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CN118359705A - 抗体构建体 - Google Patents

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CN118359705A
CN118359705A CN202410343134.7A CN202410343134A CN118359705A CN 118359705 A CN118359705 A CN 118359705A CN 202410343134 A CN202410343134 A CN 202410343134A CN 118359705 A CN118359705 A CN 118359705A
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terminus
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L·贝利
B·格拉泽
李曲飞
R·格林
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Original Assignee
Invenra Inc
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Abstract

本发明提出了多价抗体构建体、包含所述构建体的药物组合物，及其使用方法。

Description

抗体构建体
本发明申请是基于申请日为2017年10月18日，申请号为201780078920.7(国际申请号为PCT/US2017/057268)、名称为“抗体构建体”的发明专利申请的分案申请。
1.相关申请的交叉引用
本申请依据35 USC 119(e)要求2017年9月7日提交的在先共同待决美国临时专利申请No.62/555,498、2017年8月24日提交的美国临时专利申请No.62/549,894以及2016年10月19日提交的美国临时专利申请No.62/410,054的权益，其全部内容通过引用并入本文。
2.序列表
本申请包括已经通过EFS-Web提交并且其全部内容通过引用并入本文的序列表。创建于2017年XX月的所述ASCII拷贝被命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小为X,XXX,XXX字节。
3.背景技术
抗体是医学领域中非常宝贵的工具。特别是，单克隆抗体的重要性，包括它们在科学研究和医学诊断中的作用，已经被广泛认可了几十年。然而，抗体的全部潜力，特别是它们作为治疗剂的成功应用，直到最近才得到证实，如为以下成功疗法所证实：阿达木单抗(Humira)、利妥昔单抗(Rituxan)、英夫利昔单抗(Remicade)、贝伐珠单抗(Avastin)、曲妥珠单抗(赫赛汀)、pembrolizumab(Keytruda)和伊匹木单抗(Yervoy)。在这些临床成功之后，对抗体疗法的兴趣将只可能继续增加。因此，在研究药物开发和下游临床环境中都存在对抗体的有效产生和制造的需求。
抗体治疗领域的一个活跃研究领域是多特异性抗体(即，被工程化以识别多个靶标的单个抗体)的设计和使用。这些抗体提供了更好的治疗控制的希望。例如，存在改善靶特异性以减少与许多抗体疗法相关的脱靶效应的需求，特别是在基于抗体的免疫疗法的情况下。此外，多特异性抗体提供新的治疗策略，例如多种细胞受体的协同靶向，尤其是在免疫疗法背景下，。
尽管多特异性抗体具有前景，但它们的生产和使用受到许多限制其实际实施的限制因素的困扰。通常，所有多特异性抗体平台必须解决确保关联重链和轻链对之间的高保真配对的问题。然而，各种平台存在许多问题。例如，抗体链工程化可以导致组装抗体的稳定性不良、抗体链的表达和折叠不良，和/或免疫原性肽产生。其他方法被不切实际的制造过程困扰，例如复杂的体外组装反应或纯化方法。此外，若干平台被不能容易且有效地插入不同的抗体结合结构域困扰。与多特异性抗体制造相关的这些各种问题限制了许多平台的适用性，尤其是它们在许多治疗药物管线所必需的高通量筛选中的使用。
因此，存在对能够高水平表达和有效纯化的抗体平台的需求。特别地，存在对改善在研究和治疗环境两者中具有直接适用性的多特异性抗体的制造能力的多特异性抗体平台的需求。
4.发明内容
我们已经设计了多种新型多价抗体构建体。这些多价结合分子的结构驱动共同形成单特异性、双特异性、三特异性和四特异性构建体的抗原结合位点的关联多肽链的高保真配对。结合分子容易使用常规抗体表达系统表达，包括体外无细胞翻译系统和哺乳动物瞬时转染系统，并且可以用CH1亲和树脂在单个步骤中纯化。高保真度组装、高水平体外表达以及在单个步骤中纯化表达产物的能力使这些构建体非常适合于可变区文库的高通量筛选。这些构建体还表现出长期稳定性，使其非常适合作为多特异性治疗剂。
因此，在第一个方面，结合分子包含第一和第二多肽链，其中：(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且其中结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；并且(c)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
在某些方面，结合分子还包含第三和第四多肽链，其中：(a)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，并且K具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；(c)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和(d)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
在某些方面，其中所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列相同，其中所述序列是内源CH3序列。
在某些方面，所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列不同，并且各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中所述结构域B与所述结构域G相互作用，并且其中所述结构域B和所述结构域G都不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。在某些方面，所述正交修饰包括在结构域B和G之间产生工程化二硫桥的突变。在某些方面，所述产生工程化二硫桥的突变是在所述结构域B和结构域G之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。在某些方面，所述正交修饰包括杵臼(knob-in-hole)突变。在某些方面，所述杵臼突变是在所述结构域B和结构域G之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。在某些方面，所述正交修饰包括电荷对突变。在某些方面，所述电荷对突变是在所述结构域B和结构域G之一中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
在某些方面，所述结构域E具有CH3氨基酸序列。在某些方面，所述结构域E和K的氨基酸序列相同，其中所述序列是内源CH3序列。
在某些方面，所述结构域E和K的氨基酸序列不同。在某些方面，所述不同的序列各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中所述结构域E与所述结构域K相互作用，并且其中所述结构域E和所述结构域K都不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。在某些方面，所述正交修饰包括在结构域E和K之间产生工程化二硫桥的突变。在某些方面，其中所述产生工程化二硫桥的突变是在所述结构域E和结构域K之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。在某些方面，在所述结构域E和K中的所述正交修饰包括杵臼突变。在某些方面，所述杵臼突变是在所述结构域E或结构域K之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。在某些方面，所述正交修饰包括电荷对突变。在某些方面，所述电荷对突变是在所述结构域E或结构域K之一中的T366K突变和在另一结构域中的相应的L351D突变。
在某些方面，所述结构域E和所述结构域K的氨基酸序列是两种不同的抗体结构域的内源序列，所述结构域被选择具有促进所述第一多肽和所述第三多肽之间的特异性关联的特异性相互作用。在某些方面，所述两种不同的氨基酸序列是CH1序列和CL序列。在某些方面，结构域I具有CL序列，并且结构域M具有CH1序列。
在某些方面，结构域H具有VL序列，并且结构域L具有VH序列。
在某些方面，结构域H具有VL氨基酸序列；结构域I具有CL氨基酸序列；结构域K具有CH3氨基酸序列；结构域L具有VH氨基酸序列；并且结构域M具有CH1氨基酸序列。
在某些方面，所述结构域A和所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，并且所述结构域H和所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。
在某些方面，结合分子还包含第五多肽链，其中：(a)所述第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列，并且其中结构域N具有VL氨基酸序列，结构域O具有CH3氨基酸序列；(b)所述结合分子还包含第五多肽链，所述第五多肽链包含：结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且其中结构域P具有VH氨基酸序列，并且结构域Q具有CH3氨基酸序列；并且(c)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
在某些方面，(a)结构域N和结构域A的氨基酸序列相同，结构域H的氨基酸序列不同于结构域N和A，结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，结构域I的氨基酸序列不同于结构域O和B，结构域P和结构域F的氨基酸序列相同，结构域L的氨基酸序列不同于结构域P和F，结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M的氨基酸序列不同于结构域Q和G；并且(b)其中所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且所述结构域N和结构域P形成对所述第一抗原特异的第三抗原结合位点。
在某些方面，(a)结构域N、结构域A和结构域H的氨基酸序列不同，结构域O、结构域B和结构域I的氨基酸序列不同，结构域P、结构域F和结构域L的氨基酸序列不同，并且结构域Q、结构域G和结构域M的氨基酸序列不同；并且(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且所述结构域N和结构域P形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
在某些方面，结合分子还包含第六多肽链，其中：(a)所述第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域R具有VL氨基酸序列，并且结构域S具有恒定结构域氨基酸序列；(b)所述结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有VH氨基酸序列，并且结构域U具有恒定结构域氨基酸序列；并且(c)所述第三多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
在某些方面，(a)结构域R和结构域A的氨基酸序列相同，结构域H的氨基酸序列不同于结构域R和A，结构域S和结构域B的氨基酸序列相同，结构域I的氨基酸序列不同于结构域S和B，结构域T和结构域F的氨基酸序列相同，结构域L的氨基酸序列不同于结构域T和F，结构域U和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M的氨基酸序列不同于结构域U和G，并且(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且所述结构域R和结构域T形成对所述第一抗原特异的第三抗原结合位点。
在某些方面，(a)结构域R和结构域H的氨基酸序列相同，结构域A的氨基酸序列不同于结构域R和H，结构域S和结构域I的氨基酸序列相同，结构域B的氨基酸序列不同于结构域S和I，结构域T和结构域L的氨基酸序列相同，结构域F的氨基酸序列不同于结构域T和L，结构域U和结构域M的氨基酸序列相同，结构域G的氨基酸序列不同于结构域U和M，并且(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且所述结构域R和结构域T形成对所述第二抗原特异的第三抗原结合位点。
在某些方面，(a)结构域R、结构域A和结构域H的氨基酸序列不同，结构域S、结构域B和结构域I的氨基酸序列不同，结构域T、结构域F和结构域L的氨基酸序列不同，并且结构域U、结构域G和结构域M的氨基酸序列不同；并且(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且所述结构域R和结构域T形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
在某些方面，结合分子还包含第五和第六多肽链，其中：(a)所述第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列；(b)所述第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列；(c)所述结合分子还包含第五和第六多肽链，其中：所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列；并且(d)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联，并且所述第三多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子。
在某些方面，(a)结构域N和结构域A的氨基酸序列相同，结构域H和结构域R的氨基酸序列相同，结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，结构域I和结构域S的氨基酸序列相同，结构域P和结构域F的氨基酸序列相同，结构域L和结构域T的氨基酸序列相同，结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M和结构域U的氨基酸序列相同；并且(b)其中所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域N和结构域P形成对所述第一抗原特异的第二抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第三抗原结合位点，并且所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用形成对所述第二抗原特异的第四抗原结合位点。
在某些方面，权利要求36所述的结合分子，其中：(a)结构域H和结构域A的氨基酸序列相同，结构域N和结构域R的氨基酸序列相同，结构域I和结构域B的氨基酸序列相同，结构域O和结构域S的氨基酸序列相同，结构域L和结构域F的氨基酸序列相同，结构域P和结构域T的氨基酸序列相同，结构域M和结构域G的氨基酸序列相同，结构域Q和结构域U的氨基酸序列相同；并且(b)其中所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域N和结构域P形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对所述第一抗原特异的第三抗原结合位点，并且所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用形成对所述第二抗原特异的第四抗原结合位点。
在某些方面，形成所述结构域A与所述结构域B之间的连接的序列是IKRTPREP或IKRTVREP。在某些方面，形成所述结构域F和所述结构域G之间的连接的序列是SSASPREP。
在某些方面，至少一个CH3氨基酸序列具有连接所述CH3氨基酸序列和铰链氨基酸序列的C端三肽插入，其中所述三肽插入选自PGK、KSC和GEC。
在某些方面，序列是人序列。在某些方面，至少一个CH3氨基酸序列是IgG序列。在某些方面，所述IgG序列是IgG1序列。在某些方面，至少一个CH3氨基酸序列具有一个或多个异同种异型突变。在某些方面，所述异同种异型突变是D356E和L358M。在某些方面，所述CL氨基酸序列是Cκ序列。
本文还公开了结合分子，其包含第一，第二，第三和第四多肽链，其中：(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，并且结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，和K具有恒定区结构域氨基酸序列；(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；(e)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；(f)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和(g)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
在某些方面，所述结构域E具有CH3氨基酸序列；结构域H具有VL氨基酸序列；结构域I具有CL氨基酸序列；结构域K具有CH3氨基酸序列；结构域L具有VH氨基酸序列；并且结构域M具有CH1氨基酸序列。
本文还公开了药物组合物，其包含本文公开或描述的任何结合分子，和药学上可接受的载体。
本文还公开了一种治疗方法，其包括向需要治疗的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含本文公开或描述的任何结合分子，和本文公开或描述的任何药学上可接受的载体。
综上所述，本发明包括但不限于如下各项：
1.一种结合分子，其包含：
第一和第二多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，
其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且
其中结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，
其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且
其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；并且
(c)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
2.根据项1所述的结合分子，其还包含：
第三和第四多肽链，其中：
(a)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，
其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且
其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，并且K具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，
其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且
其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；
(c)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和
(d)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
3.根据项1或2中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列相同，其中所述序列是内源CH3序列。
4.根据项1或2中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列不同，并且各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中所述结构域B与所述结构域G相互作用，并且其中所述结构域B和所述结构域G都不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
5.根据项4所述的结合分子，其中所述正交修饰包括在结构域B和G之间产生工程化二硫桥的突变。
6.根据项5所述的结合分子，其中所述产生工程化二硫桥的突变是在所述结构域B和结构域G之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。
7.根据项4-6中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包括杵臼突变。
8.根据项7所述的结合分子，其中所述杵臼突变是在所述结构域B和结构域G之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
9.根据项4-8中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包括电荷对突变。
