩尔比)的混合物。
脂质体
在某些实施方式中，脂质颗粒可以是脂质体。脂质体是由围绕内部水性区室的单层或多层脂质双层以及相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层组成的球形囊泡结构。在某些实施方式中，脂质体是生物相容、无毒的，可以递送亲水性和亲脂性药物分子两者，保护它们的运载物不被细胞质酶降解，并将它们的负载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)。
脂质体可以由几种不同类型的脂质制成，例如磷脂。脂质体可以包含天然磷脂和脂质，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱、单唾液酸神经节苷脂或其任何组合。
可以向脂质体添加几种其他添加剂，以便修改它们的结构和性质。例如，脂质体可以进一步包含胆固醇、鞘磷脂和/或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，以例如提高稳定性和/或防止脂质体内部运载物的泄漏。
稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)
在某些实施方式中，所述脂质颗粒可以是稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)。SNALP可以包含可电离脂质(DLinDMA)(例如在低pH下为阳离子)、中性辅助脂质、胆固醇、可扩散聚乙二醇(PEG)脂质或其任何组合。在某些实例中，SNALP可以包含合成胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、3-N-[(w-甲氧基聚乙二醇)2000]氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙胺和阳离子1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷。在某些实例中，SNALP可以包含合成胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、PEG-cDMA和1,2-二亚油基氧基-3-(N,N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA)。
其他脂质
所述脂质颗粒还可以包含一种或多种其他类型的脂质，例如阳离子脂质如氨基脂质2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、DLin-KC2-DMA4、Cl2-200和辅助脂质二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG。
脂质复合物和/或聚合复合物
在某些实施方式中，所述递送媒介物包含脂质复合物和/或聚合复合物。脂质复合物可以与带负电荷的细胞膜结合，并诱导细胞内吞。阳离子脂质复合物的实例可以是包含脂质和非脂质组分的复合物。脂质复合物和聚合复合物的实例包括FuGENE-6试剂、含有脂质和其他组分的非脂质体溶液、两性离子氨基脂质(ZAL)、Ca2p(例如形成DNA/Ca2+微复合物)、聚乙烯亚胺(PEI)(例如支链PEI)和聚(L-赖氨酸)(PLL)。
细胞穿透肽
在某些实施方式中，所述递送媒介物包括细胞穿透肽(CPP)。CPP是促进细胞摄取各种分子运载物(例如从纳米颗粒到小化学分子和DNA大片段)的短肽。
CPP可以具有不同的大小、氨基酸序列和电荷。在某些实例中，CPP可以易位质膜，并促进各种分子运载物向细胞质或细胞器的递送。CPP可以通过不同机制引入到细胞中，例如直接穿透到膜中、内吞介导的进入和通过形成临时结构的易位。
CPP可以具有包含相对丰度高的带正电荷氨基酸例如赖氨酸或精氨酸的氨基酸组成，或者具有包含极性/带电荷氨基酸和非极性疏水氨基酸的交替模式的序列。这两种类型的结构分别被称为聚阳离子型或两亲型。第三类CPP是疏水肽，仅含有具有低净电荷的非极性残基或具有对细胞摄取至关重要的疏水性氨基酸基团。另一种类型的CPP是来自人免疫缺陷病毒I(HIV-I)的反式激活转录激活因子(Tat)。CPP的实例包括穿透蛋白(Penetratin)、Tat(48-60)、穿膜肽(Transportan)和(R-AhX-R4)(AhX是指氨基己酰基)。CPP和相关应用的实例还包括在美国专利8,372,951中描述的那些。
CPP可以相当容易地用于体外和离体工作，并且通常需要对每种运载物和细胞类型进行广泛优化。在某些实例中，CPP可以直接共价连接到Cas蛋白，然后与gRNA复合并递送到细胞。在某些实例中，可以将CPP-Cas和CPP-gRNA分开递送到多个细胞。CPP也可用于递送RNP。
DNA纳米线团
在某些实施方式中，所述递送媒介物包括DNA纳米线团。DNA纳米线团是指DNA的球状结构(例如具有纱球的形状)。所述纳米线团可以使用有助于结构的自组装的回文序列通过滚环扩增来合成。然后可以用有效载荷装载所述球。DNA纳米线团的实例被描述在Sun Wet al,J Am Chem Soc.2014Oct 22；136(42):14722-5；和Sun Wet al,Angew Chem Int EdEngl.2015Oct 5；54(41):12029-33中。DNA纳米线团可能具有与Cas:gRNA核糖核蛋白复合物内的gRNA部分互补的回文序列。DNA纳米线团可以被包被，例如用PEI包被，以诱导内体逃逸。
金纳米颗粒
在某些实施方式中，所述递送媒介物包括金纳米颗粒(也被称为AuNP或胶体金)。金纳米颗粒可以与运载物例如Cas:gRNA RNP形成复合物。金纳米颗粒可以被包被，例如被包被在硅酸盐和内体破坏性聚合物PAsp(DET)中。金纳米颗粒的实例包括AuraSenseTherapeutics的球形核酸(SNATM)构建体，以及在Mout R,et al.(2017).ACS Nano 11:2452-8；Lee K,et al.(2017).Nat Biomed Eng 1:889-901中描述的那些。
iTOP
在某些实施方式中，所述递送媒介物包括iTOP。iTOP是指不依赖于任何转导肽驱动天然蛋白质的高效细胞内递送的小分子的组合。iTOP可用于由细胞渗透作用和丙烷甜菜碱诱导的转导，使用NaCl介导的高渗性与转导化合物(丙烷甜菜碱)一起触发细胞外大分子的大吞胞饮摄取(macropinocytotic uptake)到细胞中。iTOP方法和试剂的实例包括在D'Astolfo DS,Pagliero RJ,Pras A,et al.(2015).Cell 161:674-690中描述的那些。
基于聚合物的颗粒
在某些实施方式中，所述递送媒介物可以包括基于聚合物的颗粒(例如纳米颗粒)。在某些实施方式中，所述基于聚合物的颗粒可以模拟病毒的膜融合机制。所述基于聚合物的颗粒可以是流感病毒机制的合成拷贝，并与通过内吞途径(一种涉及酸性区室形成的过程)被细胞摄取的各种类型的核酸(siRNA、miRNA、质粒DNA或shRNA、mRNA)形成转染复合物。晚期内体中的低pH起到化学开关的作用，使颗粒的表面疏水，并促进穿膜。一旦进入胞质溶胶，颗粒就会释放其有效载荷用于细胞作用。这种主动内体逃逸(Active EndosomeEscape)技术是安全的，并最大限度地提高转染效率，因为它使用的是天然摄取途径。在某些实施方式中，所述基于聚合物的颗粒可以包含烷基化和羧基烷基化的支链聚乙烯亚胺。在某些实例中，所述基于聚合物的颗粒是VIROMER，例如VIROMER RNAi、VIROMER RED、VIROMER mRNA、VIROMER CRISPR。递送本文中的系统和组合物的方法的实例包括在下述文献中描述的那些：Bawage SS et al.,Synthetic mRNA expressed Casl3amitigates RNAvirus infections,www.biorxiv.org/content/l0.l l01/370460v1.full doi:doi.org/10.1101/370460,RED,a powerful tool for transfection ofkeratinocytes.doi:10.13140/RG.2.2.16993.61281,Transfection-Factbook2018:technology,product overview,users'data.,doi:10.13140/RG.2.2.23912.16642。
链球菌溶血素O(SLO)
所述递送媒介物可以是链球菌溶血素O(SLO)。SLO是一种由A组链球菌产生的毒素，其通过在哺乳动物细胞膜中产生孔来发挥作用。SLO可以以可逆的方式起作用，这允许将蛋白质(例如高达100kDa)递送到细胞的胞质溶胶，而不损害整体生存能力。SLO的实例包括在下述文献中描述的那些：Sierig G,et al.(2003).Infect Immun 71:446-55；WalevI,et al.(2001).Proc Natl Acad Sci US A 98:3185-90；Teng KW,et al.(2017).Elife6:e25460。多功能包膜型纳米器件(MEND)
