CN118338911A

CN118338911A - 人偏肺病毒疫苗

Info

Publication number: CN118338911A
Application number: CN202280078895.3A
Authority: CN
Inventors: Y·陈; S·萨马勒; A·斯特布勒; M·基肖尔; S·蒙德尔; 张立农; J·狄纳波利; J·阿拉马雷斯-萨普埃; N·阿诺索娃; S·基夫库拉; H·丹兹; T·斯特鲁涅尔; R·格罗普
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2024-07-12
Also published as: EP4440608A1; WO2023102373A1; CO2024007274A2; JP2024542635A; IL312997A; AU2022399571A1; US20230310571A1; CA3239417A1; AR127808A1; KR20240118798A; MX2024006240A; TW202340227A

Abstract

本披露提供了抗原性融合前hMPV F多肽、编码融合前hMPV F多肽的核酸序列(例如，RNA序列，例如，mRNA序列)、包含抗原性融合前hMPV F多肽的组合物、包含编码融合前hMPV F多肽的核酸序列的组合物和hMPV疫苗。

Description

人偏肺病毒疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年11月30日提交的美国临时申请号63/284,405的权益，该美国临时申请出于所有目的通过引用以其全文并入。

CRADA声明

本发明是在履行与美国卫生与公众服务部国立卫生研究院的合作研究与开发协议中创造的。美国政府享有本发明的一定权利。

背景技术

人偏肺病毒(hMPV)是急性呼吸道感染的主要原因，特别是在儿童、免疫低下患者和老年人中。hMPV(其与禽偏肺病毒C亚型密切相关)已传播至少65年，并且几乎每个儿童在5岁前都会感染hMPV。然而，免疫是不完全的，在整个成年期期间会发生再感染。症状与其他呼吸道病毒感染的症状相似，范围从轻度(例如，咳嗽、鼻漏和发烧)到重度(例如，细支气管炎和肺炎)。

尽管疾病负担很高，但目前尚无获得许可的针对hMPV的疫苗或治疗药物。由于缺乏可用的有效的hMPV疫苗或治疗药物，因此对引发强免疫反应以强效中和hMPV感染的hMPV疫苗存在需求。

发明内容

在一方面，提供了一种抗原性人偏肺病毒(hMPV)融合前F多肽，或一种编码该抗原性hMPV融合前F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽进一步包含F0切割位点突变，该F0切割位点突变包含氨基酸取代Q100R和S101R，即用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置101的丝氨酸。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含信号肽。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含至少一个标签序列，该标签序列任选地是多组氨酸标签(例如，6x His标签、8x His标签等)和/或Strep II标签。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含foldon结构域。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含替代在SEQ ID NO:1的位置160的野生型氨基酸的氨基酸取代，和替代在SEQ ID NO:1的位置46的野生型氨基酸的氨基酸取代。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代，和替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸替代在位置160的氨基酸的氨基酸取代。在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用苯丙氨酸替代在位置160的氨基酸的氨基酸取代。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸替代在位置46的氨基酸的氨基酸取代。在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用缬氨酸替代在位置46的氨基酸的氨基酸取代。

在某些示例性实施例中，hMPV是A株或B株。在某些示例性实施例中，hMPV是A1亚型、A2亚型、B1亚型或B2亚型。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽与SEQ ID NO:3具有至少95％的序列同一性或包含SEQ ID NO:3。

在某些示例性实施例中，提供了一种包含编码F多肽的开放阅读框(ORF)的信使RNA(mRNA)。

在某些示例性实施例中，提供了一种引发有需要的受试者的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的该F多肽或核酸分子、预防有效量的该mRNA或预防有效量的该疫苗。

在某些示例性实施例中，提供了一种预防hMPV感染或减轻hMPV感染的一个或多个症状的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的该F多肽或核酸分子、预防有效量的该mRNA或预防有效量的该疫苗。

在某些示例性实施例中，提供了该F多肽或核酸分子、预防有效量的该mRNA或该疫苗用于制造用于在治疗有需要的受试者中使用的药物的用途。

在某些示例性实施例中，提供了该F多肽或核酸分子、预防有效量的该mRNA或该疫苗，用于在治疗有需要的受试者中使用。

在某些示例性实施例中，提供了一种包含容器的试剂盒，该容器包含单次使用或多次使用剂量的该F多肽或核酸分子、预防有效量的该mRNA或该疫苗，任选地其中该容器是小瓶或预填充针筒(syringe)或注射器(injector)。

在某些示例性实施例中，提供了一种编码该F多肽、该核酸分子或该mRNA的表达载体。

在某些示例性实施例中，提供了一种包含该表达载体的细胞。

在另一方面，提供了一种抗原性人偏肺病毒(hMPV)融合前F多肽，或一种编码该抗原性hMPV融合前F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含：含有氨基酸取代Q100R和S101R的F₀切割位点突变；即用精氨酸替代在SEQ IDNO:1的氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置101的丝氨酸；人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点；异源信号肽；多组氨酸标签(例如，6x His标签、8x His标签等)和/或Strep II标签；和foldon结构域。

在另一方面，提供了一种抗原性人融合前偏肺病毒(hMPV)F多肽，或一种编码该抗原性人融合前偏肺病毒F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代，和替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸替代在氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代。在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用苯丙氨酸替代在氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代T160F。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或脯氨酸替代在氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代。在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含用缬氨酸替代在氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代N46V。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽与SEQ ID NO:7具有至少95％的序列同一性。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含信号肽。

在某些示例性实施例中，所述融合前F多肽包含foldon结构域。

在某些示例性实施例中，提供了一种包含容器的试剂盒，该容器包含单次使用或多次使用剂量的该F多肽或核酸分子、预防有效量的该mRNA或该疫苗，任选地其中该容器是小瓶或预填充针筒或注射器。

在另一方面，提供了一种抗原性人偏肺病毒(hMPV)融合前F多肽，或一种编码该抗原性hMPV融合前F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含：用苯丙氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代T160F，和用缬氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代N46V；含有氨基酸取代Q100R和S101R的F₀切割位点突变；即用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置101的丝氨酸；人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点；信号肽；多组氨酸标签(例如，6x His标签、8x His标签等)和/或Strep II标签；和foldon结构域。

在另一方面，提供了一种人偏肺病毒(hMPV)F多肽，或一种编码该hMPV F多肽的核酸分子，其中所述F多肽与SEQ ID NO:7具有至少95％的序列同一性。

在某些示例性实施例中，F多肽是融合前F多肽。

在某些示例性实施例中，F多肽是抗原性的。

在某些示例性实施例中，F多肽包含用苯丙氨酸替代在氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代T160F，和用缬氨酸替代在氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代N46V。

在某些示例性实施例中，F多肽包含SEQ ID NO:7。

在某些示例性实施例中，提供了一种核酸分子，该核酸分子编码上述方面或上述实施例中任一项的多肽中的任一种。在某些示例性实施例中，核酸分子与SEQ ID NO:8具有至少95％的序列同一性。在某些示例性实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:8。在某些示例性实施例中，核酸分子与SEQ ID NO:18具有至少95％的序列同一性。在某些示例性实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:18。在某些示例性实施例中，核酸分子与SEQ ID NO:19具有至少95％的序列同一性。在某些示例性实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:19。

在某些示例性实施例中，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述实施例的多肽中的任一种，或编码该多肽的核酸分子中的任一种。在某些示例性实施例中，药物组合物是疫苗。

在某些示例性实施例中，提供了一种引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的方法，该方法包括向受试者施用该疫苗。

在某些示例性实施例中，在施用疫苗后，受试者相对于施用蛋白hMPV疫苗的受试者具有可比的抗hMPV的中和抗体的血清浓度。在某些示例性实施例中，蛋白hMPV疫苗与佐剂共施用。

在某些示例性实施例中，疫苗增加了预先存在hMPV免疫的受试者的中和抗体的血清浓度。

在某些示例性实施例中，提供了一种用于在引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染中使用的疫苗，该使用包括向受试者施用该疫苗。

在某些示例性实施例中，提供了该疫苗在制造用于引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的药物中的用途。

在另一方面，提供了一种信使RNA(mRNA)，该mRNA包含编码人偏肺病毒(hMPV)F多肽抗原的开放阅读框(ORF)，其中该hMPV F多肽抗原包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。

在某些示例性实施例中，hMPV F多肽抗原是融合前F多肽。

在某些示例性实施例中，ORF是经密码子优化的。

在某些示例性实施例中，mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个聚腺苷酸化(聚(A))序列。

在某些示例性实施例中，mRNA包含至少一种化学修饰。

在某些示例性实施例中，mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

在某些示例性实施例中，ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

在某些示例性实施例中，化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。在某些示例性实施例中，化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。在某些示例性实施例中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。

在某些示例性实施例中，将mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。

在某些示例性实施例中，LNP包含至少一种阳离子脂质。在某些示例性实施例中，阳离子脂质是可生物降解的。在某些示例性实施例中，阳离子脂质不是可生物降解的。在某些示例性实施例中，阳离子脂质是可切割的。在某些示例性实施例中，阳离子脂质不是可切割的。

在某些示例性实施例中，阳离子脂质选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。在某些示例性实施例中，阳离子脂质是cKK-E10。在某些示例性实施例中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10。

在某些示例性实施例中，LNP进一步包含聚乙二醇(PEG)缀合(PEG化的)脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质。

在某些示例性实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的阳离子脂质；摩尔比为0.25％至2.75％的聚乙二醇(PEG)缀合(PEG化)脂质、摩尔比为20％至45％的基于胆固醇的脂质和摩尔比为5％至35％的辅助脂质，其中所有的摩尔比均相对于LNP的总脂质含量。

在某些示例性实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的阳离子脂质、摩尔比为1.5％的PEG化的脂质、摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质和摩尔比为30％的辅助脂质。

在某些示例性实施例中，PEG化的脂质是二肉豆蔻酰基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

在某些示例性实施例中，基于胆固醇的脂质是胆固醇。

在某些示例性实施例中，辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。

在某些示例性实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE。

在某些示例性实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的cKK-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE。

在某些示例性实施例中，LNP具有30nm至200nm的平均直径。在某些示例性实施例中，LNP具有80nm至150nm的平均直径。

在某些示例性实施例中，提供了一种包含mRNA的药物组合物。在某些示例性实施例中，药物组合物包含疫苗。

在另一方面，提供了一种疫苗，该疫苗包含人偏肺病毒(hMPV)F多肽抗原或编码该hMPV F多肽抗原的核酸分子，其中该F多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的氨基酸序列。

在某些示例性实施例中，hMPV F多肽是融合前F多肽。

在某些示例性实施例中，疫苗与佐剂共施用。在某些示例性实施例中，疫苗与另外的疫苗组合施用。在某些示例性实施例中，另外的疫苗是呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗或流感疫苗。

在某些示例性实施例中，受试者是人。在某些示例性实施例中，人受试者是婴儿、学步儿或老年人。

在某些示例性实施例中，疫苗增加了中和抗体的血清浓度，并且其中受试者具有预先存在的hMPV免疫。

在某些示例性实施例中，提供了一种在有需要的受试者中引发免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的该疫苗。

在某些示例性实施例中，提供了一种预防hMPV感染或减轻hMPV感染的一个或多个症状的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的该疫苗。

在某些示例性实施例中，提供了该疫苗用于制造用于在治疗有需要的受试者中使用的药物的用途。

在某些示例性实施例中，提供了疫苗，用于在治疗有需要的受试者中使用。

在某些示例性实施例中，提供了一种包含容器的试剂盒，该容器包含单次使用或多次使用剂量的该疫苗，任选地其中该容器是小瓶或预填充针筒或注射器。

附图说明

根据以下说明性实施例的详细描述结合附图，将更充分地理解本披露之前述和其他特征和优点。本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。

图1描绘了示为两种示例性构建体(D185P和T160_N46V)的21种候选hMPV融合前F抗原组的设计考虑。构建体D185P用作基准参考以计量各种新型构建体的活性。“(mut)”＝带阴影的“ENPRRRR”氨基酸序列和带阴影的“P”、带阴影的“V”和带阴影的“F”单一氨基酸；“接头”＝加粗的、加下划线的“GGGGS”、“GRS”和“G”氨基酸序列；“foldon”＝加下划线的“GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL”氨基酸序列；“8xHIS”＝带阴影的“HHHHHHHH”氨基酸序列；“StrepII”＝带阴影的“SAWSHPQFEK”序列。

图2描绘了在第0天、第21天和第35天测量的针对四种hMPV融合前F抗原蛋白构建体的小鼠IgG抗体效价(在每个时间点从左到右按如下顺序列出数据点)：(1)A2-F D185P，(2)A2-F T160F_N46V，(3)A2-F K138F，和(4)A2-F G366F_K362F，以及对照：hMPV(5)A1-Fpre-F第1批，(6)A1-F pre-F第2批，(7)A1-F post F，和(8)B2 pre-F。

图3描绘了在第21天和第35天测量的针对四种hMPV融合前F抗原蛋白构建体的小鼠hMPV微量中和抗体效价：(1)A2-F D185P，(2)A2-F T160F_N46V，(3)A2-F K138F，和(4)A2-F G366F_K362F，以及对照：hMPV(5)A1 pre-F第1批，(6)A1 pre-F第2批，(7)A1 post F，和(8)B2 pre-F。

图4描绘了参考A1蛋白(A1-A185P和A1-postF)以及A2蛋白抗原候选物(A2-T160F_N46V和A2-D185P)的SEC-MALS结果。

图5描绘了如通过nanoDSF测量的A1-pre-F以及A1-post-F的代表性熔解曲线[在荧光发射330nm和350nm处](上小图)、平滑的一阶导数曲线(中小图)和光散射[mAU](下小图)。

图6描绘了如通过nanoDSF测量的源自A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体的蛋白质样品的代表性熔解曲线[在荧光发射330nm和350nm处](上小图)和平滑的一阶导数曲线(中小图)以及光散射[mAU](下小图)。

图7描绘了施用用LNP配制的任一种hMPV融合前F mRNA构建体(A2-D185P或A2-T160F_N46V)后，在第0天、第21天和第35天测量的小鼠hMPV F抗原IgG抗体效价。

图8描绘了施用用LNP配制的任一种hMPV融合前F mRNA构建体(A2-D185P或A2-T160F_N46V)后，在第0天、第21天和第35天测量的小鼠hMPV微量中和抗体效价。

图9描绘了用(1)RSV F mRNA；(2)RSV-F加hMPV-F mRNA；或(3)RSV蛋白进行疫苗接种的小鼠中抗RSV-F抗体的效价，如通过使用RSV-pre-F蛋白作为结合抗原以及用兔抗小鼠IgG检测的终点ELISA测量的。D35时间点，来自单独的动物(n＝8)的读数显示为log2转换的效价，具有平均值+/-95％置信区间。

图10描绘了用(1)hMPV F mRNA；(2)RSV-F加hMPV-F mRNA；或(3)hMPV蛋白进行疫苗接种的小鼠中抗hMPV-F抗体的效价，如通过使用hMPV-pre-F蛋白作为结合抗原以及用羊抗小鼠IgG检测的终点ELISA测量的。D35时间点，来自单独的动物(n＝8)的读数显示为log2转换的效价，具有平均值+/-95％置信区间。

图11描绘了用(1)RSV F mRNA；(2)RSV-F加hMPV-F mRNA；或(3)RSV蛋白进行疫苗接种的小鼠中的RSV中和抗体效价，如通过微量中和测定在Vero细胞的96孔板上使用与连续稀释的疫苗接种小鼠的血清混合的RSV A2-GFP株测量的。通过计算24小时培育后荧光焦点的反向减少来确定效价。D35时间点来自单独的动物(n＝8)的读数显示为log2转换的效价，具有平均值+/-95％置信区间。

图12描绘了用(1)hMPV F mRNA；(2)RSV-F加hMPV-F mRNA；或(3)hMPV蛋白进行疫苗接种的小鼠中的hMPV中和抗体效价，如通过微量中和测定在Vero细胞的96孔板上使用与连续稀释的疫苗接种小鼠的血清混合的hMPV A2-GFP株测量的。通过计算24小时培育后荧光焦点的反向减少来确定效价。D35时间点来自单独的动物(n＝8)的读数显示为log2转换的效价，具有平均值+/-95％置信区间。

图13示出了使用用1μg mRNA转染的30万个细胞/孔的D185P和T160_N46V的hMPV F蛋白表达水平的免疫印迹图。

图14描绘了使用pre-F抗体(小图A)、post-F抗体(小图B)或pre-F/post-F抗体(小图C)，在用野生型HMPV F、D185P或T160F_N46V转染的细胞中的表位表达。在每个小图A、B、C中，上线条对应于MNR hMPV T160F_N46V，中线条对应于MNR hMPV CAN97-83，并且下线条对应于MNR hMPV D185P。

图15描绘了用于评价两种hMPV候选物在24个供体中的免疫原性的hMPV MIMIC设置。

图16描绘了针对三种脊髓灰质炎毒株(即脊髓灰质炎1(小图A)、脊髓灰质炎2(小图B)和脊髓灰质炎3(小图C))，从用以1:50稀释的IPOL(脊髓灰质炎疫苗)处理的MIMIC共培养物上清液或未处理的对照(共培养中无处理且无人骨骼肌细胞，“无抗原(无HSK)”)收集的在第14天测量的人IgG抗体效价。

