CN118284626A - Trem2抗原结合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容一般涉及组合物，其包括抗体，如单克隆抗体、单克隆抗体片段等，该抗体特异性结合TREM2蛋白或TREM2蛋白表位，如哺乳动物TREM2或人类TREM2，以及此类组合物在预防、降低风险或治疗有需要的个体中的用途。

Description

TREM2抗原结合蛋白及其用途

关于通过电子文档提交的序列表

序列表的XML文件名为“UTH-012PCT0_sequence_listing_ST26_FILED.XML”，尺寸为114KB，创建于2022年9月11日，并以电子方式提交给美国专利商标局的专利中心，其全部内容通过引用并入本申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年9月13日提交的名称为“TREM2抗原结合蛋白及其用途”的美国临时申请序列号63/243,431和2022年3月18日提交的名称为“TREM2抗原结合蛋白及其用途”的美国临时申请序列号63/321,235的权益。以上述申请的内容为依据，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及抗TREM2抗体及其治疗用途。

背景

阿尔茨海默病(AD)是种以β-淀粉样蛋白(Ab)沉积为特征的神经退行性疾病。大脑常住髓系细胞小胶质细胞是调节阿尔茨海默病病理和控制淀粉样蛋白病理的关键。研究发现，髓系细胞上表达的触发受体(TREM2)是小胶质细胞的关键调节因子，它能控制小胶质细胞的活化和脑组织中的新陈代谢活动。

髓系细胞上表达的触发受体-2(TREM2)的变异已被证明会增加迟发性AD的发病风险。小胶质细胞已被证明对Aβ积累和神经退行性病变做出反应，逐渐获得独特的转录和功能特性，最终形成疾病相关小胶质细胞(DAM)。在某些小鼠模型中，DAM可减轻神经退行性病变的进展，但不适当的DAM激活可能会加速神经退行性疾病的发生。TREM2对于在应激事件中维持小胶质细胞的新陈代谢能力、使小胶质细胞发展为完全成熟的DAM特征以及最终维持小胶质细胞对Aβ斑块诱导的病理学反应至关重要。

发明内容

本公开内容一般涉及组合物，其包括抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段等，该抗体特异性结合TREM2蛋白，如哺乳动物TREM2(如任何非人类哺乳动物)或人类TREM2，还涉及使用此类组合物的方法。

发明人已经创造并鉴定了具有TREM2结合特异性的某些单克隆抗体，TREM2是种触发受体蛋白，与应激事件中的小胶质细胞功能以及小胶质细胞对抗体斑块诱导的病理反应等有关。此外，研究人员还研制出了针对TREM2的激动剂单克隆抗体和针对TREM2的拮抗剂单克隆抗体。出乎意料地，上述拮抗剂单克隆抗体可用于治疗癌症。本公开提供了与TREM2具有亲和力的多肽、编码这些多肽的多核苷酸以及生产这些多肽的方法。

在一个方面，本公开提供了经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体特异性结合TREM2，并且其中

在另一个方面，本公开提供了宿主细胞，该细胞包括编码上述任一实施方案的多肽的多核苷酸分子。

这些和其他实施方案的更多细节见附图和下文说明。其他特征、目的和优点将从描述、附图和所附权利要求书中显而易见。

“激动剂”抗体或“活化”抗体是指抗体与抗原结合后能诱导(如增加)抗原的一种或多于一种活性或功能的抗体。

“拮抗剂”抗体或“阻断”抗体是指能在抗体与抗原结合后减少或消除(如减少)抗原与一种或多于一种配体的结合，和/或在抗体与抗原结合后减少或消除(如减少)抗原的一种或多于一种活性或功能的抗体。在某些实施方案中，拮抗剂抗体或阻断抗体基本上或完全抑制抗原与一种或多于一种配体的结合和/或抗原的一种或多于一种活性或功能。

本文所使用的与肽、多肽或抗体序列有关的“氨基酸序列同一性百分数(％)”和“同源性”是指候选序列中与特定肽或多肽序列中氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，在对序列对齐并在必要时引入间隙后，且不将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为确定氨基酸序列同一性百分比而进行的比对可以通过本领域技术人员掌握的各种方法实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN^TM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定测量比对的适当参数，包括本领域已知的任何算法，以实现被比对序列全长的最大比对。

编码抗体的“经分离的”核酸分子，如本公开的抗TREM2抗体，是已被识别并与至少一种在其生产环境中通常与其相关联的污染核酸分子分离的地核酸分子。优选，经分离的核酸与生产环境中的所有成分都没有关联。本文中编码多肽和抗体的经分离的核酸分子的形态与自然界中发现的形态或环境不同。因此，经分离的核酸分子有别于细胞中天然存在的多肽和抗体的编码核酸。

“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，它可以是或曾经是载体的受体，用于多核苷酸插入片段的整合。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于自然、意外或故意的突变，后代不一定与原始母细胞完全相同(形态或基因组DNA互补)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸在体内转染的细胞。

术语“包括”及其变体(例如，包含、具有等)在描述和权利要求中出现时不具有限制性含义。

本文中使用的“一个”、“一种”、“所述”、“至少一个”和“一个或多于一个”可以互换使用，除非上下文有明确规定。

除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语均具有本领域常用的含义。本文提供的定义是为了便于理解本申请中经常使用的某些术语，并不意味着排除在本公开内容中对这些术语的合理解释。

应理解，本文所描述的本公开的方面和实施方案包括“包括”、“由”和“基本上由”方面和实施例组成的方面和实施方案。

以上对本发明的概述并非旨在描述本发明所公开的每个实施方案或每个实现方案(implementation)。下面的描述更具体地举例说明了本发明的说明性实施方案。

附图说明

图1A-H.TREM2激动剂Ab18的筛选与表征。a.从噬菌体上显示的scFv与TREM2结合开始的TREM2抗体筛选策略示意图；b.通过流式细胞仪检测HEK293T细胞上表达的与细胞表面TREM2结合的候选抗体。MFI：平均荧光强度，n＝3个独立重复；c.候选抗体(10nM，n＝3个独立重复)在TREM2-DAP12 NFAT-EGFP报告细胞上的配体竞争曲线；d.候选抗体激活TREM2-DAP12 NFAT-EGFP报告细胞的滴定曲线。滴定曲线旁标有Ab18的EC₅₀。n＝3个独立重复；e.Ab18刺激小鼠新生小胶质细胞吞噬oAβ脂质的滴定曲线。MFI：平均荧光强度。n＝3个独立重复；f.示出了Ab18可刺激小鼠新生小胶质细胞的oAβ脂质吞噬作用的代表性免疫荧光成像。比例尺＝10μm；g.示出了Ab18与293T表面表达的TREM2结合的代表性免疫荧光成像，比例尺＝20μm；h.示出了Ab18与小鼠新生小胶质细胞结合的代表性免疫荧光成像，比例尺＝20μm。对于示出的所有数据，带误差条的柱状图代表平均值±SD。

图2A-I.TREM2激动剂Ab18的抗体工程和体外生物效应的表征。a.图显示了在Ab18的格式工程研究中使用的6种抗体格式。虽然没有描述，但所有抗体都携带LALAPG突变；b.在激活TREM2-DAP12 NFAT-EGFP报告细胞中各种候选Ab18格式的滴定曲线。滴定曲线旁标有Ab18 TVD-Ig的EC₅₀。n＝3个独立重复；c.示出了抗体处理的小鼠新生小胶质细胞中SYK磷酸化增加(以pSYK表示)的免疫印迹数据；d.小鼠新生小胶质细胞中抗体介导的SYK磷酸化滴定曲线。Y轴表示与β-肌动蛋白和未处理细胞对照归一化的倍数变化。n＝3独立重复；e.抗体介导的刺激小鼠新生小胶质细胞oAβ脂质吞噬的滴定曲线。MFI：平均荧光强度。n＝3个独立重复；f.示出了Ab18 TVD-Ig(10nM)可刺激小鼠新生小胶质细胞的oAβ脂质吞噬作用而Ab18 IgG则不起作用的代表性免疫荧光成像。比例尺＝10μm；g.示出了Ab18 TVD-Ig(10nM)可刺激小鼠新生小胶质细胞向oAβ脂质迁移而Ab18 IgG则不起作用的代表性免疫荧光成像。比例尺＝70μm；h.抗体介导的刺激小鼠新生小胶质细胞向oAβ脂质迁移的滴定曲线。Y轴显示迁移百分比，该百分比根据迁移细胞数除以细胞总数计算。n＝3个独立重复；i.低CSF1浓度(5ng/mL)下抗体介导刺激小鼠新生小胶质细胞存活的滴定曲线。Y轴显示活细胞ATP产生的发光值百分比。n＝3个独立重复。对于显示的所有数据，带误差条的柱状图表示平均值±SD。

图3A-H.Ab18 TVD-Ig增强TREM2活化的分子机制。a.示出了Ab18 TVD-Ig诱导TREM2聚集的SEC图谱，复合物的尺寸明显大于Ab18 IgG与TREM2之间形成的复合物；b.a中形成的抗体-TREM2复合物的洗脱体积。洗脱体积越小意味着分子量(尺寸)越大；c.示出了Ab18 TVD-Ig(10nM)可刺激小鼠新生小胶质细胞中的TREM2聚集，而Ab18 IgG仅显示细胞表面染色的代表性免疫荧光成像。比例尺＝20μm；d.抗体处理的新生小鼠小胶质细胞中TREM2细胞表面水平的流式细胞术结果。MFI：平均荧光强度。图例中标注了抗体处理和染色标记。n＝3个独立重复；e.示出了抗体处理的小鼠新生小胶质细胞上清液中的sTREM2水平的代表性免疫印迹数据；f.e中免疫印迹数据的定量。Y轴表示归一化至APP和未处理细胞对照的倍数变化。n＝3个独立重复；g.示出了抗体处理的小鼠新生小胶质细胞中TREM2的总水平的代表性免疫印迹数据；h.g中免疫印迹数据的定量。Y轴表示归一化至钙连蛋白和未处理细胞对照的倍数变化。n＝3个独立重复。对于显示的所有数据，带误差的柱状图代表平均值±SD。统计分析中，ns＝无统计学差异，双尾学生t检验。