所述递送媒介物可以包括多功能包膜型纳米器件(MEND)。MEND可以包括凝缩的质粒DNA、PLL核和脂质膜壳。MEND可以进一步包含细胞穿透肽(例如硬脂酰八精氨酸)。所述细胞穿透肽可以在脂质壳中。所述脂质包膜可以用一种或多种功能性组分修饰，例如下述一者或多者：聚乙二醇(例如以增加血管循环时间)、用于靶向特定组织/细胞的配体、其他细胞穿透肽(例如用于更大的细胞递送)、增强内体逃逸的脂质和核递送标签。在某些实例中，所述MEND可以是四层MEND(T-MEND)，其可以靶向细胞核和线粒体。MEND的实例包括在下述文献中描述的那些：Kogure K,et al.(2004).J Control Release 98:317-23；NakamuraT,et al.(2012).Ace Chem Res45:1113-21。
脂质包被的介孔二氧化硅颗粒
所述递送媒介物可以包括脂质包被的介孔二氧化硅颗粒。脂质包被的介孔二氧化硅颗粒可以包含介孔二氧化硅纳米颗粒核和脂质膜壳。所述二氧化硅核可以具有大的内部表面积，导致高的运载物装载能力。在某些实施方式中，可以修改孔径、孔化学性质和总颗粒尺寸，以装载不同类型的运载物。所述颗粒的脂质包层也可以被修饰，以最大限度地提高运载物载量，增加循环时间，并提供精确的靶向和运载物释放。脂质包被的介孔二氧化硅颗粒的实例包括在下述文献中描述的那些：Du X,et al.(2014).Biomaterials 35:5580-90；Durfee PN,et al.(2016).ACS Nano 10:8325-45。
无机纳米颗粒
所述递送媒介物可以包括无机纳米颗粒。无机纳米颗粒的实例包括碳纳米管(CNT)(例如在Bates Kand Kostarelos K.(2013).Adv Drug Deliv Rev65:2023-33中所描述的)、裸介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)(例如在Luo GF,et al.(2014).Sci Rep 4:6064中所描述的)和致密二氧化硅纳米颗粒(SiNP)(例如在Luo D and Saltzman WM.(2000).NatBiotechnol 18:893-5中所描述的)。
使用方法
本文的组合物和系统可用于各种应用，包括修饰非动物生物体例如植物和真菌和修饰动物，治疗和诊断植物、动物和人的疾病。通常，所述组合物和系统可以被引入到细胞、组织、器官或生物体中，在那里它们修饰一个或多个基因(例如PCSK9)的表达和/或活性。
在某些实施方式中，在引入有本文描述的组合物和系统的细胞中PCSK9基因产物的表达减少。在某些实施方式中，所述PCSK9基因产物表达的减少是暂时的。在某些实施方式中，PCSK9基因产物的表达减少是稳定的。在某些实施方式中，PCSK9基因产物表达的减少是可遗传的。
在某些实施方式中，被本文的组合物和系统修饰的多个细胞包含相对于未引入有本文描述的组合物和系统的细胞降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的PCSK9基因产物的表达。
在某些实施方式中，从被本文描述的组合物和系统修饰的多个细胞扩增或衍生的细胞也包含相对于从未引入有本文描述的组合物和系统的细胞扩增或衍生的细胞降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的PCSK9基因产物的表达。
细胞和生物体
本公开提供了包含所述工程化Cas蛋白、CRISPR-Cas系统、编码CRISPR-Cas系统的一个或多个组分的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体的细胞、组织、生物体。本公开还在本文所述的任何方法或组合物中提供了编码效应蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列被密码子优化以在真核生物或真核细胞中表达。在本公开的一个实施方式中，所述密码子优化的效应蛋白是本文讨论的任何Cas蛋白，并且针对在真核细胞或生物体中的可操作性而被密码子优化，例如本文中别处提到的此类细胞或生物体，例如但不限于酵母细胞或哺乳动物细胞或生物体，包括小鼠细胞、大鼠细胞和人类细胞或非人真核生物体例如植物。
在某些实施方式中，所述感兴趣的靶基因座的修饰可能产生：至少一种基因产物的表达被改变的真核细胞；至少一种基因产物的表达被改变的真核细胞，其中所述至少一种基因产物的表达提高；至少一种基因产物的表达被改变的真核细胞，其中所述至少一种基因产物的表达降低；或包含编辑的基因组的真核细胞。
在某些实施方式中，所述真核细胞可以是哺乳动物细胞或人类细胞。
在其他实施方式中，本说明书中描述的非天然存在的或工程化的组合物、载体系统或递送系统可用于：位点特异性基因敲除；位点特异性基因组编辑；RNA序列特异性干扰；或多重基因组工程。
本文还提供了一种来自本文所描述的细胞、细胞系或生物体的基因产物。在某些实施方式中，表达的基因产物的量可以大于或小于来自不具有改变的表达或编辑的基因组的细胞的基因产物的量。在某些实施方式中，所述基因产物与来自不具有改变的表达或编辑的基因组的细胞的基因产物相比可以被改变。
示例性疗法
本公开提供了所述CRISPR-Cas系统在治疗各种疾病和紊乱中的用途。在某些实施方式中，本文所述的公开涉及一种治疗方法，其中将细胞通过CRISPR或碱基编辑器进行编辑以调节至少一个基因，随后将编辑的细胞施用到有需要的患者。在某些实施方式中，所述编辑涉及敲入、敲除或敲低细胞中至少一个靶基因的表达。在特定实施方式中，所述编辑将可能包括一个或多个外显子的外源基因、小基因或序列以反式或天然或合成的反式方式插入到靶基因的基因座、热点基因座、基因的基因组位置的安全港基因座(其中可以引入新的基因或基因元件而不破坏相邻基因的表达或调控)中，或者通过插入或缺失编码靶基因的调控元件的DNA序列中的一个或多个突变进行校正。在某些实施方式中，所述编辑包括在靶细胞中的核酸(例如基因组DNA)中引入一个或多个点突变。
在某些实施方式中，所述治疗针对器官的疾病/紊乱，包括肝脏疾病、眼部疾病、肌肉疾病、心脏疾病、血液疾病、脑部疾病、肾脏疾病，或者可以包括针对自身免疫性疾病、中枢神经系统疾病、癌症和其他增殖性疾病、神经变性疾病、炎性疾病、代谢紊乱、肌肉骨骼紊乱等的治疗。
在某些实施方式中，所述疾病与高胆固醇有关，并提供了胆固醇(例如LDL)的调节。在某些实施方式中，调节受到靶基因PCSK9中的修饰的影响。PCSK9与例如但不限于下述的疾病和紊乱相关联：无β脂蛋白血症、腺瘤、动脉硬化、动脉粥样硬化、心血管疾病、胆结石、冠状动脉硬化、冠心病、非胰岛素依赖性糖尿病、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、高胰岛素血症、高脂血症、家族性合并性高脂血症、低β脂蛋白血症、慢性肾衰竭、肝病、肝肿瘤、黑色素瘤、心肌梗塞、嗜睡症、肿瘤转移、肾母细胞瘤、肥胖症、腹膜炎、弹性假黄瘤、脑血管意外、血管疾病、黄瘤病、外周血管疾病、心肌缺血、血脂异常、糖耐量受损、黄瘤病、多源性高胆固醇血症、继发性肝脏恶性肿瘤、痴呆症、超重、慢性丙型肝炎、颈动脉粥样硬化、Ha型高脂蛋白血症、颅内动脉粥样硬化、缺血性中风、急性冠脉综合征、主动脉钙化、心血管发病、lib型高脂蛋白血症、外周动脉疾病、II型家族性醛甾酮增多症、家族性低β脂蛋白血症、常染色体隐性高胆固醇血症、常染色体显性高胆固醇血症3、冠状动脉疾病、肝癌、缺血性脑血管意外和动脉硬化性心血管疾病NOS。使用本文描述的任何方法对PCSK9基因进行表观遗传学修饰可用于治疗、预防和/或减轻本文描述的疾病和紊乱的症状。
血脂异常是一种遗传疾病，其特征在于血液中脂质水平升高，导致动脉堵塞(动脉粥样硬化)的发生。这些脂质包括血浆胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白或低密度脂蛋白。血脂异常增加心脏病发作、中风或其他循环系统问题的风险。目前的治疗包括生活方式改变例如锻炼和饮食调整，以及使用诸如他汀类药物的降脂药物。非他汀类降脂药物包括胆汁酸螯合剂、胆固醇吸收抑制剂、纯合家族性高胆固醇血症药物、贝特类药物、烟酸、ω-3脂肪酸和/或组合产品。治疗方案通常取决于具体的脂质异常，尽管不同的脂质异常往往共存。儿童的治疗更具挑战性，因为饮食改变可能很难实施，而且降脂疗法尚未被证明有效。使用本文描述的任何方法对PCSK9基因进行表观遗传学修饰可用于治疗、预防和/或减轻血脂异常(例如LDL失调)的症状。
PCSK9的活性主要局限于肝脏，并且PCSK9与血脂异常、PCSK9相关的家族性高胆固醇血症、高胆固醇血症(家族性)、胃乳头状腺癌、纯合家族性高胆固醇血症和鼻咽炎有关。PCSK9相关的家族性高胆固醇血症是一种(常染色体显性)遗传疾病，其中身体由于缺乏低密度脂蛋白胆固醇受体而出现危险的血液胆固醇水平。PCSK9相关的家族性高胆固醇血症影响全世界人口中杂合子的500分之一至纯合子的1,000,000分之一之间，并且在南非白人、法裔加拿大人、黎巴嫩基督徒和芬兰人中更为常见。PCSK9相关家族性高胆固醇血症的常见症状包括单独的低密度脂蛋白中或者也包括极低密度脂蛋白质中所含的循环胆固醇升高。目前PCSK9相关家族性高胆固醇血症的治疗方法包括施用他汀类药物以抑制肝脏中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)。治疗PCSK9相关家族性高胆固醇血症的另一个选择是依折麦布，以抑制肠道中胆固醇的吸收。
