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CN118325894A - 一种引物及检测dna聚合酶单碱基延伸能力的方法 - Google Patents

一种引物及检测dna聚合酶单碱基延伸能力的方法 Download PDF

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CN118325894A CN202410765110.0A CN202410765110A CN118325894A CN 118325894 A CN118325894 A CN 118325894A CN 202410765110 A CN202410765110 A CN 202410765110A CN 118325894 A CN118325894 A CN 118325894A
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Abstract

本发明提供一种引物，该引物为单链DNA，沿5’到3’方向，引物包括依次连接的模板区域、第一互补区域、非互补区域、第二互补区域，第一互补区域与第二互补区域的碱基完全互补；引物的总长度为35~45nt，鸟嘌呤和胞嘧啶在引物所有碱基中的数量占比为45%~55%，模板区域的长度为10~14nt，模板区域含有4种碱基。本发明所提供的引物在具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下可以利用ddNTP使延伸终止，即使补加与ddNTP碱基种类相同的dNTP也不会继续延伸；而该引物在不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下不可以利用ddNTP使延伸终止。基于此，利用该引物能够实现对DNA聚合酶单碱基延伸能力的检测。

Description

一种引物及检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法
技术领域
本发明属于DNA聚合酶检测技术领域，具体地，涉及一种引物及检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法。
背景技术
基质辅助激光解吸电离质谱技术简称MALDI-MS，是一代生物质谱技术，能在皮摩尔级甚至飞摩尔级的水平上准确分析几十万种生物大分子，在单核苷酸多态性分析（SNP）、甲基化分析上有广泛运用，对多种肿瘤、帕金森综合症、病毒感染等检测上提供了重要的帮助，并能运用到产前诊断、细菌检测、病毒分型中。MALDI-MS技术其中一个重要过程是在具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶（能够利用双脱氧核苷三磷酸ddNTP，当1个ddNTP插入后引物停止延伸）作用下使核酸模版进行单碱基延伸，这个过程需要使用具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶，然而目前没有一种简便的检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，只能通过使用MALDI-MS技术去验证所使用的DNA聚合酶是否具备单碱基延伸能力，这种方法需要使用生物质谱仪，存在成本高、操作繁琐等缺点。
基于此，如何简便的检测DNA聚合酶单碱基延伸能力，是本领域技术人员在研究中急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种引物及检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，利用该引物及方法能够实现对DNA聚合酶单碱基延伸能力的检测，且检测结果准确、检测时间短、成本低、重复性强、使用常规的PCR仪即可完成。
根据本发明的一个方面，提供一种引物，引物为单链DNA，沿5’到3’方向，引物包括依次连接的模板区域、第一互补区域、非互补区域、第二互补区域，第一互补区域与第二互补区域的碱基完全互补；引物的总长度为35~45nt，鸟嘌呤和胞嘧啶在引物所有碱基中的数量占比为45%~55%，模板区域的长度为10~14nt，模板区域含有4种碱基。本发明所提供的引物具有特定的结构和适宜的序列长度、鸟嘌呤和胞嘧啶在引物所有碱基中的数量占比（GC含量），该引物在具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下可以利用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）使延伸终止，即使补加与ddNTP碱基种类相同的dNTP也不会继续延伸；而该引物在不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下不可以利用ddNTP使延伸终止。基于此，利用该引物能够实现对DNA聚合酶单碱基延伸能力的检测，且检测结果准确、检测时间短。
优选地，第一互补区域、第二互补区域的长度为10~14nt，非互补区域的长度为2~6nt。
优选地，模板区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
根据本发明的另一个方面，提供一种检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，其特征在于，方法包括如下操作：步骤一，向上述引物中加入待测DNA聚合酶和NTPs进行延伸反应，得到第一延伸产物，按照碱基种类进行区分，NTPs由n1种ddNTP和n2种dNTP构成，n1取自1~4中的任意正整数，n1+n2=4，且，当n2不为0，在本步骤中，所添加的dNTP的碱基种类与所添加的任一种ddNTP的碱基种类皆不相同，以第一延伸产物的熔解温度为TM1；步骤二，向第一延伸产物中加入n1种dNTP进行延伸反应，得到第二延伸产物，在本步骤中添加的dNTP的碱基种类与在步骤一中ddNTP所含有的碱基种类相同，以第二延伸产物的熔解温度为TM2；步骤三，基于TM1、TM2的相对大小判断待测DNA聚合酶的单碱基延伸能力；当TM2/TM1=1.00±0.05时，得出待测DNA聚合酶具备单碱基延伸能力的结论；当TM2/TM1＞1.05时，得出待测DNA聚合酶不具备单碱基延伸能力的结论（理论上，当待测DNA聚合酶具备单碱基延伸能力时，TM2/TM1=1，但是由于在测试过程中存在一定的测试误差，因此，TM2/TM1=1.00±0.05仍然处于置信区间）。