10.根据项9所述的结合分子，其中所述电荷对突变是在所述结构域B和结构域G之一中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
11.根据项1-10中任一项所述的结合分子，其中所述结构域E具有CH3氨基酸序列。
12.根据项2-11中任一项所述的结合分子，其中所述结构域E和结构域K的氨基酸序列相同，其中所述序列是内源CH3序列。
13.根据项2-11中任一项所述的结合分子，其中所述结构域E和结构域K的氨基酸序列不同。
14.根据项13所述的结合分子，其中所述不同的序列各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中所述结构域E与所述结构域K相互作用，并且其中所述结构域E和所述结构域K都不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
15.根据项14所述的结合分子，其中所述正交修饰包括在结构域E和K之间产生工程化二硫桥的突变。
16.根据项15所述的结合分子，其中所述产生工程化二硫桥的突变是在所述结构域E和结构域K之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。
17.根据项14-16中任一项所述的结合分子，其中在所述结构域E和结构域K中的所述正交修饰包括杵臼突变。
18.根据项17所述的结合分子，其中所述杵臼突变是在所述结构域E或结构域K之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
19.根据项14-18中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包括电荷对突变。
20.根据项19所述的结合分子，其中所述电荷对突变是在所述结构域E或结构域K之一中的T366K突变和在另一结构域中的相应的L351D突变。
21.根据项13所述的结合分子，其中所述结构域E和所述结构域K的氨基酸序列是两种不同的抗体结构域的内源序列，所述结构域被选择具有促进所述第一和所述第三多肽之间的特异性关联的特异性相互作用。
22.根据项21所述的结合分子，其中所述两种不同的氨基酸序列是CH1序列和CL序列。
23.根据项2-22中任一项所述的结合分子，其中结构域I具有CL序列，并且结构域M具有CH1序列。
24.根据项2-23中任一项所述的结合分子，其中结构域H具有VL序列，并且结构域L具有VH序列。
25.根据项2-24中任一项所述的结合分子，其中：
结构域H具有VL氨基酸序列；
结构域I具有CL氨基酸序列；
结构域K具有CH3氨基酸序列；
结构域L具有VH氨基酸序列；
并且结构域M具有CH1氨基酸序列。
26.根据项2-25中任一项所述的结合分子，其中所述结构域A和所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，并且所述结构域H和所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。
27.一种结合分子，其包含：
第一、第二、第三和第四多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，
其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且
结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，并且结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，
其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且
其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；
(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，
其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且
其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，和K具有恒定区结构域氨基酸序列；
(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，
其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且
其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；
(e)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；
(f)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和
(g)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
28.根据项27所述的结合分子，其中：
所述结构域E具有CH3氨基酸序列；
结构域H具有VL氨基酸序列；
结构域I具有CL氨基酸序列；
结构域K具有CH3氨基酸序列；
结构域L具有VH氨基酸序列；
并且结构域M具有CH1氨基酸序列。
29.根据项2-26中任一项所述的结合分子，其还包含：
第五多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列，并且
其中结构域N具有VL氨基酸序列，结构域O具有CH3氨基酸序列；
(b)所述结合分子还包含第五多肽链，所述第五多肽链包含：
结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且
其中结构域P具有VH氨基酸序列，并且结构域Q具有CH3氨基酸序列；并且
(c)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
30.根据项29所述的结合分子，其中：
(a)结构域N和结构域A的氨基酸序列相同，
结构域H的氨基酸序列不同于结构域N和A，
结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，
结构域I的氨基酸序列不同于结构域O和B，
结构域P和结构域F的氨基酸序列相同，
结构域L的氨基酸序列不同于结构域P和F，
结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，
结构域M的氨基酸序列不同于结构域Q和G；并且
(b)其中所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且所述结构域N和结构域P形成对所述第一抗原特异的第三抗原结合位点。
31.根据项29所述的结合分子，其中：
(a)结构域N、结构域A和结构域H的氨基酸序列不同，
结构域O、结构域B和结构域I的氨基酸序列不同，
结构域P、结构域F和结构域L的氨基酸序列不同，并且
结构域Q、结构域G和结构域M的氨基酸序列不同；并且
(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，
所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且
所述结构域N和结构域P形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
32.根据项2-26中任一项所述的结合分子，其还包含：
第六多肽链，其中：
(a)所述第三多肽链还包含结构域R和结构域S，
其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且
其中结构域R具有VL氨基酸序列，并且结构域S具有恒定结构域氨基酸序列；
(b)所述结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：
结构域T和结构域U，
其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且
其中结构域T具有VH氨基酸序列，并且结构域U具有恒定结构域氨基酸序列；并且
(c)所述第三多肽和所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
33.根据项32所述的结合分子，其中：
(a)结构域R和结构域A的氨基酸序列相同，
结构域H的氨基酸序列不同于结构域R和A，
结构域S和结构域B的氨基酸序列相同，
结构域I的氨基酸序列不同于结构域S和B，
结构域T和结构域F的氨基酸序列相同，
结构域L的氨基酸序列不同于结构域T和F，
结构域U和结构域G的氨基酸序列相同，
结构域M的氨基酸序列不同于结构域U和G，并且
(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，
所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且
所述结构域R和结构域T形成对所述第一抗原特异的第三抗原结合位点。
34.根据项32所述的结合分子，其中
(a)结构域R和结构域H的氨基酸序列相同，
结构域A的氨基酸序列不同于结构域R和H，
结构域S和结构域I的氨基酸序列相同，
结构域B的氨基酸序列不同于结构域S和I，
结构域T和结构域L的氨基酸序列相同，
结构域F的氨基酸序列不同于结构域T和L，
结构域U和结构域M的氨基酸序列相同，
结构域G的氨基酸序列不同于结构域U和M，并且
(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，
所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且
所述结构域R和结构域T形成对所述第二抗原特异的第三抗原结合位点。
35.根据项32所述的结合分子，其中
(a)结构域R、结构域A和结构域H的氨基酸序列不同，
结构域S、结构域B和结构域I的氨基酸序列不同，
结构域T、结构域F和结构域L的氨基酸序列不同，并且
结构域U、结构域G和结构域M的氨基酸序列不同；并且
(b)所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，
所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且
所述结构域R和结构域T形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
36.根据项2-26中任一项所述的结合分子，其还包含：
第五和第六多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列；
(b)所述第三多肽链还包含结构域R和结构域S，
其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列；
(c)所述结合分子还包含第五和第六多肽链，其中：
所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且
所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，
其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列；并且
(d)所述第一多肽和所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联，并且
所述第三多肽和所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
37.根据项36所述的结合分子，其中：
(a)结构域N和结构域A的氨基酸序列相同，
结构域H和结构域R的氨基酸序列相同，
结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，
结构域I和结构域S的氨基酸序列相同，
结构域P和结构域F的氨基酸序列相同，
结构域L和结构域T的氨基酸序列相同，
结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，
结构域M和结构域U的氨基酸序列相同；并且
(b)其中所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域N和结构域P形成对所述第一抗原特异的第二抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第三抗原结合位点，并且所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用形成对所述第二抗原特异的第四抗原结合位点。
38.根据项36所述的结合分子，其中：
(a)结构域H和结构域A的氨基酸序列相同，
结构域N和结构域R的氨基酸序列相同，
结构域I和结构域B的氨基酸序列相同，
结构域O和结构域S的氨基酸序列相同，
结构域L和结构域F的氨基酸序列相同，
结构域P和结构域T的氨基酸序列相同，
结构域M和结构域G的氨基酸序列相同，
结构域Q和结构域U的氨基酸序列相同；并且
(b)其中所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，所述结构域N和结构域P形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用形成对所述第一抗原特异的第三抗原结合位点，并且所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用形成对所述第二抗原特异的第四抗原结合位点。
39.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中形成所述结构域A与所述结构域B之间的连接的序列是IKRTPREP或IKRTVREP。
40.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中形成所述结构域F和所述结构域G之间的连接的序列是SSASPREP。
41.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中至少一个CH3氨基酸序列具有连接所述CH3氨基酸序列至铰链氨基酸序列的C端三肽插入，其中所述三肽插入选自PGK、KSC和GEC。
42.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述序列是人序列。
43.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中至少一个CH3氨基酸序列是IgG序列。
44.根据项43所述的结合分子，其中所述IgG序列是IgG1序列。
45.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中至少一个CH3氨基酸序列具有一个或多个异同种异型突变。
46.根据项45所述的结合分子，其中所述异同种异型突变是D356E和L358M。
47.根据前述项中任一项所述的结合分子，其中所述CL氨基酸序列是Cκ序列。
48.一种药物组合物，其包含：
前述项中任一项所述的结合分子，和
药学上可接受的载体。
49.一种治疗方法，其包括：
向需要治疗的受试者施用根据项48所述的药物组合物。
5.附图说明
图1显示CH3-CH3 IgG1二聚体对与CH1-CL的比对。四元结构与的RMSD比对。
图2呈现本文所描述的各种结合分子(也称为抗体构建体)的示意性架构，其具有各自的命名惯例。
图3呈现本文所描述的二价1x1抗体构建体的多肽链及其结构域的更高分辨率的示意图，其具有各自的命名惯例。
图4显示示例性二价单特异性构建体的架构。
图5显示来自实施例1中描述的生物层干涉测量法(BLI)实验的数据，其中测定了具有图4中所示架构的二价单特异性结合分子[多肽1：VL-CH3(杵)-CH2-CH3/多肽2：VH-CH3(臼)]。抗原结合位点特异于TNFα。来自结合分子固定化和与固定的构建体结合的TNFα的BLI响应证实对抗原的稳健的、特异性的、二价的结合。该数据与具有高百分比的多肽1和多肽2的预期配对的分子一致。
图6说明示例性二价1x1双特异性结合分子“BC1”的特征。
图7A显示“BC1”的尺寸排阻色谱(SEC)分析，证明单个步骤CH1亲和纯化步骤(CaptureSelectTM CH1亲和树脂)通过凝胶过滤产生单个单分散峰，其中>98％是未聚集的二价蛋白。图7B显示了CrossMab二价抗体构建体的SEC分析的比较文献数据[来自Schaefer等(Proc Natl Acad Sci USA.2011Jul 5；108(27):11187-92)]。
图8A是使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线，显示单个陡峰。图8B是使用标准蛋白A纯化进行纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线。
图9显示在不同纯化阶段的“BC1”的非还原性SDS-PAGE凝胶。
图10A和10B比较了单个步骤CH1亲和纯化后的“BC1”在非还原性和还原性条件两者下的SDS-PAGE凝胶(图10A)与CrossMab双特异性抗体在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE凝胶(如参考文献中所公开的)(图10B)。
图11A和11B显示“BC1”的质谱分析，证实在还原性条件下两条不同的重链(图11A)和两条不同的轻链(图11B)。
图12呈现纯化的“BC1”在非还原性条件下的质谱分析，确认了纯化后不存在不完全配对。
图13呈现加速稳定性测试数据，证实于40℃下8周内“BC1”相对于两种IgG对照抗体的稳定性。
图14说明在实施例3中进一步描述的示例性二价1x1双特异性结合分子“BC6”的特征。
图15A呈现使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的“BC6”的尺寸排阻色谱(SEC)分析，证实单个步骤CH1亲和纯化产生单个单分散峰且不存在非共价聚集体。图15B显示“BC6”在非还原性条件下的SDS-PAGE凝胶。
图16说明在实施例4中进一步描述的示例性二价双特异性结合分子“BC28”的特征。
图17显示在“BC28”、“BC29”、“BC30”、“BC31”和“BC32”的单个步骤CH1亲和纯化后在非还原性条件下的SDS-PAGE分析。
图18显示各自使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂进行一步纯化后的“BC28”和“BC30”的SEC分析。
图19说明实施例5中进一步描述的示例性二价双特异性结合分子“BC44”的特征。
图20A和20B分别显示在加速稳定性测试条件下两种二价结合分子“BC15”和“BC16”的尺寸排阻色谱数据。“BC15”和“BC16”具有不同的可变区CH3连接。
图21呈现本文所描述的三价2x1抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图22说明在实施例7中进一步描述的示例性三价2x1双特异性结合分子“BC1-2x1”的特征。
图23显示在纯化的各个阶段，使用ThermoFisher Expi293瞬时转染系统表达的“BC1”和“BC1-2x1”蛋白的非还原性SDS-PAGE。
图24使用Octet(Pall ForteBio)生物层干涉测量法分析对二价1x1构建体“BC1”的亲合力(avidity)与三价2x1构建体“BC1-2x1”的亲合力进行比较。
图25显示三价2x1构建体“TB111”的显著特征。
图26呈现本文所描述的三价1x2抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图27说明在实施例10中进一步描述的示例性三价1x2构建体“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”的特征。
图28是SDS-PAGE凝胶，其中显示在非还原性(“-DTT”)和还原性(“+DTT”)条件下的三价1x2构建体“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”构建体的泳道已经用方框标示。
图29显示抗原结合在两种抗体：二价1x1构建体“CTLA4-4 xOX40-8”和三价1x2构建体“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”之间的比较。“CTLA4-4 x OX40-8”单价地结合CTLA4，而“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”二价地结合CTLA4。
图30说明在实施例11中进一步描述的示例性三价1x2三特异性构建体“BC28-1x1x1a”的特征。
图31显示瞬时表达和单个步骤CH1亲和树脂纯化后的“BC28-1x1x1a”的尺寸排阻色谱，展示单个明确界定的峰。
图32显示如实施例12中进一步描述的，二价和三价构建体的SDS-PAGE结果，各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后，在非还原性和还原性条件下。
图33A-33C显示对3种抗原：PD1、抗原“A”和CTLA4的Octet结合分析。如在实施例13中进一步描述的，图33A显示“BC1”与PD1和抗原“A”的结合；图33B显示二价双特异性构建体“CTLA4-4 xOX40-8”与CTLA4、抗原“A”和PD1的结合；图33C显示三价三特异性“BC28-1x1x1a”与PD1、抗原“A”和CTLA4的结合。
图34呈现本文所描述的某些四价2x2构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图35说明在实施例14中进一步描述的示例性四价2x2构建体“BC22-2x2”的某些显著特征。
图36是非还原性SDS-PAGE凝胶，其对在纯化的不同阶段的2x2四价“BC22-2x2”构建体与1x2三价构建体“BC12-1x2”和2x1三价构建体“BC21-2x1”进行比较。