在某些实施方式中，本文描述的任何方法的PCSK9基因的表观遗传学修饰可以靶向肝脏，即PCSK9活性的主要位置。
实施例
实施例1：融合分子质粒构建和敲低效率
构建了两个质粒以形成“EPICAS”系统(可以与“CRISPRoff”系统互换使用)(图1A)。“融合分子”或“催化蛋白”质粒编码dCas9、DNMT3A、DNMT3L和KRAB肽。融合的DNMT3A和DNMT3L(3A3L)肽位于dCas9的N-端，KRAB位于dCas9的C-端。因此，所述融合分子从N-端到C-端具有3A3L-dCas9-KRAB。“sgRNA”质粒编码靶向PCSK9基因的sgRNA序列。设计了多个sgRNA以靶向小鼠PCSK9基因的转录起始位点(TSS)上游和下游250bp以内的区域。
将各个sgRNA质粒与催化蛋白质粒共转染到小鼠AML12细胞系中。72小时后，通过FACS对前10％的GFP+和mCherry+细胞进行分选。进行RT-QPCR实验以评估Pcsk9的mRNA表达水平。所测试的13种sgRNA中有12种在AML12细胞中显示出Pcsk9的表达显著下调。用sgRNA9转染的细胞显示出高达约82％的有效敲低(图1B)。
接下来，测试了sgRNA9与其他各个sgRNA的组合，以确定超过一种sgRNA的组合是否可以进一步降低AML12细胞中Pcsk9的基因表达水平(图1C)。在所测试的组合中，sgRNA7和sgRNA9一起显示出最高的抑制水平。还测试了sgRNA的各个组合，以确定超过一种sgRNA的组合是否可以降低Ai9原代肝细胞中Pcsk9的基因表达水平(图1D)。所有组合均显著敲低Pcsk9的表达水平。在用sgRNA7、sgRNA8和sgRNA9共转染的细胞中观察到最低的降低。Pcsk9沉默在原代肝细胞中持续至少两周以上，并且sgRNA7和sgRNA9的组合显示出对PCSK9基因表达的最高抑制效率(高达81％)。总之，这表明EPICAS系统可用于在小鼠肝细胞中诱导Pcsk9基因的高效且持久的沉默。
实施例2：编码融合分子的mRNA的体外转录
使用体外转录和纯化来产生对应于EPICAS系统的融合分子或催化蛋白的mRNA。首先，构建了含有包括5’UTR-DNMT3A-DNMT3L-dCas9-KRAB-3’UTR-polyA表达盒在内的所有融合分子元件的质粒。通过XbaI和BpiI限制性内切酶消化将质粒序列线性化(图2A)。进行含有线性化DNA模板、T7 RNA聚合酶、NTP和帽类似物的体外转录反应，以产生含有N1-甲基假尿苷的mRNA。在用DNaseI消化DNA模板后，对mRNA产物进行纯化和缓冲液交换，并用毛细管凝胶电泳评估最终mRNA产物的纯度(图2B)。由商业供应商在固相合成条件下以最小的末端修饰化学合成了100-mer sgRNA。为了测试体外转录的mRNA的功能，在HEK293T细胞中构建了Snrpn-GFP报告系统(图2C)。该报告系统使用合成的甲基化感应启动子(来自印记基因Snrpn的启动子的保守序列元件)控制GFP的表达。该报告构建体在基因组基因座中的插入显示了邻近序列的甲基化状态。将上述体外转录的mRNA与靶向Snrpn基因的sgRNA共转染到报告细胞中。转染后8天，报告细胞中25.3％的细胞为GFP阴性，显著高于用非靶向sgRNA转染的对照组(图2D)。将GFP阴性细胞通过FACS进行分选并培养30天。在转染后30天，报告系统中93.2％的细胞为GFP阴性，而对照组中几乎没有发现GFP阴性细胞(图2D、2E)。在转染后70天和90天，报告系统中分别有86.1％和87.3％的细胞为GFP阴性(图2I)。在转染后150天和400天(即多达～400次细胞分裂)，报告系统中分别有92.7％和88.1％的细胞为GFP阴性。这表明使用CRISPRoff系统进行的表观基因组编辑的持久性(图2D)。此外，通过亚硫酸氢盐PCR测定法分析了Snrpn基因座上的DNA甲基化水平。报告细胞(GFP-OFF组)的甲基化水平显著高于对照细胞(GFP-ON组)(图2F)。这一结果伴随着在Snrpn基因座上观察到的高CpG甲基化(图2F、2G、2I)。总之，这些结果表明，EPICAS系统的瞬时表达和mRNA扫描在长时间段内使靶基因的表达沉默。
实施例3：编码融合分子的mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒包封LNP制剂和特征
使用本领域已知的标准方法配制LNP，用于将融合分子mRNA和sgRNA递送至人肝细胞。对于小鼠研究而言，LNP如前所述配制，并进行了一些修改(1)。简而言之，使用(在线)混合器将1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇、PEG脂质和可电离阳离子脂质的乙醇溶液与含有mRNA和sgRNA(1:1重量比)的水性溶液(pH 4)以1:3的流量比(乙醇：水相)快速混合。在整个研究过程中，将可电离脂质与核酸之间的N:P比例维持在4-6。
将得到的LNP制剂对1×PBS透析过夜，0.2μm除菌过滤并在4℃下储存直至使用。通过动态光散射(Malvern NanoZS Zetasizer)测定，颗粒尺寸在70-90nm(Z-Ave，流体动力学直径)的范围内，并且多分散指数<0.2。通过Quant-iT Ribogreen Assay(LifeTechnologies)测量RNA在LNP中的包封效率。
Cryo-TEM样品制备和成像
在95％相对湿度下，将LNP样品(3-5μl)分配到FEI Vitrobot室中的等离子体清洁的网(Quantifoil，R1.2/1.3 300或400铜网)上，并静置30-60s。然后，将网用滤纸吸干3s，并浸入由液氮冷却的液态乙烷中。在FEI Talos F200C上进行Cryo-EM成像，在200kV加速电压下运行。
LNP含有重量比为1:1的融合分子mRNA和靶向Pcsk9基因的sgRNA(图3A)。使用精心设计的撞击流反应器或微流体装置，使用可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、PEG化脂质(0％-30％，摩尔比)、支持性脂质(30％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)的混合物配制脂质纳米颗粒(LNP)。通过改变可电离脂质的比例，可以改变sgRNA和mRNA的释放动力学。使用较高比例的可电离脂质(摩尔比高于55％)时，sgRNA的释放比mRNA快得多。透射电子显微镜(TEM)图像显示LNP是球形和纳米尺寸的颗粒(图3B)。使用动态光散射(NanoSZ，Malvern)，LNP具有均匀的尺寸(78.2±5.2nm，PDI<0.10)(图3C)。
实施例4：在小鼠中使用LNP递送编码融合分子的mRNA和sgRNA进行PCSK9基因沉默
接下来，测试了使用EPICAS系统(也被称为“CRISPRoff”系统)在体内沉默Pcsk9表达。将LNP通过尾侧静脉注射施用到C57CB/6J小鼠(图3E)。注射后五天，对小鼠实施安乐死，获得肝脏样品并进行处理，以纯化mRNA。进行RT-QPCR实验以评估小鼠中Pcsk9基因的敲低效率。LNP注射的小鼠中Pcsk9的表达水平显著低于对照组(图3F)，表明EPICAS系统在体内沉默Pcsk9基因表达方面的功效。
为了测试LNP是否可以在体内成功地将mRNA递送到小鼠肝细胞，产生了含有荧光素酶mRNA的LNP，并通过肌肉内注射将其注射到野生型小鼠中。
体内Luc mRNA递送
为了检测Luc mRNA-LNP的体内分布，对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(n＝5)体内注射5μg Luc mRNA。在规定的检测时间点，对小鼠注射0.2ml D-荧光素(15mg/ml，在DPBS中)，并使用IVIS Lumina系统(Perkin Elmer)成像。
对于体外成像而言，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(n＝2)注射5μgLuc mRNA。12小时后，对动物腹膜内(i.p.)注射0.2mL D-荧光素(15mg/ml，在DPBS中)，然后反应5分钟。立即收集包括心、肝、脾、肺和肾在内的组织，并通过IVIS Lumina系统监测各组织的荧光信号。
通过体内荧光成像，显示LNP高效地将萤光素酶mRNA递送到小鼠肝细胞中(图3D)。结果表明，LNP还可以通过尾静脉注射将相对较大尺寸的mRNA高效地递送到小鼠肝脏中，如图所示，几乎所有肝细胞均表现出tdTomato荧光(图6A)。此外，LNP递送的荧光素酶mRNA在注射后6hr在小鼠肝脏中积累(图6B)，在注射后12hr和24hr在小鼠肝脏中逐渐减少，并在注射后48hr在肝脏中不存在(图6C)。
小鼠的LNP治疗