图17描绘了针对RSV pre-F(小图A)和RSV post-F(小图C)，从用50ng/ml RSVpre-F NP(与铁蛋白纳米颗粒融合的RSV pre-F蛋白)处理的MIMIC共培养物上清液收集的在第14天测量的人IgG抗体效价。小图C描述了抗体是否具有功能，如在RSV中和测定中测量的。

图18以图形方式描绘了pre-F(小图A)和post-F(小图B)的抗体反应。N＝22；数据以几何平均值和95％ C.I.表示。

图19以图形方式描绘了pre-F和post-F中和抗体效价。N＝22；数据以几何平均值和95％ C.I.表示。

图20描绘了针对hMPV pre-F抗原(小图A)或hMPV post-F抗原(小图B)，从用实验组(hMPV pre-F蛋白(100ng/ml或500ng/ml)或hMPV post-F抗原蛋白(100ng/ml))或对照组(无抗原无HSK、RSV pre-F NP或IPOL)处理的MIMIC共培养物上清液收集的在第14天测量的人IgG抗体效价。

图21描绘了使用收集的用hMPV pre-F蛋白(100ng/ml或500ng/ml)、hMPV post F抗原蛋白(100ng/ml)或无抗原无HSK处理的MIMIC共培养物的上清液在第14天测量的hMPV微量中和抗体效价。

具体实施方式

本披露尤其涉及抗原性融合前hMPV F多肽、编码抗原性融合前hMPV F多肽的核酸序列(例如，RNA序列，例如，mRNA序列)、包含抗原性融合前hMPV F多肽的组合物、包含编码抗原性融合前hMPV F多肽的核酸序列的组合物和hMPV疫苗。

I.定义

除非本文另有规定，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是下文描述了示例性方法和材料。在发生冲突的情况下，应以包括定义在内的本说明书为准。通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医学和药物化学、蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法以及其技术是本领域熟知且常用的那些。根据制造商的说明书如本领域通常所实现的或如本文所述的那样进行酶促反应和纯化技术。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。在整个本说明书和实施例中，词语“具有(have)”和“包括(comprise)”或变型(如“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(comprises)”或“包括(comprising)”)应被理解为意指包括所陈述的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组。将本文提和的所有出版物和其他参考文献均通过引用以其全文并入。尽管本文引用了许多文件，但此引用并不意味着承认这些文件中的任一个构成本领域公知常识的一部分。

应注意，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”实体是指一个/种或多个/种所述实体：例如，“一个核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种(one or more)”以及“至少一个/种(at least one)”在本文中可以互换使用。

此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每个具有或不具有另一者的详细披露内容。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应理解，无论在本文中将多方面用语言“包括”来描述的情况如何，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”措辞描述的其他类似方面。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本披露所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology[生物医学与分子生物学简明词典],Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC出版社(CRC Press)；The Dictionary Of Cell And Molecular Biology[细胞与分子生物学词典]，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology[牛津生物化学和分子生物学词典]，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)可以为技术人员提供本披露中所用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(SI)可接受的形式表示。数值范围包括限定范围的数字。除非另有指示，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不是对本披露的各个方面的限制。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下文紧接着定义的术语。

术语“大约”或“约”在本文中用于意指大致、大概或在……左右。当术语“约”结合数值范围使用时，它通过延伸所述数值上下的边界来修改该范围。通常，术语“约”可以通过方差(例如，10％、向上或向下)将数值修饰为高于和低于所述值(更高或更低)。在一些实施例中，该术语指示与指示数值偏差±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％或±0.01％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±10％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±5％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±4％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±3％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±2％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±1％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.9％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.8％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.7％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.6％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.5％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.4％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.3％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.1％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.05％。在一些实施例中，“约”指示与指示数值偏差±0.01％。

如本文所用，术语“信使RNA”或“mRNA”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA两者。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。编码区可替代地称为开放阅读框(ORF)。mRNA中的非编码区包括5'帽、5'非翻译区(UTR)、3'UTR和聚(A)尾。mRNA可以从天然来源中纯化，使用重组表达系统(例如，体外转录)产生，以及任选地纯化或化学合成。

如本文所用，术语“抗原性位点”或“位点表位”是指位于hMPV F三聚体的融合前形式中的位点。位点表位是用于对融合前hMPV F具有特异性的抗体的结合位点。

如本文所用，术语“抗原性位点V”或“位点V表位”是指位于hMPV F三聚体的融合前形式中的位点。位点V表位是用于对融合前hMPV F具有特异性的抗体的结合位点。

如本文所用，术语“抗原稳定性”是指抗原随时间或在溶液中的稳定性。

如本文所用，术语“空腔填充取代”是指用于填充存在于融合前hMPV F三聚体中的空腔的工程化疏水性取代。

如本文所用，术语“F蛋白”或“hMPV F蛋白”是指在病毒进入期间负责介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合的hMPV蛋白。F蛋白可以介导感染细胞与非感染细胞之间的融合以形成多核细胞或合胞体。

如本文所用，术语“hMPV F多肽”、“F多肽”或“F多肽抗原”是指包含hMPV F蛋白的至少一个表位的多肽。

如本文所用，术语“跨膜结构域”是指在hMPV F0/F1的c末端附近的横穿hMPV病毒体膜的大约23个氨基酸的序列。在某些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列GFIIVIILIAVLGSSMILVSIFII。

如本文所用，术语“胞质尾区”是指在hMPV F0/F1的c末端的位于病毒体内部的大约25个氨基酸的序列。在某些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列IKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN。

如本文所用，“foldon结构域”是指T4 fibritin的三聚化结构域。

如本文所用，“信号肽”或“信号序列”是指存在于多肽的氨基末端或羧基末端的长度大约为16-30个氨基酸的肽，该肽的功能是在内质网和高尔基体中将该多肽转移至分泌途径。在某些实施例中，信号序列对应于SEQ ID NO:1、3、5和7中任一个的氨基酸1-18。

如本文所用，“标签序列”或“亲和标签”是指可以用于纯化包含标签序列的多肽或蛋白质的多肽序列。标签序列包括例如，多组氨酸标签(例如，六组氨酸(6x His标签)、八组氨酸(8x His标签)等)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、FLAG、链霉亲和素结合肽(SBP)、strep II、麦芽糖结合蛋白(MBP)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、甲壳质结合结构域(CBD)、RNA酶A的S蛋白、血凝素(HA)、c-Myc等。

如本文所用，术语“原聚体内稳定化取代”是指hMPV F中的氨基酸取代，这些氨基酸取代通过稳定hMPV F三聚体的原聚体内的相互作用来稳定融合前构型。

如本文所用，术语“原聚体间稳定化取代”是指hMPV F中的氨基酸取代，这些氨基酸取代通过稳定hMPV F三聚体的原聚体彼此之间的相互作用来稳定融合前构型。

如本文所用，术语“蛋白酶切割”是指在多肽序列的蛋白酶切割位点的敏感残基(例如，赖氨酸或精氨酸)的蛋白水解(有时也称为“剪切”)。蛋白酶切割位点包括病毒蛋白酶切割位点，如例如，hMPV F0蛋白酶切割位点、呼吸道合胞病毒(RSV)F0蛋白酶切割位点和人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点。

如本文所用，关于hMPV F的术语“融合后”是指在病毒膜与宿主细胞膜融合后出现的hMPV F的稳定构型。

如本文所用，关于hMPV F的术语“融合前”是指在病毒-细胞相互作用之前所采取的hMPV F的构型。

如本文所用，术语“原聚体”是指寡聚蛋白质的结构单位。在hMPV F的情况下，hMPVF三聚体的单独单元是原聚体。

如本文所用，术语“免疫反应”是指免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原或疫苗)的反应。免疫反应可以包括身体中参与宿主防御反应的任何细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫反应包括但不限于先天性和/或适应性免疫反应。

如本文所用，“保护性免疫反应”是指保护受试者免受感染(例如，预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫反应。测量免疫反应的方法包括测量例如淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。

如本文所用，“抗体反应”是产生抗体的免疫反应。

如本文所用，“抗原”是指引发免疫反应的因子；和/或当暴露或施用于生物体时由T细胞受体结合的因子(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体(例如，由B细胞产生)结合的因子。在一些实施例中，抗原在生物体中引发体液反应(例如，包括抗原特异性抗体的产生)。可替代地或另外，在一些实施例中，抗原在生物体中引发细胞反应(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。特定抗原可以在靶生物体(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或几个成员中引发免疫反应，但是不能在靶生物体物种的所有成员中引发免疫反应。在一些实施例中，抗原在靶生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的成员中引发免疫反应。在一些实施例中，抗原与抗体和/或T细胞受体结合，并且在生物体中可能诱导或可能不诱导特定生理反应。在一些实施例中，例如，抗原可以在体外与抗体和/或T细胞受体结合，无论在体内是否发生这种相互作用。在一些实施例中，抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应。抗原包括如本文所述的hMPV多肽。

如本文所用，“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的物质或运载体。佐剂可以包括但不限于其上吸附有抗原的矿物质(例如，明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；抗原溶液乳化在矿物油中或水中的油包水或水包油乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)。有时包括杀死的分枝杆菌(例如，弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG基序)也可以用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还可以包括生物分子，如Toll样受体(TLR)激动剂和共刺激分子。

如本文所用，“抗原性hMPV多肽”是指包含全部或部分hMPV氨基酸序列的多肽，该序列的长度足以使该分子具有关于hMPV的抗原性。

如本文所用，“受试者”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“受试者”是指人。在一些实施例中，“受试者”是指非人动物。在一些实施例中，受试者包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在某些实施例中，非人类受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，受试者可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。在一些实施例中，术语“受试者”或“患者”被使用并且旨在与“受试者”可互换。

在一些实施例中，“受试者”选自由以下组成的组：年龄在65岁或以上的受试者、年龄在18至64岁(18至<65岁)的受试者、年龄在12岁或以上的受试者、年龄在12至17岁(12至<18岁)的受试者、年龄在6至11岁(6至<12岁)的受试者、年龄在2至5岁(2至<6岁)的受试者、年龄在1至4岁(1至<5岁)的受试者、年龄在2个月至1岁(2个月至<2岁)的受试者，以及年龄在0至2个月大(0至<3个月大)的受试者。

在一些实施例中，“受试者”选自由以下组成的组：老年人(older adult)(例如，老年人(senior adult)或老年人(elderly adult))、成年人、青少年、儿童、学步儿、婴儿。在一些实施例中，“受试者”选自由以下组成的组：年龄在60岁或以上的老年人、老人(例如，65岁或以上)、成年人(例如，18至50岁或18-64岁)、年龄在12至17岁(例如，12至<18岁)的青少年、年龄在6至11岁(例如，6至<12岁)的儿童、年龄在2至5岁(例如，2至<6岁)的儿童、年龄在1至4岁(例如，1至<5岁)的学步儿、年龄在2个月至1岁(例如，2个月至<2岁)的婴儿、新生儿(例如，0-27日龄)，以及是早产的新生婴儿(例如，孕龄少于37周)。在一些实施例中，受试者在如由美国FDA所定义的儿科年龄组：新生儿(例如，出生不满一个月(NEO))；婴儿(例如，年龄在1个月至2岁以下(“INF”))；儿童(例如，年龄在两岁至12岁以下(“CHI”))；以及青少年(例如，年龄在12岁至17岁以下(“ADO”))。在一些实施例中，受试者属于美国FDA定义的年龄组的老年人，如年龄为65岁或以上或年龄为75岁或以上。在特别的示例性实施例中，受试者是婴儿(例如，年龄在1个月至2岁以下)、学步儿(例如，1至<5岁)、或老年人(例如，年龄在60岁或以上、65岁或以上、或者75岁或以上)。

如本文所用，术语“疫苗接种(vaccination)”或“疫苗接种(vaccinate)”是指施用旨在生成例如针对致病因子的免疫反应的组合物。疫苗接种可以在暴露于致病因子和/或发生一种或多种症状之前、期间和/或之后施用，并且在一些实施例中，在暴露于致病因子之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施例中，疫苗接种包括以适当或合适的时间间隔多次施用疫苗接种组合物。

如本文所用，术语“治疗药物”或“治疗剂”是指旨在减少或消除hMPV感染的一种或多种症状的组合物的施用。治疗剂可以在暴露于hMPV和/或出现一种或多种症状之前、期间和/或之后施用。在一些实施例中，将治疗剂以适当或合适的时间间隔通过多次施用疫苗接种组合物来给予受试者。

本披露描述了分别与给定核酸序列或氨基酸序列(例如，与参考序列)具有一定程度的同一性的核酸序列(例如，DNA和RNA序列)和氨基酸序列。

术语“相同％”、“同一性％”或类似术语旨在特别是指在待比较的序列之间的最优选地比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸的百分比。所述百分比纯粹是统计性的，并且两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过以下方式进行：在最优选地比对之后，关于区段或“比较窗口”比较所述序列，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最优选地比对可以手动进行，或者借助Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.[应用数学]2,482的局部同源性算法、借助Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48,443的局部同源性算法、借助Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88,2444的相似性搜索算法或借助使用所述算法的计算机程序(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA,威斯康星州麦迪逊市科学大道575号遗传学计算机课题组(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.))进行。

通过以下方式获得同一性百分比：确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用此数目除以比较的位置的数目(例如，参考序列中的位置的数目)，并且将此结果乘以100。

在一些实施例中，同一性程度是针对区域给出的，该区域是参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施例中为连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施例中，针对参考序列的整个长度给出同一性程度。

分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可以具有所述给定序列的至少一种功能特性，例如并且在一些情况下，在功能上等同于所述给定序列。在一些实施例中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列在功能上等同于所述给定序列。

如本文所用，术语“试剂盒”是指一组经包装的相关组分，如一种或多种化合物或组合物和一种或多种相关材料，如溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。

II.hMPV F多肽抗原

人偏肺病毒(hMPV)是属于副粘病毒科肺病毒亚科的负义、单链RNA病毒。hMPV感染鼻和肺中的气道上皮细胞并且是幼儿下呼吸道感染的第二常见原因，次于呼吸道合胞病毒(RSV)。hMPV是在病毒体表面上具有糖蛋白(G蛋白)、小疏水蛋白(SH蛋白)和融合蛋白(F蛋白)的包膜病毒。

由于hMPV是包膜病毒，因此其进入宿主细胞中需要病毒膜与细胞膜融合。副粘病毒进入通常需要两种病毒糖蛋白，融合(F)蛋白和吸附(G、H或HN)蛋白，并且所有已检测的副粘病毒糖蛋白促进的膜融合均在中性pH下进行，但有一个可能的例外(即，SER病毒)。除了病毒-细胞膜融合外，副粘病毒糖蛋白还促进细胞-细胞融合。在被各种副粘病毒感染的组织中可以发现多核巨细胞(称为合胞体)。感染hMPV的培养细胞形成合胞体，但对感染hMPV的原代人气道上皮细胞的检查表明，此病毒的合胞体形成在体内可能不常发生。

hMPV F是I类融合糖蛋白，以无活性前体(F0)合成，需要被切割才能具有融合能力。蛋白水解切割产生两个二硫键连接的亚基(F2位于F1的N末端)，这些亚基组装成同源三聚体。切割发生在紧接疏水融合肽上游的单碱性切割位点处。切割可以在组织培养中通过向培养基中添加外源性胰蛋白酶或通过添加弗林蛋白酶表达质粒来实现。然而，在体内，其他丝氨酸蛋白酶(如TMPRSS2)被认为可能与切割更相关。F三聚体以亚稳态的“融合前”或“pre-F”构型并入病毒颗粒中。为了开始膜融合，hMPV F被激活并在F蛋白中发生一系列逐步构型变化，这些构型变化驱动膜融合并导致hMPV F采用高度稳定的“融合后”或“post-F”构型。

在某些示例性实施例中，通过编码hMPV F多肽的质粒和编码弗林蛋白酶的质粒(以4:1的hMPV质粒:弗林蛋白酶质粒的比率)共转染来实现F0的蛋白水解切割。

本文提供了包含hMPV F多肽的抗原性hMPV多肽。hMPV F多肽可以包含hMPV F的全序列或hMPV F的一部分。在某些实施例中，该部分是胞外域。

在一些实施例中，hMPV F多肽包含与SEQ ID NO:1、3、5和7中任一个具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。

在一些实施例中，hMPV F多肽包含具有与SEQ ID NO:1、3、5和7中任一个的多肽的至少80％同一性的经修饰的hMPV F多肽，其中该hMPV F多肽是抗原性的。

在一些实施例中，hMPV F多肽仅包含F多肽的胞外域部分。

A2-CAN97-83的F0的氨基酸序列是：

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSIFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN(SEQ ID NO:1)。(登录号AAN52910；AAN52910.1版；DB来源登录号AY145296.1)。跨膜结构域加粗并加下划线，并且胞质尾区加粗。