图37提供示例性四价2x2构建体的架构。
图38呈现本文所描述的某些四价构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图39提供双特异性四价构建体的示例性架构。
图40提供利用共同轻链策略的三特异性四价构建体的示例性架构。
图41显示通过如图39所示意的四价构建体的双特异性抗原接合，证实该构建体能够同时接合。来自B-Body固定化和与固定的构建体结合的TNFα的生物层干涉测量(BLI)响应与具有高百分比的预期链配对的分子一致。
图42提供与细胞表面抗原结合的B-Body的流式细胞术分析。交叉阴影线信号表示没有抗原的细胞；点信号表示具有表面抗原的瞬时转染细胞。
图43提供三价构建体的示例性架构。
图44提供三价构建体的示例性架构。
图45显示了如实施例17中进一步描述的，二价和三价构建体的SDS-PAGE结果，各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后，在非还原性和还原性条件下。
图46显示了测量的“BC24jv”、“BC26jv”和“BC28jv”的热转变的差异以评估连接变体的配对稳定性。
附图仅出于说明的目的而描绘本发明的各种实施方式。本领域技术人员从以下讨论中将容易认识到可以采用本文所说明的结构和方法的替代实施方式而不偏离本文所描述的本发明的原理。
6.具体实施方式
6.1定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有下文所赋予的含义。
“抗原结合位点”是指特异性识别或结合至给定抗原或表位的结合分子的区域。
“B-Body”是指本文描述的任何结合分子构建体。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗(therapeutic treatment)和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施两者，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或紊乱，例如多发性硬化、关节炎或癌症的进展。无论是可检测的还是不可检测的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状缓和、疾病程度降低、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻，以及缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还可以是指与如果不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已经具有状况或紊乱的那些以及易于具有状况或紊乱的那些或者其中待预防状况或紊乱的那些。
所谓“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指对其而言，诊断、预后或治疗(therapy)是期望的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
术语“足够量”是指足以产生期望效果的量，例如，足以调节细胞内蛋白聚集的量。
术语“治疗有效量”是有效改善疾病的症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
6.2其他解释性惯例
除非另有说明，本文提到序列都是提到氨基酸序列。
除非另有说明，抗体恒定区残基编号是根据如www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#re fs(2017年8月22日访问)和Edelman等，Proc.Natl.Acad.USA,63:78-85(1969)所描述的EU索引，其全部内容通过引用并入本文，并根据其在内源恒定区序列中的位置识别残基，而不管残基在本文所述的结合分子的链内的物理位置如何。“内源序列”或“天然序列”是指任何序列，包括核酸和氨基酸序列两者，其源自生物体、组织或细胞，并且未经人工修饰或突变。
在本公开中，“包含”、“包含”、“含有”、“具有”、“包括”、“包括”及其语言变体具有在美国专利法中赋予它们的含义，允许超出明确记载的那些的另外组分的存在。
本文所提供的范围应理解为是在范围内的所有值的简写，包括所记载的端点。例如，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组的任意数字、数字组合或子范围。
除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”应理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文显而易见，本文中使用的术语“约”应理解为处于本领域的正常容忍范围，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在记载的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从上下文是清楚的，本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
6.3结合分子
在第一个方面，提供结合分子。
参考图3，在第一系列的实施方式中，结合分子包含第一和第二多肽链，其中：(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且其中结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，并且结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；并且(c)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
还参考图3，在第二系列的实施方式中，所述结合分子还包含第三和第四多肽链，其中：(a)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，并且K具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；(c)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和(d)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
在实施方式中，第一多肽链和第三个多肽链序列彼此相同，并且第二多肽链和第四多肽序列彼此相同。在这些实施方式中，第一多肽链与第三多肽链通过结构域E与结构域K之间的相互作用关联(参见下文第6.3.15节)形成二价单特异性抗体构建体，例如下文实施例1中所示例的。
在其他实施方式中，第一和第三个多肽链序列彼此不同，并且第二和第四多肽序列彼此不同。在这些实施方式中，第一多肽链与第三多肽链通过结构域E与结构域K之间的相互作用关联(参见下文第6.3.15节)能够形成二价双特异性抗体构建体。
6.3.1结构域A(VL)
在本文所描述的结合分子中，结构域A具有VL氨基酸序列。可用于本文所描述的结合分子的VL氨基酸序列是抗体轻链可变结构域序列。在天然抗体和本文所描述的抗体构建体两者的典型排列中，特定的VL氨基酸序列与特定的VH氨基酸序列相关联以形成抗原结合位点。在实施方式中，VL氨基酸序列是哺乳动物序列，包括人序列，合成序列，或者人、非人哺乳动物、哺乳动物和/或合成序列的组合，如下文第6.3.1.1节和第6.3.1.2节中进一步详细描述。
在实施方式中，VL氨基酸序列是天然存在序列的突变序列。在某些实施方式中，VL氨基酸序列是λ(λ)轻链可变结构域序列。在某些实施方式中，VL氨基酸序列是κ(κ)轻链可变结构域序列。在优选实施方式中，VL氨基酸序列是κ(κ)轻链可变结构域序列。
在本文所描述的结合分子中，结构域A的C端与结构域B的N端连接。在某些实施方式中，结构域A具有VL氨基酸序列，所述VL氨基酸序列在其C端处在结构域A与结构域B之间的连接处被突变，如下文第6.3.19.1节和实施例6中更详细地描述。
6.3.1.1互补决定区
VL氨基酸序列包含称为“互补决定区”(CDR)的高度可变序列，通常是三个CDR(CDR1、CD2和CDR3)。在实施方式中，CDR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，CDR是人序列。在实施方式中，CDR是天然存在的序列。在实施方式中，CDR是已经被突变以改变抗原结合位点对特定抗原或表位的结合亲和性的天然存在的序列。在某些实施方式中，天然存在的CDR已经通过亲和性成熟和体细胞超突变在体内宿主中突变。在某些实施方式中，CDR已经通过包括但不限于PCR诱变和化学诱变的方法在体外突变。在实施方式中，CDR是合成序列，包括但不限于从随机序列CDR文库和合理设计CDR文库获得的CDR。
6.3.1.2框架区域和CDR移植
VL氨基酸序列包含“框架区”(FR)序列。FR是通常保守的序列区域，其充当用于散布的CDR的骨架(参见第6.3.1.1节)，通常为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列(从N端到C端)。在实施方式中，FR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，FR是人序列。在实施方式中，FR是天然存在的序列。在实施方式中，FR是合成序列，包括但不限于合理设计的序列。
在各种实施方式中，FR和CDR均来自同一天然存在的可变结构域序列。在各种实施方式中，FR和CDR来自不同的可变结构域序列，其中CDR被移植到FR骨架上，CDR提供对特定抗原的特异性。在某些实施方式中，移植的CDR都来源于相同的天然存在的可变结构域序列。在某些实施方式中，移植的CDR来源于不同的可变结构域序列。在某些实施方式中，移植的CDR是合成序列，包括但不限于从随机序列CDR文库和合理设计CDR文库获得的CDR。在某些实施方式中，移植的CDR和FR来自相同的物种。在某些实施方式中，移植的CDR和FR来自不同的物种。在优选的移植CDR实施方式中，抗体是“人源化的”，其中移植的CDR是非人哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴和山羊序列，并且FR是人序列。人源化抗体在美国专利号6,407,213中更详细地讨论，其全部内容通过引入并入本文。在各种实施方式中，来自一个物种的FR的部分或特定序列被用于替换另一物种的FR的部分或特定序列。
6.3.2结构域B(CH3)
在结合分子中，结构域B具有CH3氨基酸序列。如本文所描述，CH3氨基酸序列是抗体重链的C端结构域的序列。
在各种实施方式中，CH3序列是哺乳动物序列，包括但不限于，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，CH3序列是人序列。在某些实施方式中，CH3序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型(isotype)，或者CH4序列来自IgE或IgM同种型。在优选实施方式中，CH3序列来自IgG1同种型。
在某些实施方式中，CH3序列是内源序列。在特别的实施方式中，CH3序列是UniProt登录号P01857氨基酸224-330。在实施方式中，CH3序列是内源CH3序列的区段。在特别的实施方式中，CH3序列具有缺少N端氨基酸G224和Q225的内源CH3序列。在特别的实施方式中，CH3序列具有缺少C端氨基酸P328、G329和K330的内源CH3序列。在特别的实施方式中，CH3序列具有缺少N端氨基酸G224和Q225以及C端氨基酸P328、G329和K330的内源CH3序列。在优选实施方式中，结合分子含有多个具有CH3序列的结构域，其中CH3序列可以指完整内源CH3序列以及缺少N端氨基酸、C端氨基酸或两者的CH3序列。
在某些实施方式中，CH3序列是含有一个或多个突变的内源序列。在特别的实施方式中，突变是一个或多个正交突变，其被引入内源CH3序列中以指导特定CH3序列的特异性配对，如下文第6.3.14.1-6.3.14.3节中更详细地描述的。
在某些实施方式中，通过将具有一种同种异型(allotype)的特定氨基酸替换为具有另外的同种异型的那些，CH3序列被工程化以减少抗体的免疫原性，并且在本文中称为异同种异型(isoallotype)突变，如Stickler等(Genes Immun.2011Apr；12(3):213–221)中更详细地描述，其所教导的全部内容通过引用并入本文。在特别的实施方式中，替换G1m1同种异型的特定氨基酸。在优选实施方式中，在CH3序列中作出异同种异型突变D356E和L358M。
在一个优选实施方式中，结构域B具有人IgG1 CH3氨基酸序列，其含有如下突变变化：P343V；Y349C；和三肽插入，445P、446G、447K。在其他优选实施方式中，结构域B具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：T366K；和三肽插入，445K、446S、447C。在其他优选实施方式中，结构域B具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：Y349C；和三肽插入，445P、446G、447K。
在某些实施方式中，结构域B具有447C突变被引入否则为内源性的CH3序列的人IgG1 CH3序列。
在本文所描述的结合分子中，结构域B的N端与结构域A的C端连接。在某些实施方式中，结构域B具有CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列在其N端处在结构域A和结构域B之间的连接处被突变，如下文第6.3.19.1节和实施例6中更详细地描述。
在结合分子中，结构域B的C端与结构域D的N端连接。在某些实施方式中，结构域B具有CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列在C端处在结构域B与结构域D之间的连接处延伸，如下文第6.3.19.3节中更详细地描述。
6.3.3结构域D(CH2)
在本文所描述的结合分子中，结构域D具有CH2氨基酸序列。如本文所描述，CH2氨基酸序列是按照从N端到C端，天然抗体重链的第三结构域的CH2氨基酸序列。在各种实施方式中，CH2序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，CH2序列是人序列。在某些实施方式中，CH2序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在优选实施方式中，CH2序列来自IgG1同种型。
在某些实施方式中，CH2序列是内源序列。在特别的实施方式中，序列是UniProt登录号P01857氨基酸111-223。在优选实施方式中，CH2序列具有连接N端可变结构域-恒定结构域区段至CH2结构域的N端铰链区肽，如下文第6.3.19.3节中更详细讨论。
在结合分子中，结构域D的N端与结构域B的C端连接。在某些实施方式中，结构域B具有CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列在C端处在结构域B与结构域D之间的连接处延伸，如下文第6.3.19.3节中更详细地描述。
在结合分子中，结构域D的C端与结构域E的N端连接。在特别的实施方式中，结构域D与具有CH1氨基酸序列或CL氨基酸序列的结构域E的N端连接，如下文第6.3.19.5节中进一步详细描述。
6.3.4结构域E(恒定区)
在结合分子中，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列。如本文所描述，恒定区结构域氨基酸序列是抗体的恒定区结构域的序列。
在各种实施方式中，恒定区序列是哺乳动物序列，包括但不限于，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，恒定区序列是人序列。在某些实施方式中，恒定区序列来自抗体轻链。在特别的实施方式中，恒定区序列来自λ或κ轻链。在某些实施方式中，恒定区序列来自抗体重链。在特别的实施方式中，恒定区序列是IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型的抗体重链序列。在优选实施方式中，恒定区序列来自IgG1同种型。在某些实施方式中，恒定区序列是CH3序列。CH3序列在上文的第6.3.2节中更详细地描述。
在特别的实施方式中，恒定区序列已经被突变以包含一个或多个正交突变。在优选实施方式中，结构域E具有恒定区序列，所述恒定区序列为CH3序列，所述CH3序列包含杵-臼(knob-hole)(同义地，“杵在臼中(knob-in-hole)”、“KIH”)正交突变(如下文第6.3.14.2节中更详细地描述)和S354C或Y349C突变，所述S354C或Y349C突变与含有正交突变的CH3结构域形成工程化二硫桥(如下文第6.3.14.1节中更详细地描述)。在一些优选实施方式中，杵臼正交突变是T366W突变。
在某些实施方式中，恒定区结构域序列是CH1序列。CH1序列在下文的6.3.4.1节中更详细地描述。在某些实施方式中，CH1结构域的N端与CH2结构域的C端连接，如下文第6.3.19.5中更详细地描述。
在某些实施方式中，恒定区序列是CL序列。CL序列在下文第6.3.4.2节中更详细地描述。在某些实施方式中，CL结构域的N端与CH2结构域的C端连接，如下文第6.3.19.5中更详细地描述。
6.3.4.1CH1结构域
如本文所描述，CH1氨基酸序列是按照从N端到C端，抗体重链的第二结构域的序列。在某些实施方式中，CH1序列是内源序列。在实施方式中，CH1序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，CH1序列是人序列。在某些实施方式中，CH1序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在优选实施方式中，CH1序列来自IgG1同种型。在优选实施方式中，CH1序列是UniProt登录号P01857氨基酸1-98。
6.3.4.2CL结构域
本文所描述的用于结合分子的CL氨基酸序列是抗体轻链恒定结构域序列。在某些实施方式中，CL序列是内源序列。在各种实施方式中，CL序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在优选实施方式中，CL序列是人序列。
在某些实施方式中，CL氨基酸序列是lambda(λ)轻链恒定区序列。在特别的实施方式中，CL氨基酸序列是人λ轻链恒定结构域序列。在优选实施方式中，lambda(λ)轻链序列是UniProt登录号P0CG04。
在某些实施方式中，CL氨基酸序列是kappa(κ)轻链恒定结构域序列。在优选实施方式中，CL氨基酸序列是人kappa(κ)轻链恒定结构域序列。在优选实施方式中，κ轻链序列是UniProt登录号P01834。
6.3.5结构域F(VH)
在结合分子中，结构域F具有VH氨基酸序列。本文所描述的结合分子中的VH氨基酸序列是抗体重链可变结构域序列。在自然界和本文所描述的结合分子两者中的典型抗体排列中，特定的VH氨基酸序列与特定的VL氨基酸序列相关联以形成抗原结合位点。在各种实施方式中，VH氨基酸序列是哺乳动物序列，包括人序列，合成序列，或者非人哺乳动物、哺乳动物和/或合成序列的组合，如上文第6.3.1.1节和第6.3.1.2节中进一步详细描述。在各种实施方式中，VH氨基酸序列是天然存在的序列的突变序列。
6.3.6结构域G(CH3)
在结合分子中，结构域G具有CH3氨基酸序列。CH3序列在上文第6.3.2节中更详细地描述。
在某些优选实施方式中，结构域G具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：S354C；和三肽插入，445P、446G、447K。在一些优选实施方式中，结构域G具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：S354C；和445P、446G、447K三肽插入。在一些优选实施方式中，结构域G具有人IgG1 CH3序列，其含有如下变化：L351D，和445G、446E、447C的三肽插入。
6.3.7结构域H(可变区)
在结合分子中，结构域H具有可变区结构域氨基酸序列。如本文所描述，可变区结构域氨基酸序列是包含VL和VH抗体结构域序列的抗体的可变区结构域氨基酸序列。VL和VH序列分别在上文第6.3.1节和第6.3.5节中更详细地描述。在优选实施方式中，结构域H具有VL抗体结构域序列。
6.3.8结构域I(恒定区)
在本文所描述的结合分子中，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列。恒定区结构域氨基酸序列在上文第6.3.4节中更详细地描述。在优选实施方式中，结构域I具有作为来自κ轻链的CL的恒定区序列，如第6.3.4.2节中更详细地讨论。
6.3.9结构域J(CH2)
在结合分子中，结构域J具有CH2氨基酸序列。CH2氨基酸序列在上文第6.3.3节中更详细地描述。在优选实施方式中，CH2氨基酸序列具有连接结构域J至结构域I的N端铰链区，如下文第6.3.19.4节中更详细地描述。
在结合分子中，结构域J的C端与结构域K的N端连接。在具体的实施方式中，结构域J与具有CH1氨基酸序列或CL氨基酸序列的结构域K的N端连接，如下文第6.3.19.5节中进一步详细描述。
6.3.10结构域K(恒定区)
在结合分子中，结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列。恒定区结构域氨基酸序列在上文第6.3.4节中更详细地描述。在优选实施方式中，结构域K具有恒定区序列，所述恒定区序列是CH3序列，所述CH3序列包含杵臼正交突变(如下文第6.3.14.2节中更详细地描述)；异同种异型突变(如上文第6.3.2中更详细地描述)；和S354C或Y349C突变，所述S354C或Y349C突变与含有正交突变的CH3结构域形成工程化二硫桥(如下文第6.3.14.1节中更详细地描述)。在一些优选实施方式中，与异同种异型突变组合的杵臼正交突变是以下突变变化：D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V。