小鼠研究由北京维通利华实验动物技术有限公司和SLAC实验室批准并用于实验。将Ai9(C57BL/6J遗传背景)和C57BL/6J野生型小鼠在无特定病原体的饲养条件和12h光照/12h黑暗的循环中饲养。动物的使用和护理符合中国科学院上海生命科学研究院生命科学伦理委员会的指导方针。雄性C57BL/6J小鼠在8-10周龄时用于实验，将小鼠随机分配到各个实验组，并以盲法方式进行数据收集和分析。将LNP在200μl PBS中通过尾侧静脉注射施用到小鼠。在指定时间点处死小鼠，在尸检中获得肝脏样品和血清，用于RNA提取或血清生物化学分析。
对于C57CB/6J成年野生型小鼠中的CRISPRoff递送而言，通过LNP的静脉内注射递送重量比为1:1的CRISPRoff mRNA和sgRNA(sgRNA 7(SEQ ID NO：33)和sgRNA 9(SEQ IDNO：35))(图9A、9B)。在注射后7天收集肝组织用于qPCR分析。与注射PBS的对照小鼠相比，Pcsk9的表达显著降低(图6D)。进一步的研究显示，剂量为1.5、3.0、6.0和10mg/kg的含有CRISPRoff的LNP导致对Pcsk9表达的76％、93％、97％和98％的抑制，在3.0mg/kg时出现近平台效应(图6D)。在CRISPRoff治疗的小鼠中，血液中的Pcsk9蛋白水平也显著降低，其剂量依赖性类似于肝组织中的Pcsk9表达(图6E)。在3.0和6.0mg/kg下观察到在Pcsk9基因启动子处高水平的DNA甲基化，而血液化学(AST、ALT、ALP和ALB)未见异常(图9C、9D)。
肝脏切除和再生后稳定的PCSK9甲基化和降低的表达
部分肝切除术(PHx)诱导的肝再生小鼠模型
小鼠部分肝切除术(PHx)如前所述进行(2)。简而言之，我们使用了全身麻醉，上中线小切口，丝线缝合来绑住待切除的肝叶，温热垫和灯，以及皮下盐水注射以确保将发病率降至最低。
高脂肪饮食诱导的高胆固醇血症鼠类模型
高脂肪饮食小鼠从江苏集萃药康生物科技股份有限公司(南京，中国)获得。将小鼠在无特定病原体饲养条件和12h光照/12h黑暗的周期下饲养，并用高脂肪饮食，即从Research Diets,Inc.(New Brunswick,NJ)获得的60kcal％饱和(猪油)脂肪饮食(HFD)喂养24周。选择血液LDL-c水平大于25mg/dL的小鼠进行实验。
接下来，评估在6mg/kg剂量下CRISPRoff诱导的Pcsk9降低的持久性。在CRISPRoff治疗的小鼠的血液中，在LNP注射后2、4、6和8周，Pcsk9的蛋白质表达水平分别降低88％、81％、82％和77％，表明CRISProfff在体内对靶基因的持续沉默(图6F)。为了进一步证明CRISPRoff介导的表观基因组编辑的可遗传性，进行了肝切除实验以测量肝再生后的基因沉默效应。具体而言，在第0天向小鼠施用含有CRISPRoff的LNP，并在第7天进行部分肝切除术(PHx)(14)或假手术(图6G)。在第14天收集PHx实验后的肝组织样品，此时肝再生几乎完成(图6G)。PHx后肝脏中Pcsk9mRNA的表达显示出与假手术组中相似的降低水平(93+/-11％和92％+/-9％，P<0.0001，t-检验)(图6H)。此外，在PHx后，Pcsk9启动子处的CpG甲基化维持高水平(图6I)。在PHx后期由于大量肝细胞通过细胞分裂再生，这些结果表明CRISPRoff介导的表观基因组编辑在体内细胞分裂过程中是可遗传的，这有利于治疗设计。
高脂肪饮食喂养的小鼠中血液LDL的持续降低
已显示血清LDL-C水平随着高脂肪饮食(HFD)的增加而增加(15)。评估了在喂食HFD的小鼠中表观基因组编辑对降低Pcsk9水平的影响。具体而言，将6周龄雄性C57BI/6J小鼠用HFD喂养6个月，然后通过尾静脉注射用包封有CRISPRoff mRNA以及Pcsk9靶向sgRNA的LNP或PBS处理(图7A)。在注射后7天和14天，与PBS组相比，在4mg/kg和6mg/kg的剂量下血液中的Pcsk9水平显著降低(图7B、7C)。此外，在4mg/kg和6mg/kg下，血清LDL-C水平在注射后14天分别降低约44％和约58％，并在注射后21天分别降低约43％和约51％(图7D)。这些结果表明，通过表观基因组编辑降低Pcsk9可以高效且持久地降低HFD小鼠中的血清LDL-C水平，这在治疗设计中是有利的。
无脱靶效应的EPICAS系统对PCSK9的精准沉默
为了研究表观基因组编辑的潜在脱靶效应，评估了CRISPRoff编辑在转录组和基因组两种水平上的特异性。在LNP递送CRISPRoff mRNA和Pcsk9靶向sgRNA后7天，对小鼠肝组织进行RNA-seq。在CRISPRoff处理的小鼠中全转录组基因表达水平，除了靶基因Pcsk9的表达水平被沉默以外，与PBS处理的小鼠没有显著差异(图8A和图10A)。距Pcsk9 1-Mb窗口内的邻近基因的表达水平在两组小鼠之间也没有表现出显著差异(图8B)。在CRISPRoff处理组中观察到几个具有超过2倍变化(FDR<0.05)的非靶转录物(图10B)，但在CRISP-off和PBS处理的小鼠之间，这些非靶转录物上的DNA甲基化水平没有显示出显著差异(图10B)。此外，进行了高通量全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)，以检查肝组织上CpG的脱靶甲基化。除了Pcsk9之外，在所有CpG位点处的甲基化水平在两组小鼠之间没有显著差异，这表明在CRISPRoff处理的小鼠中Pcsk9启动子处的DNA甲基化的显性增加(图8C)。详细的检查揭示，DNA甲基化仅在被sgRNA靶向的启动子区上调，而没有扩散到Pcsk9基因体或邻近基因(图8D和图10C)。对非靶差异甲基化区域处或附近的基因的检查没有揭示出转录差异(图10D)，这表明非特异性甲基化差异对基因表达几乎没有影响。我们还比较了潜在sgRNA依赖性脱靶位点(与在靶基因座具有高序列相似性)的甲基化和基因表达水平，并发现在CRISPRoff和PBS处理的小鼠之间没有显著差异(图8E)。这些结果共同证明，表观遗传学介导的基因沉默在体内诱导很少的sgRNA非依赖性和sgRNA依赖性脱靶效应。
总之，结果证明，EPICAS(CRISPRoff)系统可以高效抑制靶基因Pcsk9在小鼠肝脏中的表达高达98％，其功效高于现有药物(他汀类药物、抗体和siRNA)和当前使用CRISPR/Cas9或碱基编辑器的基因编辑技术(8-12)。使用EPICAS(CRISPRoff)系统的无切割表观基因组编辑降低了在靶基因座处进行不必要的DNA修复介导编辑的潜在风险，这对人类治疗设计是有益的。它也没有诱导可检测的脱靶DNA甲基化和基因表达的改变。这种CRISPRoff诱导的甲基化可以通过CRISPR介导的去甲基化工具逆转(4)。值得注意的是，使用CRISProff mRNA的瞬时递送，靶基因的CRISPRoff依赖性下调在多轮细胞分裂后持续存在。使用LNP的基因编辑工具的体内递送可能比AAV更好，因为由AAV递送导致的编辑工具的长期表达既不必要也不可取。瞬时LNP介导的mRNA递送避免了由编辑器的长时间存在引起的脱靶效应以及AAV的其他副作用，例如免疫应答和编辑工具的基因组整合(16)。最后，表观基因组编辑诱导的Pcsk9沉默和血液LDL-C降低是稳健且持久的，为FH的治疗提供了潜在的治疗策略。此类方法也可应用于其他慢性疾病的治疗。
实施例5：猴细胞中的猴PCSK9基因沉默
设计了多种sgRNA以靶向猴Pcsk9基因的转录起始位点(TSS)上游和下游250bp内的区域(图4A)。
将各个sgRNA质粒与催化蛋白(DNMT3A-DNMT3L-dCas9-KRAB)质粒共转染到猴细胞中。进行RT-QPCR实验以评估猴Pcsk9的mRNA表达水平。所测试的5种sgRNA中有3种在猴细胞中显示出Pcsk9的表达显著下调(图4B)。用S2、S8或S9 sgRNA转染的细胞导致猴Pcks9下调约90％。
实施例6：人类细胞系中的人PCSK9基因沉默
构建了报告细胞系以测试在人类细胞系中PCKS9基因沉默的效率。构建具有CMV启动子驱动盒的质粒，其中所述盒在5’至3’方向上具有下述元件：5’-pCMV--300bp-TSS-+300bp-PCSK9外显子1-2A-GFP-3’。在该报告系统中，CMV启动子驱动PCSK9和GFP荧光的表达。若PCSK9被沉默，则GFP的转录被终止。将该报告质粒与PiggyBac转座酶(PBase)质粒一起转染到HEK293T细胞中。根据GFP荧光的表达，通过FACS对成功整合有报告基因盒的细胞进行分选(图5A)。
设计了109种sgRNA用于靶向PCSK9 TSS上游300bp和下游300bp的区域。构建了质粒以编码每种sgRNA。将各个sgRNA质粒与编码融合分子的质粒共转染到人类报告细胞系中。分析了转染后72h和120h平均GFP强度率的降低。GFP强度率的总体降低指示了报告系统的灵敏度(图5B)。在转染后降低的GFP强度率维持了120h。与转染后72h相比，许多sgRNA在120h显示出低得多的GFP强度率。这些结果表明EPICAS系统在人类细胞系中的功效和持久性。
接下来，使用每种sgRNA重复实验，并在转染后72h测量平均GFP强度率以进行比较(图5C)。超过一半的所设计的sgRNA显示出平均荧光强度率的显著降低，表明EPICAS系统可以诱导人类细胞中PCSK9表达的靶向敲低。