A2-CAN97-83的F0的核苷酸序列是：

ATGTCTTGGAAAGTGGTGATCATTTTTTCATTGCTAATAACACCTCAACACGGTCTTAAAGAGAGCTACCTAGAAGAATCATGTAGCACTATAACTGAGGGATATCTTAGTGTTCTGAGGACAGGTTGGTATACCAACGTTTTTACATTAGAGGTGGGTGATGTAGAAAACCTTACATGTTCTGATGGACCTAGCCTAATAAAAACAGAATTAGATCTGACCAAAAGTGCACTAAGAGAGCTCAAAACAGTCTCTGCTGACCAATTGGCAAGAGAGGAACAAATTGAGAATCCCAGACAATCTAGGTTTGTTCTAGGAGCAATAGCACTCGGTGTTGCAACAGCAGCTGCAGTCACAGCAGGTGTTGCAATTGCCAAAACCATCCGGCTTGAGAGTGAAGTCACAGCAATTAAGAATGCCCTCAAAACGACCAATGAAGCAGTATCTACATTGGGGAATGGAGTTCGAGTGTTGGCAACTGCAGTGAGAGAGCTGAAAGACTTTGTGAGCAAGAATTTAACTCGTGCAATCAACAAAAACAAGTGCGACATTGATGACCTAAAAATGGCCGTTAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGGTTTCTAAATGTTGTGCGGCAATTTTCAGACAATGCTGGAATAACACCAGCAATATCTTTGGACTTAATGACAGATGCTGAACTAGCCAGGGCCGTTTCTAACATGCCGACATCTGCAGGACAAATAAAATTGATGTTGGAGAACCGTGCGATGGTGCGAAGAAAGGGGTTCGGAATCCTGATAGGGGTCTACGGGAGCTCCGTAATTTACATGGTGCAGCTGCCAATCTTTGGCGTTATAGACACGCCTTGCTGGATAGTAAAAGCAGCCCCTTCTTGTTCCGAAAAAAAGGGAAACTATGCTTGCCTCTTAAGAGAAGACCAAGGGTGGTATTGTCAGAATGCAGGGTCAACTGTTTACTACCCAAATGAGAAAGACTGTGAAACAAGAGGAGACCATGTCTTTTGCGACACAGCAGCGGGAATTAATGTTGCTGAGCAATCAAAGGAGTGCAACATCAACATATCCACTACAAATTACCCATGCAAAGTCAGCACAGGAAGACATCCTATCAGTATGGTTGCACTGTCTCCTCTTGGGGCTCTGGTTGCTTGCTACAAAGGAGTAAGCTGTTCCATTGGCAGCAACAGAGTAGGGATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGTTGCTCCTATATAACCAACCAAGATGCAGACACAGTGACAATAGACAACACTGTATATCAGCTAAGCAAAGTTGAGGGTGAACAGCATGTTATAAAAGGCAGACCAGTGTCAAGCAGCTTTGATCCAATCAAGTTTCCTGAAGATCAATTCAATGTTGCACTTGACCAAGTTTTTGAGAACATTGAAAACAGCCAGGCCTTGGTAGATCAATCAAACAGAATCCTAAGCAGTGCAGAGAAAGGGAATACTGGCTTCATCATTGTAATAATTCTAATTGCTGTCCTTGGCTCTAGCATGATCCTAGTGAGCATCTTCATTATAATCAAGAAAACAAAGAAACCAACGGGAGCACCTCCAGAGCTGAGTGGTGTCACAAACAATGGCTTCATACCACATAATTAG(SEQ ID NO:2)。

在一些实施例中，pre-F与post-F之间共享的hMPV F蛋白的表位被封闭。在将编码抗原性hMPV F多肽的RNA(例如，mRNA)施用于受试者时或在将抗原性hMPV F多肽施用于受试者时，封闭表位减少或消除了针对表位的抗体的产生。这可以增加靶向F的特定构型(如融合前构型)特有的表位的抗体(例如，靶向位点和/或位点V的抗体)的比例。由于F在尚未进入细胞的病毒中具有融合前构型，因此靶向pre-F的抗体的比例增加可以提供更大程度的中和(例如，如本文所述，表示为中和与结合比率)。

本文所述的hMPV F多肽可以具有相对于野生型hMPV F蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的缺失或取代。

例如，在某些实施例中，hMPV多肽：(a)缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点；(b)包含相对于SEQ ID NO:1的F₀切割位点突变，该突变包含氨基酸取代Q100R和S101R，即用精氨酸替代在氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在氨基酸位置101的丝氨酸；(c)包含异源信号肽；(d)包含至少一个标签序列(其任选地为多组氨酸标签，例如，6x His标签、8x His标签等)和/或Strep II标签；和/或(e)包含foldon结构域。

在某些实施例中，hMPV多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含：相对于SEQ ID NO:1的F0切割位点突变，该突变包含氨基酸取代Q100R和S101R；即用精氨酸替代氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代氨基酸位置101的丝氨酸；人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点；异源信号肽；多组氨酸标签(例如，6x His标签、8x His标签等)和/或Strep II标签；和foldon结构域。

在某些实施例中，hMPV多肽包括在SEQ ID NO:1的位置185的缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或脯氨酸取代。

在某些实施例中，hMPV多肽包括在SEQ ID NO:1的位置160的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代，和/或在SEQ ID NO:1的位置46的缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸取代。

在某些实施例中，hMPV多肽包括在SEQ ID NO:1的位置160的取代和在SEQ ID NO:1的位置46的取代，其中这些取代是稳定hMPV多肽的三级和/或四级结构的“稳定化取代”。稳定化取代包括但不限于，以下的取代：疏水氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸)；亲水氨基酸(例如，半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；形成二硫键的氨基酸(例如，半胱氨酸)；形成氢键的氨基酸(例如，色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)；带电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)等。

在某些实施例中，hMPV多肽来自A株hMPV(例如，A1亚型或A2亚型)或来自B株hMPV(例如，B1亚型或B2亚型)。

在某些实施例中，提供了包含“骨架”F0多肽序列的氨基酸序列，示为：

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLE

VGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRrrRF

VLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGN

GVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLN

VVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMV

RRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACL

LREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC

NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQ

LNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPE

DQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTggggsgyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgrslevlfqgpghhhhhhhhsawshpqfek(SEQ ID NO:3)。

在某些实施例中，提供了编码“骨架”F0多肽序列的核苷酸序列，示为：

ATGAGTTGGAAGGTGGTGATTATCTTCTCCCTGCTGATTACACCACAA

CATGGACTGAAAGAGTCCTACTTGGAGGAGTCCTGTAGCACCATCAC

AGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGGACAGGCTGGTACACCAATGTGTT

CACCTTGGAGGTGGGAGATGTGGAGAACCTGACTTGTTCTGATGGAC

CATCCCTGATTAAGACAGAACTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGG

GAACTGAAAACAGTGTCTGCTGACCAACTTGCCAGGGAGGAACAGAT

TGAGAACCCAAGGAGGAGGAGGTTTGTGCTGGGAGCCATTGCCCTGG

GAGTGGCTACAGCAGCAGCAGTGACAGCAGGAGTGGCTATTGCCAAG

ACCATCAGATTGGAGTCTGAGGTGACAGCCATCAAGAATGCCCTGAA

AACCACCAATGAGGCTGTGAGCACCCTGGGCAATGGAGTGAGGGTGC

TGGCTACAGCAGTGAGGGAACTGAAAGACTTTGTGAGCAAGAACCTG

ACCAGGGCTATCAACAAGAACAAGTGTGACATCGATGACCTGAAAAT

GGCTGTGTCCTTCAGCCAGTTCAACAGGAGGTTCCTGAATGTGGTGAG

ACAGTTCTCTGACAATGCTGGCATCACACCTGCCATCTCCCTGGACCT

GATGACAGATGCTGAACTGGCAAGGGCTGTGAGCAATATGCCAACCT

CTGCTGGACAAATCAAACTGATGTTGGAGAACAGGGCTATGGTGAGG

AGGAAGGGCTTTGGCATCCTGATTGGAGTCTATGGCTCCTCTGTGATT

TATATGGTCCAACTTCCAATCTTTGGAGTGATTGACACACCATGTTGG

ATTGTGAAGGCTGCCCCATCCTGTTCTGAGAAGAAGGGCAACTATGCC

TGTCTGCTGAGGGAGGACCAGGGCTGGTATTGTCAGAATGCTGGCAG

CACAGTCTACTACCCAAATGAGAAGGACTGTGAGACCAGGGGAGACC

ATGTGTTCTGTGACACAGCAGCAGGCATCAATGTGGCTGAACAGAGC

AAGGAGTGTAACATCAACATCAGCACCACCAACTACCCATGTAAGGT

GAGCACAGGCAGACACCCAATCAGTATGGTGGCTCTGAGCCCACTGG

GAGCCCTGGTGGCTTGTTACAAGGGAGTGTCCTGTAGCATTGGCAGCA

ACAGGGTGGGCATCATCAAGCAACTTAACAAGGGCTGTTCCTACATC

ACCAACCAGGATGCTGACACAGTGACCATTGACAACACAGTCTACCA

ACTTAGCAAGGTGGAGGGAGAACAGCATGTGATTAAGGGCAGACCTG

TGTCCTCCTCCTTTGACCCAATCAAGTTTCCTGAGGACCAGTTCAATGT

GGCTCTGGACCAGGTGTTTGAGAACATTGAGAACAGCCAGGCTCTGG

TGGACCAGAGCAACAGGATTCTGTCCTCTGCTGAGAAGGGCAACACA

GGAGGAGGAGGCTCTGGCTACATCCCTGAGGCTCCAAGGGATGGACA

AGCCTATGTGAGGAAGGATGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTCC

TGGGCAGGTCCTTGGAGGTGCTGTTCCAGGGACCTGGACACCACCAC

CACCACCACCACCACTCTGCCTGGAGCCACCCACAGTTTGAGAAGTAA(SEQ ID NO:4)

在某些实施例中，hMPV多肽包含如SEQ ID NO:3所示的“骨架”hMPV序列，并且可以任选地含有一个或多个氨基酸取代。例如，在某些实施例中，hMPV多肽包括在SEQ ID NO:3的位置185的缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或脯氨酸取代。在某些实施例中，hMPV多肽包括在SEQ ID NO:3的位置160的苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸取代，和/或在SEQ IDNO:3的位置46的缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或脯氨酸取代。在某些实施例中，hMPV多肽包括在SEQ ID NO:3的位置100和101中的一个或两个的精氨酸取代。

在某些实施例中，hMPV多肽与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在某些实施例中，提供了包括hMPV多肽序列的氨基酸序列，示为：

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLE

VGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRrrRF

VLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGN

GVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIpDLKMAVSFSQFNRRFLN

VVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMV

RRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACL

LREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC

NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQ

LNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPE

DQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTggggsgyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgrslevlfqgpghhhhhhhhsawshpqfek(SEQ ID NO:5)(D185P)。(小写氨基酸表示接头、foldon基序、接头、HRV-3C切割位点、接头、8X-His标签和strep标签II区。)

在某些实施例中，提供了编码hMPV多肽序列的核苷酸序列，示为：

ATGAGTTGGAAGGTGGTGATTATCTTCTCCCTGCTGATT ACACCACAACATGGACTGAAAGAGTCCTACTTGGAGGAGTCCTGTAGCACCATCACAGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGGACAGGCTGGTACACCAATGTGTTCACCTTGGAGGTGGGAGATGTGGAGAACCTGACTTGTTCTGATGGACCATCCCTGATTAAGACAGAACTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGGGAACTGAAAACAGTGTCTGCTGACCAACTTGCCAGGGAGGAACAGATTGAGAACCCAAGGAGGAGGAGGTTTGTGCTGGGAGCCATTGCCCTGGGAGTGGCTACAGCAGCAGCAGTGACAGCAGGAGTGGCTATTGCCAAGACCATCAGATTGGAGTCTGAGGTGACAGCCATCAAGAATGCCCTGAAAACCACCAATGAGGCTGTGAGCACCCTGGGCAATGGAGTGAGGGTGCTGGCTACAGCAGTGAGGGAACTGAAAGACTTTGTGAGCAAGAACCTGACCAGGGCTATCAACAAGAACAAGTGTGACATCCCTGACCTGAAAATGGCTGTGTCCTTCAGCCAGTTCAACAGGAGGTTCCTGAATGTGGTGAGACAGTTCTCTGACAATGCTGGCATCACACCTGCCATCTCCCTGGACCTGATGACAGATGCTGAACTGGCAAGGGCTGTGAGCAATATGCCAACCTCTGCTGGACAAATCAAACTGATGTTGGAGAACAGGGCTATGGTGAGGAGGAAGGGCTTTGGCATCCTGATTGGAGTCTATGGCTCCTCTGTGATTTATATGGTCCAACTTCCAATCTTTGGAGTGATTGACACA CCATGTTGGATTGTGAAGGCTGCCCCATCCTGTTCTGAGAAGAAGGGCAACTATGCCTGTCTGCTGAGGGAGGACCAGGGCTGGTATTGTCAGAATGCTGGCAGCACAGTCTACTACCCAAATGAGAAGGACTGTGAGACCAGGGGAGACCATGTGTTCTGTGACACAGCAGCAGGCATCAATGTGGCTGAACAGAGCAAGGAGTGTAACATCAACATCAGCACCACCAACTACCCATGTAAGGTGAGCACAGGCAGACACCCAATCAGTATGGTGGCTCTGAGCCCACTGGGAGCCCTGGTGGCTTGTTACAAGGGAGTGTCCTGTAGCATTGGCAGCAACAGGGTGGGCATCATCAAGCAACTTAACAAGGGCTGTTCCTACATCACCAACCAGGATGCTGACACAGTGACCATTGACAACACAGTCTACCAACTTAGCAAGGTGGAGGGAGAACAGCATGTGATTAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCTCCTTTGACCCAATCAAGTTTCCTGAGGACCAGTTCAATGTGGCTCTGGACCAGGTGTTTGAGAACATTGAGAACAGCCAGGCTCTGGTGGACCAGAGCAACAGGATTCTGTCCTCTGCTGAGAAGGGCAACACAGGAGGAGGAGGCTCTGGCTACATCCCTGAGGCTCCAAGGGATGGACAAGCCTATGTGAGGAAGGATGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTGGGCAGGTCCTTGGAGGTGCTGTTCCAGGGACCTGGACACCACCACCACCACCACCACCACTCTGCCTGGAGCCACCCACAGTTTGAGAAGTAA(SEQ IDNO:6)(D185P)。

ATGTCTTGGAAAGTCGTCATCATCTTCTCTCTGCTGATCACCCCACAA

CACGGCCTGAAGGAATCTTATCTGGAAGAGTCCTGCTCCACAATCACA

GAGGGCTACCTGAGCGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTT

CACTCTGGAGGTGGGCGACGTGGAGAACCTGACTTGTAGTGACGGCC

CCTCCCTGATCAAGACTGAGCTGGACCTGACAAAGAGTGCACTGAGA

GAACTCAAGACTGTGTCCGCAGACCAGCTGGCCCGCGAGGAGCAGAT

CGAAAATCCTAGACAGTCAAGGTTCGTCCTGGGAGCCATTGCTCTGGG

AGTTGCTACAGCTGCCGCTGTGACCGCAGGGGTGGCTATTGCTAAAAC

CATCAGGCTGGAGTCCGAAGTGACAGCAATCAAGAATGCCCTGAAGA

CCACCAACGAGGCAGTCTCCACACTGGGCAATGGAGTGAGGGTGCTG

GCAACCGCCGTGAGGGAGCTGAAGGACTTCGTGTCCAAGAACCTGAC

CAGGGCTATCAACAAAAACAAGTGCGACATCCCCGATCTGAAGATGG

CAGTTAGCTTTTCCCAGTTTAACCGGAGATTCCTGAATGTGGTTAGAC

AGTTCAGCGACAACGCCGGGATCACCCCAGCTATTTCCCTGGACCTGA

TGACTGATGCCGAGCTGGCACGGGCTGTGTCCAATATGCCCACCAGC

GCTGGGCAGATTAAGCTGATGCTGGAGAATCGGGCAATGGTGAGAAG

GAAGGGGTTTGGCATCCTGATCGGCGTGTACGGGTCCTCCGTGATCTA

CATGGTGCAGCTGCCTATTTTTGGAGTGATTGATACACCCTGCTGGAT

CGTTAAAGCAGCACCCAGCTGCTCCGAGAAGAAGGGCAATTACGCCT

GTCTGCTGCGGGAGGACCAGGGGTGGTACTGCCAGAACGCCGGCTCC

ACAGTGTATTACCCCAATGAAAAGGACTGCGAGACAAGGGGAGACCA

CGTGTTCTGCGACACTGCCGCTGGGATTAATGTGGCCGAGCAGAGCA

AGGAGTGCAACATCAACATTTCCACCACAAACTACCCCTGCAAGGTG

AGCACCGGCAGGCACCCTATCTCCATGGTGGCCCTGTCTCCCCTGGGA

GCTCTGGTGGCTTGCTACAAGGGAGTGAGCTGTAGCATCGGGTCCAAT

AGAGTCGGGATTATCAAGCAGCTGAATAAGGGCTGCAGCTATATTAC

CAACCAGGATGCCGATACTGTGACTATTGACAACACAGTGTATCAGCT

GTCAAAGGTGGAAGGCGAACAGCATGTGATCAAAGGACGGCCCGTCA

GCAGCTCCTTTGACCCTATCAAATTCCCCGAAGACCAGTTTAACGTGG

CACTGGACCAGGTTTTCGAAAATATTGAGAATTCTCAGGCCCTGGTGG

ACCAGTCTAACCGGATCCTCTCCTCCGCCGAGAAGGGAAATACAGGC

TTTATTATCGTGATCATCCTGATCGCAGTGCTGGGATCCAGTATGATC

CTGGTCTCCATTTTCATCATCATTAAGAAGACCAAGAAACCCACTGGC

GCACCACCTGAACTGAGCGGCGTGACTAACAATGGCTTTATCCCTCACAATTGA(SEQ ID NO:17)(D185P mRNA)。

在某些实施例中，hMPV多肽与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多肽包含SEQ ID NO:5。在某些实施例中，hMPV多核苷酸与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多核苷酸包含SEQ ID NO:6。在某些实施例中，hMPV多核苷酸与SEQ ID NO:17具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多核苷酸包含SEQ ID NO:17。