本发明所提供的引物具有特定结构和适宜长度、GC含量，该引物延伸产物的熔解温度（即熔解曲线峰值，标记为TM值）与其长度呈明显的正相关关系。基于此，由于不同类型DNA聚合酶（具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶、不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶）利用ddNTP的能力不同，该引物在不同类型DNA聚合酶作用下进行延伸反应得到的延伸产物的长度不同，因此，利用本发明所提供的引物的第一延伸产物的TM值（标记为TM1）、第二延伸产物的TM值（标记为TM2）以及TM1与TM2的相对大小关系能够实现对DNA聚合酶单碱基延伸能力的检测。其中，若待测DNA聚合酶具备单碱基延伸能力，步骤二向第一延伸产物中补加dNTP（添加的dNTP的碱基种类与在步骤一中添加的ddNTP所含有的碱基种类相同）进行延伸反应的过程中，引物3’末端碱基不会进一步延伸，由此得到的第二延伸产物与第一延伸产物的长度相同（TM2/TM1=1.00±0.05）；若待测DNA聚合酶不具备单碱基延伸能力，步骤二向第一延伸产物中补加dNTP进行延伸反应的过程中，引物3’末端碱基会进一步延伸至与模板区域所有碱基完全互补，由此得到的第二延伸产物与第一延伸产物的长度不相同（TM2/TM1＞1.05）。综上，本发明所提供的检测方法将可以量化的引物第一延伸产物的TM1、第二延伸产物的TM2作为判断DNA聚合酶单碱基延伸能力的指标，有利于简单、快捷、准确地筛选具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶，筛选到的具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶可以直接应用于质谱技术中，具有广阔的应用前景。且本发明所提供的检测方法操作简单快捷、成本低、结果可靠、重复性强、使用常规的PCR仪即可完成检测。
优选地，在步骤一中，所添加的ddNTP包括ddGTP、ddCTP中的至少一种。由于碱基G、C对引物延伸产物的TM值影响比较大，因此，通过进一步优化ddNTP的种类，有利于提高检测精度和检测灵敏度。
优选地，以模板区域上能够与所添加的ddNTP所包括的碱基互补配对的第一个碱基为终止碱基，在步骤一中，所添加的ddNTP的种类满足，终止碱基与引物5’端末端碱基的距离＞1nt。通过控制终止碱基在模板区域的分布情况，有利于使不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下得到的第二延伸产物与第一延伸产物至少相差2个核苷酸（或2个碱基），由此，使不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下得到的第二延伸产物的TM2与第一延伸产物的TM1拉开差距（具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶作用下得到的第二延伸产物的TM2与第一延伸产物的TM1的相对大小为TM2/TM1=1.00±0.05），从而有效地提高了利用TM1、TM2相对大小判断DNA聚合酶单碱基延伸能力的准确度和灵敏度，降低检测结果出现假阳性的风险。
优选地，步骤一和/或步骤二进行延伸反应的温度为37~75℃，时间为15~30分钟。
优选地，步骤一进行延伸反应的原料还包括反应缓冲液（Buffer）、荧光染料。
优选地，荧光染料包括SYBR染料、ROX染料。
根据本发明的另一个方面，提供上述引物在制备检测具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶的试剂盒中的应用。
根据本发明的另一个方面，提供一种检测具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶的试剂盒，包括上述引物。
附图说明
图1为本发明实施例1组1的第一延伸产物、组3的第一延伸产物、组4的第一延伸产物以及组2的第二延伸产物的熔解曲线。
图2为本发明实施例1组5的第一延伸产物、组7的第一延伸产物、组8的第一延伸产物以及组6的第二延伸产物的熔解曲线。
图3为本发明实施例2进行第一次熔解曲线分析所得到的组1~7的第一延伸产物的熔解曲线。
图4为本发明实施例2进行第一次熔解曲线分析所得到的组12~18的第一延伸产物的熔解曲线。
图5为本发明实施例2进行第二次熔解曲线分析所得到的组1~7的第一延伸产物以及组8~11的第二延伸产物的熔解曲线。
图6为本发明实施例2进行第二次熔解曲线分析所得到的组12~18的第一延伸产物以及组19~22的第二延伸产物的熔解曲线。
图7为本发明对比例1组1的第一延伸产物、组3的第一延伸产物、组4的第一延伸产物以及组2的第二延伸产物的熔解曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
1、检测DNA聚合酶单碱基延伸能力，包括如下操作：
（1）步骤一，
准备试剂及配置反应体系，反应体系如表1所示。
表1.实施例1的反应体系
表1中DNA聚合酶包括待测DNA聚合酶，待测DNA聚合酶包括已经确认的具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司）、已经确认的不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司）。
表1中引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体的核苷酸序列为：5’-GACTCAACTTCGCTCACGCTGATGTAGATCATCAGCGTGAG-3’（引物的总长度为41nt，模板区域的长度为12nt，第一互补区域、第二互补区域的长度为12nt，非互补区域的长度为5nt，引物的GC含量为51%，其中，引物模板区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体的核苷酸序列为：5’-GACTCAACTTCG-3’）。
表1中NTPs包括ddNTP和dNTP，NTPs和DNA聚合酶的具体添加方案如表2所示（“+”表示添加有对应的组份）。
表2.实施例1组1~8的NTPs和DNA聚合酶的添加方案
组别 1 2 3 4 5 6 7 8
具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶 + + +
不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶 + + +
10mM ddATP 1μL
10mM ddTTP 1μL
10mM ddCTP 1μL
10mM ddGTP 1μL + + + + + +
10mM dATP 1μL + + + + + + + +
10mM dTTP 1μL + + + + + + + +
10mM dCTP 1μL + + + + + + + +
10mM dGTP 1μL + +
按照表1反应体系，组1~8添加除了NTPs、待测DNA聚合酶外的其他组份，振荡器混合均匀20s，离心10s，配置总的反应体系；将总的反应体系分装至8联排PCR管中，共8管，对应表2中8个实验组（组1~8）；然后按照表2组1~8中NTPs、待测DNA聚合酶的添加方案，添加不同实验组各自的NTPs、待测DNA聚合酶；然后盖上PCR管盖，振荡器混合均匀20s，离心10s。在1min内将组1、3、4、5、7、8放置于4℃环境（冰箱冷藏）中，然后将组2、组6放置于37℃环境（烘箱）中进行第一次延伸反应30min，得到组2、组6的第一延伸产物。
（2）步骤二，
在组2、组6第一次延伸反应结束后，向其中加入10mM dGTP 1μL，振荡器混合均匀20s，离心10s；然后，将组2、组6放置于37℃环境中（烘箱）进行第二次延伸反应30min，得到组2、组6的第二延伸产物（在组2、组6进行第二次延伸反应的同时将组1、组3、组4、组5、组7、组8放置于37℃环境中进行第一次延伸反应30min，得到组1、组3、组4、组5、组7、组8的第一延伸产物）。
用PCR仪，选择含有SYBR和ROX的项目的通道，按表3程序对组1、组3、组4、组5、组7、组8的第一延伸产物以及组2、组6的第二延伸产物进行熔解曲线分析。将组1、组3、组4、组5、组7、组8的第一延伸产物测得的TM值分别标记为组1、组3、组4、组5、组7、组8的TM1，将组2的第二延伸产物测得的TM值标记为组2的TM2，将组6的第二延伸产物的测得的TM值标记为组6的TM2。
表3.进行熔解曲线分析的程序
（3）步骤三，
基于组1的第一延伸产物的TM1、组3的第一延伸产物的TM1、组4的第一延伸产物的TM1以及组2的第二延伸产物的TM2，组5的第一延伸产物的TM1、组7的第一延伸产物的TM1、组8的第一延伸产物的TM1以及组6的第二延伸产物的TM2，判断待测各组检测的DNA聚合酶是否具有单碱基延伸能力，其具体的判断标准见本实施例下文第4点所记载的“判断标准”。
2、结果预测
表4.实施例1组1~8的结果预测
组别 1 2 3 4 5 6 7 8
具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶 + + +
不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶 + + +
10mM ddATP 1μL
10mM ddTTP 1μL
10mM ddCTP 1μL
10mM ddGTP 1μL + + + + + +
10mM dATP 1μL + + + + + + + +
10mM dTTP 1μL + + + + + + + +
10mM dCTP 1μL + + + + + + + +
10mM dGTP 1μL + +
4℃保存30min，限制延伸反应 + + + + + +
37℃（第一次）延伸反应30min + +
补加10mM dGTP 1μL + +
37℃（第二次）延伸反应30min + + + + + + + +
预期结果（碱基延伸个数） 2 2 12 0 1 12 12 0
基于引物如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，可以知道，引物延伸过程中需要用到的碱基依次为C、G、A、A、G、T、T、G、A、G、T、C。组1检测的DNA聚合酶为具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司），所采用的NTPs为dATP、dTTP、dCTP、ddGTP，由于反应体系中含有ddGTP，不含有dGTP，且单碱基延伸酶能够利用ddGTP，当引物延伸至与模板区域3’端第二个碱基C进行互补配对时，ddGTP插入，然后延伸反应终止，因此，组1引物的延伸长度为2个碱基，分别为C和G。组2在37℃第一次延伸反应30min后向反应体系中补加了dGTP进行第二次延伸反应，由于组2检测的单碱基延伸酶具备单碱基延伸能力，当引物延伸至与模板区域3’端第二个碱基C结合时，ddGTP插入使引物失去延伸能力，即使后续补加dGTP并进行第二次延伸反应，引物也无法继续延伸，因此，组2引物的延伸长度为2个碱基，分别为C和G。组3检测的DNA聚合酶为具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司），由于反应体系中同时添加了四种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），且没有添加ddNTP，因此，组3引物能够延伸至最大延伸长度12个碱基。组4作为空白组，反应体系中不含有DNA聚合酶，引物不延伸。
组5检测的DNA聚合酶为不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司），所采用的NTPs为dATP、dTTP、dCTP、ddGTP，由于反应体系中含有ddGTP，不含有dGTP，且不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶不能够利用ddGTP，当引物延伸至与模板区域3’端第二个碱基C进行互补配对时，延伸反应终止，因此，组5引物的延伸长度为1个碱基。组6在37℃第一次延伸反应30min后向反应体系中补加了dGTP进行第二次延伸反应，由于组6所检测的DNA聚合酶不具备单碱基延伸能力，在第一次延伸过程中引物延伸至与模板区域3’端第二个碱基C结合时ddGTP没有插入，后续补加dGTP进行第二次延伸反应时，引物能够继续延伸，达到最大延伸长度12个碱基。组7检测的DNA聚合酶为不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司），由于反应体系中同时添加了四种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），且没有添加ddNTP，因此，组7引物能够延伸至最大延伸长度12个碱基。组8作为空白组，反应体系中不含有DNA聚合酶，引物不能延伸。
3、检测结果
