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CN103597090B - 用于筛选能够增强或抑制oatp1b1转运活性的化合物的方法、及用于确定oatp1b1表达水平的方法 - Google Patents

用于筛选能够增强或抑制oatp1b1转运活性的化合物的方法、及用于确定oatp1b1表达水平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种使用二氯荧光素筛选增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物的方法。本发明还提供了二氯荧光素在OATP1B1表达水平的测量中的用途。本发明进一步提供了一种用于使用二氯荧光素测量在试验细胞中的OATP1B1的表达水平的方法。本发明进一步提供了包含二氯荧光素和表达OATP1B1的阳性细胞的试剂盒在试验细胞中的OATP1B1表达水平的测量中的用途。

Description

用于筛选能够增强或抑制OATP1B1转运活性的化合物的方法、及用于确定OATP1B1表达水平的方法
技术领域
本发明涉及一种使用一种荧光化合物二氯荧光素筛选增强或抑制OATP1B1转运活性的化合物的方法，并且涉及一种用于测量OATP1B1表达水平的方法。
背景技术
近年来，已经日益认识到肝细胞在药物发现中起重要作用。肝细胞是用于药物的药代动力学研究，如药物的体内清除的预测或药物相互作用的研究的必不可少的工具。已经揭示了在肝细胞中表达并且在药物的药代动力学（吸收、分配、代谢、以及排泄）中占主导作用的各种代谢酶以及转运蛋白的分子机制。在它们之中，大部分注意力已经集中到有机阴离子-转运多肽（OATP）在阴离子药物的药代动力学中的作用上（非专利文献1）。
OATP家族转运蛋白在身体的不同组织和器官，如小肠、肾、以及肝中表达，并且在它们之中，已知OATP1B1（别名：OATP-C、OATP2、或LST-1）、OATP1B3（别名：OATP-8）、以及OATP2B1（别名：OATP-B）在人肝细胞中是高度表达的（非专利文献2和3）。已知临床上重要的药物如他汀类以及血管紧张素II受体阻滞剂经由OATP1B1被人肝细胞吸收，并且已知环孢霉素以及利福平是典型的OATP1B1抑制剂（非专利文献2）。
已知OATP1B1底物药（substrate drug）与OATP1B1抑制剂的同时使用减少进入肝中的底物药的吸收，致使该底物药在临床环境中的血中浓度增加。因此，从临床安全性的角度出发，经由OATP1B1对一种试验化合物的药物相互作用潜能进行评估是非常重要的。常规上，为了定量评估一种试验化合物的转运蛋白-介导的药物相互作用潜能，使用标记有放射性同位素的已知底物的评估方法是已知的（RI法）（专利文献1）。
RI法具有高灵敏度，但是价格昂贵，并且在处理样品时还要求谨慎。作为替代，不使用放射性同位素，而是使用荧光化合物的检测方法也是已知的（荧光法）。例如，已经报道了一种使用6-羧基荧光素（6-CFL）的评估方法，该荧光素是一种良好的针对有机阴离子转运蛋白1（OAT1）的底物（非专利文献4）。
可以说荧光法易于操作，比RI法花费少，且具有优异的通过量。然而，一般而言，很难预测一种化合物是否能够用作一种转运蛋白的底物，并且，因此，已知可以用作阴离子转运蛋白底物的荧光化合物不多。另外，一些常规的荧光底物具有多种缺点，如由于底物本身发射的低荧光强度、试验化合物的自发荧光、以及荧光底物的光漂白，探测灵敏度不一定高。
引用清单
专利文献
专利文献1：日本专利申请公开号2006-340610
非专利文献
非专利文献1：马修G.索尔斯（Matthew G.Soars）等人，《化学生物学相互作用》（Chemico-Biological Interactions），168，（2007）pp.2-15
非专利文献2：凯瑟琳M.嘉科米尼（Kathleen M.Giacomini）等人，《自 然评论药物发现》（Nature Reviews Drug Discovery），第9卷，pp.215-236,2010
非专利文献3：项邦妮（Bonnie Hsiang）等人，《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.），第274卷，pp.37161-37168,1999
非专利文献4：托马斯席拉尔（Tomas Cihlar）等人，《分析生物化学》（Analytical Biochemistry），283,pp.49-55,2000
发明概述
技术问题
因此，考虑到与常规RI法相关联的问题，本发明的一个目的在于提供一种使用荧光化合物筛选增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物的方法，该方法安全、花费低廉、并且易于操作且允许具有堪比RI法的检测灵敏度，并且还在于提供一种用于测量OATP1B1表达水平的方法。
问题的解决方案