6.3.11结构域L(可变区)
在结合分子中，结构域L具有可变区结构域氨基酸序列。如本文所描述，可变区结构域氨基酸序列是包含VL和VH抗体结构域序列的抗体的可变区结构域氨基酸序列。VL和VH序列分别在上文的第6.3.1和第6.3.5节中更详细地描述。在优选实施方式中，结构域L具有VH抗体结构域序列。
6.3.12结构域M(恒定区)
在结合分子中，结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列。恒定区结构域氨基酸序列在上文第6.3.4节中更详细地描述。在优选实施方式中，结构域M具有作为来自IgG1同种型的CH1的恒定区序列，如第6.3.4.1节中更详细地讨论。
6.3.13结构域A和结构域F的配对
在结合分子中，结构域A VL氨基酸序列和结构域F VH氨基酸序列相关联并且形成抗原结合位点(ABS)。A:F抗原结合位点(ABS)能够特异性结合抗原的表位。ABS对抗原的结合在下文的第6.3.13.1节中更详细地描述。
在各种多价实施方式中，由结构域A和F形成的ABS(A:F)与结合分子内的一个或多个其他ABS序列相同，因此与结合分子内的一个或多个其他序列相同的ABS具有相同的识别特异性。
在各种多价实施方式中，A:F ABS与结合分子内的一个或多个其他ABS序列不同。在某些实施方式中，A:F ABS具有不同于结合分子中的一个或多个其他序列不同的ABS的识别特异性。在特别的实施方式中，A:F ABS识别与结合分子中的至少一个其他序列不同的ABS识别的抗原不同的抗原。在特别的实施方式中，A::F ABS识别也被结合分子中的至少一个其他序列不同的ABS识别的抗原的不同表位。在这些实施方式中，由结构域A和结构域F形成的ABS识别抗原的表位，其中结合分子内的一个或多个其他ABS识别相同的抗原但不识别相同的表位。
6.3.13.1ABS对抗原的结合
ABS和包含这样的ABS的结合分子被称为“识别”ABS特异性结合至其的表位(或更一般地，抗原)，并且表位(或更一般地，抗原)被称为是ABS的“识别特异性”或“结合特异性”。
ABS被称为以特定的亲和性结合其特异性抗原或表位。
如本文所描述，“亲和性(affinity)”是指一个分子与另一个分子之间的非共价分子间力的相互作用的强度。亲和性，即相互作用的强度，可以表示为解离平衡常数(KD)，其中较低的KD值是指分子之间较强的相互作用。抗体构建体的KD值通过本领域公知的方法测量，包括但不限于生物层干涉测量法(例如)、表面等离子共振(SPR)技术(例如)和细胞结合测定法。出于本文的目的，亲和性是通过使用的生物层干涉测量法测量的解离平衡常数。
本文所使用的“特异性结合”指的是ABS与其关联抗原或表位之间的亲和性，其中KD值低于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M。
在如本文所描述的结合分子中的ABS的数量定义结合分子的“效价”。如图2中所示意，具有单个ABS的结合分子为“单价”。具有多个ABS的结合分子被称为“多价”。具有两个ABS的多价结合分子是“二价”。具有三个ABS的多价结合分子是“三价”。具有四个ABS的多价结合分子是“四价”。
在各种多价实施方式中，多个ABS均具有相同的识别特异性。如图2中所示意，这样的结合分子是“单特异性的”“多价的”结合构建体。在其他多价的实施方式中，多个ABS中的至少两个具有不同的识别特异性。这样的结合分子是多价的且“多特异性的”。在其中ABS总体地具有两种识别特异性的多价实施方式中，结合分子是“双特异性的”。在其中ABS总体地具有三种识别特异性的多价实施方式中，结合分子是“三特异性的”。
在其中ABS对存在于同一抗原上的不同表位总体地具有多种识别特异性的多价实施方式中，结合分子是“多互补位的(multiparatopic)”。其中ABS总体地识别同一抗原上的两个表位的多价实施方式是“双互补位的”。
在各种多价实施方式中，结合分子的多价改善了结合分子对特定靶标的亲合力。如本文所述，“亲合力(avidity)”是指两个或更多个分子(例如针对特定靶标的多价结合分子)之间的相互作用的总强度，其中亲合力是由多个ABS的亲和性提供的相互作用的累积强度。如上所述，可以通过与用于确定亲和性的方法相同的方法测量亲合力。在某些实施方式中，结合分子对特定靶标的亲合力使得相互作用是特异性结合相互作用，其中两个分子之间的亲合力具有低于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的KD值。在某些实施方式中，结合分子对特定靶标的亲合力具有使得相互作用是特异性结合相互作用的KD值，其中个体ABS的一种或多种亲合性不具有有资格独自特异性结合其各自抗原或表位的KD值。在某些实施方式中，亲合力是由多个ABS对在共同的特定靶标或复合物上的不同抗原(例如在个体细胞上发现的不同抗原)的亲和性提供的相互作用的累积强度。在某些实施方式中，亲合力是由多个ABS对在共同的个体抗原上的不同表位的亲和性提供的相互作用的累积强度。
6.3.14结构域B&G的配对
在本文所描述的结合分子中，结构域B CH3氨基酸序列与结构域G CH3氨基酸序列相关联。CH3序列在上文的第6.3.2节中更详细地描述。
在各种实施方式中，结构域B和结构域G的氨基酸序列相同。在这些实施方式中的某些中，序列是内源CH3序列。
在各种实施方式中，结构域B和结构域G的氨基酸序列不同，并且各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中结构域B与结构域G相互作用，并且其中结构域B和结构域G两者都不与缺乏正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
如本文所描述的“正交修饰”或同义“正交突变”是抗体结构域的氨基酸序列中的一个或多个工程化突变，其增加具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合的亲和性。在某些实施方式中，正交修饰降低了具有正交修饰的结构域对缺乏互补正交修饰的结构域的亲和性。在某些实施方式中，正交修饰是内源抗体结构域序列中的突变。在各种实施方式中，正交修饰是内源抗体结构域序列的N端或C端的修饰，包括但不限于氨基酸添加或缺失。在特别的实施方式中，正交修饰包括但不限于工程化二硫桥、杵在臼中突变和电荷对突变，如下文第6.3.14.1-6.3.14.3节中更详细地描述。在特别的实施方式中，正交修饰包括选自但不限于工程化二硫桥、杵在臼中突变和电荷对突变的正交修饰的组合。在特别的实施方式中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸置换组合，例如异同种异型突变，如上文第6.3.2节中更详细地描述。
6.3.14.1正交工程化二硫桥
在各种实施方式中，正交修饰包括在第一与第二结构域之间产生工程化二硫桥的突变。如本文所述，“工程化二硫桥”是在两个或更多个结构域中提供非内源性半胱氨酸氨基酸的突变，使得当所述两个或更多个结构域相关联时形成非天然二硫键。在Merchant等(Nature Biotech(1998)16：677-681)中更详细地描述了工程化二硫桥，其所教导的全部内容通过引入并入本文。在某些实施方式中，工程化二硫桥改善了特定结构域之间的正交关联。在特别的实施方式中，产生工程化二硫桥的突变是在第一或第二CH3结构域之一中的K392C突变和在另一CH3结构域中的D399C。在优选实施方式中，产生工程化二硫桥的突变是在第一或第二CH3结构域之一中的S354C突变和在另一CH3结构域中的Y349C。在另一个优选实施方式中，产生工程化二硫桥的突变是在第一和第二CH3结构域两者中的447C突变，其通过延伸包含KSC三肽序列的CH3结构域的C端而提供。
6.3.14.2正交杵臼突变
在各种实施方式中，正交修饰包括杵臼(同义，杵在臼中)突变。如本文所描述，杵臼突变是改变第一结构域的表面的空间特征，使得相对于与没有互补空间突变的结构域相关联，所述第一结构域将优先与具有互补空间突变的第二结构域相关联的突变。杵臼突变在美国专利号5,821,333和美国专利号8,216,805中更详细地描述，其各自全部内容并入本文。在各种实施方式中，杵臼突变与工程化二硫桥组合，如Merchant等(Nature Biotech(1998)16：677-681))更详细地描述，其全部内容通过引用并入本文。在各种实施方式中，杵臼突变、异同种异型突变和工程化二硫突变组合。
在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的T366Y突变和在第二结构域中的Y407T突变。在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的F405A和在第二结构域中的T394W。在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的T366Y突变和F405A，以及在第二结构域中的T394W和Y407T。在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的T366W突变和在第二结构域中的Y407A突变。在某些实施方式中，组合的杵臼突变和工程化二硫突变是在第一结构域中的S354C和T366W突变，以及在第二结构域中的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变。在优选实施方式中，组合的杵臼突变、异同种异型突变和工程化二硫突变是在第一结构域中的S354C和T366W突变，以及在第二结构域中的Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变。
6.3.14.3正交电荷对突变
在各种实施方式中，正交修饰是电荷对突变。如本文所用，电荷对突变是影响结构域的表面的氨基酸的电荷，使得相对于与没有互补电荷对突变的结构域相关联，所述结构域将优先与具有互补电荷对突变的第二结构域相关联的突变。在某些实施方式中，电荷对突变改善了特定结构域之间的正交关联。电荷对突变在美国专利号8,592,562、美国专利号9,248,182和美国专利号9,358,286中更详细地描述，其各自所教导的内容都通过引用并入本文。在某些实施方式中，电荷对突变改善特定结构域之间的稳定性。在优选实施方式中，电荷对突变是在第一结构域中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
6.3.15结构域E&K的配对
在各种实施方式中，结构域E具有CH3氨基酸序列。
在各种实施方式中，结构域K具有CH3氨基酸序列。
在各种实施方式中，结构域E和K的氨基酸序列相同，其中所述序列是内源CH3序列。
在各种实施方式中，结构域E和K的序列不同。在各种实施方式中，不同的序列各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中结构域E与结构域K相互作用，并且其中结构域E和结构域K都不与缺乏正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。在某些实施方式中，正交修饰包括但不限于工程化二硫桥、杵臼突变和电荷对突变，如上文第6.3.14.1-6.3.14.3节中更详细地描述。在特别的实施方式中，正交修饰包括选自但不限于工程化二硫键、杵臼突变和电荷对突变的正交修饰的组合。在特别的实施方式中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸置换组合，例如异同种异型突变。
在各种实施方式中，结构域E和结构域K的氨基酸序列是两种不同抗体结构域的内源序列，所述结构域被选择以具有促进第一多肽与第三多肽之间的特异性关联的特异性相互作用。在各种实施方式中，两种不同的氨基酸序列是CH1序列和CL序列。CH1序列和CL序列分别在上文的第6.3.4.1节和第6.3.4.2节中更详细地描述。CH1和CL序列在重链的C端处促进特异性重链关联的使用描述于美国专利号8,242,247中，其所教导的全部内容通过引用并入本文。在某些实施方式中，CH1序列和CL序列两者都是内源序列。在某些实施方式中，CH1序列和CL序列各自在内源CH1和CL序列中分别包含正交修饰。在特别的实施方式中，内源CH1和CL序列的正交修饰是选自在CH1序列的第138位和CL序列的第116位、CH1序列的第128位和CL序列的第119位、或CH1序列的第129位和CL序列的第210位处的工程化半胱氨酸的工程化二硫桥，如在美国专利号8,053,562和美国专利号9,527,927中更详细地编号和讨论，其各自的全部内容通过引用并入本文。在优选实施方式中，工程化半胱氨酸位于由Eu索引编号的CH1序列的第128位和CLκ序列的第118位。
6.3.16结构域I&M的配对和结构域H&L的配对
在各种实施方式中，结构域I具有CL序列并且结构域M具有CH1序列。在各种实施方式中，结构域H具有VL序列并且结构域L具有VH序列。在优选实施方式中，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列，并且结构域M具有CH1氨基酸序列。在另一个优选实施方式中，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列，结构域M具有CH1氨基酸序列，并且结构域K具有CH3氨基酸序列。
在各种实施方式中，结构域I和结构域M的氨基酸序列各自在内源序列中分别包含正交修饰，其中结构域I与结构域M相互作用，并且其中结构域I和结构域M都不与缺少正交修饰的结构域显著地相互作用。在一系列的实施方式中，结构域I中的正交突变在CL序列中，并且结构域M中的正交突变在CH1序列中。正交突变在上文的第6.3.14.1-6.3.14.3节中更详细地描述。在各种实施方式中，CL序列和CH1序列中的正交突变是电荷对突变。在具体的实施方式中，电荷对突变是在CL序列中的F118S、F118A或F118V突变以及在CH1序列中的相应的A141L，或者在CL序列中的T129R突变以及在CH1序列中的相应的K147D，如由Eu索引编号并且在Bonisch等(Protein Engineering，Design&Selection，2017，pp.1-12)中更详细地描述，其所教导的全部内容通过引用并入本文。在一系列优选实施方式中，如由Eu索引编号的，电荷对突变是在CL序列中的N138K突变和在CH1序列中的相应的G166D，或者在CL序列中的N138D突变和在CH序列中的相应的G166K。
在各种实施方式中，在CL序列和CH1序列中的正交突变产生工程化二硫桥。在一系列优选实施方式中，如由Eu索引编号的，提供非内源性半胱氨酸氨基酸的突变是在CL序列中的F118C突变和在CH1序列中的相应的A141C，或在CL序列中的F118C突变和在CH1序列中的相应的L128C，或在CL序列中的S162C突变和在CH1序列中的相应的P171C突变。
在各种实施方式中，结构域H和结构域L的氨基酸序列各自在内源序列中分别包含正交修饰，其中结构域H与结构域L相互作用，并且其中结构域H和结构域L都不与缺乏正交修饰的结构域显著地相互作用。在一系列的实施方式中，结构域H中的正交突变是在VL序列中并且结构域L中的正交突变是在VH序列中。在具体的实施方式中，正交突变是在VH/VL界面处的电荷对突变。在优选实施方式中，VH/VL界面处的电荷对突变是在VH中的Q39E和在VL中的相应的Q38K，或在VH中的Q39K和在VL中的相应的Q38E，如Igawa等(ProteinEng.Des.Sel.,2010,vol.23,667–677)更详细地描述，其所教导的全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，并且结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，并且结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点。
6.3.17三价结合分子
在另一系列的实施方式中，结合分子具有三个抗原结合位点，因此被称为“三价”。
参考图21，在各种三价实施方式中，结合分子还包含第五多肽链，其中(a)第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列，并且其中结构域N具有VL氨基酸序列，结构域O具有CH3氨基酸序列；(b)所述结合分子还包含第五多肽链，所述第五多肽链包含：结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且其中结构域P具有VH氨基酸序列，并且结构域Q具有CH3氨基酸序列；并且(c)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。如图2中所示意，这些三价的实施方式被称为“2x1”三价构建体。
参考图26，在另一系列的三价实施方式中，结合分子还包含第六多肽链，其中(a)第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域R具有VL氨基酸序列，并且结构域S具有恒定结构域氨基酸序列；(b)所述结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有VH氨基酸序列，并且结构域U具有恒定结构域氨基酸序列；并且(c)所述第三多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。如图2中所示意，这些三价实施方式被称为“1x2”三价构建体。
在各种实施方式中，结构域O通过肽接头与结构域A连接。在各种实施方式中，结构域S通过肽接头与结构域H连接。在优选实施方式中，将结构域O连接至结构域A或将结构域S连接至结构域H的肽接头是6个氨基酸的GSGSGS肽序列，如在第6.3.19.6节中更详细地描述。
6.3.17.1三价2x1双特异性构建体[2(A-A)x1(B)]
参考图21，在各种实施方式中，结构域N和结构域A的氨基酸序列相同，结构域H的氨基酸序列不同于结构域N和A，结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，结构域I的氨基酸序列不同于结构域O和结构域B，结构域P和结构域F的氨基酸序列相同，结构域L的氨基酸序列不同于结构域P和结构域F，结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M的氨基酸序列不同于结构域Q和结构域G；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域N和结构域P形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点。
6.3.17.2三价2x1双特异性构建体[2(A-B)x1(A)]
参考图21，在各种实施方式中，结构域N和结构域H的氨基酸序列相同，结构域A的氨基酸序列不同于结构域N和结构域H，结构域O和结构域I的氨基酸序列相同，结构域B的氨基酸序列不同于结构域O和结构域I，结构域P和结构域L的氨基酸序列相同，结构域F的氨基酸序列不同于结构域P和结构域L，结构域Q和结构域M的氨基酸序列相同，结构域G的氨基酸序列不同于结构域Q和结构域M；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域N和结构域P形成对第二抗原特异的第三抗原结合位点。
6.3.17.3三价2x1三特异性构建体[2(A-B)x1(C)]
参考图21，在各种实施方式中，结构域N、结构域A和结构域H的氨基酸序列不同，结构域O、结构域B和结构域I的氨基酸序列不同，结构域P、结构域F和结构域L的氨基酸序列不同，结构域Q、结构域G和结构域M的氨基酸序列不同；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域N和结构域P形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
在某些实施方式中，结构域O具有作为来自κ轻链的CL的恒定区序列，并且结构域Q具有作为来自IgG1同种型的CH1的恒定区序列，如在第6.3.4.1节和第6.3.4.2节中更详细地讨论。在优选实施方式中，结构域O和结构域Q具有使得它们彼此特异性相关联的CH3序列，如上文第6.3.14节中更详细地讨论。
6.3.17.4三价2x1单特异性构建体
参考图21，在各种实施方式中，结构域N、结构域A和结构域H的氨基酸序列相同，结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，结构域P、结构域F和结构域L的氨基酸序列相同，并且结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域N和结构域P形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点。
参考图21，在另一系列的实施方式中，结构域N、结构域A和结构域H的氨基酸序列相同，结构域O、结构域B和结构域I的氨基酸序列相同，结构域P、结构域F和结构域L的氨基酸序列相同，并且结构域Q、结构域G和结构域M的氨基酸序列相同；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域N和结构域P形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点。
6.3.17.5三价1x2双特异性构建体[1(A)x2(B-A)]
参考图26，在各种实施方式中，结构域R和结构域A的氨基酸序列相同，结构域H的氨基酸序列不同于结构域R和结构域A，结构域S和结构域B的氨基酸序列相同，结构域I的氨基酸序列不同于结构域S和结构域B，结构域T和结构域F的氨基酸序列相同，结构域L的氨基酸序列不同于结构域T和结构域F，结构域U和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M的氨基酸序列不同于结构域U和结构域G，并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域R和结构域T形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点。