在上述参试的实验组中，组1、组2、组3、组4中添加的DNA聚合酶种类相同，均为具有单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司），组5、组6、组7、组8中添加的DNA聚合酶种类相同，均为不具有单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司），基于此，将组1、组2、组3、组4的实验结果进行比对，将组5、组6、组7、组8的实验结果进行比对。在组1、组2、组3、组4所设计的实验中：仅组2是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dNTP的处理获得第二延伸产物，而组2获得第一延伸产物的实验操作与组1获得第一延伸产物的实验操作完全一致，理论上组1制得的第一延伸产物的TM1与组2制得的第一延伸产物的TM1相等，基于此，可通过组1制得的第一延伸产物的TM1与组2制得的第二延伸产物的TM2的比对反映组2的第一延伸产物的TM1与第二延伸产物的TM2的相对大小关系，通过比对，组1制得的第一延伸产物的TM1与组2制得的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05；组1的第一延伸产物、组3的第一延伸产物、组4的第一延伸产物以及组2的第二延伸产物的熔解曲线如图1所示，由图1可知，图1所展示的各延伸产物的TM值与上述“结果预测”记载的内容中各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。在组5、组6、组7、组8所设计的实验中：仅组6是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dNTP的处理获得第二延伸产物，参照上述对组1第一延伸产物的TM1与组2第二延伸产物的TM2的对应关系，将组5制得的第一延伸产物的TM1与组6制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；组5的第一延伸产物、组7的第一延伸产物、组8的第一延伸产物以及组6的第二延伸产物的熔解曲线如图2所示，由图2可知，图2所展示的各延伸产物的TM值与上述“结果预测”记载的内容中各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。
4、判断标准及判断结果
判断标准：
（1）关于按照上述操作获得第二延伸产物的实验组，将其与在本实施例的上述“步骤一”中按照相同的NTPs添加方案（参见上文表2）获得的第一延伸产物进行对应，将前者获得的第二延伸产物的TM2与后者获得的第一延伸产物的TM1进行比对（如将组1获得的第一延伸产物的TM1与组2获得的第二延伸产物的TM2进行比对，又如将组5获得的第一延伸产物的TM1与组6获得的第二延伸产物的TM2进行比对），判断是否满足TM2/TM1=1.00±0.05；
（2）对各实验组实际测得的第一延伸产物的TM1、第二延伸产物的TM2进行大小排序，判断各延伸产物的TM值的相对大小是否与上述“结果预测”记载的内容中各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。
当实验结果按照上述判断标准中的第（1）点判断，满足TM2/TM1=1.00±0.05，同时，实验结果按照上述判断标准中的第（2）点判断，满足各延伸产物的TM值的相对大小与预测的各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系，说明待测的DNA聚合酶具备单碱基延伸能力。若无法同时满足上述两个条件，则需要检查实验过程是否出现问题，排除干扰因素后重复实验。理论上接受检测的DNA聚合酶如具有单碱基延伸能力，应当同时满足上述两个条件。
判断结果：
如上所述，按照判断标准的第（2）点，本实施例所设置的组1~4以及本实施例所设置的组5~8均满足各延伸产物的TM值的相对大小与预测的各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。然而，按照上述判断标准的第（1）点，在组1~4中，用于进行TM值比对的组1的第一延伸产物的TM1与组2的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05，在组5~8中，用于进行TM值比对的组5的第一延伸产物的TM1与组6的第二延伸产物的TM2不满足TM2/TM1=1.00±0.05。依据上述判断标准得出组1~4中检测的DNA聚合酶具备单碱基延伸能力，组5~8中检测的DNA聚合酶不具备单碱基延伸能力，该结果与实验设计情况相符，由此验证上述判断标准合理。因此，基于本实施例所提供的引物和检测方法能够成功地筛选到具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶。
实施例2
1、检测DNA聚合酶单碱基延伸能力，包括如下操作：
（1）步骤一，
准备试剂及配置反应体系，反应体系如表5所示。
表5.实施例2的反应体系
表5中DNA聚合酶包括待测DNA聚合酶，待测聚合酶包括已经确认的具有单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司）、已经确认的不具有单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司）。
表5中引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体的核苷酸序列为：5’-GACTCAACTTCGTCACGCTGATGTAGATCATCAGCGTGA-3’（引物的总长度为39nt，模板区域的长度为12nt，第一互补区域、第二互补区域的长度为11nt，非互补区域的长度为5nt，引物的GC含量为49%，其中，引物模板区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体的核苷酸序列为：5’-GACTCAACTTCG-3’）。
表5中NTPs包括ddNTP、dNTPs，NTPs和待测DNA聚合酶的具体添加方案如表6所示（“+”表示添加有对应的组份）。
表6.实施例2组1~22的NTPs和DNA聚合酶的添加方案
组别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶 + + + + + + + + + + +
不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶 + + + + + + + + + + +