为了解决以上问题，诸位发明人已经针对用作OATP底物的多种荧光化合物研究了它们的适应性。结果是，揭示了二氯荧光素（DCF）是一种优异的OATP1B1底物，并且还出人意料地发现使用DCF作为OATP1B1底物进行的评估结果与通过常规RI法得到的结果等效，并且完成了本发明。
即，本发明提供了一种使用二氯荧光素筛选增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物的方法。
该方法优选地包括：制备表达OATP1B1的细胞的一个步骤；使二氯荧光素以及试验化合物与这些细胞相接触的一个步骤；测量被这些细胞吸收的二氯荧光素的荧光强度的一个步骤；以及一个以下步骤：在测量的荧光强度高于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况下，确定该试验化合物为增强OATP1B1的转运活性的一种化合物，并且在测量的荧光强度低于该试验化合 物不存在时的荧光强度的情况下，确定该试验化合物为抑制OATP1B1的转运活性的一种化合物。
优选的是，在本发明的筛选法中表达OATP1B1的细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞，或在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞，或用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
本发明还提供了二氯荧光素在OATP1B1表达水平的测量中的用途。
本发明还提供了一种用于测量在试验细胞中的OATP1B1表达水平的方法，并且该方法包括：使得二氯荧光素与这些试验细胞相接触的一个步骤；测量被这些试验细胞吸收的二氯荧光素的荧光强度的一个步骤；以及基于所测量的荧光强度评估这些试验细胞中的OATP1B1表达水平的一个步骤。
在本发明的测量方法中，优选的是使用表达OATP1B1的阳性细胞作为对照相对地评估这些试验细胞中的OATP1B1的表达水平。优选的是，表达OATP1B1的阳性细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞，或在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞，或用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
本发明进一步提供了包含二氯荧光素与表达OATP1B1的阳性细胞的试剂盒在试验细胞中的OATP1B1表达水平的测量中的用途。优选的是，在该试剂盒中的表达OATP1B1的阳性细胞选自下组，该组由以下各项组成： 强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞，或在细胞膜中过表达由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白的细胞，或用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
发明的有益效果
通过使用已经被证明为OATP1B1的一种优异底物的二氯荧光素，可以安全、花费低廉、并且易于操作地检测增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物，该检测具有堪比RI法的灵敏度。通过本发明的筛选方法选择的化合物被预期为能够控制体内药代动力学，如用作OATP1B1底物的一种药物的血中浓度。还可能通过本发明的筛选法来预测一种试验化合物的OATP1B1-介导的药物相互作用潜能。
本发明还可以提供一种安全、花费低廉、并且易于操作地测量OATP1B1的表达水平的方法，该方法具有堪比RI法的灵敏度。OATP1B1表达水平的测量被认为对于，例如，表达OATP1B1的细胞，如肝细胞的活性评估以及不同批次肝细胞的活性比较是有用的。
附图简要说明
[图1]图1包括显示各种荧光素衍生物的底物特异性的图。
[图2]图2是一个显示经由OATP1B1的二氯荧光素（DCF）吸收的时间曲线的曲线图。
[图3]图3是一个显示经由OATP1B1的DCF吸收的动力学分析的曲线图。
[图4]图4是一个显示已知的OATP抑制剂对DCF的OATP1B1-介导的吸收的影响的图。
[图5]图5是一个显示在DCF法与已知的RI法之间的Ki值的比较的图。
[图6]图6是一个显示经由人肝细胞的DCF的时间/温度依赖性吸收的图。
[图7]图7包括显示经由人肝细胞的DCF吸收的动力学分析的图。
[图8]图8是一个显示OATP抑制剂对人肝细胞的DCF吸收的影响的图。
实施方式的说明
本发明中的OATP1B1主要表达于人肝细胞的细胞膜中并且是一种有机阴离子转运蛋白（有机阴离子-转运多肽：OATP），其具有吸收阴离子化合物进入细胞中的活性（转运活性）并且也称作OATP-C、OATP2、或LST-1。OATP1B1蛋白的实例包括由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质，并且包含具有在以上氨基酸序列中的一个或二至九个氨基酸残基的取代、缺失、或添加的氨基酸序列且具有OATP1B1功能的蛋白质也包含在本发明中。编码OATP1B1蛋白的DNA的实例包括由在SEQ ID NO:2中所示的核酸序列组成的蛋白质，并且包含具有以上核酸中的一个或2至50个核苷酸的取代、缺失、或添加的核酸序列且编码具有OATP1B1功能的蛋白质的DNA也包含在本发明中。