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTvVFTLEV

GDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRrrRFV

LGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNG

VRVLAfAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNV

VRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVR

RKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLL

REDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECN

INISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQL

NKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPED

QFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTggggsgyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgrslevlfqgpghhhhhhhhsawshpqfek(SEQ ID NO:7)(T160F_N46V)。(小写氨基酸表示接头、foldon基序、接头、HRV-3C切割位点、接头、8X-His标签和strep标签II区。)

ATGAGTTGGAAGGTGGTGATTATCTTCTCCCTGCTGATTACACCACAA

CATGGACTGAAAGAGTCCTACTTGGAGGAGTCCTGTAGCACCATCAC

AGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGGACAGGCTGGTACACAGTGGTGT

TCACCTTGGAGGTGGGAGATGTGGAGAACCTGACTTGTTCTGATGGAC

CATCCCTGATTAAGACAGAACTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGG

GAACTGAAAACAGTGTCTGCTGACCAACTTGCCAGGGAGGAACAGAT

TGAGAACCCAAGGAGGAGGAGGTTTGTGCTGGGAGCCATTGCCCTGG

GAGTGGCTACAGCAGCAGCAGTGACAGCAGGAGTGGCTATTGCCAAG

ACCATCAGATTGGAGTCTGAGGTGACAGCCATCAAGAATGCCCTGAA

AACCACCAATGAGGCTGTGAGCACCCTGGGCAATGGAGTGAGGGTGC

TGGCTTTTGCTGTGAGGGAACTGAAAGACTTTGTGAGCAAGAACCTG

ACCAGGGCTATCAACAAGAACAAGTGTGACATTGATGACCTGAAAAT

GGCTGTGTCCTTCAGCCAGTTCAACAGGAGGTTCCTGAATGTGGTGAG

ACAGTTCTCTGACAATGCTGGCATCACACCTGCCATCTCCCTGGACCT

GATGACAGATGCTGAACTGGCAAGGGCTGTGAGCAATATGCCAACCT

CTGCTGGACAAATCAAACTGATGTTGGAGAACAGGGCTATGGTGAGG

AGGAAGGGCTTTGGCATCCTGATTGGAGTCTATGGCTCCTCTGTGATT

TATATGGTCCAACTTCCAATCTTTGGAGTGATTGACACACCATGTTGG

ATTGTGAAGGCTGCCCCATCCTGTTCTGAGAAGAAGGGCAACTATGCC

TGTCTGCTGAGGGAGGACCAGGGCTGGTATTGTCAGAATGCTGGCAG

CACAGTCTACTACCCAAATGAGAAGGACTGTGAGACCAGGGGAGACC

ATGTGTTCTGTGACACAGCAGCAGGCATCAATGTGGCTGAACAGAGC

AAGGAGTGTAACATCAACATCAGCACCACCAACTACCCATGTAAGGT

GAGCACAGGCAGACACCCAATCAGTATGGTGGCTCTGAGCCCACTGG

GAGCCCTGGTGGCTTGTTACAAGGGAGTGTCCTGTAGCATTGGCAGCA

ACAGGGTGGGCATCATCAAGCAACTTAACAAGGGCTGTTCCTACATC

ACCAACCAGGATGCTGACACAGTGACCATTGACAACACAGTCTACCA

ACTTAGCAAGGTGGAGGGAGAACAGCATGTGATTAAGGGCAGACCTG

TGTCCTCCTCCTTTGACCCAATCAAGTTTCCTGAGGACCAGTTCAATGT

GGCTCTGGACCAGGTGTTTGAGAACATTGAGAACAGCCAGGCTCTGG

TGGACCAGAGCAACAGGATTCTGTCCTCTGCTGAGAAGGGCAACACA

GGAGGAGGAGGCTCTGGCTACATCCCTGAGGCTCCAAGGGATGGACA

AGCCTATGTGAGGAAGGATGGAGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTCC

TGGGCAGGTCCTTGGAGGTGCTGTTCCAGGGACCTGGACACCACCAC

CACCACCACCACCACTCTGCCTGGAGCCACCCACAGTTTGAGAAGTAA(SEQ ID NO:8)(T160F_N46V)。

ATGAGCTGGAAGGTTGTGATTATTTTCTCTCTGCTGATTACTCCACAG

CACGGCCTGAAGGAGTCCTACCTGGAGGAGTCCTGTTCTACTATCACT

GAGGGGTATCTCTCTGTGCTGCGGACAGGGTGGTATACAGTGGTGTTC

ACCCTGGAGGTTGGCGATGTGGAGAATCTGACTTGCAGCGATGGCCC

TTCTCTGATCAAGACCGAGCTGGATCTGACAAAAAGCGCCCTCAGAG

AACTGAAAACCGTGTCCGCCGATCAGCTGGCAAGGGAGGAGCAGATC

GAGAACCCACGGCAGAGCAGGTTTGTGCTGGGCGCTATCGCTCTGGG

CGTGGCCACTGCAGCTGCTGTCACTGCAGGGGTCGCAATCGCTAAGA

CTATCAGACTGGAATCCGAGGTGACCGCCATTAAGAATGCCCTGAAG

ACTACCAACGAGGCTGTGTCCACTCTGGGAAACGGAGTGAGGGTCCT

GGCCTTCGCAGTGAGGGAGCTGAAGGATTTTGTGTCAAAGAACCTTA

CACGGGCCATCAACAAGAATAAGTGCGATATCGATGACCTGAAGATG

GCCGTGTCCTTCTCCCAGTTCAACCGGCGCTTTCTGAATGTGGTGCGC

CAGTTTTCCGACAACGCTGGAATCACCCCTGCTATCAGCCTGGACCTC

ATGACCGACGCCGAACTCGCAAGGGCCGTTTCTAACATGCCTACATCC

GCTGGACAGATTAAGCTGATGCTGGAGAATAGAGCAATGGTGAGGAG

AAAGGGATTCGGCATCCTGATTGGCGTGTACGGATCTAGCGTGATCTA

CATGGTGCAGCTGCCGATCTTCGGCGTGATCGATACTCCTTGTTGGAT

CGTCAAGGCCGCCCCTTCCTGCTCCGAGAAGAAGGGCAATTACGCTTG

TCTGCTGCGGGAGGACCAGGGCTGGTATTGCCAGAACGCCGGGTCTA

CAGTGTACTATCCTAACGAGAAGGATTGCGAGACCAGAGGCGACCAC

GTTTTCTGTGATACAGCCGCCGGAATCAATGTCGCAGAGCAGTCTAAG

GAGTGCAACATCAATATCTCTACAACCAATTACCCATGTAAGGTGAGC

ACTGGACGGCACCCTATCAGTATGGTGGCTCTGAGCCCACTGGGGGC

ACTGGTGGCTTGCTACAAGGGGGTGAGCTGCAGTATCGGCAGTAACA

GAGTGGGCATTATCAAGCAGCTGAACAAAGGGTGCTCTTATATTACA

AACCAGGATGCAGATACTGTGACCATCGACAACACTGTGTACCAGCT

GTCCAAGGTGGAGGGGGAGCAGCATGTGATCAAAGGGAGACCCGTCT

CTTCTTCTTTCGATCCCATCAAGTTCCCTGAAGACCAGTTCAATGTTGC

CCTGGACCAGGTTTTCGAGAACATCGAAAATAGCCAGGCCTTGGTCG

ATCAATCCAACAGGATCCTGAGCAGCGCAGAGAAAGGGAACACTGGC

TTCATCATCGTGATCATTCTGATCGCCGTGCTGGGGAGCAGTATGATT

CTGGTGTCCATTTTCATCATCATCAAGAAGACCAAGAAGCCTACAGGA

GCACCCCCTGAGCTGAGCGGAGTGACCAACAACGGCTTTATCCCTCACAACTGA(SEQ ID NO:18)(T160F_N46V)。

ATGAGCTGGAAGGTTGTGATTATTTTCTCTCTGCTGATTACTCCACAG

CACGGCCTGAAGGAGTCCTACCTGGAGGAGTCCTGTTCTACTATCACT

GAGGGGTATCTCTCTGTGCTGCGGACAGGGTGGTATACAGTGGTGTTC

ACCCTGGAGGTTGGCGATGTGGAGAATCTGACTTGCAGCGATGGCCC

TTCTCTGATCAAGACCGAGCTGGATCTGACAAAAAGCGCCCTCAGAG

AACTGAAAACCGTGTCCGCCGATCAGCTGGCAAGGGAGGAGCAGATC

GAGAACCCACGGCAGAGCAGGTTTGTGCTGGGCGCTATCGCTCTGGG

CGTGGCCACTGCAGCTGCTGTCACTGCAGGGGTCGCAATCGCTAAGA

CTATCAGACTGGAATCCGAGGTGACCGCCATTAAGAATGCCCTGAAG

ACTACCAACGAGGCTGTGTCCACTCTGGGAAACGGAGTGAGGGTCCT

GGCCTTCGCAGTGAGGGAGCTGAAGGATTTTGTGTCAAAGAACCTTA

CACGGGCCATCAACAAGAATAAGTGCGATATCGATGACCTGAAGATG

GCCGTGTCCTTCTCCCAGTTCAACCGGCGCTTTCTGAATGTGGTGCGC

CAGTTTTCCGACAACGCTGGAATCACCCCTGCTATCAGCCTGGACCTC

ATGACCGACGCCGAACTCGCAAGGGCCGTTTCTAACATGCCTACATCC

GCTGGACAGATTAAGCTGATGCTGGAGAATAGAGCAATGGTGAGGAG

AAAGGGATTCGGCATCCTGATTGGCGTGTACGGATCTAGCGTGATCTA

CATGGTGCAGCTGCCGATCTTCGGCGTGATCGATACTCCTTGTTGGAT

CGTCAAGGCCGCCCCTTCCTGCTCCGAGAAGAAGGGCAATTACGCTTG

TCTGCTGCGGGAGGACCAGGGCTGGTATTGCCAGAACGCCGGGTCTA

CAGTGTACTATCCTAACGAGAAGGATTGCGAGACCAGAGGCGACCAC

GTTTTCTGTGATACAGCCGCCGGAATCAATGTCGCAGAGCAGTCTAAG

GAGTGCAACATCAATATCTCTACAACCAATTACCCATGTAAGGTGAGC

ACTGGACGGCACCCTATCAGTATGGTGGCTCTGAGCCCACTGGGGGC

ACTGGTGGCTTGCTACAAGGGGGTGAGCTGCAGTATCGGCAGTAACA

GAGTGGGCATTATCAAGCAGCTGAACAAAGGGTGCTCTTATATTACA

AACCAGGATGCAGATACTGTGACCATCGACAACACTGTGTACCAGCT

GTCCAAGGTGGAGGGGGAGCAGCATGTGATCAAAGGGAGACCCGTCT

CTTCTTCTTTCGATCCCATCAAGTTCCCTGAAGACCAGTTCAATGTTGC

CCTGGACCAGGTTTTCGAGAACATCGAAAATAGCCAGGCCTTGGTCG

ATCAATCCAACAGGATCCTGAGCAGCGCAGAGAAAGGGAACACTGGC

TTCATCATCGTGATCATTCTGATCGCCGTGCTGGGGAGCAGTATGATT

CTGGTGTCCATTTTCATCATCATCAAGAAGACCAAGAAGCCTACAGGA

GCACCCCCTGAGCTGAGCGGAGTGACCAACAACGGCTTTATCCCTCACAACTAA(SEQ ID NO:19)(T160F_N46V)。

在某些实施例中，hMPV多肽与SEQ ID NO:7具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多肽包含SEQ ID NO:7。在某些实施例中，hMPV多核苷酸与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多核苷酸包含SEQ ID NO:8。在某些实施例中，hMPV多核苷酸与SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多核苷酸包含SEQ ID NO:18。在某些实施例中，hMPV多核苷酸与SEQ IDNO:8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多核苷酸包含SEQ ID NO:8。在某些实施例中，hMPV多核苷酸与SEQ ID NO:19具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，hMPV多核苷酸包含SEQ ID NO:19。

通常，本文所述的构建体中的位置可以通过成对比对映射到参考序列(例如，SEQID NO:1的野生型序列或SEQ ID NO:3的骨架序列)上，例如，使用用标准参数(EBLOSUM62矩阵，空位罚分10，空位延伸罚分0.5)的Needleman-Wunsch算法来进行。

III.重组hMPV F多肽抗原

在某些实施例中，本披露的hMPV疫苗可以包含至少一种hMPV F多肽抗原。本披露的hMPV F多肽抗原可以通过多种方法制备。在一个实施例中，使用可能是真核或原核来源的宿主细胞系来表达hMPV F多肽。在一个实施例中，用于表达hMPV F多肽的宿主细胞系是细菌来源的。在一个实施例中，用于表达hMPV F多肽的宿主细胞系是哺乳动物来源的。可以确定最适合在其中表达所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、CHO(中国仓鼠卵巢)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系典型地可从商业服务、美国组织培养物保藏中心(ATCC)或从公开的文献获得。

在某些实施例中，杆状病毒细胞可以用于表达本文所述的hMPV F多肽抗原。例如，杆状病毒苜蓿尺蠖(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)可以用于表达hMPVF多肽。

可以通过杆状病毒DNA与含有目的hMPV F序列的嵌合质粒之间的同源重组来构建重组杆状病毒，以表达hMPV F多肽。重组病毒可通过其不同的噬斑形态和噬斑纯化至同质来检测。

重组hMPV F多肽可以在细胞中产生，这些细胞包括但不限于源自鳞翅目物种草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞。其他可以被杆状病毒感染的合适的昆虫细胞(如来自物种家蚕(Bombyx mori)、大蜡螟(Galleria mellanoma)、粉纹夜蛾(Trichplusia ni)或舞毒蛾(Lamanthria dispar)的那些细胞)也可以用作合适的底物以产生重组hMPV F多肽。

重组hMPV F多肽还可以在其他表达载体，如昆虫痘病毒(昆虫的痘病毒)、质型多角体病毒(CPV)以及具有重组hMPV F基因组成型表达的昆虫细胞转化体中表达。

重组蛋白的杆状病毒表达进一步描述于美国专利号US 5,762,919中，该专利出于所有目的通过引用以其全文并入本文。

在某些实施例中，藻细胞(例如，微藻细胞)可以用于表达如本文所述的重组hMPVF多肽抗原。在一些实施例中，微藻宿主细胞是不等鞭毛生物(heterokont/stramenopile)。在一些实施例中，微藻宿主细胞是网粘菌门(Labyrinthulomycota)的成员。在一些实施例中，网粘菌门宿主细胞是破囊壶菌目(Thraustochytriales)或网粘菌目(Labyrinthulales)的成员。

用于在微藻宿主细胞中表达hMPV多肽抗原的表达系统包含在微藻细胞中活跃的调节控制元件。在一些实施例中，表达系统包含在网粘菌门细胞中活跃的调节控制元件。在一些实施例中，表达系统包含在破囊壶菌中活跃的调节控制元件。在一些实施例中，表达系统包含在裂殖壶菌属或破囊壶菌属中活跃的调节控制元件。包括各种启动子的许多调节控制元件在许多不同物种中活跃。因此，调节序列可以在与分离出它们的细胞相同的细胞类型中使用，或者可以在与分离出它们的细胞不同的细胞类型中使用。

在一些实施例中，用于在微藻细胞中产生hMPV F多肽的表达系统包含源自网粘菌门序列的调控元件。在一些实施例中，用于在微藻细胞中产生hMPV F多肽的表达系统包含源自非网粘菌门序列(包含源自非网粘菌门藻类序列的序列)的调控元件。在一些实施例中，表达系统包含编码hMPV F多肽的多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列与在微藻宿主细胞中起作用的任何启动子序列、任何终止子序列和/或任何其他调节序列相连。可以使用诱导型或组成型活性序列。在某些实施例中，提供了用于在微藻宿主细胞中表达hMPV F多肽的表达盒以及包含该表达盒的藻细胞。

重组蛋白的微藻表达进一步描述于国际公开号WO 2011/082189和WO 2011/090731中，出于所有目的通过引用以其全文并入本文。

在某些实施例中，CHO细胞可以用于表达本文所述的hMPV F多肽。在某些实施例中，提供了包含表达hMPV F的载体的CHO细胞系。在某些实施例中，将所述CHO细胞系用所述载体转染(稳定转染或瞬时转染)。在某些实施例中，所述CHO细胞系包含整合于其基因组中的所述载体。CHO细胞系通常用于工业蛋白质生产，并且许多CHO细胞系是已知的并且是可商购的(例如，从ATCC)。例如，这样的CHO细胞系包括，例如，CHO-K1细胞系(ATCC编号：CCL-61)、CHO DP-12细胞系(ATCC编号CRL-12444和12445)和CHO 1-15细胞系(ATCC编号CRL-9606)。