接下来，在人Hep3B细胞系中测试了EPICAS系统在沉默内源性PCSK9表达中的用途。将编码融合分子的质粒与各种sgRNA质粒共转染到Hep3B细胞中。转染后48h，通过RT-PCR测量人PCSK9的mRNA表达水平。六种sgRNA导致PCSK9表达水平的最高下降(约>65％)。这些sgRNA还导致报告人类细胞系中荧光强度率降低约>50％(图5D)。这些结果表明，EPICAS系统可以在人类细胞中高效、长效地沉默内源性PCSK9的表达。
总之，这些结果表明，EPICAS系统在小鼠细胞和人类细胞均成功沉默了PCSK9的表达，并且高效且持久性地支持通过表观遗传学编辑来沉默PCSK9基因表达。LNP已被成功地用于体内递送EPICAS系统。因此，EPICAS系统的LNP制剂可以通过降低PCSK9的表达从而降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL)，用于治疗PCSK9相关疾病例如动脉粥样硬化性心血管疾病。
本公开的其他实施方式包括以下内容：
实施方式1.一种用于在细胞中减少或消除前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)基因产物的表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而减少或消除所述细胞中所述PCSK9基因产物的表达。
实施方式2.一种减少或消除受试者中PCSK9基因产物的表达的体内方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而减少或消除所述受试者中所述PCSK9基因产物的表达。
实施方式3.一种减少受试者中低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而减少所述受试者中的LDL胆固醇。
实施方式4.一种治疗或缓解受试者中PCSK9相关疾病的症状的方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而治疗或缓解所述受试者中PCSK9相关疾病的症状。
实施方式5.一种扩增PCSK9基因产物的表达减少的细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤：
i)将包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子或编码所述融合分子的核酸序列引入到多个细胞中，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰；
ii)扩增所述多个细胞以产生具有PCSK9基因产物的表达减少的多个修饰细胞，
其中相对于未引入所述所述融合分子或所述核酸序列的细胞，所述多个修饰细胞的PCSK9基因产物表达减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％，并且
其中所述细胞是肝细胞。
实施方式6.根据实施方式5所述的方法，其中所述PCSK9基因产物的表达减少是瞬时减少。
实施方式7.根据实施方式5所述的方法，其中所述PCSK9基因产物的表达减少是稳定减少。
实施方式8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述PCSK9调控元件是核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘子元件、边界元件或基因座控制区。
实施方式9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。
实施方式10.根据实施方式9所述的方法，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内。
实施方式11.根据实施方式9所述的方法，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游300bp以内。
实施方式12.根据实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。
实施方式13.根据实施方式12所述的方法，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约300bp以内。
实施方式14.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内和所述转录起始位点下游300bp以内。
实施方式15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，其中所述至少一个核苷酸的修饰是DNA甲基化。
实施方式16.根据实施方式1-15中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶(DNMT)、DNA去甲基化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或其部分。
实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶(DNMT)或其部分。
实施方式18.根据实施方式17所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶是DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。
实施方式19.根据实施方式18所述的方法，其中所述DNMT3A包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
实施方式20.根据实施方式18所述的方法，其中所述DNMT3L包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
实施方式21.根据实施方式1-20中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
实施方式22.根据实施方式21所述的方法，其中所述基于锌指蛋白的转录因子是Kruppel相关抑制盒(KRAB)。
实施方式23.根据实施方式22所述的方法，其中所述KRAB包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
实施方式24.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶或其部分以及基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
实施方式25.根据实施方式24所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶选自DNMT3A和DNMT3L及其组合，并且所述基于锌指蛋白的转录因子是KRAB。
实施方式26.根据实施方式1-25中任一项所述的方法，其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
实施方式27.根据实施方式26所述的方法，其中所述至少一种DNA结合蛋白是dCas9。
实施方式28.根据实施方式27所述的方法，其中所述dCas9包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)dCas9、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)dCas9、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)dCas9、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9、固氮螺菌属(Azospirillum)(例如菌株B510)dCas9、Gluconacetobacter diazotrophicus dCas9、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)dCas9、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)dCas9、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(例如菌株DSM16511)dCas9、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)(例如菌株CF89-12)dCas9、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(例如菌株LMD-9)dCas9。
实施方式29.根据实施方式27所述的方法，其中所述dCas9包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