本发明中的二氯荧光素（DCF）是荧光化合物，荧光素，的一种衍生物，并且是可商购的。直到现在才知道DCF可以是一种有机阴离子-转运多肽的底物。
本发明的筛选法是一种使用二氯荧光素筛选增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物的方法并且优选地包括以下步骤。
本发明筛选法的第一个步骤是制备表达OATP1B1的细胞的一个步骤。表达OATP1B1的细胞是在细胞膜中功能性表达OATP1B1的细胞。功 能性表达表示OATP1B1以具有阴离子化合物转运活性的状态在细胞膜中表达。未明确地限定表达OATP1B1的细胞，其实例包括表达OATP1B1的永生化细胞系、表达OATP1B1的人工修饰的细胞系、以及用病毒永生化且表达OATP1B1的细胞系。另外，优选使用表达OATP1B1的人源性细胞系以及高度表达OATP1B1的转基因细胞系。
具体地说，在本发明筛选法中使用的表达OATP1B1的细胞优选地是原代培养细胞，或已建立或未建立的、表达OATP1B1的细胞，如强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞。在此，强制表达OATP1B1的细胞是通过基因工程技术导入有编码OATP1B1蛋白或肽的基因或核苷酸、并且功能性表达OATP1B1蛋白或肽的细胞。这样一种强制表达的细胞是，例如，优选地在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞，或用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。OATP1B1的过表达可以是瞬时表达或稳定表达，并且考虑到再现性，更优选地使用稳定表达OATP1B1的细胞。类似地，转化细胞可以是瞬时或稳定转化的细胞，并且考虑到再现性，更优选地使用稳定转化的细胞。
未明确地限定用于强制表达的宿主细胞，并且根据处理的简单性，优选使用哺乳动物细胞，如HEK-293细胞、或爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）。基因转移技术通常是已知的。例如，通过，例如PCR，使用作为模版的人肝脏cDNA以及适当的引物从而克隆在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的全长来扩增目标DNA；将该DNA插入到具有适当的表达启动子的载体中；并且通过如磷酸钙转染、脂转染、或微注射的方法，将该载体导入细胞中。可以用适当的选择性培养基选择转化细胞。
本发明筛选法的第二个步骤是使二氯荧光素以及试验化合物与这 些细胞相接触的一个步骤。使二氯荧光素以及试验化合物与细胞相接触是指将这两者同时或顺序地添加到用于这些细胞的培养基或缓冲液中使得这两者与这些细胞相接触。0.1μM或更高的二氯荧光素浓度给予充分的探测灵敏度，并且该浓度可以在，例如，0.1至1000μM的范围之内适当地调节。同时，试验化合物的浓度取决于该化合物而改变并且，一般而言，可以在1nM至1mM的范围之内适当地调节。与这些细胞相接触的时间可以是1至30分钟，并且优选地是在其中二氯荧光素的吸收线性增加的时间范围内。
在使二氯荧光素以及试验化合物与这些细胞接触之后，优选地洗涤这些细胞以去除未被这些细胞吸收的荧光化合物。通常可以使用缓冲液如PBS或克雷布斯-汉斯莱特（KH）缓冲液，在1℃至10℃下，一至三次地进行该洗涤。
本发明筛选法的第三个步骤是测量由这些细胞吸收的二氯荧光素的荧光强度的一个步骤。通过增溶这些细胞，可以将被这些细胞吸收的二氯荧光素收集到溶液中。细胞增溶作用的实例包括用一种NaOH水溶液处理。使用荧光光度计，在450至550nm的激发波长以及500至600nm的荧光波长处测量含有所收集的二氯荧光素的溶液的荧光强度。为了将所测量的荧光强度转化为荧光化合物的量（如摩尔数量），优选的是预先形成校准曲线。另外，为了使得所结合的荧光化合物标准化，优选的是将荧光化合物的量转化为每个细胞或每单位蛋白质的量。
本发明筛选法的第四个步骤是一个以下步骤：在测量的荧光强度高于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况下，确定该试验化合物为增强OATP1B1的转运活性的一种化合物，并且在测量的荧光强度低于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况下，确定该试验化合物为抑制OATP1B1的转运活性的一种化合物。所测量的荧光强度高于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况表示进入这些细胞的二氯荧光素的吸收通过该试验化合物的存在而增 加，并且因此该试验化合物被认为增强了OATP1B1的转运活性。另一方面，所测量的荧光强度低于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况表示进入这些细胞的二氯荧光素的吸收通过该试验化合物的存在而减少，并且因此该试验化合物被认为抑制了OATP1B1的转运活性。