6.3.17.6三价1x2双特异性构建体[1(A)x2(BB)]
参考图26，在各种实施方式中，结构域R和结构域H的氨基酸序列相同，结构域A的氨基酸序列不同于结构域R和结构域H，结构域S和结构域I的氨基酸序列相同，结构域B的氨基酸序列不同于结构域S和结构域I，结构域T和结构域L的氨基酸序列相同，结构域F的氨基酸序列不同于结构域T和结构域L，结构域U和结构域M的氨基酸序列相同，结构域G的氨基酸序列不同于结构域U和结构域M，并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域R和结构域T形成对第二抗原特异的第三抗原结合位点。
6.3.17.7三价1x2三特异构建体[1(A)x2(B-C)]
参考图26，在各种实施方式中，结构域R、结构域A和结构域H的氨基酸序列不同，结构域S、结构域B和结构域I的氨基酸序列不同，结构域T、结构域F和结构域L的氨基酸序列不同，结构域U、结构域G和结构域M的氨基酸序列不同；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域R和结构域T形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
在特别的实施方式中，结构域S具有来自κ轻链的CL的恒定区序列，结构域U具有来自IgG1同种型的CH1的恒定区序列，如在第6.3.4.1节和第6.3.4.2节中更详细地讨论。在优选实施方式中，结构域S和结构域U具有使得它们彼此特异性相关联的CH3序列，如上文第6.3.14节中更详细地讨论。
6.3.17.8。三价1x2单特异性构建体
参考图26，在各种实施方式中，结构域R、结构域A和结构域H的氨基酸序列相同，结构域S和结构域B的氨基酸序列相同，结构域T、结构域F和结构域L的氨基酸序列相同，结构域U和结构域G的氨基酸序列相同；并且结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，并且结构域R和结构域T形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点。
6.3.18四价2x2结合分子
在各种实施方式中，结合分子具有四个抗原结合位点，因此被称为“四价”。
参考图34，在另一系列的实施方式中，结合分子还包含第五和第六多肽链，其中(a)第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列；(b)所述第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列；(c)所述结合分子还包含第五和第六多肽链，其中：所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列；并且(d)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联，并且所述第三多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子。
在各种实施方式中，结构域O通过肽接头与结构域A连接，并且结构域S通过肽接头与结构域H连接。在优选实施方式中，将结构域O连接至结构域A并且将结构域S连接至结构域H的肽接头是6个氨基酸的GSGSGS肽序列，如第6.3.19.6节中更详细地描述。
6.3.18.1四价2x2双特异性构建体
参考图34，在一系列四价2x2双特异性结合分子中，结构域N和结构域A的氨基酸序列相同，结构域H和结构域R的氨基酸序列相同，结构域O和结构域B的氨基酸序列相同。结构域I和结构域S的氨基酸序列相同，结构域P和结构域F的氨基酸序列相同，结构域L和结构域T的氨基酸序列相同，结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M和结构域U的氨基酸序列相同；并且其中结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域N和结构域P形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第三抗原结合位点，并且结构域R与结构域T之间的相互作用形成对第二抗原特异的第四抗原结合位点。
参考图34，在另一系列的四价2x2双特异性结合分子中，结构域H和结构域A的氨基酸序列相同，结构域N和结构域R的氨基酸序列相同，结构域I和结构域B的氨基酸序列相同，结构域O和结构域S的氨基酸序列相同，结构域L和结构域F的氨基酸序列相同，结构域P和结构域T的氨基酸序列相同，结构域M和结构域G的氨基酸序列相同，结构域Q和结构域U的氨基酸序列相同；并且其中结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域N和结构域P形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点，并且结构域R与结构域T之间的相互作用形成对第二抗原特异的第四抗原结合位点。
6.3.18.2四价2x2单特异性构建体
参考图34，在各种实施方式中，结构域N、结构域A、结构域H和结构域R的氨基酸序列相同，结构域O和结构域B的氨基酸序列相同，结构域I和结构域S的氨基酸序列相同，结构域P、结构域F、结构域L和结构域T的氨基酸序列相同，结构域Q和结构域G的氨基酸序列相同，结构域M和结构域U的氨基酸序列相同；并且其中结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域N和结构域P形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点，并且结构域R与结构域T之间的相互作用形成对第一抗原特异的第四抗原结合位点。
参考图34，在另一系列的四价2x2单特异性的实施方式中，结构域N、结构域A、结构域H和结构域R的氨基酸序列相同，结构域I和结构域B的氨基酸序列相同，结构域O和结构域S的氨基酸序列相同，结构域P、结构域F、结构域L和结构域T的氨基酸序列相同，结构域M和结构域G的氨基酸序列相同，结构域Q和结构域U的氨基酸序列相同；并且其中结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，结构域N和结构域P形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点，并且结构域R与结构域T之间的相互作用形成对第一抗原特异的第四抗原结合位点。
6.3.19结构域连接
6.3.19.1连接VL与CH3结构域的连接
在各种实施方式中，在VL结构域的C端与CH3结构域的N端之间形成连接的氨基酸序列是工程化序列。在某些实施方式中，在VL结构域的C端缺失或添加一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，连接VL结构域的C端与CH3结构域的N端的连接是在下文第6.12.6节的表2中描述的序列之一。在特别的实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111。在某些实施方式中，在CH3结构域的N端缺失或添加一个或多个氨基酸。在特别的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343。在特别的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343和R344。在某些实施方式中，在VL结构域的C端和CH3结构域的N端两者缺失或添加一个或多个氨基酸。在特别的实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111，并且在CH3结构域的N端缺失P343。在优选实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111和V110。在另一个优选实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111和V110，并且CH3结构域的N端具有P343V突变。
6.3.19.2连接VH与CH3结构域的连接
在各种实施方式中，在VH结构域的C端与CH3结构域的N端之间形成连接的氨基酸序列是工程化序列。在某些实施方式中，在VH结构域的C端缺失或添加一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，连接VH结构域的C端与CH3结构域的N端的连接是在下文第6.12.6节的表3中描述的序列之一。在特别的实施方式中，在VH结构域的C端缺失K177和G118。在某些实施方式中，在CH3结构域的N端缺失或添加一个或多个氨基酸。在特别的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343。在特别的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343和R344。在特别的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343、R344和E345。在某些实施方式中，在VH结构域的C端和CH3结构域的N端两者缺失或添加一个或多个氨基酸。在优选实施方式中，在VH结构域的C端缺失T166、K177和G118。
6.3.19.3连接CH3 C端与CH2 N端的连接(铰链)
在本文所描述的结合分子中，CH2结构域的N端具有“铰链”区氨基酸序列。如本文所用，铰链区是连接抗体的N端可变结构域-恒定结构域区段与抗体的CH2结构域的抗体重链的序列。另外，铰链区通常同时提供在N端可变结构域-恒定结构域区段与CH2结构域之间的灵活性，和在重链(例如第一多肽链和第三多肽链)之间形成二硫桥的氨基酸序列基序。如本文所用，铰链区氨基酸序列是SEQ ID NO:56。
在各种实施方式中，CH3氨基酸序列在C端处在CH3结构域的C端与CH2结构域的N端之间的连接处延伸。在某些实施方式中，CH3氨基酸序列在C端处在CH3结构域的C端与铰链区之间的连接处延伸，所述铰链区又连接到CH2结构域的N端。在优选实施方式中，CH3氨基酸序列通过插入PGK三肽序列来延伸，所述PGK三肽序列之后是IgG1铰链区的DKTHT基序。
在特别的实施方式中，在CH3结构域的C端处的延伸引入可以与另一CH3结构域的正交C端延伸形成二硫键的氨基酸序列。在优选实施方式中，在CH3结构域的C端处的延伸引入KSC三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，其与引入κ轻链的GEC基序的另一CH3结构域的正交C端延伸形成二硫键。
6.3.19.4连接CL C端与CH2 N端的连接(铰链)
在各种实施方式中，CL氨基酸序列是通过其C端与铰链区连接，所述铰链区又与CH2结构域的N端连接。铰链区序列在上文的第6.3.19.3节中更详细地描述。在优选实施方式中，铰链区氨基酸序列是SEQ ID NO:56。
6.3.19.5连接CH2 C端与恒定区结构域的连接
在各种实施方式中，CH2氨基酸序列通过其C端与恒定区结构域的N端连接。恒定区在上文的第6.3.4节中更详细地描述。在优选实施方式中，CH2序列通过其内源序列与CH3序列连接。在其他实施方式中，CH2序列与CH1或CL序列连接。讨论连接CH2序列至CH1或CL序列的实例更详细地描述于美国专利号8,242,247中，其全部内容通过引用并入本文。
6.3.19.6在三价和四价分子上连接结构域O至结构域A或连接结构域S至结构域H的连接
在各种实施方式中，抗体的重链(例如，第一多肽链和第三多肽链)在它们的N端延伸以包含提供另外的ABS的另外的结构域。参考图21、图26和图34，在某些实施方式中，结构域O和/或结构域S的恒定区结构域氨基酸序列的C端分别与结构域A和/或结构域H的可变区结构域氨基酸序列的N端连接。在一些优选实施方式中，恒定区结构域是CH3氨基酸序列，并且可变区结构域是VL氨基酸序列。在一些优选实施方式中，恒定区结构域是CL氨基酸序列，并且可变区结构域是VL氨基酸序列。在某些实施方式中，恒定区结构域通过肽接头与可变区结构域连接。在优选实施方式中，肽接头是6个氨基酸的GSGSGS肽序列。
在各种实施方式中，抗体的轻链(例如，第二多肽链和第四多肽链)在它们的N端延伸以包含抗体的另外的可变结构域恒定结构域区段。在某些实施方式中，恒定区结构域是CH1氨基酸序列，并且可变区结构域是VH氨基酸序列。
6.4特异性二价结合分子
在另一个方面，提供二价结合分子。
参考图3，在第一系列的实施方式中，结合分子包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，并且结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，和K具有恒定区结构域氨基酸序列；(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；(e)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；(f)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和(g)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子。
在优选实施方式中，结构域E具有CH3氨基酸序列，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域K具有CH3氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列，并且结构域M具有CH1氨基酸序列。
在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，并且结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点，并且结合分子是双特异性二价结合分子。在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点，并且结构域H与结构域L之间的相互作用形成对第一抗原特异的第二抗原结合位点，并且结合分子是单特异性二价结合分子。
6.4.1二价双特异性B-Body“BC1”
参考图3和图6，在一系列的实施方式中，结合分子包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有含有T366K突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入KSC三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有L351D突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入GEC氨基酸二硫基序；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。
在优选实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:8，第二多肽链具有序列SEQID NO:9，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:10，并且第四多肽链链具有序列SEQ ID NO:11。
6.4.2二价双特异性B-Body“BC6”
参考图3和图14，在一系列的实施方式中，结合分子包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入KSC三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，结构域D具有人IgG1CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有C端延伸的人IgG1CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入GEC氨基酸二硫基序；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。
6.4.3二价双特异性B-Body“BC28”
参考图3和图16，在一系列的实施方式中，结合分子包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有含有Y349C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有S354C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。
在优选实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:24，第二多肽链具有序列SEQID NO:25，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:10，并且第四多肽链链具有序列SEQ ID NO:11。
6.4.4二价双特异性B-Body“BC44”
参考图3和图19，在一系列的实施方式中，结合分子包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有含有Y349C突变、P343V突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有S354C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、T366S、L368A和Y407V的人IgG1CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子；(h)结构域A和结构域F形成对第一抗原特异的第一抗原结合位点；(i)结构域H和结构域L形成对第二抗原特异的第二抗原结合位点。
在优选实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:32，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO:25，所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO:10，和第四多肽链具有序列SEQ IDNO:11。
6.5特异性三价结合分子
6.5.1三价1x2双特异性B-Body“BC28-1x2”
参考第6.4.3节和图26，在一系列的实施方式中，结合分子还包含第六多肽链，其中(a)第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域R具有第一VL氨基酸序列，并且结构域S具有含有Y349C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列，其后是连接结构域S与结构域H的GSGSGS接头肽；(b)结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：结构域T和结构域U，其中结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有VH氨基酸序列，并且结构域U具有含有S354C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列；(c)第三多肽和第六多肽通过结构域R与结构域T之间的相互作用和结构域S与结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子，并且(d)结构域R和结构域T形成对第一抗原特异的第三抗原结合位点。
在优选实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:24，第二多肽链具有序列SEQID NO:25，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:37，第四多肽链具有序列SEQ ID NO:11，并且第六多肽链具有序列SEQ ID NO:25。
6.5.2三价1x2三特异性B-Body“BC28-1x1x1a”
参考第6.4.3节和图26和图30，在一系列的实施方式中，结合分子还包含第六多肽链，其中(a)第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域R具有第三VL氨基酸序列，并且结构域S具有含有T366K突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入KSC三肽序列，其后是连接结构域S与结构域H的GSGSGS接头肽；(b)结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：结构域T和结构域U，其中结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有VH氨基酸序列，并且结构域U具有含有L351D突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入GEC氨基酸二硫基序；并且(c)第三多肽和第六多肽通过结构域R与结构域T之间的相互作用和结构域S与结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子，并且(d)结构域R和结构域T形成对第三抗原特异的第三抗原结合位点。
在优选实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:24，第二多肽链具有序列SEQID NO:25，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:45，第四多肽链具有序列SEQ ID NO:11，第六多肽链具有序列SEQ ID NO:53。