图4A-G.Ab18/αTfR双特异性抗体表征。a.Ab18/αTfR和相应对照的双特异性抗体设计图；b.示出了Ab18和αTfR的单分子结合的夹心BLI研究。每条曲线中涉及的相应蛋白都标注在虚线上方，表示每个结合阶段的开始。“Wash”是指将传感器浸入空白动力学缓冲液中以允许自由解离；c.抗体处理TREM2-DAP12 NFAT-EGFP报告细胞的滴定曲线。用流式细胞仪测量EGFP+百分比。n＝3个独立重复；d.处理(腹腔注射20mg/kg)后指定时间点灌注大脑中的抗体浓度。n＝5只独立小鼠；e.如d所述处理后指定时间点血清中的抗体浓度。n＝5只独立小鼠；f.如d所述处理后指定时间点的脑/血清抗体浓度。Y轴显示的比率是以脑抗体浓度(nM)除以血清抗体浓度(M)乘以100计算得出的；g.示出了处理(腹腔注射20mg/kg)24小时后小鼠脑部的抗体分布情况的代表性免疫荧光成像。为检测Ab18的分布，使用了抗人二抗。同样的脑切片也用CD31(血管)、IBA1(小胶质细胞)和TO-PRO-3(细胞核)共同染色，以实现共定位可视化。比例尺＝20μm。对于显示的所有数据，带误差条的柱状图表示平均值±SD。

图5A-D.Ab18/αTfR改善5XFAD小鼠淀粉样蛋白病理。a.指定抗体处理5XFAD小鼠脑切片代表性淀粉样蛋白斑块免疫荧光染色(20mg/kg，从小鼠5月龄开始每周腹腔注射14次)。比例尺＝70μm；b.按a中所述方法处理的小鼠的6E10染色强度总定量。n＝5只独立小鼠；c.按a中所述方法处理的小鼠皮质中的淀粉样蛋白斑块负荷。n＝5只独立小鼠；d.按a中所述方法处理的小鼠海马体中的淀粉样蛋白斑块负荷。n＝5只独立小鼠。对于显示的所有数据，带误差条的柱状图代表平均值±SD。统计分析中，ns＝无统计学差异，***P<0.001，双尾学生t检验。

图6A-F.Ab18/αTfR在小胶质细胞和星形胶质细胞中对淀粉样斑块反应的影响。a.指定抗体处理5XFAD小鼠皮质中代表性淀粉样斑块-小胶质细胞共定位免疫荧光染色(20mg/kg，从小鼠5月龄开始每周腹腔注射14次)。比例尺＝20μm；b.按a中所述方法处理的5XFAD小鼠大脑皮层代表性的淀粉样斑块-CD68共定位免疫荧光染色。比例尺＝20μm；c.按a中所述方法处理的5XFAD小鼠大脑皮层代表性的淀粉样斑块-GFAP共定位免疫荧光染色。比例尺＝20μm；d.按a中所述方法处理的小鼠脑切片中淀粉样蛋白斑块30μm范围内IBA1面积的定量。n＝5只独立小鼠；e.按a中所述方法处理的小鼠脑切片中淀粉样蛋白斑块30μm范围内CD68面积的定量。n＝5只独立小鼠；f.按a中所述方法处理的小鼠脑切片中淀粉样蛋白斑块30μm范围内GFAP面积的定量。n＝5只独立小鼠。对于显示的所有数据，带误差条的柱状图表示平均值±SD。统计分析中，ns＝无统计学差异，***P<0.001，双尾学生t检验。

图7A-D.Ab18/αTfR改善神经元损伤，但不影响神经元总密度。a.用指定抗体处理的5XFAD小鼠皮层的代表性淀粉样蛋白斑块-LAMP1共定位免疫荧光染色(20mg/kg，从小鼠5月龄开始每周腹腔注射14次)。比例尺＝70μm；b.按a中所述方法处理的小鼠脑切片中淀粉样斑块30μm范围内LAMP1面积的定量。n＝5只独立小鼠；c.按a中所述方法处理的5XFAD小鼠脑切片中具有代表性的NeuN免疫荧光染色。比例尺＝70μm；d.按a中所述方法处理的小鼠脑切片中NeuN强度的定量。n＝5只独立小鼠。对于显示的所有数据，带误差条的柱状图代表平均值±SD。统计分析中，ns＝无统计学差异，***P<0.001，双尾学生t检验。

详细说明

本文提及的所有出版物均以引用方式并入本发明。

本公开内容描述了与TREM2具有结合亲和力的单克隆抗体及其片段。

抗TREM2抗体已在美国专利公开号US20190040130A1和PCT专利公开号WO2018195506A1中公开，其中每项专利的全部内容并入本文。与这些出版物中用于生产抗体的方法不同，本公开描述了通过淘选噬菌体展示文库来识别具有TREM2结合亲和力的克隆而生产的一些抗体。而本公开的其他单克隆抗体则是通过使用经免疫的兔的B细胞制造杂交瘤而产生的。这些单克隆抗体随后利用本领域已知的技术进行了人源化处理。

抗体

在某些实施方案中，预期与TREM2蛋白的至少一部分结合并调节(如激活、增加、减少或阻断)至少一种小胶质细胞功能抗体或其片段。本文所用术语“抗体”泛指任何免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和基因修饰的IgG以及包括抗体CDR结构域并保持抗原结合活性的多肽。抗体可选自嵌合抗体、亲和成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、抗原结合抗体片段或天然或合成配体。在一些实施方案中，TREM2结合抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

“抗体分子”包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，抗体不一定属于任何特定类别。根据抗体重链恒定区氨基酸序列的不同，免疫球蛋白可划分为不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类又可分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

本文所用的抗体分子的“抗原结合部分”是指完整抗体的一个或多于一个片段，这些片段保留了与目标分子(如TREM2)特异性结合的能力。抗体分子的抗原结合功能可由完整抗体的片段执行。抗体分子的术语“抗原结合部分”所包括的结合片段实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、由V_H和CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段、单结构域抗体(dAb)片段和经分离的互补决定区(CDR)。

术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域。“Fc区”可以是自然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能会有所不同，但人类IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226位或Pro230位的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区残基的编号与Kabat中的EU指数相同。免疫球蛋白的Fc区一般包括两个恒定域CH2和CH3。如本领域所知，Fc区可以二聚体或单体形式存在。

抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，可以是单独的，也可以是组合的。如本领域所知，重链和轻链的可变区分别由四个框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)组成，互补决定区又称超可变区，有助于形成抗体的抗原结合位点。当选择FR来修饰CDR时，例如当人源化或优化抗体时，来自含有相同标准类别CDR序列的抗体的FR是首选的。

本文所用术语“保守取代”是指用一个氨基酸取代另一个氨基酸，但不会明显有害地改变功能活性。“保守取代”的优选实例是用一个氨基酸取代另一个氨基酸(参见例如Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89:10915-10919)。

因此，通过已知的方法和本文所述的方法，可以制造出对TREM2蛋白、其一个或多于一个各自的表位或上述任何一种的缀合物具有特异性的单克隆抗体、抗体片段、结合域和CDR(包括上述任何一种的工程形式)，无论这些抗原或表位是从天然来源中分离出来的，还是天然化合物的合成衍生物或变体。

适用于本实施例的抗体片段实例包括但不限于：(i)由V_L、V_H、CL和CHI结构域组成的Fab片段；(ii)由V_H和CHI结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单个抗体的V_L和V_H结构域组成的“Fv”片段；(iv)由V_H结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab’)2片段，由两个相连的Fab片段组成的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中V_H结构域和V_L结构域通过肽接头连接，该肽接头允许两个结构域结合形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见，例如U.S.Pat.No.5,091,513)；(ix)双特异抗体，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(参见，例如US Patent App.Pub.No.20050214860，其全部内容通过引用并入本文)。Fv、scFv或双特异抗体分子可通过加入连接V_H和V_L结构域的二硫键来稳定。也可以制造包含与CH3结构域连接的scFv的微抗体(参见，例如Hu等人，1996,“Minibody:A NovelEngineered Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody Fragment(Single-Chain Fv-CH3)Which Exhibits Rapid,High-Level Targeting of Xenografts”,Cancer Res.56:3055-3061，其全部内容通过引用并入本文)。

在实施方案中还考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人(Murali,R.；Liu,Q.；Cheng,X.；Berezov,A.；Richter,M.；Furuchi,K.；Greene,M.I.；Zhang,H.Antibody likepeptidomimetics as large scale immunodetection probes.Cell.Mol.Biol.(Noisy-le-grand)2003,49:209-216，其全部内容通过引用并入本文)描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是作为精简抗体(pared-down antibodies)的肽类，并且具有血清半衰期更长以及合成方法更简便等优点。

单克隆抗体(或称“MAb”)是单一种类的抗体，其中每个抗体分子都能识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞都来自单一的B淋巴细胞系。产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与制备多克隆抗体的方法相同。在一些实施方案中，啮齿类动物如小鼠和大鼠被用于生成单克隆抗体。在一些实施方案中，兔子、绵羊或青蛙细胞被用于生成单克隆抗体。使用大鼠是众所周知的，而且可能具有某些优势。小鼠(如BALB/c小鼠)是常规的使用方法，通常能产生高比例的稳定融合。

杂交瘤技术是指将先前用TREM2抗原免疫过的小鼠的单个B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。这种技术提供了无限代繁殖单个抗体产生细胞的方法，从而可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体(单克隆抗体)。

血浆B细胞(CD45+CD5-CD19+)可从新鲜制备的免疫兔外周血单核细胞中分离出来，并进一步筛选出TREM2结合细胞。富集产生抗体的B细胞后，可分离总RNA并合成cDNA。可扩增重链和轻链抗体可变区的DNA序列，将其构建成噬菌体展示Fab表达载体，并转化到大肠杆菌中。可通过多轮富集筛选出与TREM2特异性结合的Fab，并对其进行测序。可使用哺乳动物表达载体系统在人胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中将筛选出的TREM2结合蛋白表达为兔和兔/人嵌合型全长IgG，并使用带有快速蛋白液相色谱(FPLC)分离装置的蛋白G树脂进行纯化。