实施方式30.根据实施方式1-29中任一项所述的方法，其中所述融合分子包含与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者融合的至少一种基因表达调节剂。
实施方式31.根据实施方式30所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂与所述至少一种DNA结合蛋白直接融合。
实施方式32.根据实施方式30所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂通过非调节剂、第二调节剂或接头与所述至少一种DNA结合蛋白间接融合。
实施方式33.根据实施方式30-32中任一项所述的方法，其中所述融合分子包含在C-端末端上融合有KRAB并在N-端末端上融合有DNMT3A和DNMT3L的dCas9。
实施方式34.根据实施方式33所述的方法，其中所述融合分子包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。
实施方式35.根据实施方式1-34中任一项所述的方法，其中所述融合分子还包含至少一个核定位序列。
实施方式36.根据实施方式35所述的方法，其中所述至少一个核定位序列与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者直接融合。
实施方式37.根据实施方式35所述的方法，其中所述至少一个核定位序列通过接头与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者间接融合。
实施方式38.根据实施方式1-37中任一项所述的方法，其中所述编码融合分子的核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)。
实施方式39.根据实施方式1-37中任一项所述的方法，其中所述编码融合分子的核酸序列是信使核糖核酸(mRNA)。
实施方式40.根据实施方式1-39中任一项所述的方法，其进一步包括引入至少一个单一引导RNA(sgRNA)或编码所述sgRNA的DNA的步骤，所述sgRNA与所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的DNA序列互补，从而将所述融合分子靶向所述PCSK9基因或PCSK9调控元件。
实施方式41.根据实施方式40所述的方法，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO：27-95或98-108的核酸序列。
实施方式42.根据实施方式1-41中任一项所述的方法，其中所述融合分子被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式43.根据实施方式40-41中任一项所述的方法，其中所述融合分子和所述sgRNA被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式44.根据实施方式43所述的方法，其中所述融合分子和所述sgRNA被配制在同一脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式45.根据实施方式43所述的方法，其中所述融合分子和所述sgRNA被配制在不同脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式46.根据实施方式42-45中任一项所述的方法，其中所述脂质体或脂质纳米颗粒包含可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、PEG化脂质(0％-30％，摩尔比)、支持性脂质(5％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)。
实施方式47.根据实施方式46所述的方法，其中所述可电离脂质选自pH响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质。
实施方式48.根据实施方式1-41中任一项所述的方法，其中所述融合分子被配制在AAV载体中。
实施方式49.根据实施方式40-41中任一项所述的方法，其中所述融合分子和所述sgRNA被配制在AAV载体中。
实施方式50.根据实施方式49所述的方法，其中所述融合分子和所述sgRNA被配制在同一AAV载体中。
实施方式51.根据实施方式49所述的方法，其中所述融合分子和所述sgRNA被配制在不同AAV载体中。
实施方式52.根据实施方式1-51中任一项所述的方法，其中所述融合分子通过局部注射、系统性输注或其组合递送到所述细胞。
实施方式53.根据实施方式2-4和8-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方式54.根据实施方式4和8-53中任一项所述的方法，其中所述PCSK9相关疾病是高动脉粥样硬化性心血管疾病。
实施方式55.根据实施方式4和8-53中任一项所述的方法，其中所述PCSK9相关疾病是高胆固醇血症。
实施方式56.根据实施方式1-55中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
实施方式57.一种sgRNA，其包含SEQ ID NO：27-95或98-108中任一者的核酸序列。
实施方式58.一种DNA序列，其编码根据实施方式54所述的sgRNA。
实施方式59.一种药物组合物，其包含：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述融合分子靶向PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的基因组区域，
其中所述至少一种基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
其中所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)、DNA去甲基化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或其部分、或基于锌指蛋白的转录因子或其部分，或其组合，并且
其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
实施方式60.根据实施方式59所述的药物组合物，其中所述PCSK9调控元件是转录起始位点、核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘子元件、边界元件或基因座控制区。
实施方式61.根据实施方式59-60中任一项所述的药物组合物，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。
实施方式62.根据实施方式61所述的药物组合物，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内。
实施方式63.根据实施方式61所述的药物组合物，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游300bp以内。
实施方式64.根据实施方式59-63中任一项所述的药物组合物，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp以内。
实施方式65.根据实施方式64所述的药物组合物，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点下游约300bp以内。
实施方式66.根据实施方式59-65中任一项所述的药物组合物，其中所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述PCSK9基因的转录起始位点上游1000bp以内和所述转录起始位点下游300bp以内。
实施方式67.根据实施方式59-66中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一个核苷酸的修饰是DNA甲基化。
实施方式68.根据实施方式59-67所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)或其部分。
实施方式69.根据实施方式68所述的药物组合物，其中所述DNA甲基转移酶是DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT1或DNMT2。
实施方式70.根据实施方式69所述的药物组合物，其中所述DNMT3A包含SEQ IDNO：23的氨基酸序列。
实施方式71.根据实施方式69所述的药物组合物，其中所述DNMT3L包含SEQ IDNO：24的氨基酸序列。
实施方式72.根据实施方式59-71中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂包括基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