通过OATP1B1功能的降低，增强OATP1B1的转运活性的化合物可以用于遗传多态性的归一化。另外，可能会增强由OATP1B1转运的外源物的排泄。另一方面，抑制OATP1B1的转运活性的化合物导致药物与OATP1B1的选择性底物的相互作用，并且，因此，选择不会抑制OATP1B1转运活性的化合物导致低药物相互作用风险的药剂的产生。
本发明还提供了二氯荧光素在OATP1B1表达水平的测量中的用途。优选的是，指定用于OATP1B1表达水平测量的二氯荧光素，即，优选的是，例如，将二氯荧光素与手册中描述的，例如，测量OATP1B1表达水平的一种方法封装在一起。
本发明的、用于测量在试验细胞中的OATP1B1表达水平的方法包括：使二氯荧光素与试验细胞相接触的一个步骤；测量被这些试验细胞吸收的二氯荧光素的荧光强度的一个步骤；以及基于所测量的荧光强度评估这些试验细胞中的OATP1B1表达水平的一个步骤。这些步骤与上述步骤等效。优选地，将所测量的荧光强度首先基于校准曲线转化为荧光化合物的量，并且然后标准化为每个细胞或每单位蛋白质的化合物量。可以将准备好的标准化数据与在其他细胞中的那些进行比较，并且可以将其在表达相对大量或少量OATP1B1的细胞的选择中使用。
在本发明的测量方法中，优选的是使用表达OATP1B1的阳性细胞作为对照相对地评估这些试验细胞中的OATP1B1的表达水平。优选的是，表达OATP1B1的阳性细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1 的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞，或在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞，或用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
本发明还提供了包含二氯荧光素与表达OATP1B1的阳性细胞的试剂盒在试验细胞中的OATP1B1表达水平的测量中的用途。优选的是，在该试剂盒中的表达OATP1B1的阳性细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞，或在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞，或用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
该试剂盒任选地包括用于培养细胞的培养基、用于添加到细胞或洗涤细胞的缓冲液、用于测量蛋白质的量的试剂、以及其他组分。
实例
（实例1：各种荧光素衍生物的底物特异性的研究）
针对各种荧光染料，即，以下荧光素衍生物，作为OATP底物的适应性，对它们各自进行了研究。
[化学式1]
[表1]
使用人肝脏总RNA（英杰公司（Invitrogen Corporation））作为模板并且使用以下引物，通过RT-PCR对OATP1B1、OATP1B3、以及OATP2B1的互补DNA（分别由SEQ ID NO:2、3、以及4所示）进行克隆：
用于OATP1B1的引物
正义引物：CGTCCGACTTGTTGCAGTTG(SEQ ID NO:5) 
反义引物：AACACAGAAGCAGAAGTGGC(SEQ ID NO:6) 
用于OATP1B3的引物
正义引物：TAACATCAGAAAAAGGATGGACTTG(SEQ ID NO:7) 
反义引物：TGCAATGTTAGTTGGCAGCA(SEQ ID NO:8) 
用于OATP2B1的引物
正义引物：CTGAGAAGATTTGCTTCCTC(SEQ ID NO:9) 
反义引物：ACTGCTGTGGCTGCTACTCT(SEQ ID NO:10) 
通过脂转染，使用Lipofectamin2000（英杰公司），将携带所得基因的表达载体、pcDNA3.1载体（英杰公司）分别导入HEK-293细胞。将这些细胞在含有潮霉素的选择性培养基中培养，以分别产生加强表达OATP1B1、OATP1B3、以及OATP2B1的HEK-293细胞。
将以上细胞以4×105个细胞/孔播种于聚-D-赖氨酸-包被的培养皿中。用KH缓冲液替代该培养基，并且向各自的HEK-293细胞中添加溶解于DMSO中的荧光染料，使得该KH缓冲液中的终浓度是1μM，随后在37℃下孵育5分钟。随后，将这些细胞用冰冷的KH缓冲液洗涤三次并且然后用0.1N NaOH水溶液增溶，然后测量被这些细胞吸收的荧光染料的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。