6.6抗原特异性
可以选择本文所描述的结合分子的抗原结合位点以特异性结合各种各样的分子靶标。例如，一个或多个抗原结合位点可以特异性结合E-Cad、CLDN7、FGFR2b、N-Cad、Cad-11、FGFR2c、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FOLR1、IGF-Ira、GLP1R、PDGFRα、PDGFRb、EPHB6、ABCG2、CXCR4、CXCR7、整联蛋白-avb3、SPARC、VCAM、ICAM、膜联蛋白、ROR1、ROR2、TNFα、CD137、血管生成素2、血管生成素3、BAFF、β淀粉样物质、C5、CA-125、CD147、CD125、CD147、CD152、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD274、CD28、CD3、CD30、CD33、CD37、CD4、CD40、CD44、CD44v4、CD44v6、CD44v7、CD50、CD51、CD52、CEA、CSF1R、CTLA-2、DLL4、EGFR、EPCAM、HER3、GD2神经节苷脂、GDF-8、Her2/neu、CD2221、IL-17A、IL-12、IL-23、IL-13、IL-6、IL-23、整联蛋白、CD11a、MUC1、Notch、TAG-72、TGFβ、TRAIL-R2、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、VEGFc、促红细胞生成素(hematopoietin)(四螺旋束)(例如EPO(erythropoietin)(促红细胞生成素))、IL-2(T细胞生长因子)、IL-3(多集落CSF)、IL-4(BCGF-1、BSF-1)、IL-5(BCGF-2)、IL-6IL-4(IFN-β2、BSF-2、BCDF)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-13(P600)、G-CSF、IL-15(T细胞生长因子)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、OSM(OM、制瘤素M)和LIF(白血病抑制因子))；干扰素(例如IFN-γ、IFN-α和IFN-β)；免疫球蛋白超家族(例如B7.1(CD80)和B7.2(B70、CD86))；TNF家族(例如TNF-α(恶液质素)(cachectin)、TNF-β(淋巴毒素、LT、LT-α)、LT-β、Fas、CD27、CD30和4-1BBL)；和未分配给特定家族的那些(例如TGF-β、IL1α、IL-1β、IL-1RA、IL-10(细胞因子合成抑制子F)、IL-12(NK细胞刺激因子)、MIF、IL-16、IL-17(mCTLA-8)和/或IL-18(IGIF、干扰素-γ诱导因子))；在涉及双特异性抗体的实施方式中，抗体可以例如结合这些靶标中的两种。此外，抗体的重链的Fc部分可用于靶向Fc受体表达细胞，例如使用IgE抗体的Fc部分靶向肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
可以选择特异性结合TNF受体家族的一个或多个抗原结合位点，所述TNF受体家族包括但不限于TNFR1(也称为CD120a和TNFRSF1A)、TNFR2(也称为CD120b和TNFRSF1B)、TNFRSF3(也称为LTβR)、TNFRSF4(也称为OX40和CD134)、TNFRSF5(也称为CD40)、TNFRSF6(也称为FAS和CD95)、TNFRSF6B(也称为DCR3)、TNFRSF7(也称为CD27)、TNFRSF8(也称为CD30)、TNFRSF9(也称为4-1BB)、TNFRSF10A(也称为TRAILR1、DR4和CD26)、TNFRSF10B(也称为TRAILR2、DR5和CD262)、TNFRSF10C(也称为TRAILR3、DCR1、CD263)、TNFRSF10D(也称为TRAILR4、DCR2和CD264)、TNFRSF11A(也称为RANK和CD265)、TNFRSF11B(也称为OPG)、TNFRSF12A(也称为FN14、TWEAKR和CD266)、TNFRSF13B(也称为TACI和CD267)、TNFRSF13C(也称为BAFFR、BR3和CD268)、TNFRSF14(也称为HVEM和CD270)、TNFRSF16(也称为NGFR、p75NTR和CD271)、或TNFRSF17(也称为BCMA和CD269)、TNFRSF18(也称被称为GITR和CD357)、TNFRSF19(也称为TROY、TAJ和TRADE)、TNFRSF21(也称为CD358)、TNFRSF25(也称为Apo-3、TRAMP、LARD或WS-1)、EDA2R(也称为XEDAR)。
可以选择特异性结合免疫肿瘤靶标的一个或多个抗原结合位点或位点，所述免疫肿瘤靶标包括但不限于，检查点抑制剂靶标例如PD1、PDL1、CTLA-4、PDL2、B7-H3、B7-H4、BTLA、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、BY55和CGEN-15049。
在一系列的实施方式中，可以选择特异性靶向肿瘤相关细胞的一个或多个抗原结合位点。在各种实施方式中，一个或多个抗原结合位点特异性靶向肿瘤相关免疫细胞。在某些实施方式中，一个或多个抗原结合位点特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞(Treg)。在具体的实施方式中，结合分子具有对选自CD25、OX40、CTLA-4和NRP1中的一种或多种的抗原特异的抗原结合位点，使得结合分子特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞。在具体的实施方式中，结合分子具有特异性结合CD25和OX40、CD25和CTLA4、CD25和NRP1、OX40和CTLA-4、OX40和NRP1、或CTLA-4和NRP1的抗原结合位点，使得结合分子特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞。在优选实施方式中，双特异性二价结合分子具有特异性结合CD25和OX40、CD25和CTLA-4、CD25和NRP1、OX40和CTLA4、OX40和NRP1、或CTLA-4和NRP1的抗原结合位点，使得结合分子特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞。在具体的实施方式中，肿瘤相关调节性T细胞的特异性靶向导致调节性T细胞的耗尽(例如杀死)。在优选实施方式中，调节性T细胞的耗尽是由抗体-药物缀合物(ADC)修饰所介导，例如与毒素缀合的抗体，如下文第6.7.1节中更详细地讨论。
在一系列的实施方式中，结合分子具有选自CD3、ROR1和ROR2中的一种或多种的抗原结合位点。在具体的实施方式中，双特异性二价具有特异性结合CD3和ROR1的抗原结合位点。在具体的实施方式中，双特异性二价具有特异性结合CD3和ROR2的抗原结合位点。在具体的实施方式中，三特异性三价具有特异性结合CD3、ROR1和ROR2的抗原结合位点。
6.7进一步的修饰
在另一系列的实施方式中，结合分子具有另外的修饰。
6.7.1结合分子-药物缀合物
在各种实施方式中，结合分子与治疗剂(即药物)缀合以形成结合分子-药物缀合物。治疗剂包括但不限于化学治疗剂、成像剂(例如放射性同位素)、免疫调节剂(例如细胞因子、趋化因子或检查点抑制剂)和毒素(例如细胞毒性剂)。在某些实施方式中、治疗剂通过接头肽附着于结合分子，如下文第6.7.3节中更详细地讨论。
制备可以适于将药物与本文公开的结合分子缀合的抗体-药物缀合物(ADC)的方法描述于例如美国专利号8,624,003(罐法)、美国专利号8,163,888(一步)、美国专利号5,208,020(两步法)、美国专利号8,337,856、美国专利号5,773,001、美国专利号7,829,531、美国专利号5,208,020、美国专利号7,745,394、WO2017/136623、WO2017/015502、WO2017/015496、WO2017/015495、WO2004/010957、WO2005/077090、WO2005/082023、WO2006/065533、WO2007/030642、WO2007/103288、WO2013/173337、WO2015/057699、WO2015/095755、WO2015/123679、WO2015/157286、WO2017/165851、WO2009/073445、WO2010/068759、WO2010/138719、WO2012/171020、WO2014/008375、WO2014/093394、WO2014/093640、WO2014/160360、WO2015/054659、WO2015/195925、WO2017/160754、Storz(MAbs.2015Nov-Dec；7(6):989–1009)、Lambert等(Adv Ther,2017 34:1015)、Diamantis等(British Journal of Cancer,2016,114,362–367)、Carrico等(Nat Chem Biol,2007.3:321-2)、We等(Proc Natl Acad SciUSA,2009.106:3000-5)、Rabuka等(Curr Opin Chem Biol.,2011 14:790-6)、Hudak等(Angew Chem Int Ed Engl.,2012:4161-5)、Rabuka等(Nat Protoc.,20127:1052-67)、Agarwal等(Proc Natl Acad Sci USA.,2013,110:46-51)、Agarwal等(BioconjugateChem.,2013,24:846–851)、Barfield等(Drug Dev.and D.,2014,14:34-41)、Drake等(Bioconjugate Chem.,2014,25:1331-41)、Liang等(J Am Chem Soc.,2014,136:10850-3)、Drake等(Curr Opin Chem Biol.,2015,28:174-80)、和York等(BMC Biotechnology,2016,16(1):23)，将其各自所教导的全部内容通过引用并入本文。
6.7.2另外的结合部分(moiety)
在各种实施方式中，结合分子具有包含一个或多个另外的结合部分的修饰。在某些实施方式中，结合部分是抗体片段或抗体形式，包括但不限于全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、双抗体、单链双抗体(scDiabody)，DART，tandAb，微抗体，骆驼VHH，和领域技术人员已知的其他抗体片段或形式。示例性的抗体和抗体片段形式详细描述于Brinkmann等(MABS,2017,Vol.9,No.2,182–212)，其所教导的全部内容通过引用并入本文。
在特别的实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着到第一多肽链或第三多肽链的C端。在特别的实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着到第一多肽链和第三多肽链两者的C端。在特别的实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着到第一多肽链和第三多肽链两者的C端。在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分的各个部分(portion)分别附着到第一多肽链和第三多肽链的C端，使得所述部分(portion)形成功能性结合部分。
在特别的实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着到任何多肽链(例如，第一、第二、第三、第四、第五、或第六多肽链)的N端。在某些实施方式中，另外的结合部分的各个部分分别附着到不同多肽链的N端，使得所述部分形成功能性结合部分。
在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分对结合分子内的ABS的不同抗原或表位具有特异性。在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分对结合分子内的ABS的相同抗原或表位具有特异性。在某些实施方式中，其中修饰是两个或更多个另外的结合部分，所述另外的结合部分对相同的抗原或表位具有特异性。在某些实施方式中，其中修饰是两个或更多个另外的结合部分，所述另外的结合部分对不同的抗原或表位具有特异性。
在某些实施方式中，使用体内方法将一个或多个另外的结合部分附着到结合分子，所述体内方法包括但不限于，反应性化学和亲和标签系统，如在下文第6.7.3节中更详细地讨论。在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分通过Fc介导的结合(例如蛋白A/G)附着到结合分子。在某些实施方式中，使用重组DNA技术将一个或多个另外的结合部分附着到结合分子，例如在同一表达载体(例如质粒)上编码结合分子与另外的结合部分之间的融合产物的核苷酸序列。
6.7.3功能性/反应性基团
在各种实施方式中，结合分子具有包含可以在下游过程中使用的功能性基团或化学反应性基团的修饰，例如链接到另外的部分(例如药物缀合物和另外的结合部分，如在上文第6.7.1和6.7.2节更详细地讨论)和下游纯化过程。
在某些实施方式中，修饰是化学反应性基团，包括但不限于反应性硫醇(例如基于马来酰亚胺的反应性基团)、反应性胺(例如基于N-羟基琥珀酰亚胺的反应性基团)、“点击化学”(click chemistry)基团(例如反应性炔基)和带有甲酰甘氨酸(FGly)的醛。在某些实施方式中，修饰是功能性基团，包括但不限于亲和肽序列(例如HA、HIS、FLAG、GST、MBP和Strep系统等)。在某些实施方式中，功能性基团或化学反应性基团具有可切割的肽序列。在特别的实施方式中，可切割肽通过包括但不限于光切割、化学切割、蛋白酶切割、还原性条件和pH条件的方法切割。在特别的实施方式中，蛋白酶切割通过细胞内蛋白酶进行。在特别的实施方式中，蛋白酶切割通过细胞外或膜相关蛋白酶进行。采用蛋白酶切割的ADC疗法在Choi等(Theranostics,2012；2(2):156–178)中更详细地描述，其所教导的全部内容通过引用并入本文。
6.8药物组合物
在另一个方面，提供药物组合物，所述药物组合物包含如本文所描述的结合分子，和药学上可接受的载体或稀释剂。在典型的实施方式中，药物组合物是无菌的。
在各种实施方式中，药物组合物包含浓度为0.1mg/ml-100mg/ml的结合分子。在具体的实施方式中，药物组合物包含浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml、或10mg/ml的结合分子。在一些实施方式中，药物组合物包含浓度大于10mg/ml的结合分子。在某些实施方式中，结合分子以20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、或甚至50mg/ml或更高的浓度存在。在特别的实施方式中，结合分子以大于50mg/ml的浓度存在。
在各种实施方式中，药物组合物更详细地描述于美国专利号8,961,964、美国专利号8,945,865、美国专利号8,420,081、美国专利号6,685,940、美国专利号6,171,586、美国专利号8,221,865、美国专利号9,216,219、美国申请10/813,483、WO2014/066468、WO2011/104381、和WO2016/180941，将其中每一项所教导的全部内容通过引用并入本文。
6.9制备方法
本文所描述的结合分子可以很容易地通过使用目前用于抗体制备的标准无细胞翻译、瞬时转染和稳定转染的方法进行表达而制备。在具体的实施方式中，Expi293细胞(ThermoFisher)可用于使用来自ThermoFisher的方案和试剂，例如ExpiFectamine，或本领域技术人员已知的其他试剂，例如在Fang等(Biological Procedures Online,2017,19:11)中详细描述的聚乙烯亚胺，生产结合分子，其所教导的全部内容通过引用并入本文。
如在下文的实施例中进一步描述的，表达的蛋白质可以容易地使用CH1亲和树脂纯化，例如CaptureSelect CH1树脂，和从ThermoFisher提供的方案。可以使用本领域常规使用的离子交换层析法进行进一步的纯化。
6.10治疗方法
在另一个方面，提供治疗方法，所述方法包括以有效治疗患者的量向患者施用本文所描述的结合分子。
在一些实施方式中，本公开的抗体可用于治疗癌症。癌症可以是来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌症。在一些实施方式中，癌症可以是瘤，恶性的；癌；癌，未分化的；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛细胞癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；类癌瘤，恶性的；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性粒细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；琥珀酸腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢间质瘤，恶性的；肉瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；成骨细胞瘤，恶性的；支持细胞癌；睾丸间质细胞瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳腺外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；肾小球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素瘤；浅表性蔓延性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝色痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性的；mullerian混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；肉瘤；间质瘤，恶性的；brenner肿瘤，恶性的；叶状肿瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢肿瘤，恶性的；绒毛膜癌；中肾，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因的肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉性牙源肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体，恶性的；脊索瘤；胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质瘤；少突母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金的；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
本公开的抗体可以自身或以药物组合物的形式施用给受试者以治疗，例如癌症、自身免疫、移植排斥、创伤后免疫应答、移植抗宿主病、缺血，中风和传染病，例如通过靶向病毒抗原，例如HIV的gp120。
6.11另外的方面和实施方式
在以下编号的项目中提供了其他方面和实施方式。
1.一种结构域交换抗体，所述结构域交换抗体包含包含VH-CH3的重链(HC)和包含VL-CH3-CH2-CH3的轻链(LC)，其中所述HC的所述VH-CH3与所述LC的所述VL-CH3二聚化，由此形成包含CH3LC/CH3HC结构域对的第一结构域交换LC/HC二聚体。
2.根据项目1所述的抗体，其中所述轻链进一步限定为VL-CH3(杵)-CH2-CH3，并且其中所述重链进一步限定为VH-CH3(臼)。
3.根据项目1所述的抗体，其中所述轻链进一步限定为VL-CH3(臼)-CH2-CH3，并且其中所述重链进一步限定为VH-CH3(杵)。
4.根据项目1-3中任一项所述的抗体，其中所述轻链还包含第二LC/HC二聚体，其中所述轻链进一步限定为VL-CH3-CH2-CH3-VX1-CHX，并且其中所述轻链进一步与VX2-CHX2二聚化。
5.根据项目4所述的抗体，其中VX1是第二VH区，并且其中VX2是第二VL区。
6.根据项目4所述的抗体，其中VX1是第二VL区，并且其中VX2是第二VH区。
7.根据项目4-6中任一项所述的抗体，其中CHX和CHX2形成CH3/CH3二聚体。
8.根据项目4-6中任一项所述的抗体，其中CHX和CHX2形成CH1/CL二聚体。
9.根据项目4所述的抗体，其中所述轻链进一步限定为VL-CH3-CH2-CH3-VH1-CH1，并且其中所述VX2-CHX2是VL1-CL。
10.根据项目1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含两条轻链，其中第一轻链进一步限定为VL-CH3-CH2-CH3-VH1-CH1，并且第二轻链进一步限定为VL-CH3-CH2-CH3-VL1-CL，其中VH1-CH1与VL1-CL二聚化。
11根据项目1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含两条轻链，其中第一轻链进一步限定为VL-CH3-CH2-CH3-VH1-CH3，并且第二轻链进一步限定为VL-CH3-CH2-CH3-VL1-CH3，其中VH1-CH3与VL1-CH3二聚化。
12.根据项目11所述的抗体，其中所述VL1-CH3进一步限定为VL1-CH3(杵)，并且其中所述VH1-CH3进一步限定为VH1-CH3(臼)。