10mM ddATP + + + + + +
10mM ddTTP + + + + + +
10mM ddCTP + + + + + +
10mM ddGTP + + + + + +
10mM dATP + + + + + + + + + + + + + +
10mM dTTP + + + + + + + + + + + + + +
10mM dCTP + + + + + + + + + + + + + +
10mM dGTP + + + + + + + + + + + + + +
按照表5反应体系，组1~22添加除了NTPs、待测DNA聚合酶外的其他组份，振荡器混合均匀20s，离心10s，配置总的反应体系；将总的反应体系分装至8联排PCR管中，8管对应表6中22个实验组（组1~22）；然后按照表6组1~22中NTPs、待测DNA聚合酶的添加方案，添加组1~22各自的NTPs、待测DNA聚合酶；然后盖上PCR管盖，振荡器混合均匀20s，离心10s。然后将1~22置于37℃环境（烘箱）中进行第一次延伸反应30min，得到组1~22的第一延伸产物。
用PCR仪，选择含有SYBR和ROX的项目的通道，按表3程序对组1~7、组12~18的第一延伸产物进行第一次熔解曲线分析（进行第一次熔解曲线分析时，组8~11、组19~22放入4℃冰箱）。
（2）步骤二，
对组1~7、组12~18的第一延伸产物进行第一次熔解曲线分析后，分别向组1~7、组12~18中补加1μL的去核酸水，放入4℃冰箱保存。按照表7，对组8~11、组19~22补加dNTP，振荡器混合均匀20s，离心10s，然后将组8~11、组19~22置于37℃环境中（烘箱）进行第二次延伸反应30min，反应结束后取出，得到组8~11、组19~22的第二延伸产物。
用PCR仪，选择含有SYBR和ROX的项目的通道，按表3程序对组1~7、组12~18的第一延伸产物以及组8~11、组19~22的第二延伸产物进行第二次熔解曲线分析。将组1~7、组12~18的第一延伸产物测得的TM值分别标记为组1~7、组12~18的TM1，将组8~11的第二延伸产物测得的TM值分别标记为组8~11的TM2，将组19~22的第二延伸产物测得的TM值分别标记为组19~22的TM2。
（3）步骤三，
基于组1~7的第一延伸产物的TM1以及组8~11的第二延伸产物的TM2，组12~18的第一延伸产物的TM1以及组19~22的第二延伸产物的TM2，判断各组检测的DNA聚合酶是否具有单碱基延伸能力，其具体的判断标准参见实施例1第4点所记载的“判断标准”。
2、结果预测
表7.实施例2组8~11、组19~22的dNTP补加方案及结果预测
组别 8 9 10 11 19 20 21 22
具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶 + + + +
不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶 + + + +
10mM ddATP + +
10mM ddTTP + +
10mM ddCTP + +
10mM ddGTP + +
10mM dATP + + + + + +
10mM dTTP + + + + + +
10mM dCTP + + + + + +
10mM dGTP + + + + + +
37℃（第一次）延伸反应30min + + + + + + + +
补加10mM dATP + +
补加10mM dTTP + +
补加10mM dCTP + +
补加10mM dGTP + +
37℃（第二次）延伸反应30min + + + + + + + +
预期结果（碱基延伸个数） 3 6 1 2 12 12 12 12
表8.实施例2组1~7、12~18的结果预测
组别 1 2 3 4 5 6 7 12 13 14 15 16 17 18
具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶 + + + + + + +
不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶 + + + + + + +
10mM ddATP + + + +
10mM ddTTP + + + +
10mM ddCTP + + + +
10mM ddGTP + + + +
10mM dATP + + + + + + + +
10mM dTTP + + + + + + + +
10mM dCTP + + + + + + + +
10mM dGTP + + + + + + + +
37℃（第一次）延伸反应30min + + + + + + + + + + + + + +
预期结果（碱基延伸个数） 3 6 1 2 0 12 1 2 5 0 1 0 12 0
根据引物如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，可以知道，引物延伸过程中需要用到的碱基依次为C、G、A、A、G、T、T、G、A、G、T、C。组1~7检测的DNA聚合酶为具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司），其中，组1~4所采用的NTPs均只含一种ddNTP（分别为ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）和其他三种dNTP，由于具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶能够利用ddNTP，当引物延伸至与终止碱基（与所添加的ddNTP所包括的碱基互补配对的第一个碱基）互补配对时，ddNTP插入，然后延伸反应终止，因此，组1~4引物分别延伸了3、6、1、2个碱基。组5作为空白组，反应体系中不含有dNTP、ddNTP，引物不延伸。组6反应体系中含有四种dNTP，不含有ddNTP，引物能够延伸至最大延伸长度12个碱基。组7反应体系中所添加的NTPs只含有四种ddNTP，引物只能延伸1个碱基。组8、组9、组10、组11是分别在组1、组2、组3、组4的基础上，补加了dNTP（该dNTP的碱基种类与相应实验组第一次延伸反应中添加的ddNTP所包括的碱基种类相同）进行第二次延伸反应，由于具备单碱基延伸能力的单碱基延伸酶可以利用ddNTP，第一次延伸反应时ddNTP插入使引物失去延伸能力，即使后续补加dNTP（该dNTP的碱基种类与相应实验组ddNTP所包括的碱基种类相同）进行第二次延伸反应，引物也无法继续延伸，因此，组8、组9、组10、组11的碱基延伸个数分别与组1、组2、组3、组4相同。