在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，由非人类供体的抗原结合序列嫁接到非人类、人类或人源化的异源序列(如框架和/或恒定结构域序列)上的抗体。目前已开发出将单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域替换为人类来源的类似结构域的方法，但外来抗体的可变区保持不变。另外，“全人源”的单克隆抗体是在转人免疫球蛋白基因的小鼠体内产生的。通过重组构建同时具有啮齿动物(如小鼠)和人类氨基酸序列的抗体可变区，已经开发出将单克隆抗体的可变区转化为更人源化(more human form)的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有超变异CDR来自小鼠单克隆抗体，而框架和恒定区则来自人类氨基酸序列(参见，例如U.S.Pat.Nos.5,091,513和6,881,557，其全部内容通过引用并入本文)。人们认为，将抗体中具有啮齿类动物特征的氨基酸序列替换为人类抗体中相应位置的氨基酸序列，可以降低治疗使用过程中出现不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可能发生基因突变或其他变化，这可能会也可能不会改变杂交瘤产生的抗体的结合特异性。

在各种动物物种中生产多克隆抗体以及生产包括人源化、嵌合型和全人源的各种类型的单克隆抗体的方法，在本领域是众所周知的，并且具有很高的可预测性。例如，以下美国专利和专利申请提供了此类方法的授权说明，其全部内容通过引用并入本文：美国专利申请检索号2004/0126828和2002/0172677；以及U.S.Pat.Nos.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,196,265、4,275,149、4,277,437、4,366,241、4,469,797、4,472,509、4,606,855、4,703,003、4,742,159、4,767,720、4,816,567、4,867,973、4,938,948、4,946,778、5,021,236、5,164,296、5,196,066、5,223,409、5,403,484、5,420,253、5,565,332、5,571,698、5,627,052、5,656,434、5,770,376、5,789,208、5,821,337、5,844,091、5,858,657、5,861,155、5,871,907、5,969,108、6,054,297、6,165,464、6,365,157、6,406,867、6,709,659、6,709,873、6,753,407、6,814,965、6,849,259、6,861,572、6,875,434和6,891,024。

抗体可以从任何动物来源产生，包括鸟类和哺乳动物。抗体优选是绵羊抗体、鼠类抗体(如小鼠和大鼠)、兔抗体、山羊抗体、豚鼠抗体、骆驼抗体、马抗体或鸡抗体。此外，较新的技术允许从人类组合抗体库中开发和筛选人类抗体。例如，噬菌体抗体表达技术可以在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，如U.S.Pat.No.6,946,546中所述，其通过引用并入本文。

在不拘泥于理论的前提下，据信无论抗体的来源(如动物物种、单克隆细胞系或其他来源)如何，TREM2抗体都有能力通过与TREM2结合来调节人类小胶质细胞的活性。某些动物物种可能不太适合用于产生治疗性抗体，因为它们更有可能通过抗体的“Fc”部分激活补体系统，从而引起过敏反应。然而，全抗体可通过酶解被转化为“Fc”(补体结合)片段和具有结合域或CDR的抗体片段。去除Fc部分可降低抗原抗体片段引起不良免疫反应的可能性，因此不含Fc的抗体可优先用于预防或治疗。如上所述，抗体也可以构造成嵌合型或部分人源型或完全人源型，以减少或消除给动物施用由其他物种产生或具有其他物种序列的抗体所导致的不良免疫学后果。

根据设想，取代变体(substitutional variants)可包括在单克隆抗体蛋白的一个或多于一个位点上用一个氨基酸替换另一个氨基酸，并可用于调节多肽的一种或多于一种特性，同时或不损失其他功能或特性。取代可以是保守的，即用形状和电荷相似的氨基酸替换一个氨基酸。保守取代在本领域中是众所周知的，例如包括以下变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。另外，取代也可能是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守性变化通常涉及用化学性质不同的残基替代残基，如用极性或带电荷的氨基酸替代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。

本公开的蛋白质(如单克隆抗体)可以是分离的(如某种程度的富集和/或纯化)和/或重组的或体外合成的。另外，也可以从细菌中分离出非重组蛋白或重组蛋白。还可以考虑在组合物和方法中使用含有这种变体的细菌。因此，无需分离蛋白质。

因此，本公开提供了特异性结合TREM2的分离或重组单克隆抗体。在某些方面，提供了能与TREM2-Ab2Hu、TREM2-Ab8Hu、TREM2-Ab19Hu、TREM2-Ab1Rb、TREM2-Ab2Rb、TREM2-Ab6Rb、TREM2-Ab12Rb、TREM2-Ab16Rb、TREM2-Ab22Rb或TREM2-Ab26Rb单克隆抗体(均已在此公开和描述)竞争与TREM2的结合的抗体。在某些方面，抗体可包括TREM2-Ab2Hu、TREM2-Ab8Hu、TREM2-Ab19Hu、TREM2-Ab1Rb、TREM2-Ab2Rb、TREM2-Ab6Rb、TREM2-Ab12Rb、TREM2-Ab16Rb、TREM2-Ab22Rb或TREM2-Ab26Rb单克隆抗体的全部或部分重链可变区和/或轻链可变区。

抗体或优选抗体的免疫学部分可以化学缀合到或被表达为具有其他蛋白质的融合蛋白。就本说明书及所附权利要求书而言，所有此类融合蛋白都包括在抗体或抗体免疫学部分的定义中。

实施方案提供了针对TREM2、多肽和肽的抗体和抗体样分子，它们与至少一种制剂连接形成抗体缀合物或有效载荷。为了提高抗体分子作为诊断或治疗药物的疗效，传统的做法是将至少一种所需的分子或部分连接或共价结合或复合。这种分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报告分子。效应分子包括具有例如细胞毒性活性等所需活性的分子。附着在抗体上的效应分子的非限制性实例包括毒素、治疗酶、抗生素、放射性标记核苷酸等。相比之下，报告分子的定义是任何可使用检测方法检测的分子。与抗体连接的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、触媒、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、彩色颗粒或配体，如生物素。

在抗体与其缀合分子的附着或接合方面，本领域已知有多种方法。一些附着方法包括使用金属螯合物，例如将有机螯合剂二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)、乙烯三胺四乙酸、N-氯对甲苯磺酰胺和/或四氯-3a-6a-二苯基甘脲附着到抗体上。单克隆抗体也可在例如戊二醛或高碘酸盐等偶联剂存在下与酶反应。与荧光素标记物的缀合物可在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应制备。

在另一方面，本公开提供了可在合适宿主中表达(如转录和翻译)以产生TREM2结合多肽或其部分的多核苷酸。可以考虑通过本领域已知的方法将这些多核苷酸序列克隆到合适的表达载体中，并在体内或体外使用该表达载体表达由多核苷酸序列编码的TREM2结合多肽。

在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与H2-Hu-HC-DNA(SEQ ID NO:134)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与H8-Hu-HC-DNA(SEQ ID NO:135)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与19H-Hu HC-DNA(SEQ ID NO:136)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与16H-HC-DNA(SEQ ID NO:137)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与22H-HC-DNA(SEQ ID NO:138)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与26H-HC-DNA(SEQ ID NO:139)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与H2-Hu-HC-DNA(SEQ ID NO:140)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与H8-Hu-HC-DNA(SEQ ID NO:141)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与H19-Hu-HC-DNA(SEQ ID NO:142)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。

在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与20L-LC-DNA(SEQ ID NO:143)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与8L-LC-DNA(SEQ ID NO:144)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与19L LC-DNA(SEQ ID NO:145)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与1K-LC-DNA(SEQ ID NO:146)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与2K-LC-DNA(SEQ IDNO:147)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与6K-LC-DNA(SEQ IDNO:148)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与12K-LC-DNA(SEQID NO:149)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与16K-LC-DNA(SEQID NO:150)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与22K-LC-DNA(SEQID NO:151)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与26K-LC-DNA(SEQID NO:152)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的部分。

疾病治疗

本发明实施方案的某些方面可用于预防或治疗与TREM2调节蛋白相关的疾病或失调(例如，与β-淀粉样肽相关的脑部疾病和其他此类神经退行性疾病和失调，包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、痴呆、路易体痴呆(DLB)和其他疾病，包括神经炎症过程和涉及小胶质细胞的过程等)。任何与TREM2结合的抗体都可能增加或降低TREM2的活性。

“治疗”是指对对象施用或应用治疗剂，或对对象实施某种程序或方式，以获得疾病或健康相关状况的治疗效果。例如，治疗可包括施用药学有效量的调节TREM2生物活性的抗体。

“对象”和“患者”指人类或非人类，如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定的实施方案中，对象是人类。

本申请中使用的“治疗作用”或“治疗效果”是指在治疗该病症方面促进或提高对象健康的任何作用。这包括但不限于降低疾病征兆或症状的频率或严重程度。

药物制剂

在对含有抗体的治疗组合物进行临床应用时，制备适合预期应用的药物或治疗组合物通常是有益的。在某些实施方案中，药物组合物可包括例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及可在其中衍生的任何范围。

本发明实施方案中的治疗组合物优选以注射组合物的形式施用，可以是液体溶液或悬浮液；也可以制备适于注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式。这些制剂也可以乳化。

短语“药用或药理上可接受的”指的是给例如人等动物用药时不会产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，制备包括抗体或其他活性成分的药物组合物将为本领域技术人员所熟知。此外，对于动物(如人)施用，制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何及所有水性溶剂(如水、酒精/水溶液、生理盐水、肠外载体，如氯化钠、Ringer's葡萄糖等)、非水性溶剂(如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，如乙醇酸酯)、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延缓剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、螯合剂和惰性气体、等渗剂、吸收延迟剂、盐类、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、液体和营养补充剂，以及本领域普通技术人员已知的类似材料及其组合。药物组合物中各种成分的pH值和确切浓度根据众所周知的参数进行调整。

术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理离散单位，每个单位含有预定数量的治疗组合物，经计算可产生上文讨论的与施用相关的预期反应，即适当的途径和治疗方案。根据治疗次数和单位剂量确定的施用量取决于所需的效果。给患者或对象施用本发明实施方案的组合物的实际剂量可由物理和生理因素决定，如体重、对象的年龄、健康状况和性别、所治疗疾病的类型、疾病的渗透程度、先前或同时进行的治疗干预、患者的特异体质、施用途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，剂量还可包括每次施用约1mg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(此范围包括干预剂量(intervening doses))或多于1000mg/kg/体重，以及由此衍生的任何范围。在本文所列数字的非限制性推导范围示例中，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5mg/kg/体重至约500mg/kg/体重等范围。在任何情况下，负责施用的医师都将确定组合物中活性成分的浓度以及针对个体对象的适当剂量。