13.根据项目1-3中任一项所述的抗体，其中所述重链还包含第二LC/HC二聚体，其中所述重链进一步限定为VX1-CHX-VH-CH3，并且其中所述重链进一步与VX2-CHX2二聚化。
14.根据项目13所述的抗体，其中VX1是第二VH区，并且其中VX2是第二VL区。
15.根据项目13所述的抗体，其中VX1是第二VL区，并且其中VX2是第二VH区。
16.根据项目13-15中任一项所述的抗体，其中CHX和CHX2形成CH3/CH3二聚体。
17.根据项目13-15中任一项所述的抗体，其中CHX和CHX2形成CH1/CL二聚体。
18.根据项目4所述的抗体，其中所述重链进一步限定为VH1-CH1-VH-CH3，并且其中所述VX2-CHX2是VL1-CL。
19.根据项目4-18中任一项所述的抗体，其中所述第一LC/HC二聚体包含识别第一表位的第一结合位点，并且其中所述第二LC/HC二聚体包含识别与所述第一表位不同或来源于不同抗原的第二表位的第二结合位点，其中所述第一LC/HC二聚体或第二LC/HC二聚体是结构域交换的。
20.根据项目19所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含两个第一LC/HC二聚体和单个第二LC/HC二聚体。
21.根据项目19所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含两个第一LC/HC二聚体和两个第二LC/HC二聚体。
22.根据项目1-21中任一项所述的抗体，其中所述HC或所述LC包含如下表A中所示的突变。
23.根据项目1-22中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。
24.根据项目1-23中任一项所述的抗体，其中所述LC由VL-CH3-CH2-CH3组成，任选地还包含一个或多个接头/连接或铰链区。
25.根据项目1-24中任一项所述的抗体，其中所述第一LC/HC二聚体的特征在于CH3(杵)/CH3(臼)二聚体，CH3Hc/CH3Hc二聚体，或包含能够产生CH3LC/CH3HC结构域的关联对的工程化CH3结构域；并且其中所述轻链进一步与包含CH2-CH3的Fc链二聚化，从而形成Fc区。
26.根据项目1-25中任一项所述的抗体，其中所述轻链进一步与包含CH2-CH3的Fc链二聚化，由此形成Fc区；并且其中所述Fc区的特征在于CH3(杵)/CH3(臼)二聚体、CH3Hc/CH3Hc二聚体、或包含能够产生CH3LC/CH3HC结构域的关联对的工程化CH3结构域。
27.根据项目25-26中任一项所述的抗体，其中所述工程化CH3结构域包含人IgG1的CH3的氨基酸序列或其与人IgG1的CH3具有至少80％的序列同一性的功能变体，所述工程化CH3结构域包含以下中的一项或多项：
a)一个或多个杵或臼突变，优选T366Y/Y407T、F405A/T394'W、T366Y:F405A/T394'W:Y407T、T366W/Y407'A和S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407V中的任一个；
b)半胱氨酸残基，其与另一关联CH3结构域的半胱氨酸残基共价连接，由此引入结构域间二硫桥，优选连接CH3结构域两者的C端；
c)SEED CH3异二聚体，其包含人IgA和IgG CH3序列的交替区段；和/或
d)一个或多个突变，在该情况下排斥电荷抑制异二聚体形成，优选K409D/D399、K409D/D399'R、K409E/D399、K409E/D399'R、K409D:K392D/D399'K:E356'K或K409D:K392D:K370D/D399'K:E356'K:E357'K中的任一个；和/或
e)选择用于异二聚体形成和/或热稳定性的一个或多个突变，优选T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W、T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W、L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、或F405A:Y407V/T366L:T394W中的任一个，其中编号是根据Eu索引。
28.根据项目1-25中任一项所述的抗体，其中所述VH或VL结构域中任一个与所述CH3结构域之间的连接包含氨基酸序列，其为
a)人IgG抗体的CH2与CH3结构域之间的连接的至少一部分，和/或
b)人IgG抗体的VL与CL结构域之间的连接的至少一部分；和/或
c)人IgG抗体的VH和CH1结构域之间的连接的至少一部分；和/或
d)人工连接序列，其长度为5至20个氨基酸，优选8至15个氨基酸。
29.根据项目1-28中任一项所述的抗体，其中所述抗体是：
a)有效应子功能能力的抗体，其包含Fcγ受体结合位点和/或位于所述CH2和/或CH3结构域中的任一个中的C1 q结合位点；
b)效应子阴性抗体，其包含缺乏与Fcγ受体和/或C1 q的结合的Fc区；或
c)包含位于CH2和/或CH3结构域中的任一个中的pH依赖性FcRn结合位点。
30.根据项目1-29中任一项所述的抗体，其中所述抗体通过单价结合位点特异性识别第一靶标，所述单价结合位点包含引入识别所述靶标的所述结合位点的重链和轻链对，其中所述轻链与另一包含恒定区的轻链结合，由此形成Fc区。
31.根据项目30所述的抗体，其中所述抗体是特异性识别第二靶标的双特异性抗体，其中所述第一靶标是TNF-α、CD3、CD16、CD47或PD-1，并且其中所述第二靶标是EGFR、ROR1或HER2，HER3、Lag-3。
32.根据项目1-31中任一项所述的抗体，其中所述抗体的恒定结构域具有人来源或是其与各自的人IgG1抗体结构域具有至少80％的序列同一性的人源化或功能活性变体。
33.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码项目1至32中任一项所述的抗体。
6.12实施例
提供以下实施例是作为说明而非限制。
6.12.1实施例1：二价单特异性构建体和二价双特异性构建体
识别TNFα的二价单特异性B-Body是使用标准分子生物学程序以以下架构(VL(赛妥珠单抗)-CH3(杵)-CH2-CH3/VH(赛妥珠单抗)-CH3(臼))构成。在这个构建体中，
第一多肽链(SEQ ID NO:1)
结构域A＝VL(赛妥珠单抗)
结构域B＝CH3(IgG1)(杵：S354C+T366W)
结构域D＝CH2(IgG1)
结构域E＝CH3(IgG1)
第二多肽链(SEQ ID NO:2)
结构域F＝VH(赛妥珠单抗)
结构域G＝CH3(IgG1)(臼：Y349C，T366S，L368A，Y407V)
第三多肽链：
与第一多肽链相同
第四多肽链：
与第二多肽链相同。
结构域和多肽链参照符合图3。整个构建体架构在图4中示出。具有以简写“(VL)”识别的结构域A的第一多肽链的序列在SEQ ID NO:1中提供。具有以简写“(VH)”识别的结构域F的第二多肽链的序列在SEQ ID NO:2中提供。
全长构建体在不含大肠杆菌的蛋白质合成表达系统中于26℃下在轻轻摇动下表达～18小时。表达后，将无细胞提取物离心以沉淀不溶物质，并用10x Kinetic Buffer(Forte Bio)将上清液稀释2x，用作生物层干涉测量法的分析物。
将生物素化的TNFα固定在链霉亲和素传感器上以产生～1.5nm的波移位响应。在用10x Kinetic Buffer建立基线后，将传感器浸入抗体构建体分析物溶液中。该构建体产生～3nm的响应，与赛妥珠单抗的传统IgG形式相当，证实了二价单特异性构建体组装成功能性全长抗体的能力。结果显示在图5中。
我们还构建了具有以下结构域架构的二价双特异性抗体：
第一多肽链：VL-CH3-CH2-CH3(杵)
第二多肽链：VH-CH3
第三多肽链：VL-CL-CH2-CH3(臼)
第四多肽链VH-CH1。
序列(可变区序列除外)分别在SEQ ID NO:3(第一多肽链)、SEQ ID NO:4(第二多肽链)、SEQ ID NO:5(第三多肽链)，SEQ ID NO:6(第四多肽链)中提供。
6.12.2实施例2：二价双特异性B-Body“BC1”
我们构建了特异于PD1和第二抗原“抗原A”的二价双特异性构建体，称为“BC1”。“BC1”架构的显著特征在图6中示出。
更详细地，具有符合图3的结构域和多肽链参照以及在括号中表示的天然序列的修饰，架构是：
第一多肽链(SEQ ID NO:8)
结构域A＝VL(“抗原A”)
结构域B＝CH3(T366K；445K、446S、447C三肽插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(T366W、S354C)
第二多肽链(SEQ ID NO:9)：
结构域F＝VH(“抗原A”)
结构域G＝CH3(L351D；445G、446E、447C三肽插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:10)：
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(SEQ ID NO:11)：
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
结构域A(SEQ ID NO:12)和结构域F(SEQ ID NO:16)形成特异于“抗原A”的抗原结合位点(A:F)。结构域H具有来自纳武单抗的VH序列，并且结构域L具有来自纳武单抗的VL序列；H与L相关联以形成特异于人PD1的抗原结合位点(H:L)。
结构域B(SEQ ID NO:13)具有含有多个突变：T366K、445K、446S和447C插入的人IgG1 CH3的序列。T366K突变是结构域G中L351D残基的电荷对关联体。结构域B上的“447C”残基来自C端KSC三肽插入。
结构域D(SEQ ID NO:14)具有人IgG1 CH2的序列。
结构域E(SEQ ID NO:15)具有含有突变T366W和S354C的人IgG1 CH3的序列。366W是“杵”突变。354C引入能够与结构域K中的关联349C突变形成二硫键的半胱氨酸。
结构域G(SEQ ID NO:17)具有含有以下突变：L351D和445G、446E、447C三肽插入的人IgG1 CH3的序列。L351D突变引入了与结构域B T366K突变关联的电荷对。结构域G上的“447C”残基来自C端GEC三肽插入。
结构域I(SEQ ID NO:19)具有人Cκ轻链(Cκ)的序列。
结构域J[SEQ ID NO:20]具有人IgG1 CH2结构域的序列，并且与结构域D的序列相同。
结构域K[SEQ ID NO:21]具有含有以下变化：Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 CH3的序列。349C突变引入能够与结构域E中的关联354C突变形成二硫键的半胱氨酸。356E和L358M引入降低免疫原性的异同种异型氨基酸。366S、368A和407V是“臼”突变。
结构域M[SEQ ID NO:23]具有人IgG1 CH1区域的序列。
使用哺乳动物表达，“BC1”可以容易地以大于100μg/ml的浓度下高水平表达。
我们发现，二价双特异性“BC1”蛋白可以很容易地使用来自ThermoFisher的CH1特异性CaptureSelectTM亲和树脂在单个步骤中纯化。
如图7A所示，SEC分析证实单个步骤的CH1亲和纯化步骤通过凝胶过滤产生单个单分散峰，其中>98％是单体。图7B显示了CrossMab二价抗体构建体的SEC分析的比较文献数据。
图8A是使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂进行一步纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线，显示单个陡峰。图8B是使用标准蛋白A纯化进行纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线，显示与不完全组装产物的共纯化一致的另外的洗脱峰。
图9显示在非还原性条件下的SDS-PAGE凝胶。如在泳道3中所见，使用CH1亲和树脂的“BC1”的单个步骤纯化提供了几乎均匀的单一条带，泳道4显示进行后续阳离子交换完善步骤的很少的额外纯化。相比之下，泳道7显示使用标准蛋白A纯化的较少量的纯化，泳道8-10证实使用阳离子交换层析的蛋白A纯化的材料的进一步纯化。
图10比较了在非还原性和还原性条件两者下在单个步骤的CH1亲和纯化后“BC1”的SDS-PAGE凝胶(图A)与如在参考文献中公开的在非还原性和还原性条件下CrossMab双特异性抗体的SDS-PAGE凝胶(图B)。
图11显示“BC1”的质谱分析，证实在还原性条件下两条不同的重链(图11A)和两条不同的轻链(图11B)。图12中的质谱数据确认了纯化后不存在不完全配对。
进行加速稳定性测试以评估“BC1”B-Body设计的长期稳定性。将纯化的B-Body在PBS缓冲液中浓缩至8.6mg/ml，并在40℃孵育。使用具有Shodex KW-803柱的分析尺寸排阻色谱(SEC)每周测量结构完整性。通过测量与聚集体的形成相关的完整单体的百分比(单体％)来确定结构完整性。数据显示在图13中。IgG对照1是具有良好稳定性的阳性对照。IgG对照2是已知在孵育条件下聚集的阴性对照。“BC1”B-Body已经孵育8周而没有任何结构完整性损失，如通过分析性SEC测定的。
我们还确定“BC1”具有高热稳定性，二价构建体的TM为～72℃。
表1在关键可开发性特性方面对“BC1”和CrossMab进行比较：
*来自Schaefer等(Proc Natl Acad Sci USA.2011Jul5；108(27):11187-92)的数据。
6.12.3实施例3：二价双特异性B-Body“BC6”
我们构建了二价双特异性B-Body，称为“BC6”，其与“BC1”相同，但在结构域B中在残基366处和在结构域G中在残基351处保持野生型残基。因此“BC1”缺乏已经被设计为促进“BC1”中结构域B和结构域G的正确配对的电荷对关联体T366K和L351D。“BC6”架构的显著特征在图14中示出。
尽管不存在“BC1”中存在的电荷对残基，我们发现使用CH1亲和树脂的“BC6”的单个步骤纯化得到高度均一的样品。图15A显示使用CaptureSelectTMC H1亲和树脂进行一步纯化后的“BC6”的SEC分析。数据证实单个步骤CH1亲和纯化产生单个单分散峰，类似于我们对“BC1”观察到的，证实多肽链1和2之间以及多肽链3和4之间的二硫键是完整的。色谱图还显示不存在非共价聚集体。
图15B显示在非还原性条件下的SDS-PAGE凝胶，其中泳道1用在单个步骤CH1亲和纯化后的第一批“BC6”加样，泳道2用在单个步骤CH1亲和纯化后的第二批“BC6”加样。泳道3和4证实可以用在CH1亲和纯化之后的离子交换层析实现进一步纯化。
6.12.4实施例4：二价双特异性B-Body“BC28”、“BC29”、“BC30”、“BC31”
我们构建了二价1x1双特异性B-Body“BC28”、“BC29”、“BC30”和“BC31”，其具有在结构域B和结构域G的CH3界面内的工程化二硫作为在“BC1”和“BC6”中存在的C端二硫的替代S-S键。文献表明CH3界面的二硫键合不足以在Fc CH3结构域的环境下强迫正交性(orthogonality)。这些B-Body构建体的一般架构在图16中示出，“BC28”的显著特征总结如下：
多肽链1：“BC28”链1(SEQ ID NO:24)
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(Y349C；445P，446G，447K插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、K366W)
多肽链2：“BC28”链2(SEQ ID NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
多肽链3：“BC1”链3(SEQ ID NO:10)
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
多肽链4：“BC1”链4(SEQ ID NO:11)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
“BC28”A:F抗原结合位点特异于“抗原A”。“BC28”H:L抗原结合位点特异于PD1(纳武单抗序列)。“BC28”结构域B相对于野生型CH3具有以下变化：Y349C；445P、446G、447K插入。“BC28”结构域E相对于野生型CH3具有以下变化：S354C、K366W。“BC28”结构域G相对于野生型具有以下变化：S354C；445P、446G、447K插入。
因此“BC28”具有位于结构域B的349C残基处的工程化半胱氨酸和位于结构域G的354C残基处的工程化半胱氨酸(“349C-354C”)。
“BC29”具有位于结构域B的351C残基和结构域G的351C处半胱氨酸(“351C-351C”)。“BC30”具有位于结构域B的354C残基和结构域G的349C处的工程化半胱氨酸(“354C-349C”)。BC31具有位于394C残基处的工程化半胱氨酸和位于结构域G的394C处的工程化半胱氨酸(“394C-394C”)。BC32具有在结构域B的407C残基和结构域G的407C处的工程化半胱氨酸(“407C-407C”)。
图17显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后在非还原性条件下的SDS-PAGE分析。泳道1和3显示完整“BC28”(泳道1)和“BC30”(泳道3)的高水平表达和实质性均一性。泳道2显示BC29的寡聚化。泳道4和5分别显示BC31和BC32的不良表达，以及BC32中的不充分连接。另一个构建体BC9具有在结构域B的392残基和结构域G的399处引入的半胱氨酸(“392C-399C”)，其是由Genentech报道的二硫配对，证实在SDS PAGE上的寡聚化(数据未显示)。
图18显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的“BC28”和“BC30”的SEC分析。我们还证实了使用蛋白A树脂的单个步骤纯化可以容易地纯化“BC28”(结果未显示)。
6.12.5实施例5：二价双特异性B-Body“BC44”
图19显示了二价双特异性1x1 B-Body“BC44”的一般架构，我们目前优选的二价双特异性1x1构建体。
第一多肽链(“BC44”链1)(SEQ ID NO:32)
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(P343V；Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域E＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、K366W)
第二多肽链(＝“BC28”多肽链2)(SEQ NO：25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P，446G，447K插入)
第三多肽链(＝“BC1”多肽链3)(SEQ ID NO:10)
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(＝“BC1”多肽链4)(SEQ ID NO:11)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
6.12.6实施例6：可变CH3连接工程化
我们产生了一系列变体，其中我们突变了结构域A与结构域B之间的VL-CH3连接和结构域F与结构域G之间的VH-CH3连接以评估二价1x1 B-Body构建体的表达水平、组装和稳定性。尽管可能存在许多解决方案，但为了减少T细胞表位的引入，我们选择仅使用天然见于VL、VH和CH3结构域内的残基。结构域架构的结构评估进一步限制了期望的序列组合。下表2和表3显示基于“BC1”和其他二价构建体的多种连接变体的连接。
图20显示“BC15”和“BC16”样品于40℃下在加速稳定性测试方案的指定周的尺寸排阻色谱。“BC15”保持稳定；“BC16”被证明随着时间的推移是不稳定的。
6.12.7实施例7：三价2x1双特异性B-Body构建体(“BC1-2x1”)
我们基于“BC1”构建了三价2x1双特异性B-Body“BC1-2x1”。该架构的显著特征在图22中示出。
更详细地，使用图21中总结的结构域和多肽链参照。
第一多肽链
结构域N＝VL(“抗原A”)
结构域O＝CH3(T366K、447C)
结构域A＝VL(“抗原A”)
结构域B＝CH3(T366K、477C)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(杵，354C)
第五多肽链(＝“BC1”链2)
结构域P＝VH(“抗原A”)
结构域Q＝CH3(L351D、447C)
第二多肽链(＝“BC1”链2)
结构域F＝VH(“抗原A”)
结构域G＝CH3(L351D、447C)
第三多肽链(＝“BC1”链3)
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(臼，349C)
第四多肽链(＝“BC1”链4)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
图23显示使用Thermo Fisher Expi293瞬时转染系统表达的蛋白质的非还原性SDS-PAGE。
泳道1显示使用CaptureSelectTMCH1亲和树脂的一步纯化后的三价2x1“BC1-2X1”蛋白的洗脱液。泳道2显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的较低分子量、较快迁移的二价“BC1”蛋白。泳道3-5显示使用蛋白A的“BC1-2x1”的纯化。泳道6和7显示使用CH1亲和树脂的“BC1-2x1”的纯化。