组12~18检测的DNA聚合酶为不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司），其中，组12~15所采用的NTPs均只含一种ddNTP（分别为ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）和其他三种dNTP，由于不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶不能够利用ddNTP，当引物延伸至与终止碱基互补配对时，引物停止延伸，因此，组12~15引物分别延伸了2、5、0、1个碱基。组16作为空白组，反应体系中不含有dNTP、ddNTP，引物不延伸。组17反应体系中含有四种dNTP，不含有ddNTP，引物能够延伸至最大延伸长度12个碱基。组18反应体系中只含有四种ddNTP，不含有dNTP，由于不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶不能利用ddNTP，引物不能延伸。组19、组20、组21、组22是分别在组12、组13、组14、组15的基础上，补加了dNTP（该dNTP的碱基种类与相应实验组第一次延伸反应中添加的ddNTP所包括的碱基种类相同）进行第二次延伸反应，由于不具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶不可以利用ddNTP，当后续补加了dNTP后，引物能够继续延伸，且能够延伸至最大延伸长度12个碱基。
3、检测结果
在上述参试的实验组中，组1~11中添加的DNA聚合酶种类相同，均为具有单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司），组12~22中添加的DNA聚合酶种类相同，均为不具有单碱基延伸能力的DNA聚合酶（购自广东国盛医学科技有限公司），基于此，将组1~11的实验结果进行比对，将组12~22的实验结果进行比对。在组1~11所设计的实验中：仅组8~11是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dNTP的处理获得第二延伸产物，其中，组8是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dATP的处理获得第二延伸产物，而组8获得第一延伸产物的实验操作与组1获得第一延伸产物的实验操作完全一致，理论上组1制得的第一延伸产物的TM1与组8制得的第一延伸产物的TM1相等，基于此，可通过组1制得的第一延伸产物的TM1与组8制得的第二延伸产物的TM2的比对反映组8的第一延伸产物的TM1与第二延伸产物的TM2的相对大小关系，通过比对，组1制得的第一延伸产物的TM1与组8制得的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05，同理，组9是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dTTP的处理获得第二延伸产物，组10是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dCTP的处理获得第二延伸产物，组11是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dGTP的处理获得第二延伸产物，参照上述对组1第一延伸产物的TM1与组8第二延伸产物的TM2的对应关系，将组2制得的第一延伸产物的TM1与组9制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；将组3制得的第一延伸产物的TM1与组10制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；将组4制得的第一延伸产物的TM1与组11制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；进行第一次熔解曲线分析所得到的组1~7的第一延伸产物的熔解曲线如图3所示，进行第二次熔解曲线分析所得到的组1~7的第一延伸产物以及组8~11的第二延伸产物的熔解曲线如图5所示，由图3、5可知，图3、5所展示的各延伸产物的TM值与上述“结果预测”记载的内容中各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。
在组12~22所设计的实验中：仅组19~22是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dNTP的处理获得第二延伸产物，其中，组19是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dATP的处理获得第二延伸产物，组20是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dTTP的处理获得第二延伸产物，组21是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dCTP的处理获得第二延伸产物，组22是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dGTP的处理获得第二延伸产物，参照上述对组1第一延伸产物的TM1与组2第二延伸产物的TM2的对应关系，将组12制得的第一延伸产物的TM1与组19制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；将组13制得的第一延伸产物的TM1与组20制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；将组14制得的第一延伸产物的TM1与组21制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；将组15制得的第一延伸产物的TM1与组22制得的第二延伸产物的TM2进行比对，结果显示TM2/TM1＞1.05；进行第一次熔解曲线分析所得到的组12~18的第一延伸产物的熔解曲线如图4所示，进行第二次熔解曲线分析所得到的组12~18的第一延伸产物以及组19~22的第二延伸产物的熔解曲线如图6所示，由图4、6可知，图4、6所展示的各延伸产物的TM值与上述“结果预测”记载的内容中各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。