体外生产允许扩大规模以产生大量的所需多肽。用于组织培养条件下的细胞培养的技术是本领域已知的，并且包括同质悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或固定化或包埋式细胞培养(例如，在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷盒上)。如果必要和/或需要的话，可以使用常规色谱法(例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素色谱法和/或(免疫)亲和色谱法)纯化多肽的溶液。

IV.RNA

在某些实施例中，本披露的hMPV疫苗可以包含至少一种核糖核酸(RNA)，该RNA包含编码hMPV F多肽抗原的ORF。在某些实施例中，RNA是信使RNA(mRNA)，该mRNA包含编码hMPV F蛋白抗原的ORF。在某些实施例中，RNA(例如，mRNA)进一步包含至少一个5’UTR、3’UTR、聚(A)尾和/或5’帽。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原示为：MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIpDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSIFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN(SEQ ID NO:9)(A2-D185P)。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原由如(SEQ ID NO:6)所示的mRNA ORF(A2-D185PmRNA ORF)编码。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原由如(SEQ ID NO:17)所示的经密码子优化的mRNA ORF(AD185P mRNA ORF)编码。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原示为：

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTG WYTvVFTLEVGDVENLTCSDGPSLIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLAfAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQFNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSIFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN(SEQ ID NO:11)(A2-T160F_N46V)。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原由如(SEQ ID NO:8)所示的mRNA ORF(A2-T160F_N46V mRNA ORF)编码。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原由如(SEQ ID NO:18)所示的经密码子优化的mRNA ORF(T160F_N46V mRNA ORF)编码。

在某些实施例中，hMPV F蛋白抗原由如(SEQ ID NO:19)所示的经密码子优化的mRNA ORF(T160F_N46V mRNA ORF)编码。

II.A.5’帽

mRNA 5’帽可以提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性，并且促进翻译效率。已知几种类型的5’帽。7-甲基鸟苷帽(也称为“m⁷G”或“帽-0”)包含通过5'-5'-三磷酸键与第一转录核苷酸连接的鸟苷。

典型地如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸中除去一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后，经由鸟苷酰基转移酶向末端磷酸中添加鸟苷三磷酸(GTP)，产生5‘5‘5三磷酸键联；然后，通过甲基转移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的实例包括但不限于，m7G(5')ppp、(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。另外的帽结构描述于美国公开号US 2016/0032356和美国公开号US2018/0125989中，将其通过引用并入本文。

多核苷酸的5’加帽可以根据制造商的方案使用以下化学RNA帽类似物在体外转录反应期间伴随完成，以产生5’-鸟苷帽结构：3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G(ARCA帽)；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG；m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pU；和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(新英格兰生物实验室(NewEngland BioLabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇；TriLink生物技术公司(TriLinkBiotechnologies))。经修饰的RNA的5'-加帽可以在转录后使用牛痘病毒加帽酶完成，以产生帽0结构：m7G(5')ppp(5')G。可以使用牛痘病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶两者产生帽1结构，以产生：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。可以从帽1结构产生帽2结构，然后使用2’-O甲基-转移酶对5’倒数第三个核苷酸进行2’-O-甲基化。可以从帽2结构产生帽3结构，然后使用2’-O甲基-转移酶对5’倒数第四个核苷酸进行2’-O-甲基化。

在某些实施例中，本披露的mRNA包含选自由以下组成的组的5’帽：3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G(ARCA帽)、G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pU和m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG。

在某些实施例中，本披露的mRNA包含5’帽：

II.B.非翻译区(UTR)

在一些实施例中，本披露的mRNA包括5’和/或3’非翻译区(UTR)。在mRNA中，5’UTR在转录起始位点处开始并且继续到起始密码子，但是不包括起始密码子。3’UTR紧接终止密码子之后开始并且继续直到转录终止信号。

在一些实施例中，本文披露的mRNA可以包含5’UTR，其包含影响mRNA的稳定性或翻译的一种或多种元件。在一些实施例中，5’UTR可以具有约10至5,000个核苷酸的长度。在一些实施例中，5’UTR可以具有约50至500个核苷酸的长度。在一些实施例中，5'UTR具有至少约10个核苷酸的长度、约20个核苷酸的长度、约30个核苷酸的长度、约40个核苷酸的长度、约50个核苷酸的长度、约100个核苷酸的长度、约150个核苷酸的长度、约200个核苷酸的长度、约250个核苷酸的长度、约300个核苷酸的长度、约350个核苷酸的长度、约400个核苷酸的长度、约450个核苷酸的长度、约500个核苷酸的长度、约550个核苷酸的长度、约600个核苷酸的长度、约650个核苷酸的长度、约700个核苷酸的长度、约750个核苷酸的长度、约800个核苷酸的长度、约850个核苷酸的长度、约900个核苷酸的长度、约950个核苷酸的长度、约1,000个核苷酸的长度、约1,500个核苷酸的长度、约2,000个核苷酸的长度、约2,500个核苷酸的长度、约3,000个核苷酸的长度、约3,500个核苷酸的长度、约4,000个核苷酸的长度、约4,500个核苷酸的长度或约5,000个核苷酸的长度。

在一些实施例中，本文披露的mRNA可以包含3’UTR，其包含以下中的一种或多种：聚腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的位置的稳定性的蛋白质的结合位点或miRNA的一个或多个结合位点。在一些实施例中，3’UTR可以具有50至5,000个核苷酸或更长的长度。在一些实施例中，3’UTR可以具有50至1,000个核苷酸或更长的长度。在一些实施例中，3’UTR具有至少约50个核苷酸的长度、约100个核苷酸的长度、约150个核苷酸的长度、约200个核苷酸的长度、约250个核苷酸的长度、约300个核苷酸的长度、约350个核苷酸的长度、约400个核苷酸的长度、约450个核苷酸的长度、约500个核苷酸的长度、约550个核苷酸的长度、约600个核苷酸的长度、约650个核苷酸的长度、约700个核苷酸的长度、约750个核苷酸的长度、约800个核苷酸的长度、约850个核苷酸的长度、约900个核苷酸的长度、约950个核苷酸的长度、约1,000个核苷酸的长度、约1,500个核苷酸的长度、约2,000个核苷酸的长度、约2,500个核苷酸的长度、约3,000个核苷酸的长度、约3,500个核苷酸的长度、约4,000个核苷酸的长度、约4,500个核苷酸的长度或约5,000个核苷酸的长度。

在一些实施例中，本文披露的mRNA可以包含5’或3’UTR，其源自与由mRNA转录物编码的基因不同的基因(即，UTR是异源UTR)。

在某些实施例中，5’和/或3’UTR序列可以源自稳定的mRNA(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加mRNA的稳定性。例如，5’UTR序列可以包括部分序列的CMV即早期1(IE1)基因或其片段，以改善mRNA的核酸酶抗性和/或改善mRNA的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hGH)的序列或其片段包括到mRNA的3’端或非翻译区。通常，相对于其未经修饰的对应物，这些修饰可以改善mRNA的稳定性和/或药代动力学特性(例如，半衰期)，并且包括例如为改善mRNA对体内核酸酶消化的这种抗性而进行的修饰。

示例性5'UTR包括源自CMV立即早期1(IE1)基因的序列(美国公开号2014/0206753和2015/0157565，其各自通过引用并入本文)或序列GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:16)(美国公开号2016/0151409，出于所有目的通过引用以其全文并入本文)。

在各种实施例中，5’UTR可以源自TOP基因的5’UTR。TOP基因的特征典型地在于5’-末端寡嘧啶(TOP)束的存在。此外，大多数TOP基因的特征在于生长相关的翻译调节。然而，具有组织特异性翻译调节的TOP基因也是已知的。在某些实施例中，源自TOP基因的5’UTR的5’UTR缺乏5’TOP基序(寡嘧啶束)(例如，美国公开号2017/0029847、2016/0304883、2016/0235864和2016/0166710，其各自通过引用并入本文)。

在某些实施例中，5’UTR源自核糖体蛋白大32(L32)基因(美国公开号2017/0029847，同上)。

在某些实施例中，5’UTR源自羟基类固醇(17-b)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5’UTR(美国公开号2016/0166710，同上)。

在某些实施例中，5’UTR源自ATP5A1基因的5’UTR(美国公开号2016/0166710，同上)。

在一些实施例中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5’UTR。

在一些实施例中，5'UTR包含SEQ ID NO:13所示的核酸序列：GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG。在一些实施例中，3'UTR包含SEQID NO:14所示的核酸序列：CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC。5'UTR和3'UTR进一步详细描述于国际公开号WO 2012/075040(通过引用并入本文)中。

II.C.聚腺苷酸化尾

如本文所用，术语“聚(A)序列”、“聚(A)尾”和“聚(A)区”是指mRNA分子的3’端处的腺苷核苷酸序列。聚(A)尾可以为mRNA赋予稳定性，并且保护其免于外切核酸酶降解。聚(A)尾可以增强翻译。在一些实施例中，聚(A)尾实质上是同聚物的。例如，100个腺苷核苷酸的聚(A)尾实质上可以具有100个核苷酸的长度。在某些实施例中，聚(A)尾可以被与腺苷核苷酸不同的至少一个核苷酸(例如，不是腺苷核苷酸的核苷酸)中断。例如，100个腺苷核苷酸的聚(A)尾可以具有超过100个核苷酸的长度(包括100个腺苷核苷酸和与腺苷核苷酸不同的至少一个核苷酸或一段核苷酸)。在某些实施例中，聚(A)尾包含序列AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:15)。

如本文所用，“聚(A)尾”典型地涉及RNA。然而，在本披露的上下文中，该术语同样涉及DNA分子中的相应序列(例如，“多(T)序列”)。

聚(A)尾可以包含约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸或约40至约150个腺苷核苷酸。聚(A)尾的长度可以是至少约10、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个腺苷核苷酸。

在核酸是RNA的一些实施例中，在RNA体外转录期间从DNA模板获得核酸的聚(A)尾。在某些实施例中，通过常用的化学合成方法在体外获得聚(A)尾，而无需从DNA模板转录。在各种实施例中，聚(A)尾使用可商购的聚腺苷酸化试剂盒和相应的方案通过RNA的酶促聚腺苷酸化(在RNA体外转录后)产生，或者可替代地，通过使用固定化的聚(A)聚合酶来产生，例如使用如国际公开号WO 2016/174271中所述的方法产生。

核酸可以包含通过酶促聚腺苷酸化获得的聚(A)尾，其中大部分核酸分子包含约100(+/-20)至约500(+/-50)或约250(+/-20)个腺苷核苷酸。

在一些实施例中，核酸可以包含源自模板DNA的聚(A)尾，并且可以另外包含通过酶促聚腺苷酸化产生的至少一个另外的聚(A)尾，例如如国际公开号WO 2016/091391中所述。

在某些实施例中，核酸包含至少一个聚腺苷酸化信号。

在各种实施例中，核酸可以包含至少一个多(C)序列。

如本文所用，术语“多(C)序列”旨在是多达约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸序列。在一些实施例中，多(C)序列包含约10至约200个胞嘧啶核苷酸、约10至约100个胞嘧啶核苷酸、约20至约70个胞嘧啶核苷酸、约20至约60个胞嘧啶核苷酸或约10至约40个胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，多(C)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。

II.D.化学修饰

本文披露的mRNA可以是经修饰的或未经修饰的。在一些实施例中，mRNA可以包含至少一个化学修饰。在一些实施例中，本文披露的mRNA可以含有一个或多个典型地增强RNA稳定性的修饰。示例性修饰可以包括骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施例中，所披露的mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)(包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)))合成。在某些实施例中，所披露的mRNA可以由嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物合成，该类似物或衍生物例如像1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5’-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基-辫苷、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。

在一些实施例中，所披露的mRNA可以包含至少一个化学修饰，包括但不限于假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。

在一些实施例中，化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。

在一些实施例中，化学修饰包含N1-甲基假尿苷。

在一些实施例中，mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

在一些实施例中，ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

这样的类似物的制备描述于例如，美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和美国专利号5,700,642中。

II.E.mRNA合成

本文披露的mRNA可以根据多种方法中的任一种合成。例如，根据本披露的mRNA可以经由体外转录(IVT)合成。一些用于体外转录的方法描述在例如Geall等人(2013)Semin.Immunol.[免疫学论文集]25(2):152-159；Brunelle等人(2013)Methods Enzymol.[酶学方法]530:101-14中。简而言的，典型地用以下进行IVT：含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷三磷酸库、可以包括DTT和镁离子的缓冲系统、适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切的条件可以根据特别应用而变化。这些试剂的存在通常在最终mRNA产物中是不希望的，并且这些试剂可以被认为是可以纯化或除去的杂质或污染物，以提供适用于治疗用途的无污染的和/或同质的mRNA。虽然在一些实施例中可能需要从体外转录反应提供的mRNA，但根据本披露可以使用其他来源的mRNA，包括由细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。

V.脂质纳米颗粒(LNP)

本披露的LNP可以包含四类脂质：(i)可电离脂质(例如，阳离子脂质)；(ii)PEG化脂质；(iii)基于胆固醇的脂质(例如，胆固醇)；和(iv)辅助脂质。

A.阳离子脂质

可电离脂质促进mRNA包封，并且可以是阳离子脂质。阳离子脂质在低pH下提供带正电荷的环境，以促进带负电荷的mRNA药物物质的有效包封。示例性阳离子脂质示出在下表1中。

表1-可电离脂质

阳离子脂质可以选自[ckkE10]/[OF-02]、[(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基]4-(二甲基氨基)丁酸酯(D-Lin-MC3-DMA)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLin-DMA)；二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸9-十七烷基酯(SM-102)；[(4-羟丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；[3-(二甲基氨基)-2-[(Z)-十八碳-9-烯酰基]氧基丙基](Z)-十八碳-9-烯酸酯(DODAP)；2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-[2-[二(十七烷基)氨基]-2-氧代乙基]戊酰胺(DOGS)；[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚烷-2-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]N-[2-(二甲基氨基)乙基]氨基甲酸酯(DC-Chol)；四(8-甲基壬基)3,3’,3”,3”’-(((甲基氮烷二基)双(丙烷-3,1二基))双(氮烷三基))四丙酸酯(306Oi10)；(2-(二辛基铵基)乙基)磷酸癸酯(9A1P9)；5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氢-1H-咪唑-2-甲酸乙酯(A2-Iso5-2DC18)；双(2-(十二烷基二硫烷基)乙基)3,3’-((3-甲基-9-氧代-10-氧杂-13,14-二噻-3,6-二氮杂二十六基)氮烷二基)二丙酸酯(BAME-O16B)；1,1’-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)；3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮(cKK-E12)；六(辛烷-3-基)9,9′,9″,9″′,9″″,9″′″-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮烷二基))三(丙烷-3,1-二基))三(氮烷三基))六壬酸酯(FTT5)；(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9″′Z,12Z,12′Z,12″Z,12″′Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)；TT3；N¹,N³,N⁵-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；8-((2-羟乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质5)；以及其组合。

在某些实施例中，阳离子脂质是可生物降解的。

在各种实施例中，阳离子脂质不是可生物降解的。

在一些实施例中，阳离子脂质是可切割的。

在某些实施例中，阳离子脂质不是可切割的。

阳离子脂质进一步详细描述在Dong等人(PNAS.[美国国家科学院院刊]111(11):3955-60.2014)；Fenton等人(Adv Mater.[先进材料]28:2939.2016)；美国专利9,512,073；和美国专利号10,201,618，其各自通过引用并入本文。

B.PEG化脂质

PEG化的脂质组分提供了对纳米颗粒的粒度和稳定性的控制。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且提供用于增加脂质-核酸药物组合物的循环寿命并且增加其向靶组织的递送的手段(Klibanov等人FEBS Letters[FEBS通讯]268(1):235-7.1990)。可以选择这些组分以在体内快速交换出药物组合物(参见例如，美国专利号5,885,613)。

所考虑的PEG化脂质包括但不限于长度长达5kDa的聚乙二醇(PEG)链，其共价连接至具有C₆-C₂₀(例如，C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₄、C₁₆或C₁₈)长度的一条或多条烷基链的脂质，如衍生化神经酰胺(例如，N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)](C8 PEG神经酰胺))。在一些实施例中，PEG化脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DLPE-PEG)；或1,2-二硬脂酰基-外消旋-甘油-聚乙二醇(DSG-PEG)；PEG-DAG；PEG-PE；PEG-S-DAG；PEG-S-DMG；PEG-cer；PEG-二烷氧基丙基氨基甲酸酯；2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)；以及其组合。

在某些实施例中，PEG具有高分子量，例如2000-2400g/mol。在某些实施例中，PEG是PEG2000(或PEG-2K)。在某些实施例中，本文的PEG化脂质是DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DLPE-PEG2000、DSG-PEG2000、C8 PEG2000、或ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)。在某些实施例中，本文的PEG化脂质是DMG-PEG2000。

C.基于胆固醇的脂质

胆固醇组分为纳米颗粒内的脂质双层结构提供了稳定性。在一些实施例中，LNP包含一种或多种基于胆固醇的脂质。合适的基于胆固醇的脂质包括例如：DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰氨基胆固醇)、l,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人，BiochemBiophys Res Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯](1991)179:280；Wolf等人，BioTechniques[生物技术](1997)23:139；美国专利5,744,335)、咪唑胆固醇酯(“ICE”；国际公开号WO 2011/068810)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、β-谷甾醇、谷甾烷醇(sitostanol)、岩藻甾醇、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、麦角甾醇；链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)；羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)；7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)；二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)；酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)；胆甾烯醇(lathosterol)(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)；薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)；菜油甾醇(campesterol)(菜油甾-5-烯-3β-醇)；菜油甾烷醇(campestanol)(5a-菜油甾烷-3b-醇)；24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-甲基烯-3β-醇)；十七烷酸胆甾醇酯(cholesteryl margarate)(十七烷酸胆甾-5-烯-3β-基酯)；油酸胆甾醇酯；硬脂酸胆甾醇酯和胆固醇的其他修饰形式。在一些实施例中，在LNP中使用的基于胆固醇的脂质是胆固醇。