为了定量测量被这些细胞吸收的荧光化合物的量，预先准备好显示每单位荧光化合物的荧光强度的校准曲线。基于这个校准曲线，将所测量的荧光强度转化为每孔的荧光化合物（pmol/孔或μL/孔），将其除以这些增溶的细胞（标准化）的总蛋白量（mg蛋白/孔）以转化为每单位蛋白质的荧光化合物量（pmol/mg蛋白或μL/mg蛋白）。
结果示于图1(a)中。如在图1(a)中显而易见，在所试验的荧光染料与转运蛋白的组合之中，二氯荧光素（DCF）与OATP1B1的组合显示了最大吸收。这些结果表明DCF是一种优异的用于OATP1B1的底物。为了参考，还通过相同的方法研究了各种荧光素衍生物对OAT1以及OAT3的底物特异性。结果示于图1(b)中。图1(b)证明，如在非专利文献4中描述的，对于OAT1，6-CFL是一种令人满意的底物并且还证明对DCF于OAT1和OAT3两者都不是一种令人满意的底物。这些结果还证明DCF与OATP1B1的组合具有特异性。
（实例2：经由OATP1B1的DCF吸收的时间曲线）
如在实例1中所述的，制备加强表达OATP1B1的HEK-293细胞并且以4×105个细胞/孔将其播种于聚-D-赖氨酸-包被的培养皿中。用KH缓冲液替代该培养基，并且向这些细胞中添加溶解于DMSO中的DCF，使得该在KH缓冲液中的终浓度是0.1μM、1μM、以及10μM，随后在37℃下孵育0至30分钟。在1min、5min、10min、以及30min的孵育时间处将这些细胞取样，用冰冷的KH缓冲液洗涤三次，并且然后用0.1N NaOH水溶液增溶，然后如示例1中所述被测量这些细胞吸收的荧光染料的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。
结果示于图2中。图2揭示了被加强表达OATP1B1的HEK-293细胞吸收到这些细胞中的DCF的量随着时间的过去而增加并且取决于添加的DCF的浓度。
（实例3：经由OATP1B1的DCF吸收的动力学分析）
如在实例1中所述的，制备加强表达OATP1B1的HEK-293细胞并且以4×105个细胞/孔将其播种于聚-D-赖氨酸-包被的培养皿中。用KH缓冲液替代该培养基，并且向这些细胞添加溶解于DMSO中的DCF，使得在该KH缓冲液中的终浓度是0.1至100μM，随后在37℃下孵育5分钟。绘制在0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、以及100μM的DCF浓度处的吸收速率，并且通过米-门二氏曲线进行分析。
结果示于图3中。通过以下米-门二氏方程计算Km和Vmax。其结果是，Vmax是131.6（pmol/min/mg蛋白质），并且Km是7.22（μM）。每个参数代表四个独立实验的平均值。揭示了DCF是一种令人满意的用于OATP1B1的底物。
v=Vmax·S/(Km+S)
（实例4：已知的OATP抑制剂对DCF的OATP1B1-介导的吸收 的影响）
如在实例1中所述的，制备加强表达OATP1B1的HEK-293细胞并且以4×105个细胞/孔将其播种于聚-D-赖氨酸-包被的培养皿中。向这些细胞添加DCF（在0.1%DMSO中，终浓度：3μM）以及一个预定浓度的一种已知的OATP1B1抑制剂，随后在37℃下孵育5分钟。作为已知的OATP1B1抑制剂，使用了利福平（Rif:10μM）、四溴酚酞磺酸钠（BSP:10μM）、环孢霉素A（Cys A:10μM）、雌二醇-17β-D-葡糖苷酸（EG:10以及30μM）、以及雌酮-3-硫酸盐（ES:10以及30μM）。在孵育之后，将这些细胞用冰冷的KH缓冲液洗涤三次，并且然后用0.1N NaOH水溶液增溶，并如在实例1中所述测量被这些细胞吸收的DCF的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。
结果示于图4中。图4揭示了与未添加有任何抑制剂的对照相比，OATP1B1-介导的DCF的吸收在添加有已知的OATP1B1抑制剂的细胞中下降。即，HEK-293细胞的DCF吸收受到了已知的OATP1B1抑制剂的抑制。还揭示了这种抑制取决于抑制剂雌二醇-17β-D-葡糖苷酸以及雌酮-3-硫酸盐的浓度。这证明DCF的吸收是由在HEK-293细胞中加强表达的OATP1B1介导的。
（实例5：在DCF法与常规RI法之间的Ki值的比较） 
如在实例1中所述的，制备加强表达OATP1B1的HEK-293细胞并且以4×105个细胞/孔将其播种于聚-D-赖氨酸-包被的培养皿中。在DCF法中，如在实例4中所述的，向这些细胞添加DCF（在0.1%DMSO中，终浓度：3μM）以及预定浓度的一种已知的OATP抑制剂，将这些细胞在37℃下孵育5分钟，并且测量被这些细胞吸收的DCF的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。在常规RI法中，使用放射性标记的雌二醇-17β-D-葡糖苷酸（EG）。如在DCF中，向这些细胞添加放射性标记的EG（在0.1%DMSO中，终浓度：0.01μM）以及预定浓度的一种已知的OATP抑制剂，随后将这些细胞在37℃ 下孵育5分钟。随后，将这些细胞用冰冷的KH缓冲液洗涤三次，并且然后用0.1N NaOH水溶液增溶，并且在用1N HCl水溶液中和之后，测量被这些细胞吸收的放射性。作为抑制剂的化合物显示于下表中。计算在DCF法与常规RI法中的Ki值，并且研究于其间的关联。