活性化合物可以配制成非肠道施用，例如，配制成通过静脉注射、肌肉注射、鞘内注射、皮下注射甚至腹膜内注射等途径。通常情况下，此类组合物可以配制成液体溶液或悬浮液；也可以配制成适合在注射前加入液体后配制溶液或悬浮液的固体形式；制剂还可以乳化。

适合注射使用的药剂形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；以及用于临时配制无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在任何情况下，制剂都必须是无菌的，必须具有流动性，以便于注射。此外，在生产和储存条件下还应保持稳定，并防止细菌和真菌等微生物的污染作用。

含蛋白质的组合物可以配制成中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，这些盐是与无机酸如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可以来自无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙基胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

药物组合物可包括溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们的适当混合物和植物油。例如，可以通过使用卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂来保持适当的流动性。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以防止微生物的作用。在许多情况下，优选加入等渗剂，例如糖或氯化钠。在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长注射组合物的吸收时间。

试剂盒和诊断

在实施方案的各个方面，设想含有治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些实施方案中，本实施方案设想了用于制备和/或施用本实施方案的疗法的试剂盒。该试剂盒可包括一个或多于一个密封小瓶，其中含有本发明实施方案的任何药物组合物。例如，试剂盒可包含至少一种抗TREM-2抗体以及用于制备、配制和/或施用本发明实施方案的成分或执行本发明方法的一个或多于一个步骤的试剂。在某些实施方案中，试剂盒还可包括合适的容器，即不会与试剂盒中的成分发生反应的容器，如Eppendorf管、化验板、注射器、瓶子或管。容器可以由塑料或玻璃等可消毒材料制成。

试剂盒还可包括说明书，该说明书概述了本文所述方法的程序步骤，并将遵循与本文所述或本领域普通技术人员已知的基本相同的程序。说明指令可以是包括机器可读指令的计算机可读介质，当使用计算机执行这些指令时，会显示出递送药用有效量治疗剂的真实或虚拟程序。

实施例

除非另有说明，否则下文所述实验和实施例产生的数据可参见Zhao等人(Sci.Transl.Med.14,eabq0095(2022)，其全部内容通过引用并入本文)。

方法

细胞系

HEK293T取自美国类型培养物保藏中心，用DMEM+10％ FBS培养。2B4细胞核因子活化T细胞(NFAT)-GFP报告细胞系用RPMI-1640+10％ FBS培养。

噬菌体展示的scFv抗体库的淘选

之前制备了噬菌体展示的scFv抗体库(Zhao,S.等人,Partial Leptin Reductionas an Insulin Sensitization and Weight Loss Strategy.Cell Metab,2019.30(4):p.706-719.e6)。TREM2特异性抗体库的淘选按照之前的描述进行，并进行了修改(Zhao,S.等人,Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight LossStrategy.Cell Metab,2019.30(4):p.706-719.e6)。简而言之，MaxiSorp Nunc-Immuno试管(Thermo Fisher Scientific)在4℃下用20μg/mL在DPBS中的小鼠TREM2-His涂布过夜。用DPBS冲洗后去除未结合的抗原。用DPBS中的5％脱脂奶粉(milk)封闭表面后，噬菌体文库与涂有TREM2的试剂盒在室温、5％脱脂奶粉中孵育2小时。用PBS+0.05％tween-20洗去未结合的噬菌体后，用100mM TEA孵育20分钟洗脱捕获的噬菌体。然后将洗脱的噬菌体感染对数期生长的大肠杆菌TG1在2x YTAG琼脂500cm²平板(Corning)上扩增，30℃过夜。扩增后的噬菌体感染TG1细胞用于制备噬菌体，以便使用M13KO7辅助噬菌体进行下一轮筛选。富集过程进行了三轮，使用上一轮的输出作为下一轮的输入。三轮筛选后，测量输出滴度，用单个菌落制备ELISA用噬菌体。用2μg/mL的TREM2-His涂布高结合ELISA平板(Corning)，在4℃下过夜。在用PBS中的5％脱脂奶粉进行封闭后，将从5％脱脂奶粉PBS中的单个TG1菌落制备的噬菌体与涂布的TREM2在室温下孵育1小时。用PBS+0.05％ Tween-20冲洗后，加入1:2000浓度的抗M13-HRP(Santa Cruz Biotechnology)，室温下孵育1小时。用PBS+0.05％ Tween-20冲洗后，加入TMB底物(Thermo Fisher Scientific)并孵育5分钟，然后用1N H₂SO₄终止。在450nm波长下读取OD值。选出前20％的高结合克隆。使用Qiagen BioRobot Universal系统提取96孔格式的噬菌体。DNA测序后，使用IMGT V-quest服务分析序列，以确定具有独特CDR3区域的抗体序列。

抗体的构建和生产

使用具有退化性的混合通用引物将独特的scFv克隆转化为人类IgG1(Zhao,S.等人，Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight LossStrategy.Cell Metab,2019.30(4):p.706-719.e6)。TREM2特异性抗体库的淘选按照之前的描述进行，并进行了修改(Zhao,S.等人，Partial Leptin Reduction as an InsulinSensitization and Weight Loss Strategy.Cell Metab,2019.30(4):p.706-719.e6)。使用PrimeStar GXL聚合酶(Takara Bio)扩增单个重链和轻链可变链。使用In-fusion HD克隆混合酶(Takara Bio)将凝胶纯化的可变链片段克隆到已消化的载体中。对转化后的质粒进行测序后，将序列验证过的IgG质粒转染到2mL规模的Expi293F细胞中。重链质粒和轻链质粒的比例为1:1。培养5天后，取出细胞，收集含抗体的上清液进行筛选检测。

为了构建各种形式的抗体和双特异性抗体，相应的基因片段按以下方法融合。首先使用PrimeStar GXL聚合酶(Takara Bio)扩增所需的基因片段；然后使用In-fusion HD克隆混合酶(Takara Bio)融合高达3个基因片段，以构建新型抗体格式的全部或部分，直至得到所需的构建体。在Expi293F中表达时，重链和轻链质粒以相同的重量比共转染。为了纯化毫克级抗体，用CaptivA蛋白-A亲和树脂(Repligen)纯化Expi293F产生的抗体，用0.1M甘氨酸(pH＝2.5)洗脱，然后用1/20体积的1M Tris-HCl(pH＝9)中和。使用Amicon Ultra-15超滤装置(截留分子量＝30k)(MilliporeSigma)将缓冲液交换到DPBS。

细胞免疫荧光检测

以指定密度将细胞接种在8孔室载玻片(Thermo Scientific)中。Expi293T和Expi293T-TREM2的密度为每孔4x10⁴个细胞。对于小胶质细胞，密度为每孔5x10⁴个细胞。对于小胶质细胞的吞噬作用，将1μM oAβ-脂质(Alexa Fluor 555标记)与指定抗体混合，并与培养过夜的细胞在1％ BSA PBS中孵育2小时。吞噬实验结束后，在4％ PFA中固定细胞15分钟(4℃)。用1μM的TO-PRO-3(Thermo Scientific)标记细胞核，在RT下15分钟。然后用ProLong Gold Antifade Mountant(Thermo Scientific)装片，并用Leica TCS SP5共聚焦显微镜成像。

Expi293T和Expi293T-TREM2表面染色时，先用DPBS冲洗过夜培养的细胞一次以去除培养基，然后用1％ BSA PBS封闭1小时。在4℃下用4％ PFA固定15分钟后，用DPBS冲洗一次以去除PFA。在1％ BSA PBS中加入Ab18(100nM)1小时，然后用DPBS冲洗过量的Ab18 3次。在1％BSA PBS中加入1μg/mL的抗人Alexa Fluor 488(Jackson Immunoresearch)1小时。细胞核用1μM TO-PRO-3(Thermo Scientific)在RT下标记15分钟。然后使用ProLong GoldAntifade Mountant(Thermo Scientific)对细胞装片，并使用Leica TCS SP5共聚焦显微镜成像。

小胶质细胞抗体染色的步骤与上述Expi293T染色步骤相似，但使用生物素化Ab18(使用Sulfo-NHS-Biotin自制)，并用链霉亲和素-Alexa Fluor 488(JacksonImmunoresearch)检测。在整个封闭和孵育过程中，加入0.1mg/mL人IgG1 Fc片段(JacksonImmunoresearch)和1％BSAPBS以封闭与Fc受体的相互作用。

小胶质细胞生存力

小鼠新生小胶质细胞的制备方法如前所述(Xiang，X.等人，TREM2 deficiencyreduces the efficacy of immunotherapeutic amyloid clearance.EMBO Mol Med,2016.8(9):p.992-1004)。分化7天后，将细胞清洗并重悬于含有指定抗体和5ng/ml集落刺激因子(CSF)(Biolegend)的培养基中。5天后，用CellTiter-Glo(Promega)通过发光检测法测量细胞ATP水平，以显示细胞生存力。

尺寸排阻色谱法(SEC)

TREM2抗体和TREM2复合物的SEC图谱由纯蛋白纯化系统(Cytiva)测定。简而言之，纯化的抗体和小鼠TREM2-His(Sino Biological)以2:1的比例混合，抗体浓度为1mg/mL。共注入100μl混合物。在1X PBS(pH 7.4)运行缓冲液中，使用等度梯度在Superose6Increase 10/300GL色谱柱上以0.5ml/分钟的速度运行36mL PBS。

小鼠大脑切片的免疫染色

采集的小鼠大脑一半在液氮中速冻，另一半准备冷冻切片。为了进行免疫荧光，将一半小鼠大脑浸入4％ PFA 中1天，然后浸入30％蔗糖中2天，最后包埋到OCT培养基(Sakura)中，并使用Leica Cryostat CM1950切成40μm的浮动冠状切片。浮动切片在使用前保存在4℃含有0.01％叠氮化钠的PBS中。