D.辅助脂质

辅助脂质增强了LNP的结构稳定性，并且说明LNP在内体中逃逸。它改善了mRNA药物有效载荷的摄取和释放。在一些实施例中，辅助脂质是两性离子脂质，其具有用于增强药物有效载荷的摄取和释放的促融合特性。辅助脂质的实例是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DEPE)；以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPOC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、DMPC、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DLPC)、1,2-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DLPE)。

其他示例性辅助脂质是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、鞘磷脂、神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其组合。在某些实施例中，辅助脂质是DOPE。在某些实施例中，辅助脂质是DSPC。

在各种实施例中，本发明的LNP包含(i)选自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10或GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14的阳离子脂质；(ii)DMG-PEG2000；(iii)胆固醇；和(iv)DOPE。

E.脂质组分的摩尔比

上述组分的摩尔比对于LNP在递送mRNA中的有效性是重要的。阳离子脂质、PEG化脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质的摩尔比是A：B：C：D，其中A+B+C+D＝100％。在一些实施例中，在LNP中阳离子脂质相对于总脂质的摩尔比(即，A)是35％-55％，如35％-50％(例如，38％-42％，如40％或45％-50％)。在一些实施例中，PEG化的脂质组分相对于总脂质的摩尔比(即，B)是0.25％-2.75％(例如，1％-2％，如1.5％)。在一些实施例中，基于胆固醇的脂质相对于总脂质的摩尔比(即，C)是20％-50％(例如，27％-30％，如28.5％或38％-43％)。在一些实施例中，辅助脂质相对于总脂质的摩尔比(即，D)是5％-35％(例如，28％-32％，如30％或8％-12％，如10％)。在一些实施例中，(PEG化的脂质+胆固醇)组分具有与辅助脂质相同的摩尔量。在一些实施例中，LNP所含有的阳离子脂质与辅助脂质的摩尔比大于1。

在某些实施例中，本披露的LNP包含：

摩尔比为35％至55％或40％至50％的阳离子脂质(例如，摩尔比为35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％或55％的阳离子脂质)；

摩尔比为0.25％至2.75％或1.00％至2.00％的聚乙二醇(PEG)缀合(PEG化的)脂质(例如，摩尔比为0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％、1.50％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％或2.75％的PEG化脂质)；

摩尔比为20％至50％、25％至45％或28.5％至43％的基于胆固醇的脂质(例如，摩尔比为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的基于胆固醇的脂质)；和

摩尔比为5％至35％、8％至30％或10％至30％的辅助脂质(例如，摩尔比为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的辅助脂质)，

其中所有摩尔比均相对于该LNP的总脂质含量。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的阳离子脂质；摩尔比为1.5％的PEG化的脂质；摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质；和摩尔比为30％的辅助脂质。

在某些实施例中，PEG化脂质是二肉豆蔻酰基-PEG2000(DMG-PEG2000)。

在各种实施例中，基于胆固醇的脂质是胆固醇。

在一些实施例中，辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的OF-02；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的cKK-E10；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的SM-102；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DSPC。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为35％至55％的ALC-0315；摩尔比为0.25％至2.75％的ALC-0159；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DSPC。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的OF-02；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的cKK-E10；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为50％的8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸9-十七烷基酯(SM-102)；摩尔比为10％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)；摩尔比为38.5％的胆固醇；和摩尔比为1.5％的1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为46.3％的(4-羟丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；摩尔比为9.4％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)；摩尔比为42.7％的胆固醇；和摩尔比为1.6％的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

在某些实施例中，LNP包含：摩尔比为47.4％的(4-羟丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；摩尔比为10％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)；摩尔比为40.9％的胆固醇；和摩尔比为1.7％的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

为了计算待放入LNP配制品中的每种脂质的实际量，首先基于所需的N/P比确定阳离子脂质的摩尔量，其中N是阳离子脂质中氮原子的数量，并且P是待由LNP转运的mRNA中的磷酸基团的数量。接下来，基于阳离子脂质的摩尔量和所选择的摩尔比计算每种其他脂质的摩尔量。然后使用每种脂质的分子量将这些摩尔量转化为重量。

F.缓冲液和其他组分

为了稳定核酸和/或LNP(例如，为了延长疫苗产品的保质期)，为了促进LNP药物组合物的施用，和/或为了增强核酸的体内表达，核酸和/或LNP可以与一种或多种载剂、靶向配体、稳定试剂(例如，防腐剂和抗氧化剂)和/或其他药学上可接受的赋形剂组合配制。此类赋形剂的实例是对羟基苯甲酸酯、硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞钠(thiomersal)、氯丁醇、苯扎氯铵、螯合剂(例如，EDTA)。

本披露的LNP组合物可以作为冷冻液体形式或冻干形式提供。可以使用各种冷冻保护剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘露糖、右旋糖等。冷冻保护剂可以构成LNP组合物的5％-30％(w/v)。在一些实施例中，LNP组合物包含海藻糖，例如为5％-30％(例如，10％)(w/v)。一旦用冷冻保护剂配制，LNP组合物便可以在-20℃至-80℃下冷冻(或冻干和冷冻保存)。

可以将LNP组合物在水性缓冲溶液中提供给患者：如果先前冷冻，则解冻，或者如果先前冻干，则在床边在水性缓冲溶液中重构。缓冲溶液可以是等渗的，并且适用于例如肌内或皮内注射。在一些实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

VI.用于制造LNP疫苗的方法

本发明的LNP可以通过多种技术制备。例如，可以根据常规技术制备多层囊泡(MLV)，如通过使所选择的脂质沉积在合适的容器或器皿的内壁上(通过将脂质溶解在适当的溶剂中，然后蒸发溶剂以在器皿内部留下薄膜)或通过喷雾干燥来制备。然后可以伴随涡旋运动向器皿中添加水相，这使得MLV形成。然后可以通过均质化、超声处理或挤出多层囊泡来形成单层囊泡(ULV)。另外，可以通过洗涤剂去除技术形成单层囊泡。

各种方法描述于美国公开号US2011/0244026、US 2016/0038432、US2018/0153822、US2018/0125989和US2021/0046192中，并且可以用于制备LNP疫苗。一种示例性方法使得需要通过将mRNA与脂质的混合物混合来包封mRNA，而无需首先将脂质预形成脂质纳米颗粒，如美国公开号US2016/0038432中所述。另一种示例性方法使得需要通过将预形成的LNP与mRNA混合来包封mRNA，如美国公开号US2018/0153822中所述。

在一些实施例中，制备负载mRNA的LNP的方法包括将一种或多种溶液加热到大于环境温度的温度的步骤，该一种或多种溶液是包括预形成的脂质纳米颗粒的溶液、包括mRNA的溶液和包括LNP包封的mRNA的混合溶液。在一些实施例中，该方法包括在混合步骤之前加热mRNA溶液和预形成的LNP溶液中的一种或两种的步骤。在一些实施例中，该方法包括在混合步骤期间加热包括预形成的LNP的溶液、包括mRNA的溶液和包括LNP包封的mRNA的溶液中的一种或多种。在一些实施例中，该方法包括在混合步骤之后加热LNP包封的mRNA的步骤。在一些实施例中，一种或多种溶液被加热到的温度是或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些实施例中，一种或多种溶液被加热到的温度范围为从约25℃-70℃、约30℃-70℃、约35℃-70℃、约40℃-70℃、约45℃-70℃、约50℃-70℃或约60℃-70℃。在一些实施例中，温度是约65℃。

可以使用各种方法来制备适用于本披露的mRNA溶液。在一些实施例中，可以将mRNA直接溶解在本文所述的缓冲溶液中。在一些实施例中，可以通过在与用于包封的脂质溶液混合之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液。在一些实施例中，可以通过紧接在与用于包封的脂质溶液混合之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液。在一些实施例中，合适的mRNA储备溶液可以含有在水或缓冲液中的浓度为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml的mRNA。

在一些实施例中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。典型地，将缓冲溶液以大于mRNA储备溶液的速率的速率混合。例如，缓冲溶液可以按mRNA储备溶液的速率的至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x或20x的速率混合。在一些实施例中，将缓冲溶液以范围为约100-6000ml/分钟(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟或60-420ml/分钟)的流速混合。在一些实施例中，将缓冲溶液以为或大于约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟或6000ml/分钟的流速混合。

在一些实施例中，将mRNA储备溶液以范围为约10-600ml/分钟之间(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟或约480-600ml/分钟)的流速混合。在一些实施例中，将mRNA储备溶液以为或大于约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟或600ml/分钟的流速混合。

将所需mRNA掺入脂质纳米颗粒中的过程称为“加样”。示例性方法描述于Lasic等人，FEBS Lett.[FEBS通讯](1992)312:255-8中。LNP掺入的核酸可以完全或部分位于脂质纳米颗粒的内部空间中，脂质纳米颗粒膜的双层膜内，或与脂质纳米颗粒膜的外表面相关。将mRNA掺入脂质纳米颗粒中在本文中也称为“包封”，其中核酸完全或基本上包括在脂质纳米颗粒的内部空间内。

合适的LNP可以按各种尺寸制备。在一些实施例中，减小的脂质纳米颗粒尺寸与mRNA的更有效递送相关。选择适当的LNP尺寸可以考虑靶细胞或组织的位点以及在某种程度上脂质纳米颗粒将用于的应用。

各种方法可用于改变脂质纳米颗粒群体的尺寸。在各种实施例中，本文中的方法利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)来测量LNP粒度。在一种方案中，将10μl的LNP样品与990μl的10％海藻糖混合。将此溶液装入比色皿中，并且然后放入Zetasizer机器中。z-平均直径(nm)或累积量平均值被认为是样品中LNP的平均尺寸。Zetasizer机器还可以用于通过使用动态光散射(DLS)和自相关函数的累积量分析来测量多分散性指数(PDI)。可以通过对所形成的LNP进行超声处理来减小平均LNP直径。间歇超声处理循环可以与准弹性光散射(QELS)评估交替，以指导有效的脂质纳米颗粒合成。

在一些实施例中，大部分纯化LNP(即，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的LNP)的尺寸为约70-150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm)。在一些实施例中，基本上所有(例如，大于80％或90％)的经纯化的脂质纳米颗粒的尺寸为约70-150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm)。

在某些实施例中，LNP的平均直径为30-200nm。

在各种实施例中，LNP的平均直径为80-150nm。

在一些实施例中，本发明的组合物中的LNP的平均尺寸小于150nm、小于120nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于30nm或小于20nm。

在一些实施例中，本发明的组合物中的大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的LNP的尺寸的范围为从约40-90nm(例如，约45-85nm、约50-80nm、约55-75nm或约60-70nm)或约50-70nm(例如，约55-65nm)，这特别适合于经由雾化进行肺部递送。

在一些实施例中，通过本披露提供的药物组合物中的LNP的分散性或分子尺寸异质性量度(PDI)小于约0.5。在一些实施例中，LNP的PDI小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.28、小于约0.25、小于约0.23、小于约0.20、小于约0.18、小于约0.16、小于约0.14、小于约0.12、小于约0.10或小于约0.08。PDI可以通过如上所述的Zetasizer机器测量。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物中大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的经纯化的LNP将mRNA包封在每个单独的颗粒内。在一些实施例中，药物组合物中基本上所有(例如，大于80％或90％)的经纯化的脂质纳米颗粒将mRNA包封在每个单独的颗粒内。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的包封效率为50％至99％；或大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％。典型地，用于在本文中使用的脂质纳米颗粒的包封效率为至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％或95％)。

在一些实施例中，LNP的N/P比为1至10。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比高于1、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。在某些实施例中，本文的典型LNP的N/P比为4。

在一些实施例中，根据本披露的药物组合物含有至少约0.5μg、1μg、5μg、10μg、100μg、500μg或1000μg包封mRNA。在一些实施例中，药物组合物含有约0.1μg至1000μg、至少约0.5μg、至少约0.8μg、至少约1μg、至少约5μg、至少约8μg、至少约10μg、至少约50μg、至少约100μg、至少约500μg或至少约1000μg包封mRNA。

在一些实施例中，mRNA可以通过化学合成或通过DNA模板的体外转录(IVT)来制备。在此方法中，在IVT过程中，使用cDNA模板来产生mRNA转录物，并且将DNA模板通过DNA酶降解。通过深度过滤和切向流过滤(TFF)纯化转录物。通过添加帽和尾进一步修饰经纯化转录物，并且通过深度过滤和TFF再次纯化经修饰RNA。

然后在水性缓冲液中制备mRNA，并且将其与含有LNP的脂质组分的两亲溶液混合。用于溶解LNP的四种脂质组分的两亲溶液可以是醇溶液。在一些实施例中，醇是乙醇。水性缓冲液可以是例如柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐或琥珀酸盐缓冲液，并且可以具有约3.0-7.0(例如，约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.5)的pH。缓冲液可以含有其他组分，如盐(例如，钠，钾和/或钙盐)。在特定实施例中，水性缓冲液具有1mM柠檬酸盐、150mMNaCl，pH 4.5。

制造mRNA-LNP组合物的示例性非限制性方法涉及将经缓冲的mRNA溶液与脂质的乙醇溶液以受控的均匀方式混合，其中在整个混合过程中维持脂质：mRNA的比率。在此说明性实例中，mRNA在含有柠檬酸一水合物、柠檬酸三钠二水合物和氯化钠的水性缓冲液中呈现。将mRNA溶液添加到溶液(1mM柠檬酸盐缓冲液、150mM NaCl，pH 4.5)中。将四种脂质(例如，阳离子脂质、PEG化的脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质)的脂质混合物溶解在乙醇中。将水性mRNA溶液和乙醇脂质溶液在具有近“无脉”泵系统的“T”形混合器中以4:1的体积比混合。然后对所得混合物进行下游纯化和缓冲液交换。可以使用透析盒或TFF系统实现缓冲液交换。可以使用TFF来紧接在经由T混合过程形成之后对所得的新生LNP进行浓缩和缓冲液交换。渗滤过程是连续操作，通过以与渗透物流相同的速率添加适当的缓冲液使体积保持不变。

VII.hMPV疫苗的包装和使用

本文所述的一种或多种hMPV F多肽抗原可以作为疫苗施用于受试者。本文所述的hMPV疫苗可以配制或包装用于肠胃外(例如，肌内、皮内或皮下)施用或鼻咽(例如，鼻内)施用。在各种实施例中，hMPV疫苗可以配制或包装用于肺部施用。在各种实施例中，hMPV疫苗可以配制或包装用于静脉内施用。疫苗组合物可以呈即用配制品的形式，其中将该组合物冻干并在即将使用前用生理缓冲液(例如，PBS)重构。疫苗组合物还可以按水溶液或冷冻水溶液的形式运送和提供，并且可以直接施用给受试者而无需重构(如果先前冷冻，则在解冻后)。

因此，本披露提供了制品(如试剂盒)，其在单个容器中提供hMPV疫苗，或在一个容器(例如，第一容器)中提供hMPV疫苗以及在另一个容器(例如，第二容器)中提供用于重构的生理缓冲液。该一个或多个容器可以含有单次使用剂量或多次使用剂量。该一个或多个容器可以是预处理的玻璃小瓶或安瓿。制品也可以包括使用说明书。

hMPV疫苗的施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、气管内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。

在特别的示例性实施例中，疫苗通过注射肌内(IM)施用。hMPV疫苗可以注射到受试者中，例如其上臂三角肌处。在这样的实施例中，注射剂以常规形式制备，即作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳剂。在一些实施例中，注射溶液和悬浮液由无菌粉末、冻干粉或颗粒来制备。

本文所述的药物组合物可以用标准针和针筒(任选地预填充的)递送，例如肌内、皮下或静脉内递送。另外，笔式输送装置(例如，注射器(例如，单腔或多腔)或自动注射笔)可用于递送本文所述的药物组合物。这样的笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。在一些实施例中，疫苗被提供以用于在吸入中使用，并且在预填充的泵、雾化器或吸入器中提供。在某些实施例中，可以使用预填充的注射器进行鼻内递送的逐滴施用。

hMPV疫苗可以以预防有效量施用于有需要的受试者，该预防有效量是即提供持续足够的时间(例如，一年、两年、五年、十年或一生)的针对靶病原体的足够免疫保护的量。足够的免疫保护可以是例如预防或减轻与病原体感染相关的症状。在一些实施例中，将多个剂量(例如，两个剂量)的疫苗施用(例如，注射)于有需要的受试者，以实现所需的预防效果。剂量(例如，初免剂量和加强剂量)可以隔开至少例如2周、3周、4周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、五年或十年之间隔。

VIII.药物组合物

根据本披露纯化的hMPV多肽抗原可以用作药物组合物中的组分，例如，用于作为疫苗使用。这些组合物将典型地包括RNA或结合多肽和药学上可接受的载体。本披露的药物组合物还可以包括一种或多种另外的组分，如小分子免疫增强剂(例如，TLR激动剂)。本披露的药物组合物还可以包括用于RNA的递送系统，如脂质体、水包油乳剂或微粒。在一些实施例中，药物组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。在某些实施例中，组合物包含包封在LNP内的编码抗原的核酸分子。