图24使用Octet(Pall ForteBio)分析比较了二价“BC1”构建体的亲合力与三价2x1“BC1-2x1”构建体的亲合力。将生物素化的抗原“A”固定在表面上，并将抗体构建体在表面上通过以进行结合分析。
6.12.8实施例8：三价2x1三特异性B-Body构建体(“TB111”)
我们设计了具有图25所示意的架构的三价2x1三特异性分子“TB111”。参考图21中阐述的结构域命名惯例，TB111具有以下架构(“Ada”表示来自阿达木单抗的V区域)：
多肽链1
结构域N：VH(“Ada”)
结构域O：CH3(T366K、394C)
结构域A：VL(“抗原A”)
结构域B：CH3(T366K、349C)
结构域D：CH2
结构域E：CH3(杵，354C)
多肽链5
结构域P：VL(“Ada”)
结构域Q：CH3(L351D、394C)
多肽链2
结构域F：VH(“抗原A”)
结构域G：CH3(L351D，351C)
多肽链3
结构域H：VL(“Nivo”)
结构域I：CL(κ)
结构域J：CH2
结构域K：CH3(臼，349C)
多肽链4(＝“BC1”链4)
结构域L：VH(“Nivo”)
结构域M：CH1
这个构建体没有表达。
6.12.9实施例9：三价1x2双特异性构建体(“BC28-1x2”)我们构建了具有以下结构域结构的三价1x2双特异性B-Body：第一多肽链(＝“BC28”链1)(SEQ ID NO:24)
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、K366W)
第二多肽链(＝“BC28”链2)(SEQ ID NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:37)
结构域R＝VL(抗原“A”)
结构域S＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
接头＝GSGSGS
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C，D356E，L358M，T366S，L368A，Y407V)
第四多肽链(＝“BC1”链4)(SEQ ID NO:11)：
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
第六条多肽链(＝“BC28”链2)(SEQ ID NO:25)
结构域T＝VH(抗原“A”)
结构域U＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
A:F抗原结合位点特异于“抗原A”，如同H:L结合抗原结合位点一样。R:T抗原结合位点特异于PD。因此，该构建体的特异性是抗原“A”x(PD1-抗原“A”)。
6.12.10实施例10：三价1x2双特异性构建体(“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”)
我们构建了具有如图27所示意的一般结构的三价1x2双特异性分子(“CTLA4-4 xNivo x CTLA4-4”)。结构域命名在图26中阐述。
图28是SDS-PAGE凝胶，其中显示在非还原性和还原性条件下的“CTLA4-4 x Nivox CTLA4-4”构建体的泳道已经用方框标示。
图29比较了两种抗体的抗原结合：“CTLA4-4 x OX40-8”和“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”。“CTLA4-4 x OX40-8”单价地结合CTLA4；而“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”二价地结合CTLA4。
6.12.11实施例11：三价1x2三特异性构建体“BC28-1x1x1a”
我们构建了具有如图30所示意的一般结构的三价1x2三特异性分子。参考图26中所阐述的结构域命名法。
第一多肽链(＝“BC28”链1)[SEQ ID NO:24]
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、K366W)
第二多肽链(＝“BC28”链2)(SEQ ID NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:45)
结构域R＝VL(CTLA4-4)
结构域S＝CH3(T366K；445K、446S、447C插入)
接头＝GSGSGS
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(＝“BC1”链4)(SEQ ID NO:11)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
第六条多肽链(＝hCTLA4-4链2)(SEQ ID NO:53)
结构域T＝VH(CTLA4)
结构域U＝CH3(L351D、445G、446E、447C插入)
该三特异性构建体的抗原结合位点是：
抗原结合位点A:F特异于“抗原A”
抗原结合位点H:L特异于PD1(纳武单抗序列)
抗原结合位点R:T特异于CTLA4。
图31显示瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后“BC28-1x1x1a”的尺寸排阻色谱，展示单个明确界定的峰。
6.12.12实施例12：二价和三价构建体的SDS-PAGE分析
图32显示具有各种构建体的SDS-PAGE凝胶，各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后，在非还原性和还原性条件下。
泳道1(非还原性条件)和2(还原性条件，+DTT)是二价1x1双特异性构建体“BC1”。泳道3(非还原性)和4(还原性)是三价双特异性2x1构建体“BC1-2x1”(参见实施例7)。泳道5(非还原性)和6(还原性)是三价1x2双特异性构建体“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”(参见实施例10)。泳道7(非还原性)和8(还原性)是实施例11中描述的三价1x2三特异性“BC28-1x1x1a”构建体。
SDS-PAGE凝胶证实各种构建体的完整组装，主要条带在非还原性凝胶中在对每种构建体所预期的分子量处显示。
6.12.13实施例13：结合分析
图33显示对3种抗原：PD1、抗原“A”和CTLA-4的Octet结合分析。在每种情况下，抗原被固定并且B-Body是分析物。作为参照，还比较了1x1双特异性“BC1”和“CTLA4-4 xOX40-8”以证实1x1B-Body仅特异性结合针对其选择抗原结合位点的抗原。
图33A显示“BC1”与PD1和抗原“A”但不与CTLA4结合。图33B显示二价双特异性1x1构建体“CTLA4-4 x OX40-8”与CTLA4但不与抗原“A”或PD1结合。图33C显示三价三特异性1x2构建体“BC28-1x1x1a”与PD1、抗原“A”和CTLA4结合。
6.12.14实施例14：四价构建体
图35显示2x2四价双特异性构建体“BC22-2x2”的总体架构。通过使每个可变结构域-恒定结构域区段加倍，用“BC1”骨架构建该2x2四价双特异性。结构域命名法在图34中示意。
图36是SDS-PAGE凝胶。泳道7-9分别显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后(“CH1洗脱液”)和在另外的离子交换层析纯化后(泳道8，“在IEX后的pk1”；泳道9，“在IEX后的pk2”)的“BC22-2x2”四价构建体。泳道1-3是在CH1亲和纯化(泳道1)和后续的离子交换层析(泳道2和3)后的三价2x1构建体“BC21-2x1”。泳道4-6是1x2三价构建体“BC12-1x2”。
图37显示2x2四价构建体的总体结构。
图39和40示意具有替代结构的四价构建体。结构域命名发在图38中示出。
6.12.15实施例15：B-Body的双特异性抗原结合。
构建了四价双特异性2x2 B-Body“B-Body-IgG 2x2”。更详细地，使用图38中总结的结构域和多肽链参照。
第一多肽链
结构域A＝VL(赛妥珠单抗)
结构域B＝CH3(IgG1，杵)
结构域D＝CH2(IgG1)
结构域E＝CH3(IgG1)
结构域W＝VH(抗原“A”)
结构域X＝CH1(IgG1)
第三肽链(与第一多肽链相同)
结构域H＝VL(赛妥珠单抗)
结构域I＝CH3(IgG1，杵)
结构域J＝CH2(IgG1)
结构域K＝CH3(IgG1)
结构域WW＝VH(抗原“A”)
结构域XX＝CH1(IgG1)
第二多肽链
结构域F＝VH(赛妥珠单抗)
结构域G＝CH3(IgG1，臼)
第四多肽链(与第三多肽链相同)
结构域F＝VH(赛妥珠单抗)
结构域G＝CH3(IgG1，臼)
第七多肽链
结构域Y＝VH(“抗原A”)
结构域Z＝CLκ
第八多肽链(与第七多肽链相同)
结构域YY＝VH(“抗原A”)
结构域ZZ＝CLκ。
这如实施例1所述克隆并表达。此处，BLI实验由以下组成：生物素化的抗原“A”固定于链霉亲和素传感器上，接着用10x Kinetic Buffer建立基线。然后将传感器浸入无细胞表达的“B-Body-IgG 2x2”中，随后建立新的基线。最后，将传感器浸入100nM TNFα中，其中观察到第二结合事件，确认了单个“B-Body-IgG 2x2”构建体对抗原两者的双特异性结合。结果显示在图41中。
6.12.16实施例16：“BB-IgG 2x2”的抗原特异性细胞结合。
使用Expi-293转染试剂盒(Life Technologies)对Expi-293细胞进行模拟转染或用抗原“B”瞬时转染。转染后48小时，收获Expi-293细胞并于室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟。将细胞在PBS中洗涤两次。将200,000个抗原B或模拟转染的Expi-293细胞置于V形底96孔板中的100μL PBS中。将细胞与3μg/mL浓度的“B-Body-IgG2x2”在室温下一起孵育1.5小时。将细胞在300×G下离心7分钟，在PBS中洗涤，并与100μL的浓度为8μg/mL的FITC标记的山羊抗人二抗在室温下一起孵育1小时。将细胞以300×G离心7分钟，用PBS洗涤，使用Guava easyCyte通过流式细胞术确认细胞结合。结果显示在图42中。
6.12.17实施例17：二价和三价构建体的SDS-PAGE分析
图45显示具有各种构建体的SDS-PAGE凝胶，各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后，在非还原性和还原性条件下。
泳道1(非还原性条件)和2(还原性条件，+DTT)是二价1x1双特异性构建体“BC1”。泳道3(非还原性)和4(还原性)是二价1x1双特异性构建体“BC28”(参见实施例4)。泳道5(非还原性)和6(还原性)是二价1x1双特异性构建体“BC44”(参见实施例5)。泳道7(非还原性)和8(还原性)是三价1x2双特异性“BC28-1x2”构建体(参见实施例9)。泳道9(非还原性)和10(还原性)是实施例11中描述的三价1x2三特异性“BC28-1x1x1a”构建体。
SDS-PAGE凝胶证实各种构建体的完整组装，主要条带在非还原性凝胶中在对每种构建体预期的分子量处显示。
6.12.18实施例18：可变CH3连接工程化的稳定性分析
评估了各种连接变体组合之间的配对稳定性。进行差示扫描荧光测定以确定来自链1(结构域A和B)的VL-CH3多肽与来自2(结构域F和G)的VH-CH3多肽之间的各种连接变体配对的熔融温度。各自具有如上表2和表3所示的“BC6”、“BC28”、“BC30”、“BC44”和“BC45”的相应连接序列的连接变体“BC6jv”、“BC28jv”、“BC30jv”、“BC44jv”和“BC45jv”证实配对稳定性增加，Tm在76-77度范围内(参见表4)。图46显示“BC24jv”、“BC26jv”和“BC28jv”的热转变的差异，“BC28jv”表现出三者中的最大稳定性。该图的x轴是温度，y轴是荧光的变化除以温度的变化(-dFluor/dTemp)。如Niesen等(Nature Protocols，(2007)2,2212-2221)所述进行实验，其全部教导通过引用并入本文。
6.13序列
>实施例1，二价单特异性构建体链1[SEQ ID NO:1]
>实施例1，二价单特异性构建体链2[SEQ ID NO:2]
>实施例1，二价、双特异性构建体链1[SEQ ID NO:3]
VL-CH3-铰链-CH2-CH3(杵)
>实施例1，二价、双特异性构建体链2[SEQ ID NO:4]
>实施例1，二价、双特异性构建体链3_[SEQ ID NO:5]
VL-CL-铰链-CH2-CH3(臼)
>实施例1，二价、双特异性构建体链4[SEQ ID NO:6]
>人IgG1的Fc片段[SEQ ID NO:7]
>BC1链1[SEQ ID NO:8]
结构域排列:
在第一CH3中的突变(结构域B):
T366K；445K、446S、447C插入
在第二CH3中的突变(结构域E):
S354C、K366W
>BC1链2[SEQ ID NO:9]
结构域排列:
F-G
VH-CH3
在CH3中的突变(结构域G):
L351D；445G、446E、447C插入
>BC1链3[SEQ ID NO:10]
结构域排列:
在CH3中的突变(结构域K):
Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V
>BC1链4[SEQ ID NO:11]
结构域排列:
L-M
VH-CH1
>BC1结构域A[SEQ ID NO:12]
>BC1结构域B[SEQ ID NO:13]
>BC1结构域D[SEQ ID NO:14]
>BC1结构域E[SEQ ID NO:15]
>BC1结构域F[SEQ ID NO:16]
>BC1结构域G[SEQ ID NO:17]
>BC1结构域H[SEQ ID NO:18]
>BC1结构域I[SEQ ID NO:19]
>BC1结构域J[SEQ ID NO:20]
>BC1结构域K[SEQ ID NO:21]
>BC1结构域L[SEQ ID NO:22]
>BC1结构域M[SEQ ID NO:23]
>BC28链1[SEQ ID NO:24]
结构域排列:
结构域B中的突变:
Y349C；445P,446G,447K插入结构域E中的突变:
S354C,K366W
>BC28链2[SEQ ID NO:25]
结构域排列:
F-G
VH-CH3
结构域G中的突变:
S354C；445P,446G,447K插入
>BC28结构域A[SEQ ID NO:26]
>BC28结构域B[SEQ ID NO:27]
>BC28结构域D[SEQ ID NO:28]
>BC28结构域E[SEQ ID NO:29]
>BC28结构域F[SEQ ID NO:30]
>BC28结构域G[SEQ ID NO:31]
>BC44链1[SEQ ID NO:32]
结构域排列:
结构域B中的突变:
P343V；Y349C；445P,446G,447K插入结构域E中的突变:
S354C,K366W
>BC44结构域A[SEQ ID NO:33]
>BC44结构域B[SEQ ID NO:34]
>BC44结构域D[SEQ ID NO:35]
>BC44结构域E[SEQ ID NO:36]
>BC28二价链3等同于SEQ ID NO:10
>BC28二价链4等同于SEQ ID NO:11
>BC28 1x2链3[SEQ ID NO:37]
结构域排列:
结构域S中的突变:
Y349C；445P,446G,447K插入
六氨基酸接头插入:GSGSGS
结构域K中的突变:
Y349C,D356E,L358M,T366S,L368A,Y407V>BC28 1x2结构域R[SEQ ID NO:38]
>BC28 1x2结构域S[SEQ ID NO:39]
>BC28 1x2接头[SEQ ID NO:40]
>BC28 1x2结构域H[SEQ ID NO:41]
>BC28 1x2结构域I[SEQ ID NO:42]
>BC28 1x2结构域J[SEQ ID NO:43]
>BC28 1x2结构域K[SEQ ID NO:44]
>BC28-1x1x1a链3[SEQ ID NO:45]
结构域排列:
结构域S中的突变:
T366K；445K,446S,447C插入
六氨基酸接头插入:GSGSGS
结构域K中的突变:
Y349C,D356E,L358M,T366S,L368A,Y407V>BC28-1x1x1结构域AR[SEQ ID NO:46]
>BC28-1x1x1结构域AS[SEQ ID NO:47]
>BC28-1x1x1a接头[SEQ ID NO:48]
>BC28-1x1x1a结构域H[SEQ ID NO:49]
>BC28-1x1x1a结构域I[SEQ ID NO:50]
>BC28-1x1x1结构域AJ[SEQ ID NO:51]
>BC28-1x1x1结构域AK[SEQ ID NO:52]
>hCTLA4-4.链2[SEQ ID NO:53]
结构域排列:
F-G
VH-CH3
结构域G中的突变
L351D,445G,446E,447C插入
>hCTLA4-4结构域F[SEQ ID NO:54]
>hCTLA4-4结构域G[SEQ ID NO:55]
其他序列:
>铰链:DKTHTCPPCP[SEQ ID NO:56]
>BC1-多肽1结构域连接:IKRTPREP[SEQ ID NO:57]
>BC15-多肽1结构域连接:IKRTVREP[SEQ ID NO:58]
>BC16-多肽1结构域连接:IKRTREP[SEQ ID NO:59]
>BC17-多肽1结构域连接:IKRTVPREP[SEQ ID NO:60]
>BC26-多肽1结构域连接:IKRTVAEP[SEQ ID NO:61]
>BC27-多肽1结构域连接:IKRTVAPREP[SEQ ID NO:62]
>BC1-多肽2结构域连接:SSASPREP[SEQ ID NO:63]
>BC13-多肽2结构域连接:SSASTREP[SEQ ID NO:64]
>BC14-多肽2结构域连接:SSASTPREP[SEQ ID NO:65]
>BC24-多肽2结构域连接:SSASTKGEP[SEQ ID NO:66]
>BC25-多肽2结构域连接:SSASTKGREP[SEQ ID NO:67]
7.通过引用并入
出于所有目的，在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献的全部内容通过引用并入本文，其程度如同每项个体的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独指出出于所有目的通过引用并入。
8等同
虽然已经说明和描述了各个具体实施方式，但是以上说明书并非是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

Claims (10)

1.一种结合分子，其包含：
第一和第二多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，
其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且
其中结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，
其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且
其中结构域F具有VH氨基酸序列，并且结构域G具有CH3氨基酸序列；并且
(c)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其还包含：
第三和第四多肽链，其中：
(a)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，
其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且
其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，并且K具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，
其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且
其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列，并且结构域M具有恒定区氨基酸序列；
(c)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；和
(d)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列相同，其中所述序列是内源CH3序列。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列不同，并且各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中所述结构域B与所述结构域G相互作用，并且其中所述结构域B和所述结构域G都不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
5.根据权利要求4所述的结合分子，其中所述正交修饰包括在结构域B和G之间产生工程化二硫桥的突变。
6.根据权利要求5所述的结合分子，其中所述产生工程化二硫桥的突变是在所述结构域B和结构域G之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包括杵臼突变。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述杵臼突变是在所述结构域B和结构域G之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包括电荷对突变。
10.根据权利要求9所述的结合分子，其中所述电荷对突变是在所述结构域B和结构域G之一中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
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