首先用含0.3％ Triton X-100的1％ BSA PBS封闭漂浮切片2小时，然后用相应的抗体染色：CD31(1:500，R&D system)、链霉亲和素-Alexa Fluor 488(1:500，JacksonImmunoresearch)、电离的钙结合适配分子1(IBA1)(1:1000，Wako)、6E10(1:500，Biolegend)、CD68(1:500，Biolegend)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(1:100，Santa CruzBio)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)(1:500，Biolegend)和神经元核抗原(NeuN)(1:1000，Biolegend)，在含0.3％ Triton X-100的1％ BSA PBS溶液中在4℃下轻摇过夜。用0.3％Triton X-100的PBS冲洗后，将相应的荧光标记二抗与脑切片在4℃轻摇下孵育2小时。用DPBS中的TO-PRO-3(1μM)对细胞核染色30分钟，然后用ProLong Gold Antifade Mountant(Thermo Scientific)装片。使用Leica TCS SP5共聚焦显微镜对脑切片进行成像。根据之前的描述(Shihan,M.H.等人，A simple method for quantitating confocalfluorescent images.Biochem Biophys Rep,2021.25:p.100916；Ghosh,A.等人，Anepoxide hydrolase inhibitor reduces neuroinflammation in a mouse model ofAlzheimer's disease.Sci Transl Med,2020.12(573))，使用ImageJ进行定量。为了定量小鼠皮层和海马体中指定标记物的荧光强度，使用ImageJ对图像进行分析，并在定量前用软件减去荧光图像的背景。

通过生物层干涉测量法(BLI)验证双特异性抗体

链霉亲和素传感器(Fortebio)用于捕获生物素化TREM2蛋白(Sino Biological)。在所有孵育步骤中，样品均在室温下保持1000rpm的振荡。在TREM2加载步骤中，100nM生物素化TREM2蛋白与传感器孵育指定时间。在双特异性抗体相互作用步骤中，使用了200nM的抗体。在muTfR孵化步骤中，使用了100nM muTfR-His(Sino Biological)。在孵育之间，将传感器浸入空白动力学缓冲液中，使蛋白质自由解离。

免疫印迹

使用含有Halt^TM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(100X)(Thermo Fisher)的NP-40裂解缓冲液(1％ NP40，50mM Tris-HCl，pH＝8，150mM NaCl)裂解细胞或脑组织，振荡1小时后获得细胞裂解液或脑裂解液。在14000rpm转速下离心10分钟除去碎片后，用Pierce BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher)对蛋白质总量进行归一化。蛋白质样品经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)分离，然后转移到Immun-Blot PVDF膜(Bio-Rad)上。用在5％ BSA TBST中稀释的特异性一抗和二抗检测蛋白质(Zhao,Y.等人，TREM2 Is a Receptor forβ-Amyloid that Mediates Microglial Function.Neuron,2018.97(5):p.1023-1031.e7；Zhong,L.等人，Amyloid-beta modulates microglial responses by binding to thetriggering receptor expressed on myeloid cells 2(TREM2).Mol Neurodegener,2018.13(1):p.15；Chen,H.-M.等人，Blocking immunoinhibitory receptor LILRB2reprograms tumor-associated myeloid cells and promotes antitumor immunity.TheJournal of Clinical Investigation,2018.128(12):p.5647-56622)。所用抗体为SYK(1:1000，Cell Signaling Technology)、磷酸化脾酪氨酸激酶(pSYK)(1:1000，CellSignaling Technology)、ACTB(1:1000，Cell Signaling Technology)、APP(1:500Millipore Sigma)、sTREM2和TREM2(1:500Millipore Sigma)以及Calnexin(1:1000，Abcam)。免疫反应带用West Pico PLUS化学发光底物(Thermo Fisher)显现。使用ImageJ对免疫反应带进行定量。进行了三个独立的处理重复，所示为具有代表性的免疫印迹。

抗体脑分布研究

动物实验按照经批准的实验方案进行。C57BL6小鼠(雌性，8周龄，JacksonLaboratory)随机分组，每组5只。小鼠腹腔注射0.1mL DPBS中的抗体(生物素化，20mg/kg)。注射24小时后通过尾静脉采血，然后用DPBS以2mL/分钟的速度经心肌灌注10分钟。按上述方法处理脑组织，进行免疫荧光染色或生化分析。

测量脑和血清中的抗体浓度

用2μg/mL的小鼠TREM2(Sino Biological)涂布高结合ELISA板(Corning)，4℃过夜。用1％ BSA PBS封闭后，将单个脑裂解液与涂布的TREM2在室温下孵育2小时。用PBS+0.05％ Tween-20冲洗后，加入1:5000浓度的抗小鼠Fc-HRP(Jackson Immunoresearch)，室温孵育1小时。用PBS+0.05％ Tween-20冲洗后，加入TMB底物(Thermo Fisher Scientific)并孵育5分钟，然后用1N H₂SO停止孵育。在450nm波长下读取OD值。使用纯化的相应双特异性抗体按上述相同方法建立标准曲线。

表1.用于表达TREM2 mAb的重链和轻链对。

表2.使用Octet Red96生物层干涉仪(BLI)测定的TREM2 mAbs动力学结合参数。

表3.使用BLIOctet检测法根据竞争结合对表位箱进行的分组

表4.抗体重(H)链CDR的氨基酸序列

表5.抗体轻(L)链CDR的氨基酸序列

表6.抗体重(H)链的氨基酸序列

表7.抗体轻(L)链的氨基酸序列

表8：编码抗体重(H)链CDR序列的DNA序列

表9：编码抗体轻(L)链CDR序列的DNA序列

NFAT-GFP报告试验

TREM2-DAP12(DNAX激活蛋白12)报告基因构建体是通过融合小鼠TREM2(19-171aa)和带有D50A突变的huDAP12(28-113aa)而产生的。TREM2的原始信号肽被小鼠免疫球蛋白κ轻链的前导序列所取代。在TREM2的N端引入了HA标记。

报告基因被克隆到pCDH-CMV-MCS-IRES-Puro中。通过慢病毒转导产生了转导单个报告基因构建体的2B4报告细胞。为了制备慢病毒颗粒，pCMV-VSV-G(Addgene 8454)、pCMVdelta R8.2(Addgene 12263)和含有GOI的单个pCDH转染质粒被转染到HEK293T中。在10μg/mL聚凝胺(Santa Cruz Biotechnology)存在的情况下，用慢病毒上清液(1:1稀释于RPMI-1640)转染2B4 NFAT-GFP亲代报告细胞过夜。转染48小时后，用1μg/mL嘌呤霉素筛选细胞，直到出现足够数量的转基因细胞。

为了进行报告检测，在96孔细胞培养板上涂布了在初步实验中确定的最佳浓度的配体：oAβ(在DPBS中为1μM，过夜，4℃)、PS(在甲醇中0.1mg/mL，室温下直至完全蒸发)和PC(L-α-磷脂酰胆碱，购自Avanti Polar Lipids，在甲醇中为0.03mg/mL，室温下直至完全蒸发)。配体涂布后，用DPBS冲洗3次，去除未结合的配体。在0.1mL完全培养基中加入1μg/mL嘌呤霉素和指定的可溶性抗体处理，将总共100000个报告细胞接种到单个孔中(96孔板)。培养过夜后，使用iQue3高通量流式细胞仪(Sartorius)读取GFP阳性细胞群，至少收集10000个活细胞。

制备oAβ脂蛋白复合物

L-α-磷脂酰丝氨酸(PS)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)粉末购自Avanti Polar Lipids。PS和DMPC溶解在10mg/mL的氯仿中，并以1:4的比例混合。在真空下蒸发氯仿，形成含有PS和DMPC混合物的薄层。加入DPBS使脂质混合物重新水化至5mg/mL，然后在冰上超声至溶液呈半透明状，形成脂质体。为了制备oAβ-脂蛋白复合物，将PS/DMPC脂质体和载脂蛋白e(APOE)混合，PS/DMPC脂质体的最终浓度为1mg/mL，APOE的最终浓度为0.25mg/mL。混合物在18℃15分钟和30℃15分钟下孵育3个周期(Hubin，E.等人，Apolipoprotein E associated with reconstituted high-density lipoprotein-likeparticles is protected from aggregation.FEBS Lett,2019.593(11):p.1144-1153)。然后将FAM标记的oAβ加入到最终浓度为1μM的重构APOE中，并在室温下孵育1小时。

小胶质细胞吞噬试验

小鼠新生小胶质细胞的制备方法如前所述(Xiang，X.等人，TREM2 deficiencyreduces the efficacy of immunotherapeutic amyloid clearance.EMBO Mol Med,2016.8(9):p.992-1004)。为了进行吞噬实验，将小胶质细胞接种在涂有聚-D-赖氨酸的96孔培养板中，培养基为不含血清或细胞因子的RMPI-1640。oAβ-脂蛋白复合物用1％ BSA稀释至相当于100nM FAM-oAβ的浓度。用稀释的oAβ脂蛋白复合物取代细胞培养板中的培养基，并在37℃下孵育2小时。细胞被吞噬后，用胰蛋白酶分离细胞5分钟，加入0.2％的胰板蓝淬灭细胞表面结合的FAM-oAβ，并孵育5分钟。然后将细胞转移到V底96孔板中，用350g离心5分钟洗涤两次。对于细胞松弛素d(CytoD)处理组，10μM CytoD与细胞在37℃下预孵育30分钟，并在吞噬实验期间持续存在。使用iQue3高通量流式细胞仪(Sartorius)对吞噬作用进行定量。

转运孔板试验中小胶质细胞的迁移

小鼠新生小胶质细胞的制备方法如前所述(Xiang，X.等人，TREM2 deficiencyreduces the efficacy of immunotherapeutic amyloid clearance.EMBO Mol Med,2016.8(9):p.992-1004)。将细胞接种在不含血清或细胞因子的RMPI-1640中的Transwell嵌套(PET膜，8μm孔径，Corning 3374)中。在迁移室和接收室中加入指定浓度的相应处理剂。只有接收室(底部)含有0.5μM oAβ-脂质复合物。细胞在37℃、5％ CO₂条件下培养24小时。培养结束后，用DPBS冲洗细胞三次，用4％ PFA固定10分钟，然后用0.05％结晶紫染色10分钟。用DPBS洗去未结合的结晶紫，然后让板风干。根据生产商的方案和文献(Moore,C.S.等人.，P2Y12expression and function in alternatively activated humanmicroglia.Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm,2015.2(2):p.e80)用33％的乙酸在水中(100rpm，摇晃10分钟)洗脱细胞结合结晶紫，定量细胞数。使用平板阅读器在590nm波长处测量吸光度，对结晶紫的量进行定量。为了定量迁移的细胞，用湿润的棉签去除留在Transwell嵌套内的未迁移细胞。迁移百分比是用迁移细胞的OD值除以总细胞的OD值计算得出的。小胶质细胞迁移成像的检测方法与上述方法类似，只是小胶质细胞预先用1μMCFSE(Thermo)标记，在37℃下放置15分钟。使用Nikon Eclipse TE2000E宽场荧光显微镜对迁移的细胞进行成像。