提供了包括向患者施用hMPV结合多肽的方法，其中该hMPV结合多肽拮抗剂包含在药物组合物中。用提供合适的转移、递送、耐受性等的合适的载体、赋形剂和其他药剂配制本文所述的药物组合物。在所有药物化学家都已知的配方中可以找到许多适当的配制品：Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],Mack Publishing Company[麦克出版公司],Easton,PA[宾夕法尼亚州伊斯顿]。这些配制品包括例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTIN^TM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、碳蜡乳剂(具有不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人“Compendium of excipients forparenteral formulations[用于肠胃外配制品的赋形剂的汇编]”PDA(1998)J Pharm SciTechnol.[药物科学与技术杂志]52:238-311。

各种递送系统是已知的并且可用于施用本文所述的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变型病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用中(参见例如，Wu等人，1987,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]262:4429-4432)。施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、气管内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。

本文所述的药物组合物可以用标准针和针筒(例如，预填充的针筒)皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔式递送装置(例如，自动注射笔)可方便地应用于递送本文所述的药物组合物。

对于直接施用于鼻窦，可以使用例如微导管(例如，内窥镜和微导管)、气雾器、粉末分配器、雾化器、或吸入器施用本文所述的药物组合物。这些方法包括以雾化配制品的形式向有需要的受试者施用hMPV结合多肽。可以如例如美国专利号US 8,178,098(通过引用以其全文并入本文)中所述的制备雾化抗体。

可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射，滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过已知方法制备。例如，可以通过例如将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在通常用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备可注射制剂。注射用水性介质有例如生理盐水，一种含有葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液，其可以与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等组合使用。油性介质采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂典型地填充在适当的安瓿中。

有利地，将上述的用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于配合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的这样的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)、栓剂等。

IX.疫苗接种方法

可以将本文披露的hMPV疫苗施用于受试者以诱导针对hMPV F蛋白的免疫反应，其中疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体效价相对于未用本文披露的hMPV疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体效价，或相对于针对hMPV的替代性疫苗增加。“抗抗原抗体”是与抗原特异性结合的血清抗体。

在一个方面，本披露提供了一种引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的hMPV疫苗。本披露还提供了用于在引发对hMPV的免疫反应或在保护受试者免受hMPV感染中使用的本文所述的hMPV疫苗。本披露还提供了用于在制造用于引发对hMPV的免疫反应或用于保护受试者免受hMPV感染的疫苗中使用的本文所述的hMPV mRNA。

在某些实施例中，在施用hMPV疫苗后，受试者相对于施用与佐剂共施用的hMPV蛋白疫苗的受试者具有可比的针对hMPV的中和抗体的血清浓度。

在某些实施例中，hMPV疫苗增加了对hMPV F蛋白的位点具有结合特异性的抗体的血清浓度。

在某些实施例中，hMPV疫苗增加了对hMPV F蛋白的位点V具有结合特异性的抗体的血清浓度。

在某些实施例中，hMPV疫苗增加了预先存在hMPV免疫的受试者的中和抗体的血清浓度。

为了可以更好地理解本发明，阐述了以下实例。这些实例仅用于说明目的，并不被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实例

特别实施例之前述描述将如此充分地披露本披露的一般性质，其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不偏离本披露总体概念的情况下容易地修改和/或调整此类特别实施例用于多种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包括在所披露的实施例的等效方案的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据传授内容和指导来解释。

实例1：融合前稳定化hMPV F糖蛋白抗原构建体的产生

为了改善融合前构型的稳定性，增强纯化，并诱导更高的中和抗体效价，设计了一组候选hMPV融合前F抗原构建体，其具有基于来自加拿大的命名为A2-CAN97-83的A2亚型的野生型hMPV-F抗原(SEQ ID NO:1)的突变。

该组候选hMPV融合前F抗原构建体的设计考虑的图形表示示于图1中，其中示出了两个示例性构建体D185P(SEQ ID NO:5)和T160F/N46V(SEQ ID NO:7)。每种构建体含有以下特征：(1)信号肽；(2)在氨基酸100-101处的pre-F切割位点突变(QS至RR)；(3)跨膜结构域和胞质尾区的去除；(4)fibritin基序(即，foldon结构域)的添加；(5)HRV-3C切割位点；(6)8x His标签和Strep II标签；以及(7)用于第(4)项至第(6)项的适当接头(SEQ ID NO:3)。

根据此骨架，进行计算机分析以确定通过添加填充腔突变或界面稳定性突变来增加pre-F构型稳定性的单点突变或双点突变。总体而言，该组候选hMPV融合前F抗原由21种不同构建体构成，如表1的第1列中所示。

实例2：融合前稳定化hMPV F抗原构建体的蛋白表达的评价

将每种候选hMPV融合前F抗原构建体的核酸分子分离并且克隆到表达载体中。在使用Expi293F人类细胞进行哺乳动物瞬时转染后评价每种构建体的蛋白表达的产生。在构建体转染后24小时，回收细胞裂解物或上清液，以用于通过蛋白质印迹进行分析。

在21种候选设计中，产生了九种蛋白质抗原。然而，如通过1L培养物的SDS-PAGE确定的，只有四种蛋白抗原具有≥90％的纯度。所有21种构建体的蛋白表达特征示于表1中。具有高蛋白产量和纯度的构建体具有以下突变：D185P、T160F_N46V、K138F和G366F_K362F。

表1-21种候选hMPV融合前F抗原构建体的蛋白表达特征

实例3：小鼠中融合前稳定化hMPV F抗原蛋白构建体的免疫原性

随后评价与来自A1株的参考hMPV-F蛋白相比，表1中所述的具有≥90％纯度的四种候选hMPV F抗原构建体在小鼠中的免疫原性。

在第(D)0天和D21，通过肌内(IM)注射向如表2中示出的8只BALB/c小鼠(N＝8)的组施用0.5μg剂量的具有氢氧化铝(Al(OH)₃)佐剂的蛋白抗原。在每次疫苗施用之前以及在最后一次疫苗接种后两周(D35)，对所有小鼠进行放血并且提取血清。然后使用血清来确定循环抗hMPV-F IgG效价(如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)(图2)和通过hMPV微量中和测定(图3)测量的)，以确定抗体反应的中和活性。为了确保post-F组中的所有蛋白质实际上都呈post-F构型，在准备施用前将蛋白质加热至70℃持续10分钟。

表2-小鼠中的hMPV F抗原疫苗研究设计

数据显示，具有A2-K138F突变的构建体诱导最高的结合抗体效价(通过hMPV-FELISA)，其次是A2-T160F_N46V、A2-G366F_K362F，以及最后是A2-D185P(图2)。当通过使用hMPV A2-GFP病毒进行微量中和评价时，A2-T160F_N46V具有最高的中和效价，其次是A2-K138F、A2-D185P和A2-G366F_K362F(图3)。

尽管A2-K138F具有最高的结合抗体效价和第二高的中和抗体效价，但发现此构建体在溶液中形成聚集体，表明潜在的不适当的蛋白质折叠，并且因此将其从进一步评价中排除。由于A2-G366F_K362F具有第二低的结合抗体效价和最低的中和抗体效价，因此也将它从进一步评价中排除。因此，发现A2-D185P和A2-T160F_N46V诱导最高质量的抗体，并选择它们进行如实例4中所述的高级分析以评价纯度、尺寸和热稳定性。

实例4：融合前稳定化hMPV F抗原构建体的物理化学表征

为了进一步表征从A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体产生的蛋白质的纯度、尺寸和热稳定性，进行HP-SEC、SEC-HPLC、SEC-MALS和nanoDSF分析。

纯度和尺寸

HP-SEC、SEC-HPLC和SEC-MALS分析的结果总结于下表3中。

表3-融合前稳定化hMPV F抗原构建体和对照的SEC评价的总结。

	A1 A185P	A1 Post-F	A2 T160F_N46V	A2 D185P
					HP-SEC三聚体(％)	98.8	100	94.7	97.1
SEC-HPLC MW(kDa)	341.4	337.2	384.0	321.7
					SEC-MALS MW(KDa)	224.4	282.5	266.5	224.3

确定MALS的三聚体峰的分子量(MW)。SEC-HPLC的条件如下：TSK 3000SWxl SEC柱，磷酸盐缓冲液(0.2M NaH₂PO₄，0.1M精氨酸，1％ IPA，pH 6.5)，流速0.5ml/min。SEC-MALS的条件如下：1.7μM，BEH蛋白柱，和50mM Tris缓冲液(pH 7.5)，流速0.3ml/min。

图4展示了参考A1蛋白(A1-A185P和A1-post-F)，和下方A2蛋白抗原候选物(A2-T160F_N46V和A2-D185P)的SEC-MALS结果。所有四种蛋白的数据也总结于表3中。两种A1参考蛋白均显示≥98.8％的三聚体形成以及A1-A185P和A1-post-F的MW分别为224kDa和283kDa。来自A2-T160F_N46V和A2-D185P构建体的蛋白质分别由97.4％和97.1％的三聚体构成，这些三聚体的MW分别为267kDa和224kDa。

热稳定性

使用纳米级差示扫描荧光法(nanoDSF)确定了大和小两个批次的A1-pre-F和A1-post-F蛋白以及A2候选蛋白抗原(A2-T160F_N46V和A2-D185P)的蛋白质变性的起始温度(Tonset)和熔点(Tm)。将样品在配制缓冲液中稀释至0.5mg/ml的最终浓度并且一式两份地装载到nanoDSF毛细管中。所有测量都是使用nanoDSF装置进行。加热速率是1.5℃/分钟，从20℃至95℃。使用PR.Stability Analysis v1.01记录并且分析数据。

图5示出了A1-preF(A185P)和A2-postF(n＝3)的熔解曲线，分别产生60.12℃和86.7℃的Tm值。此数据显示，nanoDSF可以区分A1融合前与融合后抗原，其熔解温度相差大约27℃。

有趣的是，当比较A2 hMPV-F候选蛋白抗原的热稳定特性时，如图6所示，发现源自A2-T160F_N46V构建体的蛋白质的热稳定性高于从A2-D185P构建体产生的更低程度工程化的蛋白质，熔点增加了近9℃(Tm分别为70.4℃和79.3℃)。

实例5：编码融合前稳定化hMPVF抗原构建体的mRNA

为了确定是否可以进一步改善hMPV F抗原构建体的免疫原性，选择A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体测试基于mRNA的疫苗。A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中。A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体的mRNA ORF分别示于SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中。A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体的经密码子优化的mRNA ORF分别示于SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中。

本文所述的mRNA包含编码hMPV F蛋白抗原的开放阅读框(ORF)、至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个聚腺苷酸化(聚(A))序列。mRNA进一步包含具有以下结构的5'帽：

5'UTR和3'UTR的核酸序列分别示于SEQ ID NO:13和14中。

实例6：融合前稳定化hMPV F抗原mRNA构建体在小鼠中的免疫原性

通过测量IM注射用脂质纳米颗粒(LNP)配制的mRNA之前和之后的循环抗hMPV-F效价来在小鼠中测试表达mRNA的A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体的相对免疫原性。将每种mRNA包封到由40％阳离子脂质OF-02、30％磷脂DOPE、1.5％ PEG化的脂质DMGPEG2000和28.5％胆固醇构成的LNP中。可替代地，LNP脂质可以表示为以下比率，其中阳离子脂质:PEG化的脂质:胆固醇:磷脂是40:1.5:28.5:30。

在D0和D21，经由IM注射向八只BALB/c小鼠(N＝8)的组施用1μg剂量。在每次疫苗施用之前以及在最后一次疫苗接种后两周(D35)，对所有小鼠进行放血并且提取血清。然后使用血清来确定循环抗hMPV-F IgG效价(如通过ELISA(图7)和通过hMPV微量中和测定(图8)测量的)，以确定抗体反应的中和活性。

通过hMPV-F ELISA确定，在所有时间点，表达mRNA的A2-D185P和A2-T160F_N46V构建体两者均诱导相似高的结合抗体效价(图7)。当通过使用A2-GFP病毒进行微量中和评价时，两种构建体均诱导类似强效的中和效价(图8)。因此，当经由mRNA-LNP表达时，两种抗原均具有相似的免疫原性。

实例7：针对hMPV和RSV的mRNA多病原体疫苗的合理设计

RSV和hMPV是在人类群体内引起仅次于流感病毒的广泛发病率的呼吸道病毒(Collins等人2013,Fields Virology.[病毒学领域]第6版:Lippincott Williams andWilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司])。尽管有疾病负担，但用于两种病毒的疫苗和治疗策略仍然有限。鉴于hMPV与RSV表面糖蛋白之间的显著同源性，以及针对两种病毒的保护将导致更少的注射并简化疫苗时间表的实际考虑(Lauer等人2017,Clin VaccineImmunol.[临床疫苗免疫学]24(1):e00298-16)，设计了包含RSV和hMPV抗原构建体的组合mRNA疫苗。

因此，共配制了包含以下两种mRNA的组合疫苗：(1)RSV F抗原构建体，FD3；和(2)hMPV F抗原构建体，A2-CAN97-83。

使用的mRNA hMPV构建体以及5'和3'UTR描述于实例6中。

使用的mRNA RSV构建体描述于美国临时专利申请序号63/276,233中，将其出于所有目的通过引用以其全文并入本文。

实例8：针对hMPV和RSV的mRNA多病原体疫苗在小鼠中的免疫原性

通过测量IM注射用脂质纳米颗粒(LNP)配制的mRNA之前和之后的循环抗RSV FD3和抗hMPV-F效价来在小鼠中评价如实例7中所描述的针对hMPV和RSV的mRNA多病原体疫苗的相对免疫原性。将每种mRNA包封到由40％阳离子脂质OF-02、30％磷脂DOPE、1.5％ PEG化的脂质DMGPEG2000和28.5％胆固醇构成的LNP中。可替代地，LNP脂质可以表示为以下比率，其中阳离子脂质:PEG化的脂质:胆固醇:磷脂是40:1.5:28.5:30。

在D0和D21，根据以下方案经由IM注射对五组BALB/c小鼠(N＝8)进行免疫：(1)第1组-以50μL总体积施用1μg剂量的用cOrn-EE1 LNP配制的RSV mRNA，施用于右后肢；(2)第2组-以50μL总体积施用1μg剂量的用cOrn-EE1 LNP配制的hMPV mRNA，施用于右后肢；(3)第3组-以100μL总体积施用在单一cOrn-EE1 LNP中含有1μg RSV和1μg hMPV mRNA的共配制品，向每个后肢递送50μL；(4)第4组-以50μL总体积施用1μg具有明矾佐剂的RSV pre-F蛋白纳米颗粒，施用于右后肢，作为RSV免疫原性对照；以及(5)第5组-以50μL总体积施用1μg具有明矾佐剂的hMPV pre-F，施用于右后肢，作为hMPV免疫原性对照。

在每次疫苗施用前以及最后一次疫苗接种后2周(D35)，对所有小鼠进行放血，并通过ELISA测试D35血清以确定循环抗RSV和抗hMPV-F效价，并且通过微量中和测定进行测试以确定RSV和hMPV抗体反应的中和活性。

通过RSV-F ELISA确定，在单独给予时或在与hMPV共配制时，RSV mRNA诱导相似的效价(图9)。类似地，通过hMPV-F ELISA确定，在单独给予时或在与RSV共配制时，hMPV mRNA诱导相似的效价(图10)。当通过使用RSV A2-GFP病毒进行微量中和评价时，单独递送或与hMPV组合递送的RSV mRNA均诱导类似强效的中和效价(图11)。当通过使用hMPV A2-GFP病毒进行微量中和评价时，单独递送或与RSV组合递送的hMPV mRNA均诱导类似强效的中和效价(图12)。因此，用作为单一LNP递送的RSV和hMPV mRNA的共配制品的免疫与单独递送的任一抗原具有相似的免疫原性。

实例9：hMPV F多肽抗原抗体结合分析

一式八份测试抗体与hMPV F构建体的结合。将所有样品和抗体在动力学缓冲液(ForteBio动力学缓冲液1X稀释度+PBS)中分别稀释至5μg/mL和1μg/mL的最终浓度。将抗体上样到蛋白A生物传感器上并用以下条件测试所有抗原的结合：初始基线(120s)、抗体上样(180s)、第二基线(120s)、抗原的缔合(180s)、抗原的解离(120s)。使用ForteBio DataAnalysis 12.0软件分析结合结果。

表4显示，A2-T160F_N46V和A2-D185P对mAb MPE8、101F、338和DS7具有预期的结合模式。

表4-hMPV F抗原性构建体的结合特征

实例10：hMPV F抗原表达

HEK293细胞-30万个细胞/孔

接下来，将HELA细胞以30万个细胞/孔铺板于2mL DMEM+10％FBS中的6孔板中。第二天以lipofectamine 2000用1μg/孔hMPV mRNA构建体转染细胞。第二天收获细胞并在500μL/孔的RIPA+1x HALT+0.2％Omnicleave中裂解。将裂解物在冰上培育10分钟。将15μL裂解物与5μL NuPAGE LDS样品缓冲液组合。