4、判断标准及判断结果
判断标准：本实施例的判断标准参见实施例1第4点所记载的“判断标准”。
判断结果：
如上所述，按照判断标准的第（2）点，本实施例所设置的组1~11以及本实施例所设置的组12~22均满足各延伸产物的TM值的相对大小与预测的各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。然而，按照上述判断标准的第（1）点，在组1~11中，用于进行TM值比对的组1的第一延伸产物的TM1与组8的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05，用于进行TM值比对的组2的第一延伸产物的TM1与组9的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05，用于进行TM值比对的组3的第一延伸产物的TM1与组10的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05，用于进行TM值比对的组4的第一延伸产物的TM1与组11的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05，在组12~22中，用于进行TM值比对的组12的第一延伸产物的TM1与组19的第二延伸产物的TM2不满足TM2/TM1=1.00±0.05，用于进行TM值比对的组13的第一延伸产物的TM1与组20的第二延伸产物的TM2不满足TM2/TM1=1.00±0.05，用于进行TM值比对的组14的第一延伸产物的TM1与组21的第二延伸产物的TM2不满足TM2/TM1=1.00±0.05，用于进行TM值比对的组15的第一延伸产物的TM1与组22的第二延伸产物的TM2不满足TM2/TM1=1.00±0.05。依据上述判断标准得出组1~11中检测的DNA聚合酶具备单碱基延伸能力，组12~22中检测的DNA聚合酶不具备单碱基延伸能力，该结果与实验设计情况相符，由此验证上述判断标准合理。因此，基于本实施例所提供的引物和检测方法能够成功地筛选到具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶。
对比例1
1、检测DNA聚合酶单碱基延伸能力，包括如下操作：
本对比例参照实施例1组1~4检测DNA聚合酶单碱基延伸能力，本对比例与实施例1组1~4构成区别的是：本对比例所采用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体的核苷酸序列为：5’-TAGCGAAGGATGTGACTCAACTTCGTGCTCCCGCGGCCGATCTGCCGGCCGCGGGAGCA-3’（引物的总长度为59nt，模板区域的长度为25nt，第一互补区域、第二互补区域的长度为14nt，非互补区域的长度为6nt，引物的GC含量为66%）。除了上述区别以外，本对比例所采用的物料以及工艺操作与实施例1组1~4严格保持一致。
2、结果预测
本对比例的结果预测参见实施例1第2点所记载的“结果预测”（参见上文表4中的组1~4）。
3、检测结果
在上述参试的实验组中，组1、组2、组3、组4中添加的DNA聚合酶种类相同，均为具有单碱基延伸能力的单碱基延伸酶（购自广东国盛医学科技有限公司），基于此，将组1、组2、组3、组4的实验结果进行比对，在组1、组2、组3、组4所设计的实验中：仅组2是在其所获得的第一延伸产物的基础上通过补加dNTP的处理获得第二延伸产物，而组2获得第一延伸产物的实验操作与组1获得第一延伸产物的实验操作完全一致，理论上组1制得的第一延伸产物的TM1与组2制得的第一延伸产物的TM1相等，基于此，可通过组1制得的第一延伸产物的TM1与组2制得的第二延伸产物的TM2的比对反映组2的第一延伸产物的TM1与第二延伸产物的TM2的相对大小关系，通过比对，组1制得的第一延伸产物的TM1与组2制得的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05；组1的第一延伸产物、组3的第一延伸产物、组4的第一延伸产物以及组2的第二延伸产物的熔解曲线如图7所示，由图7可知，图7所展示的各延伸产物的TM值与上述“结果预测”记载的内容中各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数不存在明显的相关性。
4、判断标准及判断结果
判断标准：本对比例的判断标准参见实施例1第4点所记载的“判断标准”。
判断结果：
如上所述，按照上述判断标准的第（1）点，在组1~4中，用于进行TM值比对的组1的第一延伸产物的TM1与组2的第二延伸产物的TM2满足TM2/TM1=1.00±0.05。然而，按照判断标准的第（2）点，本实施例所设置的组1~4不满足各延伸产物的TM值的相对大小与预测的各延伸产物相对于引物的碱基延伸个数呈明显的正相关关系。依据上述判断标准无法得出组1~4中检测的DNA聚合酶是否具备单碱基延伸能力，检测失败，需要检查实验过程是否出现问题，排除干扰因素后重复实验。
检测失败的原因在于，本对比例所采用的引物的序列过长，达到59nt，GC含量过高，达到66%，导致本对比例所提供的引物的延伸产物的TM值与延伸产物相对于引物的碱基延伸个数不存在明显相关性，由此无法利用TM1、TM2的相对大小实现对DNA聚合酶单碱基延伸能力的判断。
而在实施例1和实施例2中所采用的引物具有合适的序列长度及GC含量，该引物的延伸产物的TM值与其碱基延伸个数呈明显的正相关关系，由此，利用实施例1和实施例2中所采用的引物及检测方法能够准确地判断DNA聚合酶是否具备单碱基延伸能力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种引物，其特征在于：所述引物为单链DNA，
沿5’到3’方向，所述引物包括依次连接的模板区域、第一互补区域、非互补区域、第二互补区域，所述第一互补区域与所述第二互补区域的碱基完全互补；
所述引物的总长度为35~45nt，鸟嘌呤和胞嘧啶在所述引物所有碱基中的数量占比为45%~55%，所述模板区域的长度为10~14nt，所述模板区域含有4种碱基。
2.如权利要求1所述引物，其特征在于：所述模板区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求2所述引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQID No.3所示。
4.一种检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，其特征在于：所述方法包括如下操作：