[表2]
结果示于图5中。如图5中显而易见，来自DCF法的Ki值与来自常规RI法的Ki值之间存在非常高的关联（R2=0.9797）。从这些结果证明可以使用DCF作为底物计算对OATP1B1的抑制效应，并且证明DCF法可以提供与常规RI法等效的抑制常数。
（实例6：经由人肝细胞的时间/温度依赖性DCF吸收）
冻存的人肝细胞以及冻存的肝细胞恢复培养基（CHRM）购买自英杰公司。将冻存的人肝细胞在37℃下于水浴中解冻并且添加到在37℃下预热的 CHRM中。在室温下离心之后，弃去上清液，并且在冰冷的KH缓冲液中制备1×106细胞/mL的肝细胞悬浮液并且在冰上储存。以终浓度20μM通过将DCF溶解于KH缓冲液中制备DCF溶液。在开始吸收反应之前，将该肝细胞悬浮液在37℃下于水浴中预孵育2分钟，并且将在37℃预热的DCF溶液以与该肝细胞悬浮液相同的体积添加到其中，从而开始该反应。类似地，还是在4℃，将预先储存在冰上的DCF溶液以与肝细胞悬浮液相同的体积添加到储存在冰上的肝细胞悬浮液中，从而开始该反应。将该肝细胞分别在37℃与4℃下孵育0至5分钟。在0.5min、2min、以及5min的孵育时间处将这些细胞取样，并且通过油旋法（oil spin method）将肝细胞从DCF溶液中分离（例如，吉久舍让（Yoshihisa SHITARA）等人，《药理学和实验治疗学杂志》（JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS）,304:610-616,2003）。具体地说，收集80μL的肝细胞悬浮液并且添加到含有50μL油（比重：1.015，西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich Co.））以及油层下的100μL2N NaOH水溶液的离心管中，并且在10,000g进行离心，持续20秒。通过离心，使得肝细胞穿过该油层并且用2N NaOH水溶液进行增溶。随后，如在实例1中所述的，测量被这些细胞吸收的DCF的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。
结果示于图6中。由于在肝细胞的细胞膜表面上表达的转运蛋白在4℃下不起作用，在4℃所测量的荧光化合物DCF的吸收被认为是转运蛋白-依赖性吸收（不特异性地结合到被动扩散的膜表面上）。由于转运蛋白在37℃起作用，在37℃与4℃处的DCF吸收之间的差异被认为是由转运蛋白（OATP1B1以及在肝细胞中表达的其他转运蛋白）介导的吸收。图6揭示了在37℃，人肝细胞的、转运蛋白介导的DCF吸收随着时间的过去而增加。
（实例7：人肝细胞的DCF吸收的动力学分析）
如在实例6中所述制备人肝细胞，并且以1×106细胞/mL制备肝细胞悬浮液。以2μM、6μM、20μM、60μM、200μM、600μM、以及2000μM的终浓度将DCF溶解于KH缓冲液中。在开始吸收反应之前，将该肝细胞悬浮液在37℃下在水浴中孵育2分钟，并且将在37℃预热的DCF溶液以与该肝细胞悬浮液相同的体积添加到其中，从而开始该反应。在37℃下孵育0至5分钟并且在0.5min、2min、以及5min的孵育时间处将这些肝细胞取样，并且通过油旋法将肝细胞从DCF溶液中分离。将这些肝细胞用2N NaOH水溶液进行增溶，并且如在实例1中所述测量被这些细胞吸收的DCF的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。在每个浓度处绘制吸收速率，通过米-门二氏方程分析这些数据，该分析包含被动扩散的术语，并且通过Eadie-Hofstee曲线进一步分析在吸收速率与DCF的吸收清除之间的关系。
结果示于图7（a）和（b）中。在图7（b）中，在相应于较高的吸收速率的较高的浓度范围处观察到DCF吸收的饱和。这个结果表明人肝细胞的DCF吸收是由转运蛋白介导的。此外，在动力学分析中，通过以下包含术语被动扩散的米-门二氏方程计算Km、Vmax、以及Pdif。其结果是，Km是38.55μM，Vmax是117.52pmol/min/106个细胞，并且Pdif是2.20μL/min/106个细胞。预测了人肝细胞的DCF吸收主要是由OATP1B1介导的，由此Km值接近从实例3中加强表达OATP1B1的细胞获得的值（Km=7.22μM）并且预测了如在实例1中所示的，在人肝细胞中表达的OATP转运蛋白中，OATP1B1显示了最高的DCF转运活性。
v=Vmax·S/(Km+S)+Pdif·S
（实例8：OATP抑制剂对人肝细胞的DCF吸收的影响）