将样品在8％-16％梯度SDS-PAGE上在185V下运行75分钟。将蛋白质转移到硝化纤维膜上。将印迹用Intercept无蛋白封闭缓冲液在室温封闭1小时。将印迹在4℃在Intercept无蛋白封闭缓冲液中用一抗NBP2-50505小鼠抗hMPV-F(hMPV24)(Novus公司)染色过夜。将印迹用TBST洗涤3x5分钟。将印迹在室温在Intercept封闭缓冲液中用驴抗小鼠800二抗染色1小时。将印迹用TBST洗涤4x5分钟，然后在Licor Odyssey上扫描。

结果示于图13。D185P显示在60kDa的预期分子量附近的稳健表达。T160F_N46V显示蛋白质表达，但信号明显低于D185P。

HSKM细胞

将mRNA转染到24孔板中的人骨骼肌(HSKM)细胞中。在24小时后，使用流式细胞术来测量表位表达。细胞数量/孔＝10万。在转染24小时后，用PBS洗涤孔，并且添加胰蛋白酶(0.25％)以分离细胞。将细胞分布在96孔板中，以进行流式细胞术，并进行细胞内染色(Cytoperm)处理，之后添加抗体。二抗是山羊抗人IgG(Jackson Immuno Research[杰克逊免疫研究公司]-目录号109-115-098)。

MNR hMPV D185P表达水平与MNR hMPV CAN97-83相似。对于所有表位，MNR hMPVT160F_N46V显示更高的表达水平。

实例11：稳定化前和稳定化后hMPV F抗原蛋白构建体在MIMIC系统中的免疫原性

简介：

(模块化免疫体外构建体)系统可以体外刺激体内疫苗接种/感染部位发生的先天和适应性免疫反应。Williams等人(2015)Sanofi Pasteur poster[赛诺菲巴斯德海报],“In vitro differentiation of class-switched YF specific antibodysecreting cells fromB cells[类别转换的YF特异性抗体分泌细胞从初始B细胞的体外分化]”。使用MIMIC系统可以重现人类生理学特有的一些方面，例如，HLA单倍型、年龄、自身免疫状态和性别，从而补充在动物模型中进行的免疫原性研究。Higbee等人(2009)ATLA 37:19-27。

为此，在MIMIC系统中测试了pre-hMPV F和post-hMPV F抗原蛋白构建体，以评估相对于对照的免疫原性反应的质量。对照组包括：未处理的对照(无抗原无人骨骼肌细胞(无HSK))、参考抗原-与铁蛋白纳米颗粒融合的RSV pre-F蛋白(pre-F NP)和脊髓灰质炎疫苗(IPOL)。

材料与方法

简言之，经由磁珠分离试剂盒从22个不同的人献血者收获PBMC。添加从中选择的人树突状细胞(DC)和B细胞，并将其于人骨骼肌细胞(HSKMC)共培养，并用hMPV pre-F抗原蛋白(100ng/ml或500ng/ml)或hMPV post F抗原蛋白(100ng/ml)刺激。对于B细胞反应，在共培养14天后，收集上清液并且分析抗体特异性和功能。

结果：

图15描述了MIMIC设置。对于共享的pre-F/post-F表位，T160F_N46V和D185P在75ng/ml和375ng/ml剂量下观察到相似的表达水平(图14，小图A-C)。为了确认激活MIMIC共培养物，将先前分析的脊髓灰质炎疫苗(IPOL)和抗原(RSV pre-F-NP)用作阳性对照。如图16，小图A-C中所示，相对于未处理的对照，以1:50稀释的IPOL处理引发了针对三种脊髓灰质炎毒株(脊髓灰质炎1、2和3)的抗体反应。类似地，共培养物的50ng/ml的RSV pre-F NP处理引发了对RSV pre-F(图17，小图A)和RSV post-F(图17，小图B)两者的IgG特异性抗体反应。此外，这些抗体也具有功能，如在RSV中和测定中测量的(图17，小图C)。

hMPV pre-F和post-F蛋白显示出高的pre-F和post-F抗体反应(图18，小图A和B)以及高的中和抗体效价(图19)。

相对于无抗原对照，来自用实验组hMPV pre-F抗原蛋白或hMPV post-F抗原蛋白处理的共培养物的上清液引发对hMPV pre-F抗原(图20，小图A)和hMPV post-F抗原(图20，小图B)两者的稳健的IgG抗体反应。此外，这些抗体具有功能，如在hMPV中和测定中测量的(图21)。来自所有三个处理组的抗体与hMPV融合前F抗原和hMPV融合后F抗原结合并且中和病毒感染性，这支持了融合前hMPV和融合后hMPV共享中和表位的看法。

考虑到本文披露的说明书和实践，本披露的其他实施例对于本领域技术人员而言是清楚的。所述说明书和实例旨在仅被视为示例性的，所附权利要求指示了本披露的真实范围和精神。

本文引用的所有专利和出版物通过引用以其全文并入本文。

Claims

1.一种抗原性人偏肺病毒(hMPV)融合前F多肽，或一种编码该抗原性hMPV融合前F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点。

2.如权利要求1所述的F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽进一步包含F₀切割位点突变，该F₀切割位点突变包含氨基酸取代Q100R和S101R，即用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置101的丝氨酸。

3.如权利要求1或2所述的F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含信号肽。

4.如权利要求1-3中任一项所述的F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含至少一个标签序列，该标签序列任选地是8x His标签和/或Strep II标签。

5.如权利要求1-4中任一项所述的F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含foldon结构域。

6.如权利要求1-5中任一项所述的F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代，和替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代。

7.一种抗原性人偏肺病毒(hMPV)融合前F多肽，或一种编码该抗原性hMPV融合前F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含：

含有氨基酸取代Q100R和S101R的F₀切割位点突变；即用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置101的丝氨酸；

人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点；

异源信号肽；

8x His标签和/或Strep II标签；和

foldon结构域。

8.一种抗原性人融合前偏肺病毒(hMPV)F多肽，或一种编码该抗原性人融合前偏肺病毒F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含替代在SEQ ID NO:1的位置160的野生型氨基酸的氨基酸取代，和替代在SEQ ID NO:1的位置46的野生型氨基酸的氨基酸取代。

9.一种抗原性人融合前偏肺病毒(hMPV)F多肽，或一种编码该抗原性人融合前偏肺病毒F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代，和替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代。

10.如权利要求8或9所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸替代在位置160的氨基酸的氨基酸取代。

11.如权利要求10所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含用苯丙氨酸替代在位置160的氨基酸的氨基酸取代。

12.如权利要求8-11中任一项所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含用缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸替代在位置46的氨基酸的氨基酸取代。

13.如权利要求12所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含用缬氨酸替代在位置46的氨基酸的氨基酸取代。

14.如权利要求8所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽与SEQ ID NO:7具有至少95％的序列同一性。

15.如权利要求8-14中任一项所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽进一步包含F₀切割位点突变，该F₀切割位点突变包含氨基酸取代Q100R和S101R，即用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置100的谷氨酰胺，以及用精氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置101的丝氨酸。

16.如权利要求8-15中任一项所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含信号肽。

17.如权利要求8-16中任一项所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含至少一个标签序列，该标签序列任选地是8x His标签和/或Strep II标签。

18.如权利要求8-17中任一项所述的hMPV F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽包含foldon结构域。

19.一种抗原性人偏肺病毒(hMPV)融合前F多肽，或一种编码该抗原性hMPV融合前F多肽的核酸分子，其中所述融合前F多肽缺乏跨膜结构域且缺乏胞质尾区，并且包含：

用苯丙氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代T160F，和用缬氨酸替代在SEQ ID NO:1的氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代N46V；

人鼻病毒3C(HRV-3C)蛋白酶切割位点；

信号肽；

8x His标签和/或Strep II标签；和

foldon结构域。

20.如前述权利要求中任一项所述的F多肽或核酸分子，其中该hMPV是A株或B株。

21.如前述权利要求中任一项所述的F多肽或核酸分子，其中该hMPV是A1亚型、A2亚型、B1亚型或B2亚型。

22.如前述权利要求中任一项所述的F多肽或核酸分子，其中所述融合前F多肽与SEQID NO:3具有至少95％的序列同一性或包含SEQ ID NO:3。

23.一种人偏肺病毒(hMPV)F多肽，或一种编码该hMPV F多肽的核酸分子，其中所述F多肽与SEQ ID NO:7具有至少95％的序列同一性。

24.如权利要求23所述的F多肽或核酸分子，其中该F多肽是融合前F多肽。

25.如权利要求23所述的F多肽或核酸分子，其中该F多肽是抗原性的。

26.如权利要求23所述的F多肽或核酸分子，其中该F多肽包含用苯丙氨酸替代在氨基酸位置160的苏氨酸的氨基酸取代T160F，和用缬氨酸替代在氨基酸位置46的天冬酰胺的氨基酸取代N46V。

27.如权利要求23所述的F多肽或核酸分子，其中该F多肽包含SEQ ID NO:7。

28.一种编码如权利要求23-27中任一项所述的多肽的核酸分子。

29.如权利要求28所述的核酸分子，该核酸分子与SEQ ID NO:8具有至少95％的序列同一性或包含SEQ ID NO:8。

30.如权利要求28所述的核酸分子，该核酸分子与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有至少95％的序列同一性或包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。

31.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求23-27中任一项所述的F多肽或编码该F多肽的核酸分子，或如权利要求28-30中任一项所述的核酸分子。

32.如权利要求31所述的药物组合物，该药物组合物包含疫苗。

33.一种信使RNA(mRNA)，该mRNA包含编码如权利要求1-27中任一项所述的F多肽的开放阅读框(ORF)。

34.一种信使RNA(mRNA)，该mRNA包含编码人偏肺病毒(hMPV)F多肽抗原的开放阅读框(ORF)，其中该hMPV F多肽抗原包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。

35.如权利要求33或34所述的mRNA，其中该hMPV F多肽抗原是融合前F多肽。

36.如权利要求33-35中任一项所述的mRNA，其中该ORF是经密码子优化的。

37.如权利要求33-36中任一项所述的mRNA，其中该mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和至少一个聚腺苷酸化(聚(A))序列。

38.如权利要求33-37中任一项所述的mRNA，其中该mRNA包含至少一个化学修饰。

39.如权利要求33-38中任一项所述的mRNA，其中在该mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

40.如权利要求33-39中任一项所述的mRNA，其中在该ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

41.如权利要求37-39中任一项所述的mRNA，其中该化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。

42.如权利要求41所述的mRNA，其中该化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。

43.如权利要求41所述的mRNA，其中该化学修饰是N1-甲基假尿苷。

44.如权利要求33-43中任一项所述的mRNA，其中将该mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。

45.如权利要求44所述的mRNA，其中该LNP包含至少一种阳离子脂质。

46.如权利要求45所述的mRNA，其中该阳离子脂质是可生物降解的。

47.如权利要求45所述的mRNA，其中该阳离子脂质不是可生物降解的。

48.如权利要求45所述的mRNA，其中该阳离子脂质是可切割的。

49.如权利要求45所述的mRNA，其中该阳离子脂质不是可切割的。

50.如权利要求45所述的mRNA，其中该阳离子脂质选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。

51.如权利要求50[9]所述的mRNA，其中该阳离子脂质是cKK-E10。

52.如权利要求50所述的mRNA，其中该阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10。

53.如权利要求44-52中任一项所述的mRNA，其中该LNP进一步包含聚乙二醇(PEG)缀合(PEG化的)脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质。

54.如权利要求44-52中任一项所述的mRNA，其中该LNP包含：

摩尔比为35％至55％的阳离子脂质，

摩尔比为0.25％至2.75％的聚乙二醇(PEG)缀合(PEG化的)脂质，

摩尔比为20％至45％的基于胆固醇的脂质，和

摩尔比为5％至35％的辅助脂质，

其中所有摩尔比均相对于该LNP的总脂质含量。

55.如权利要求54所述的mRNA，其中该LNP包含：

摩尔比为40％的阳离子脂质，

摩尔比为1.5％的PEG化的脂质，

摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质，和

摩尔比为30％的辅助脂质。

56.如权利要求53-55中任一项所述的mRNA，其中该PEG化的脂质是二肉豆蔻酰基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

57.如权利要求53-55中任一项所述的mRNA，其中该基于胆固醇的脂质是胆固醇。

58.如权利要求53-55中任一项所述的mRNA，其中该辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。

59.如权利要求44-55中任一项所述的mRNA，其中该LNP包含：

摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10，

摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000，

摩尔比为28.5％的胆固醇，和

摩尔比为30％的DOPE。

60.如权利要求44-55中任一项所述的mRNA，其中该LNP包含：

摩尔比为40％的cKK-E10，

摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000，

摩尔比为28.5％的胆固醇，和

摩尔比为30％的DOPE。

61.如权利要求44-60[9]中任一项所述的mRNA，其中该LNP具有30nm至200nm的平均直径。

62.如权利要求61所述的mRNA，其中该LNP具有80nm至150nm的平均直径。

63.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求33-62中任一项所述的mRNA。

64.如权利要求63所述的药物组合物，该药物组合物包含疫苗。

65.一种引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的方法，该方法包括向受试者施用权利要求32或64的疫苗。

66.如权利要求65所述的方法，其中在施用该疫苗后，该受试者相对于施用蛋白hMPV疫苗的受试者具有可比的抗hMPV的中和抗体的血清浓度。

67.如权利要求66所述的方法，其中该蛋白hMPV疫苗与佐剂共施用。

68.如权利要求65所述的方法，其中该疫苗增加预先存在hMPV免疫的受试者的中和抗体的血清浓度。

69.一种用于在引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染中使用的疫苗，该使用包括向受试者施用如权利要求32或64所述的疫苗。

70.如权利要求32或64所述的疫苗在制造用于引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的药物中的用途。

71.一种引发有需要的受试者的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的如权利要求1-27中任一项所述的F多肽或核酸分子、预防有效量的如权利要求33-62中任一项所述的mRNA或预防有效量的如权利要求32、64和69中任一项所述的疫苗。

72.一种预防hMPV感染或减轻hMPV感染的一个或多个症状的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的如权利要求1-27中任一项所述的F多肽或核酸分子、预防有效量的如权利要求33-62中任一项所述的mRNA或预防有效量的如权利要求32、64和69中任一项所述的疫苗。

73.如权利要求1-27中任一项所述的F多肽或核酸分子，预防有效量的如权利要求33-62中任一项所述的mRNA或如权利要求32、64和69中任一项所述的疫苗用于制造用于在治疗有需要的受试者中使用，任选地在如权利要求71或72所述的方法中使用的药物的用途。

74.如权利要求1-27中任一项所述的F多肽或核酸分子，预防有效量的如权利要求33-62中任一项所述的mRNA或如权利要求32、64和69中任一项所述的疫苗，用于在治疗有需要的受试者中，任选地在如权利要求71或72所述的方法中使用。

75.一种包含容器的试剂盒，该容器包含单次使用或多次使用剂量的如权利要求1-27中任一项所述的F多肽或核酸分子、预防有效量的如权利要求33-62中任一项所述的mRNA或如权利要求32、64或69中任一项所述的疫苗，任选地其中该容器是小瓶或预填充针筒或注射器。

76.一种疫苗，该疫苗包含人偏肺病毒(hMPV)F多肽抗原或编码该hMPV F多肽抗原的核酸分子，其中该F多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的氨基酸序列或由SEQ IDNO:7的氨基酸序列组成的氨基酸序列。

77.如权利要求76所述的疫苗，其中该hMPV F多肽是融合前F多肽。

78.一种引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的方法，该方法包括向受试者施用如权利要求76或77所述的疫苗。

79.如权利要求77所述的方法，其中该疫苗与佐剂共施用。

80.如权利要求78或79所述的方法，其中该疫苗与另外的疫苗组合施用。

81.如权利要求80所述的方法，其中该另外的疫苗是呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗或流感疫苗。

82.如权利要求78-81中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

83.如权利要求82所述的方法，其中该人受试者是婴儿、学步儿或老年人。

84.如权利要求78-83中任一项所述的方法，其中该疫苗增加中和抗体的血清浓度，并且其中该受试者具有预先存在的hMPV免疫。

85.一种用于在引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染中使用的疫苗，该使用包括向受试者施用如权利要求76或77所述的疫苗。

86.如权利要求76或77所述的疫苗在制造用于引发对hMPV的免疫反应或保护受试者免受hMPV感染的药物中的用途。

87.一种在有需要的受试者中引发免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的如权利要求76或77所述的疫苗。

88.一种预防hMPV感染或减轻hMPV感染的一个或多个症状的方法，该方法包括向该受试者施用，任选地肌内、鼻内、静脉内、皮下或皮内施用预防有效量的如权利要求76或77所述的疫苗。

89.如权利要求76或77所述的疫苗用于制造用于在治疗有需要的受试者中使用，任选地在如权利要求87或88所述的方法中使用的药物的用途。

90.如权利要求76或77所述的疫苗，用于在治疗有需要的受试者中使用，任选地在如权利要求87或88所述的方法中使用。

91.一种包含容器的试剂盒，该容器包含单次使用或多次使用剂量的如权利要求76或77所述的疫苗，任选地其中该容器是小瓶或预填充针筒或注射器。

92.一种表达载体，该表达载体编码如权利要求1-27中任一项所述的F多肽或核酸分子，或如权利要求33-62中任一项所述的mRNA。

93.一种细胞，该细胞包含如权利要求92所述的表达载体。