步骤一，向如权利要求1~3任一项所述引物中加入待测DNA聚合酶和NTPs进行延伸反应，得到第一延伸产物，按照碱基种类进行区分，所述NTPs由n1种ddNTP和n2种dNTP构成，n1取自1~4中的任意正整数，n1+n2=4，且，当n2不为0，在本步骤中，所添加的dNTP的碱基种类与所添加的任一种ddNTP的碱基种类皆不相同，以所述第一延伸产物的熔解温度为TM1；
步骤二，向所述第一延伸产物中加入n1种dNTP进行延伸反应，得到第二延伸产物，在本步骤中添加的dNTP的碱基种类与在所述步骤一中所述ddNTP所含有的碱基种类相同，以所述第二延伸产物的熔解温度为TM2；
步骤三，基于所述TM1、所述TM2的相对大小判断所述待测DNA聚合酶的单碱基延伸能力；当TM2/TM1=1.00±0.05时，得出所述待测DNA聚合酶具备单碱基延伸能力的结论；当TM2/TM1＞1.05时，得出所述待测DNA聚合酶不具备单碱基延伸能力的结论。
5.如权利要求4所述检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，其特征在于：在所述步骤一中，所添加的ddNTP包括ddGTP、ddCTP中的至少一种。
6.如权利要求4所述检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，其特征在于：
以所述模板区域上能够与所添加的ddNTP所包括的碱基互补配对的第一个碱基为终止碱基，在所述步骤一中，所添加的ddNTP的种类满足，所述终止碱基与所述引物5’端末端碱基的距离＞1nt。
7.如权利要求4所述检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，其特征在于：所述步骤一和/或所述步骤二进行所述延伸反应的温度为37~75℃，时间为15~30分钟。
8.如权利要求4所述检测DNA聚合酶单碱基延伸能力的方法，其特征在于：所述步骤一进行所述延伸反应的原料还包括反应缓冲液、荧光染料。
9.如权利要求1~3任一项所述引物在制备检测具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶的试剂盒中的应用。
10.一种检测具备单碱基延伸能力的DNA聚合酶的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1~3任一项所述引物。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1354261A (zh) * 2000-11-22 2002-06-19 吴昌 单碱基延伸信号鉴别方法
CN103882114A (zh) * 2014-01-09 2014-06-25 华晶基因技术有限公司 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法
CN106636076A (zh) * 2015-10-28 2017-05-10 盛司潼 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
CN107557463A (zh) * 2016-06-24 2018-01-09 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
CN111893216A (zh) * 2020-08-11 2020-11-06 北京毅新博创生物科技有限公司 核酸质谱检测dna/rna的产品及检测方法
CN115135664A (zh) * 2020-06-22 2022-09-30 苏州新海生物科技股份有限公司 一种核酸配体及其应用
CN116970690A (zh) * 2023-07-13 2023-10-31 陕西科技大学 一种dna序列的熔解测定方法及试剂盒
CN117143978A (zh) * 2023-08-30 2023-12-01 天津大学 颈环寡核苷酸及其在含有z碱基的制备方法中的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1354261A (zh) * 2000-11-22 2002-06-19 吴昌 单碱基延伸信号鉴别方法
CN103882114A (zh) * 2014-01-09 2014-06-25 华晶基因技术有限公司 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法
CN106636076A (zh) * 2015-10-28 2017-05-10 盛司潼 一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
CN107557463A (zh) * 2016-06-24 2018-01-09 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
CN115135664A (zh) * 2020-06-22 2022-09-30 苏州新海生物科技股份有限公司 一种核酸配体及其应用
CN111893216A (zh) * 2020-08-11 2020-11-06 北京毅新博创生物科技有限公司 核酸质谱检测dna/rna的产品及检测方法
CN116970690A (zh) * 2023-07-13 2023-10-31 陕西科技大学 一种dna序列的熔解测定方法及试剂盒
CN117143978A (zh) * 2023-08-30 2023-12-01 天津大学 颈环寡核苷酸及其在含有z碱基的制备方法中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL LIEW等: "Nucleotide extension genotyping by high-resolution melting", 《J MOL DIAGN .》, vol. 12, no. 6, 16 September 2010 (2010-09-16), pages 731 - 738 *
王芳: "DNA序列的熔解测定及其在食源性致病菌鉴别检测中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 January 2024 (2024-01-15), pages 1 - 103 *

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