5XFAD动物实验

动物实验按照机构指南和批准的方案进行。5XFAD小鼠(B6.Cg-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax，雌性，8周龄，MMRRC)随机分组，每组5只。小鼠长到5月龄后，每周腹腔注射14次0.2mL DPBS中的抗体。最后一次注射两天后，小鼠被处死，并按上述方法收集大脑进行免疫荧光染色和生化分析。

统计分析

使用GraphPad Prism(v8，GraphPad Software)生成图表并进行统计分析。采用双尾学生t检验，以p<0.05为差异显著。数据以平均值±SD表示。

结果

Ab18能激活TREM2而不干扰配体与TREM2的相互作用

为了产生激动剂抗体，发明人设计了抗体筛选方案，从针对小鼠TREM2细胞外结构域(ECD)的噬菌体展示人类scFv库开始(图1a)。他们使用噬菌体ELISA来鉴定能与TREM2ECD结合的克隆；并将11个阳性scFv克隆转化为人类IgG1抗体，用于进一步研究和验证。发明人首先使用流式细胞术测试了这11种IgG1抗体与细胞表面表达的TREM2的结合情况。11种IgG1抗体中至少有8种(如Ab2、Ab4、Ab11、Ab18、Ab19、Ab22、Ab45和Ab55)与表达TREM2的HEK293T细胞有很强的TREM2依赖性结合(图1b)。

TREM2的天然配体包括oAβ和磷脂(如PC、PS)。TREM2与这些配体之间的相互作用已被证明可调节小胶质细胞的功能，如在斑块周围集聚、小胶质细胞的新陈代谢和存活以及斑块相关的小胶质细胞病变(Wang，Y.等人，TREM2 lipid sensing sustains themicroglial response in an Alzheimer's disease model.Cell,2015.160(6):p.1061-71)。因此，为了避免扰乱正常的TREM2信号传导，进行了测试，以确定不会与天然配体竞争的激动剂抗体。构建类似于之前描述的NFAT-EGFP报告细胞系统(Wang,Y.等人，TREM2lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's diseasemodel.Cell,2015.160(6):p.1061-71；Song,W.等人，Alzheimer's disease-associatedTREM2 variants exhibit either decreased or increased ligand-dependentactivation.Alzheimers Dement,2017.13(4):p.381-387)以表达TREM2-DAP12。配体-TREM2结合通过DAP12的免疫受体酪氨酸基激活基调(ITAM)区域触发TREM2信号传导，进一步激活SYK，然后诱导一系列信号级联，最终导致NFAT反应元件下游EGFP的表达(Ohtsuka,M.等人，NFAM1,an immunoreceptor tyrosine-based activation motif-bearingmolecule that regulates B cell development and signaling.Proc Natl Acad Sci US A,2004.101(21):p.8126-31)。利用报告试验，筛选了与表达在HEK293T细胞上的TREM2结合的八种抗体，以确定它们与三种代表性TREM2配体oAβ、PC和PS的拮抗作用。在TREM2-DAP12报告试验中，Ab4、Ab11、Ab18和Ab45对这三种配体均无拮抗作用(图1c)。然后，在TREM2-DAP12 NFAT EGFP报告细胞实验中，用流式细胞仪筛选四种抗体在没有TREM2配体的情况下的激动活性。在这四种抗体中，Ab18对TREM2信号的激活具有浓度依赖性，EC₅₀为79.4nM(图1d)。值得注意的是，Ab18的TREM2激活活性不需要固体表面涂布或Fc受体的参与，因为抗体是作为可溶性分子添加到培养基中的，而且Fc区带有LALAPG突变以消除与Fc受体的相互作用(Wang,X.,M.Mathieu和R.J.Brezski,IgG Fc engineering to modulateantibody effector functions.Protein&cell,2018.9(1):p.63-73)。

TREM2信号已被证明可促进小胶质细胞对淀粉样β脂复合物的吞噬作用(Yeh,F.L.等人，TREM2 Binds to Apolipoproteins,Including APOE and CLU/APOJ,and TherebyFacilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.Neuron,2016.91(2):p.328-40)。然后测试了Ab18是否能增强小胶质细胞对oAβ脂质复合物的吞噬作用。使用小鼠新生小胶质细胞，其通常用于小胶质细胞体外功能测试(Svoboda,D.S.等人，Human iPSC-derivedmicroglia assume aprimary microglia-like state after transplantation into theneonatal mouse brain.Proceedings of the National Academy of Sciences,2019.116(50):p.252933)。经Ab18处理的小胶质细胞显示出浓度依赖性的oAβ脂质吞噬作用增强，EC₅₀为405.2nM，而吞噬作用抑制剂CytoD的处理则作为对照(图1e)。用荧光标记的oAβ脂免疫荧光进一步验证了吞噬作用的增强。用200nM的Ab18处理的小胶质细胞比用对照IgG处理的小胶质细胞吞噬oAβ脂的能力明显增强(图1f)。然而，与对照IgG相比，10nM的Ab18在促进oAβ脂质吞噬方面没有任何作用(图1f)。使用免疫荧光染色法，Ab18与表达TREM2的HEK293T细胞有很强的细胞表面结合力(图1g)。通过免疫荧光染色，Ab18还显示出与小鼠新生小胶质细胞的强细胞表面结合(图1h)。

将Ab18改造成四价后，TREM2的激活率提高了100倍。

虽然Ab18显示了TREM2激动剂的活性，但由于抗体通过血脑屏障(BBB)的穿透性较差，在试验条件下，EC₅₀太高，无法进入大脑。据报道，外周施用的抗体只有不到0.1％能进入中枢神经系统，达到约1nM的浓度(Banks,W.A.,From blood-brain barrier to blood-brain interface:new opportunities for CNS drug delivery.Nat Rev Drug Discov,2016.15(4):p.275-92)。抗体工程被用来提高Ab18的TREM2激动剂效力。据报道，使用IgG-scFv等形式将价态从二价提高到四价，可改善受体的交联，从而提高效价(Yang,Y.等人，Tetravalent biepitopic targeting enables intrinsic antibody agonism of tumornecrosis factor receptor superfamily members.MAbs,2019.11(6):p.996-1011)。设计了五种不同形式的四价Ab18(图2a)，以确定价数的增加是否能提高工程抗体的效力。所有的工程抗体都与TREM2有四价结合。使用TREM2-DAP12报告系统滴定工程抗体以激活TREM2信号。与原始的抗体18相比，所有五种格式的抗体都能明显改善TREM2的激活；具有EC₅₀＝0.42nM的四价可变结构域免疫球蛋白(TVD-Ig)格式，增加的倍数从10倍到100倍不等(图2b)。

TREM2信号触发SYK磷酸化(Ulland,T.K.和M.Colonna,TREM2-a key player inmicroglial biology and Alzheimer disease.Nat Rev Neurol,2018.14(11):p.667-675)。Ab18TVD-Ig TREM2信号在小胶质细胞中的影响是通过定量pSYK水平变化来检测的。经Ab18TVD-Ig处理的小胶质细胞在10nM和100nM浓度下磷酸化的SYK都有显著增加(图2c)。相比之下，与对照Ig相比，IgG格式的原始Ab18处理的小胶质细胞在100nM浓度下pSYK水平的增加很小，但在10nM浓度下却没有增加(图2c)。进一步滴定显示，与对照IgG处理相比，Ab18 TVD-Ig(EC₅₀＝1.4nM)和Ab18 IgG(EC₅₀＝152.3nM)对pSYK水平的增加具有浓度依赖性。值得注意的是，与原始Ab18相比，Ab18 TVD-Ig激活TREM2信号的能力提高了109倍(图2d)。

测试了Ab18 TVD-Ig对oAβ脂质小胶质细胞吞噬作用的影响。经Ab18 TVD-Ig处理的小胶质细胞对oAβ脂质的吞噬作用呈浓度依赖性增加；Ab18 TVD-Ig的EC₅₀值为6.9，与原始的Ab18 IgG相比，其对oAβ脂质的吞噬作用增加了33倍(图2e)。免疫荧光成像显示，与对照IgG相比，10nM的Ab18 IgG对oAβ质小胶质细胞吞噬作用没有改善，而10nM的Ab18 TVD-Ig对oAβ脂质小胶质细胞吞噬作用有显著增加(图2f)。

除了吞噬作用外，TREM2在调节小胶质细胞向淀粉样蛋白迁移方面也至关重要。小胶质细胞向淀粉样蛋白迁移是小胶质细胞介导的斑块毒性减弱和Aβ清除的关键步骤(Wang,Y.等人，TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in anAlzheimer's disease model.Cell,2015.160(6):p.1061-71)。小胶质细胞迁移也经常被用作评估小胶质细胞功能的标志物(Zhong，L.等人，Soluble TREM2 amelioratespathological phenotypes by modulating microglial functions in an Alzheimer’sdisease model.Nature Communications,2019.10(1):p.136；Abud,E.M.等人，iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases.Neuron,2017.94(2):p.278-293.e9)。在10nM浓度下，Ab18 TVD-Ig能显著改善小胶质细胞向oAβ脂质的迁移；相比之下，相同浓度下原始Ab18 IgG的效果与阴性对照相似(图1g)。进一步滴定显示，Ab18 TVD-Ig的EC₅₀值为1.2nM，而原始Ab18 IgG的EC₅₀值为372.3nM(图2h)。

TREM2信号在CSF耗竭条件下促进小胶质细胞存活(Wang,Y.等人，TREM2 lipidsensing sustains the microglial response in an Alzheimer's diseasemodel.Cell,2015.160(6):p.1061-71)，TREM2和CSF1R之间的协同作用在斑块相关的小胶质细胞病中发挥作用(Wang,Y.等人，TREM2 lipid sensing sustains the microglialresponse in an Alzheimer's disease model.Cell,2015.160(6):p.1061-71)。发明人研究了Ab18 TVD-Ig是否可以在5天的低CSF补充(5ng/mL)下改善小胶质细胞存活。如图2i所示，通过测量活细胞中ATP水平的超灵敏发光试验测定，Ab18 TVD-Ig对小胶质细胞存活的促进作用明显更强，Ab18 TVD-Ig和原始Ab18IgG的EC₅₀值分别为4.7nM和466.3nM，提高了99倍。