实施方式73.根据实施方式72所述的药物组合物，其中所述基于锌指蛋白的转录因子是Kruppel相关抑制盒(KRAB)。
实施方式74.根据实施方式73所述的药物组合物，其中所述KRAB包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
实施方式75.根据实施方式59-74中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂包括DNA甲基转移酶或其部分以及基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
实施方式76.根据实施方式75所述的药物组合物，其中所述DNA甲基转移酶选自DNMT3A和DNMT3L及其组合，并且所述基于锌指蛋白的转录因子是KRAB。
实施方式77.根据实施方式中59-76任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
实施方式78.根据实施方式77所述的药物组合物，其中所述至少一种DNA结合蛋白是dCas9。
实施方式79.根据实施方式78所述的药物组合物，其中所述dCas9包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)dCas9、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)dCas9、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)dCas9、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)dCas9、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)dCas9、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)dCas9、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)dCas9、固氮螺菌属(Azospirillum)(例如菌株B510)dCas9、Gluconacetobacter diazotrophicus dCas9、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)dCas9、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)dCas9、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)dCas9、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)(例如菌株DSM16511)dCas9、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)(例如菌株CF89-12)dCas9、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(例如菌株LMD-9)dCas9。
实施方式80.根据实施方式78所述的药物组合物，其中所述dCas9包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
实施方式81.根据实施方式59-80中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子包含与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者融合的所述至少一种基因表达调节剂。
实施方式82.根据实施方式81所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂与所述至少一种DNA结合蛋白直接融合。
实施方式83.根据实施方式81所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂通过非调节剂、第二调节剂或接头与所述至少一种DNA结合蛋白间接融合。
实施方式84.根据实施方式81-83中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子包含在C-端末端上融合有KRAB并在N-端末端上融合有DNMT3A和DNMT3L的dCas9。
实施方式85.根据实施方式84所述的药物组合物，其中所述融合分子包含SEQ IDNO：97的氨基酸序列。
实施方式86.根据实施方式59-85中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子还包含至少一个核定位序列。
实施方式87.根据实施方式86所述的药物组合物，其中所述至少一个核定位序列与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者直接融合。
实施方式88.根据实施方式86所述的药物组合物，其中所述至少一个核定位序列通过接头与所述至少一种DNA结合蛋白的C-端、N-端或两者间接融合。
实施方式89.根据实施方式59-88中任一项所述的药物组合物，其中所述编码融合分子的核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)。
实施方式90.根据实施方式59-88中任一项所述的药物组合物，其中所述编码融合分子的核酸序列是信使核糖核酸(mRNA)。
实施方式91.根据实施方式中59-90任一项所述的药物组合物，其进一步包含与所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的DNA序列互补的至少一个单一引导RNA(sgRNA)。
实施方式92.根据实施方式91所述的药物组合物，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO：27-95或98-108的核酸序列。
实施方式93.根据实施方式59-92中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子被包装在脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式94.根据实施方式91-92中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子和所述sgRNA被包装在脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式95.根据实施方式94所述的药物组合物，其中所述融合分子和所述sgRNA被包装在同一脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式95.根据实施方式94所述的药物组合物，其中所述融合分子和所述sgRNA被包装在不同脂质体或脂质纳米颗粒中。
实施方式97.根据实施方式93-96中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体或脂质纳米颗粒包含可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、PEG化脂质(0％-30％，摩尔比)、支持性脂质(5％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)。
实施方式98.根据实施方式93-97中任一项所述的药物组合物，其中所述可电离脂质选自pH响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质。
实施方式99.根据实施方式59-92中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子被包装在AAV载体中。
实施方式100.根据实施方式91-92中任一项所述的药物组合物，其中所述融合分子和所述sgRNA被包装在AAV载体中。
实施方式101.根据实施方式100所述的药物组合物，其中所述融合分子和所述sgRNA被包装在同一AAV载体中。
实施方式102.根据实施方式100所述的药物组合物，其中所述融合分子和所述sgRNA被包装在不同AAV载体中。

Claims (42)

1.一种用于在细胞中减少或消除前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)基因产物的表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而减少或消除所述细胞中PCSK9基因产物的表达。
2.一种减少或消除受试者中PCSK9基因产物的表达的体内方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而减少或消除所述受试者中PCSK9基因产物的表达。