如在实例6中所述制备人肝细胞，并且以1×106个细胞/mL制备肝细胞悬浮液。以20μM以及2000μM的终浓度将DCF溶解于KH缓冲液中。向含 有20μM的DCF的KH缓冲液中添加含有预定浓度的一种已知的OATP1B1抑制剂的DMSO溶液，以给出一种抑制剂溶液。作为已知的OATP1B1抑制剂，使用了四溴酚酞磺酸钠（BSP，终浓度：10μM）、利福平（Rif，终浓度：10μM）、以及环孢霉素A（Cys A，终浓度：10μM）。另外，通过向含有预定浓度DCF的KH缓冲液中添加DMSO各自制备不含任何抑制剂的阳性对照、不含任何OATP1B1抑制剂并且在4℃进行研究的阴性对照（4℃）、以及含有高浓度（终浓度：1000μM）的DCF而不是抑制剂的一个对照（DCF（1000））。在开始吸收反应之前，将该肝细胞悬浮液在37℃下于水浴中孵育2分钟，并且将在37℃预热的、含有DCF的溶液以与该肝细胞悬浮液相同的体积添加到其中，从而开始该反应。将这些肝细胞在37℃下孵育0至5分钟并且在0.5min、2min、以及5min的孵育时间处取样，并且通过油旋法将肝细胞从DCF溶液中分离。将这些肝细胞用2N NaOH水溶液进行增溶，并且如在实例1中所述测量被这些细胞吸收的DCF的荧光强度（激发波长：490nm，荧光波长：515nm）。
结果示于图8中。在图8中，在阳性对照与4℃（两者都不含任何抑制剂）的吸收之间的差异被认为是由转运蛋白介导的DCF的吸收量。另一方面，含有1000μM DCF的对照显示出堪比在4℃下的吸收的荧光强度水平，并且未观察到转运蛋白介导的吸收。这一结果被认为是由1000μM DCF转运蛋白的饱和引起的。另外，揭示了DCF的吸收通过每种OATP1B1抑制剂：BSP、Rif、以及Cys A而被降低到堪比在4℃下的吸收的水平。即，人肝细胞的DCF吸收受到已知的OATP1B1抑制剂的抑制。通过这一结果证实进入到人肝细胞中的DCF吸收主要是由OATP1B1介导的。
工业实用性
通过使用已经被证明为OATP1B1的一种优异底物的二氯荧光素，可以安全、花费低廉、并且易于操作地检测增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物，该检测具有堪比RI法的灵敏度。通过本发明的筛选方法选择的化合物被预期为能够控制体内药代动力学，如用作OATP1B1底物的一种药物的血中浓度。还可能通过本发明的筛选法预测一种试验化合物的OATP1B1-介导的药物相互作用潜能。
本发明还可以提供一种安全、花费低廉、并且易于操作地测量OATP1B1的表达水平的方法，该方法具有堪比RI法的灵敏度。OATP1B1表达水平的测量被认为对于，例如，表达OATP1B1的细胞，如肝细胞的活性评估以及不同批次肝细胞的活性比较是有用的。

Claims (15)

1.一种使用二氯荧光素筛选增强或抑制OATP1B1的转运活性的化合物的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，包括：
制备表达OATP1B1的细胞的一个步骤；
使二氯荧光素以及试验化合物与这种细胞相接触的一个步骤；
测量被这种细胞吸收的二氯荧光素的荧光强度的一个步骤；以及
一个以下步骤：在所测量的荧光强度高于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况下，确定该试验化合物为增强OATP1B1的转运活性的一种化合物，并且在所测量的荧光强度低于该试验化合物不存在时的荧光强度的情况下，确定该试验化合物为抑制OATP1B1的转运活性的一种化合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中表达OATP1B1的细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中表达OATP1B1的细胞是在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中表达OATP1B1的细胞是用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
6.二氯荧光素在OATP1B1表达水平的测量中的一种用途。
7.一种用于测量在试验细胞中的OATP1B1表达水平的方法，该方法包括：
使二氯荧光素与这种试验细胞相接触的一个步骤；
测量被这种试验细胞吸收的二氯荧光素的荧光强度的一个步骤；以及
基于所测量的荧光强度评估这种试验细胞中的OATP1B1表达水平的一个步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在这种试验细胞中的OATP1B1的表达水平是使用表达OATP1B1的阳性细胞作为对照相对地评估的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中这种该阳性细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其中这种阳性细胞是在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞。
11.根据权利要求8所述的方法，其中这种阳性细胞是用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
12.一种试剂盒在试验细胞中的OATP1B1表达水平的测量中的用途，该试剂盒包含二氯荧光素以及表达OATP1B1的阳性细胞。