四价TREM2结合可有效触发TREM2聚集，而不会改变细胞中TREM2的水平。

TREM2与带有ITAM的DAP12相关联。激活TREM2会导致DAP12 ITAM区域磷酸化并招募SYK，从而启动一系列信号级联(Ulrich,J.D.等人，Elucidating the Role of TREM2 inAlzheimer's Disease.Neuron,2017.94(2):p.237-248)。ITAM介导的信号激活的有效启动通常包括多聚配体对受体的聚集(Blank,U.等人，Inhibitory ITAMs as novelregulators of immunity.Immunol Rev,2009.232(1):p.59-71)。例如，TREM2的激活通常包括配体被涂布在固体表面或作为大型多聚体复合物(如脂质体)呈现(Schlepckow,K.等人，Enhancing protective microglial activities with a dual function TREM2antibody to the stalk region.EMBO Mol Med,2020.12(4):p.e11227；Song,W.等人，Alzheimer's disease-associated TREM2 variants exhibit either decreased orincreased ligand-dependent activation.Alzheimers Dement,2017.13(4):p.381-387；Yeh,F.L.等人，TREM2 Binds to Apolipoproteins,Including APOE and CLU/APOJ,andThereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.Neuron,2016.91(2):p.328-40.)。这项研究表明，二价Ab18 IgG需要相对较高的浓度(EC₅₀＝152.3纳摩尔)才能激活TREM2；相比之下，四价工程化TVD-Ab18在激活TREM2方面表现出明显更高的效力(EC₅₀＝1.4纳摩尔)。通过直接评估工程抗体对TREM2的聚集，测试了四价介导的TREM2激活增强是否是受体聚集增加的结果。

通过使用尺寸排阻色谱法测量抗体-TREM2复合物的分子尺寸，对TREM2的聚集进行了研究。二价Ab18 IgG显示抗体与TREM2之间形成了明显的复合物，保留时间约为15分钟。相比之下，四价Ab18 TVD-Ig的保留时间缩短至10分钟，表明复合物的尺寸明显增加(图3a和3b)，这表明四价Ab18 TVD-Ig对TREM2的激活增强与TREM2的聚集增加有关。为了进一步证实SEC数据，使用免疫荧光成像技术研究了TREM2在小胶质细胞中的聚集情况。Ab18TVD-Ig处理显示了大量的点状结构，这可能是聚集的TREM2分子；相比之下，二价Ab18处理的小胶质细胞中基本没有点状结构(图3c)。免疫荧光成像和SEC分析的综合结果支持了这样一种观点，即四价Ab18 TVD-Ig可诱导TREM2聚集，进而引发ITAM介导的信号级联的强烈启动。

据报道，由于蛋白酶裂解和可溶性TREM2(sTREM2)片段的释放，TREM2表面水平在小胶质细胞激活时下调(Ulland,T.K.和M.Colonna,TREM2-a key player in microglialbiology and Alzheimer disease.Nat Rev Neurol,2018.14(11):p.667-675)。设计了基于抗体的策略，通过阻断α-分泌酶介导的TREM2脱落来增强TREM2信号传导(Schlepckow,K.等人，Enhancing protective microglial activities with a dual function TREM2antibody to the stalk region.EMBO Mol Med,2020.12(4):p.e11227)。通过多种方法定量了Ab18 TVD-Ig处理后小胶质细胞中TREM2水平的变化。使用流式细胞术研究了Ab18TVD-Ig处理后细胞表面TREM2水平的变化。如图3d所示，Ab18 TVD-Ig处理的小胶质细胞与对照IgG和Ab18 IgG处理的小胶质细胞相比，细胞表面的TREM2水平相似。多个抗体浓度点都得到了相同的结果(图3d)，这表明Ab18 TVD-Ig激活TREM2不会降低细胞表面TREM2的水平。

由TREM2裂解产生的sTREM2被认为是AD的生物标志物(Suárez-Calvet,M.等人，Early increase of CSF sTREM2 in Alzheimer’s disease is associated with taurelated-neurodegeneration but not with amyloid-βpathology.MolecularNeurodegeneration,2019.14(1):p.1)，并发现sTREM2水平与斑块病理相关(Zhong,L.等人，Soluble TREM2 ameliorates pathological phenotypes by modulating microglialfunctions in an Alzheimer’s disease model.Nature Communications,2019.10(1):p.1365；Vilalta,A.等人，Wild-type sTREM2 blocks A&#x3b2；aggregation andneurotoxicity,but the Alzheimer's R47H mutant increases A&#x3b2；aggregation.Journal of Biological Chemistry,2021.296)。在脂多糖(LPS)或γ干扰素(IFNγ)介导的髓样细胞活化中观察到sTREM2生成增加(Ulland,T.K.和M.TREM2-a keyplayer in microglial biology and Alzheimer disease.Nat Rev Neurol,2018.14(11):p.667-675)。在本公开中，对抗体处理后小胶质细胞培养上清液中的sTREM2水平进行了定量。在测试的浓度范围内，Ab18 TVD-Ig处理的小胶质细胞与对照IgG和Ab18 IgG处理的小胶质细胞相比，显示出相似的sTREM2生成水平(图3e和3f)，这表明Ab18 TVD-Ig激活TREM2不会增加sTREM2的生成。此外，还测定了用工程抗体处理的小胶质细胞中TREM2的总水平。在测试的浓度范围内，Ab18 TVD-Ig处理的小胶质细胞显示的总TREM2水平与对照IgG和Ab18IgG相似(图3g和3h)，这表明Ab18 TVD-Ig激活TREM2不会改变总TREM2水平。总之，四价Ab18 TVD-Ig或二价Ab18 IgG激活TREM2对细胞表面TREM2、sTREM2和总TREM2水平的影响相似。

αTfR介导的TREM2抗体高效入脑。

如图2b所示，Ab18 TVD-Ig在激活TREM2信号和促进各种小胶质细胞功能方面的EC₅₀值在1nM至10nM范围内。然而，外周注射的抗体在脑实质内的浓度通常低于1nM(Banks,W.A.,From blood-brain barrier to blood-brain interface:new opportunities forCNS drug delivery.Nat Rev Drug Discov,2016.15(4):p.275-92)。为了提高TREM2抗体的脑浓度，构建了双特异性抗体，该双特异性抗体由四价TREM2靶向Ab18 TVD-Ig和小鼠转铁蛋白受体(αTfR)靶向抗体组成，小鼠转铁蛋白受体(αTfR)靶向抗体作为单价scFv位于其中一条重链的C端(图4a)。这种双特异性抗体设计利用了TfR的转囊途径，以促进抗体通过BBB(Banks,W.A.,From blood-brain barrier to blood-brain interface:newopportunities for CNS drug delivery.Nat Rev Drug Discov,2016.15(4):p.275-92；Pardridge,W.M.,Drug Transport across the Blood–Brain Barrier.Journal ofCerebral Blood Flow&Metabolism,2012.32(11):p.1959-1972；Kariolis,M.S.等人，Brain delivery of therapeutic proteins using an Fc fragment blood-brainbarrier transport vehicle in mice and monkeys.Sci Transl Med,2020.12(545)；Yu,Y.J.等人，Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier innonhuman primates.Sci Transl Med,2014.6(261):p.261ra154；Yu,Y.J.等人，Boostingbrain uptake of a therapeutic antibody by reducing its affinity for atranscytosis target.Sci Transl Med,2011.3(84):p.84ra44；Niewoehner,J.等人，Increased brain penetration and potency of atherapeutic antibody using amonovalent molecular shuttle.Neuron,2014.81(1):p.49-60)。值得注意的是，之前的研究表明，αTfR的单价参与了有效入脑，因为靶向TfR的二价抗体往往被困在血管内而无法进入脑实质(Niewoehner,J.等人，Increased brain penetration and potency of atherapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle.Neuron,2014.81(1):p.49-60)。

单价αTfR涉及两条抗体重链的异源二聚化(图4a)。

抗体重链的异二聚体是通过静电转向策略产生的(Wang,F.等人，Design andcharacterization of mouse IgG1 and IgG2a bispecific antibodies for use insyngeneic models.MAbs,2020.12(1):p.1685350)。对于长期体内治疗，人类IgG同种型的免疫原性需要采取额外措施抑制免疫系统或使用小鼠IgG同种型以避免免疫原性(Bohrmann,B.等人，Gantenerumab:a novel human anti-Aβantibody demonstratessustained cerebral amyloid-βbinding and elicits cell-mediated removal ofhuman amyloid-β.J Alzheimers Dis,2012.28(1):p.49-69)。为了避免本公开中的这些并发症，在我们的双特异性抗体设计中，使用了具有LALAPG突变(L234A、L235A和P329G)的小鼠IgG2a同种型来取消与Fc受体的相互作用(Wang,X.,M.Mathieu和R.J.Brezski,IgG Fcengineering to modulate antibody effector functions.Protein&cell,2018.9(1):p.63-73；Schlothauer,T.等人，Novel human IgG1 and IgG4Fc-engineered antibodieswith completely abolished immune effector functions.Protein Eng Des Sel,2016.29(10):p.457-466)。静电转向策略允许小鼠IgG同种型双特异性链的异二聚化配对(Wang,F.等人，Design and characterization of mouse IgG1 and IgG2a bispecificantibodies for use in syngeneic models.MAbs,2020.12(1):p.1685350)，被选用于本公开内容。采用A/B格式命名各种抗体设计，其中A表示N端的结合分子，B表示C端的结合分子。“A”可以是TVD-Ig格式的Ab18或对照IgG，B可以是单价scFv格式的αTfR或对照IgG(图4a)。需要特别注意的是，虽然没有写出TVD-Ig，但所有用于双特异性抗体研究的Ab18都是TVD-Ig格式。为了证明TREM2Ab和TfR Ab在双特异性构建物中结合成单个分子，首先通过结合TREM2将双特异性抗体捕获到传感器上。在空白缓冲液中达到平衡后，将捕获抗体的传感器浸入TfR ECD溶液中。这种夹心BLI检测的结果验证了TREM2Ab和TfR Ab结合成单个分子(图4b)。夹心BLI试验还包括三组“减一”对照，它们不包括三个结合伙伴(TREM2、Ab或TfR)中的一个。如曲线Ab18/αTfR+TfR所示，省略TREM2显示出完全平坦的曲线，这证实了在所用实验条件下观察到的结合信号依赖于TREM2(图4b)。同样，在TREM2+TfR曲线中，当传感器浸入TfR溶液中时，省略抗体显示出平坦的曲线(图4b)，这表明在所用实验条件下观察到的TfR结合信号依赖于抗体。最后，在TREM2+Ab18/αTfR曲线中，省略TfR会产生平缓的TfR结合，这证实了观察到的结合信号来自TfR。综上所述，所有Ab18/αTfR双特异性构建物都包括TfR和TREMe2结合特异性。