3.一种减少受试者中低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而减少所述受试者中的LDL胆固醇。
4.一种治疗或缓解受试者中PCSK9相关疾病的症状的方法，所述方法包括向所述受试者的细胞引入下述物质的步骤：
包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
从而治疗或缓解所述受试者中PCSK9相关疾病的症状。
5.一种扩增PCSK9基因产物的表达减少的细胞群体的方法，所述方法包括下述步骤：
i)将包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子或编码所述融合分子的核酸序列引入到多个细胞中，
其中所述基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰；
ii)扩增所述多个细胞以产生具有PCSK9基因产物的表达减少的多个修饰细胞，
其中相对于未引入所述融合分子或所述核酸序列的细胞，所述多个修饰细胞的PCSK9基因产物表达减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％，并且
其中所述细胞是肝细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述PCSK9调控元件是核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘子元件、边界元件或基因座控制区。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一个核苷酸的修饰是DNA甲基化。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶(DNMT)、DNA去甲基化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或其部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述DNMT是DNMT3A，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述DNMT是DNMT3L，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基于锌指蛋白的转录因子是Kruppel相关抑制盒(KRAB)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述KRAB包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶或其部分以及基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶选自DNMT3A和DNMT3L及其组合，并且所述基于锌指蛋白的转录因子是KRAB。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种DNA结合蛋白是dCas9。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述dCas9包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述融合分子包含在C-端末端上融合有KRAB并在N-端末端上融合有DNMT3A和DNMT3L的dCas9。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述融合分子包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其进一步包括引入至少一个单一引导RNA(sgRNA)或编码所述sgRNA的DNA的步骤，所述sgRNA与所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的DNA序列互补，从而将所述融合分子靶向所述PCSK9基因或PCSK9调控元件。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO：27-95或98-108的核酸序列。
23.一种sgRNA，其包含SEQ ID NO：27-95或98-108中任一者的核酸序列。
24.一种DNA序列，其编码根据权利要求23所述的sgRNA。
25.一种药物组合物，其包含：包含至少一种DNA结合蛋白和至少一种基因表达调节剂的融合分子，或编码所述融合分子的核酸序列，
其中所述融合分子靶向PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的基因组区域，
其中所述至少一种基因表达调节剂提供所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，
其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶(DNMT)、DNA去甲基化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶或其部分、或基于锌指蛋白的转录因子或其部分，或其组合，并且
其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述PCSK9调控元件是转录起始位点、核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘子元件、边界元件或基因座控制区。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一个核苷酸的修饰是DNA甲基化。
28.根据权利要求25-27所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶(DNMT)或其部分。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述DNMT是DNMT3A，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
30.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述DNMT是DNMT3L，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂包含基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述基于锌指蛋白的转录因子是Kruppel相关抑制盒(KRAB)。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述KRAB包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种基因表达调节剂包含DNA甲基转移酶或其部分以及基于锌指蛋白的转录因子或其部分。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述DNA甲基转移酶选自DNMT3A和DNMT3L及其组合，并且所述基于锌指蛋白的转录因子是KRAB。
36.根据权利要求中25-35任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种DNA结合蛋白是Cas9、dCas9、Cpf1、锌指核酸酶(ZNF)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶、dCas9-FokI核酸酶或MegaTal核酸酶。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述至少一种DNA结合蛋白是dCas9。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述dCas9包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
39.根据权利要求25-38所述的药物组合物，其中所述融合分子包含在C-端末端上融合有KRAB并在N-端末端上融合有DNMT3A和DNMT3L的dCas9。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述融合分子包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。
41.根据权利要求中25-40中任一项所述的药物组合物，其进一步包含与所述PCSK9基因附近和/或PCSK9调控元件内的DNA序列互补的至少一个单一引导RNA(sgRNA)。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO：27-95或98-108的核酸序列。
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