13.根据权利要求12所述的用途，其中这种该阳性细胞选自下组，该组由以下各项组成：强制表达OATP1B1的细胞、永生化的人肝细胞、原代培养的人肝细胞、新鲜分离的人肝细胞、冻存的人肝细胞、以及夹心培养的人肝细胞。
14.根据权利要求12所述的用途，其中这种阳性细胞是在细胞膜中过表达由在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的细胞。
15.根据权利要求12所述的用途，其中这种阳性细胞是用由在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列组成的DNA转化的细胞。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6087264B2 (ja) * 2013-11-29 2017-03-01 株式会社日立ハイテクノロジーズ 成分分析装置、薬効分析装置、及び分析方法
JP6758026B2 (ja) * 2015-04-17 2020-09-23 株式会社日立ハイテク 成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法
CN106289921B (zh) * 2016-08-09 2019-05-31 温州医科大学 2′，7′-二氯荧光素及其衍生物在蛋白检测中的应用
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JP6282362B2 (ja) * 2017-01-31 2018-02-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ 成分分析装置、薬効分析装置、及び分析方法
JP6582070B2 (ja) * 2018-01-22 2019-09-25 株式会社日立ハイテクノロジーズ 分析方法
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Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60042220D1 (de) * 1999-09-21 2009-06-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verwendung vom transportergen oatp-c zur screening von testsubstanzen
EP1264880A1 (en) * 2001-06-06 2002-12-11 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Double-transfected cell line useful for the identification of transport inhibitors
JP2006340610A (ja) * 2005-06-07 2006-12-21 Sumitomo Chemical Co Ltd 薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEDNARCZYK ET AL.FLUORESCENCE-BASED ASSAYS FOR THE ASSESMENT OF DRUG INTERACTION WITH THE HUMAN TRANSPORTERS OATP1B1 AND OATP1B3.《Analytical Biochemistry》.2010,第405卷全文. *
MACIEJ J ET AL.Pharmacokinetics of 5(and6)-Carboxy-2’,7’-Dichloroflurscein and its Diacetate Promoiety in the liver.《the journal of PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS》.2003,第304卷(第2期),第805-806页. *
Tomas Cihlar et al.Flutescence-Based Assay for the interaction of small Molecules with the human renal organic anion transporter1.《Analytical Biochemistry》.2000,第283卷49-55. *
YAMAGUCHI ET AL.SCREEING OF ANTIBIOTICS THAT INTERACT WITH ORGANIC ANION-TRANSPORTING POLYPEPTIDES 1B1 AND 1B3 USING FLUORESCENT PROBES.《Biol.Pharm.Bull》.2011,第34卷(第3期),全文. *

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