为了验证双特异性抗体Ab18/αTfR能否保持激活TREM2的能力，使用TREM2NFAT-EGFP报告细胞滴定TREM2激活情况。如图4c所示，与Ab18 TVD-Ig相比，双特异性抗体Ab18/αTfR和Ab18/对照对TREM2报告细胞的激活作用相似，这表明双特异性抗体工程没有损害TREM2抗体的功能。小鼠腹腔注射单剂量的双特异性抗体(Ab18/αTfR或Ab18/对照)，剂量为20mg/kg。采用夹心酶联免疫吸附法对不同时间点的血浆和大脑抗体浓度进行定量。为避免血液中的抗体污染，小鼠在采集大脑前用DPBS进行灌注。如图4d所示，从4小时开始，Ab18/αTfR的脑抗体浓度已经比Ab18/对照高出5倍。注射后24小时，Ab18/αTfR和Ab18/对照的脑部抗体浓度差异继续扩大到10倍。24小时后，脑部抗体浓度差异开始下降，并在注射后第7天消失。在整个过程中，大脑中Ab18/对照的抗体浓度维持在约1nM的低水平；相反，注射后24小时，大脑中Ab18/αTfR的最高浓度超过了20nM。在血清中，Ab18/αTfR的清除率比Ab18/对照快，这可能是因为TfR在外周器官中广泛表达，从而加快了清除率(图4e)。考虑到Ab18/αTfR较快的清除速度和血清中转运的依赖性[46、47]，发明人计算了脑/血清抗体浓度比，发现Ab18/αTfR对脑抗体进入的改善形成了更鲜明的对比，注射后24小时抗体浓度最高增加了30倍(图4f)。更值得注意的是，即使在注射后第7天，Ab18/αTfR的脑/血清比率仍保持在Ab18/对照水平的10倍以上(图4f)。

如Niewoehner等人之前证明的，TfR抗体可能被捕获在血管内，因此ELISA检测到的抗体可能至少部分来自血管内的抗体，而不是脑实质内的抗体。为了验证TREM2抗体是否进入了脑实质，对灌注小鼠的浮动脑切片进行了免疫荧光染色。Ab18/αTfR处理显示抗体明显分布在血管外，如CD31染色所示，相比之下，可能由于浓度较低，Ab18/对照几乎没有脑实质染色(图4g)。此外，小胶质细胞标记物IBA1的免疫染色显示Ab18/αTfR信号与IBA1共定位，表明TREM2与脑实质中的小胶质细胞结合(图4g)。综上所述，这些结果表明，Ab18/αTfR双特异性抗体能有效穿过BBB，并与脑实质中的小胶质细胞上的TREM2结合。

TREM2/αTfR双特异性抗体可减少5XFAD小鼠的斑块负荷。

本公开证明，Ab18对TREM2的激动作用可改善小胶质细胞在体外对oAβ的吞噬作用。此外，还研究了Ab18/αTfR长期治疗5XFAD小鼠对淀粉样病理学的影响。研究包括两个对照组：Ab18/对照组(αTfR臂被不与TfR结合的对照scFv取代)和对照/αTfR组(Ab18 TVD-Ig被不与TREM2结合的对照IgG取代，但αTfR保持不变。发明人在5XFAD小鼠5月龄时开始进行抗体处理，此时淀粉样斑块已经开始累积(Ghosh,A.等人，An epoxide hydrolaseinhibitor reduces neuroinflammation in a mouse model of Alzheimer'sdisease.Sci Transl Med,2020.12(573)；Forner,S.等人，Systematic phenotyping andcharacterization of the 5xFAD mouse model of Alzheimer’s disease.ScientificData,2021.8(1):p.270)。5XFAD小鼠每周腹腔注射20mg/kg的抗体，以保持大脑中抗体的有效浓度。每周注射14次后，灌注后收集大脑，用6E10染色浮动切片，标记Aβ斑块。与Ab18/对照和对照/αTfR相比，Ab18/αTfR处理的小鼠在大脑皮层和海马体的斑块强度、斑块数量和尺寸都明显减少；而两个对照组(Ab18/对照和对照/αTfR)则没有明显差异(图5a-d)。具体而言，进一步的定量分析显示，经Ab18/αTfR处理后，大脑皮层和海马体的6E10免疫染色强度分别下降了约4倍和7倍。经Ab18/αTfR处理后，皮质和海马体中的斑块数量分别减少了3倍至10倍。经Ab18/αTfR处理后，各种尺寸的斑块均显著减少，其中500μm²以上的大斑块减少最为显著(在大脑皮层和海马体中均减少了约10倍)。这些结果表明，Ab18/αTfR的长期治疗可显著减少斑块的数量和尺寸，而且疗效取决于Ab18和αTfR。

TREM2抗体可促进小胶质细胞与斑块的相互作用，而不会影响星形胶质细胞。

TREM2已被证明在斑块周围的小胶质细胞集群以及随后的斑块清除中发挥关键作用(Wang,Y.等人，TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in anAlzheimer's disease model.Cell,2015.160(6):p.1061-71.)。在本公开中，研究了小胶质细胞标记物IBA1与斑块标记物6E10的共定位，以确定Ab18/αTfR处理是否能改善小胶质细胞与斑块的接触。如图6a和6d所示，斑块30μm范围内的IBA1信号比Ab18/对照或对照/αTfR的信号显著增加了4倍；这表明Ab18/αTfR显著增加了小胶质细胞在斑块周围的聚集。这一观察结果与体外实验结果一致，体外实验结果表明，Ab18介导的TREM2激活可促进小胶质细胞向oAβ脂质复合物迁移(图2g)。小胶质细胞在斑块周围聚集后，吞噬淀粉样蛋白是清除斑块的下一个关键步骤。CD68是小胶质细胞的吞噬标记物，经常被用来研究斑块近端小胶质细胞的吞噬状态(Wang,S.等人，Anti-human TREM2 induces microglia proliferationand reduces pathology in an Alzheimer's disease model.J Exp Med,2020.217(9)；Ghosh,A.等人，An epoxide hydrolase inhibitor reduces neuroinflammation in amouse model of Alzheimer's disease.Sci Transl Med,2020.12(573)；Zhong,L.等人，Soluble TREM2 ameliorates pathological phenotypes by modulating microglialfunctions in an Alzheimer’s disease model.Nature Communications,2019.10(1):p.1365)。对CD68和斑块(6E10)进行染色，观察到Ab18/αTfR处理的小鼠斑块周围CD68强度比Ab18/对照或对照/αTfR处理的小鼠显著增加(约4倍)(图6b和6e)。这一观察结果与体外实验结果一致，体外实验结果表明Ab18介导的TREM2激活可促进小胶质细胞吞噬oAβ脂质复合物。已知星形胶质细胞在斑块病理学中发挥重要作用(Ghosh,A.等人，An epoxidehydrolase inhibitor reduces neuroinflammation in a mouse model of Alzheimer'sdisease.Sci Transl Med,2020.12(573)；Forner,S.等人，Systematic phenotyping andcharacterization of the 5xFAD mouse model of Alzheimer’s disease.ScientificData,2021.8(1):p.270；González-Reyes,R.E.等人，Involvement of Astrocytes inAlzheimer’s Disease from aNeuroinflammatory and Oxidative StressPerspective.Frontiers in Molecular Neuroscience,2017.10(427))。为了排除TREM2抗体影响星形胶质细胞的可能性，对GFAP(星形胶质细胞的标记物)和6E10进行了共染色。如图6c和6f所示，各处理组的GFAP-6E10共定位相似，表明TREM2激动不会对星形胶质细胞-斑块的相互作用产生实质性影响。这一结果与小胶质细胞通常表达TREM2而星形胶质细胞通常不表达TREM2的事实相符。

TREM2抗体可减少神经元损伤。

5XFAD小鼠的神经元损伤非常严重(Eimer,W.A.和R.V Neuron loss in the5XFAD mouse model of Alzheimer’s disease correlates with intraneuronal Aβ42accumulation and Caspase-3activation.Molecular Neurodegeneration,2013.8(1):p.2)。已知斑块与萎缩性神经元相关，而萎缩性神经元是老年痴呆症的常见病理特征(Benzing,W.C.,E.J.Mufson和D.M.Armstrong,Alzheimer's disease-like dystrophicneurites characteristically associated with senile plaques are not foundwithin other neurodegenerative disease unless amyloidβ-protein deposition ispresent.Brain Research,1993.606(1):p.10-18；Gowrishankar,S.等人，Massiveaccumulation of luminal protease-deficient axonal lysosomes at Alzheimer'sdisease amyloid plaques.Proc Natl Acad Sci U S A,2015.112(28):p.E3699-708；Sadleir,K.R.等人，Presynaptic dystrophic neurites surrounding amyloid plaquesare sites of microtubuledisruption,BACE1 elevation,and increased Aβgenerationin Alzheimer's disease.Acta Neuropathol,2016.132(2):p.235-256)。斑块周围是肿胀、变性的轴突和树突(也称为萎缩性神经元)，这一事实提出了一个问题：TREM2激动剂降低斑块水平是否会导致萎缩性神经元减少。在本公开的研究中，用6E10和LAMP1对皮层进行了染色，LAMP1是萎缩性神经元的标记物(Zhong,L.等人，Soluble TREM2amelioratespathological phenotypes by modulating microglial functions in an Alzheimer’sdisease model.Nature Communications,2019.10(1):p.1365；Forner,S.等人，Systematic phenotyping and characterization of the 5xFAD mouse model ofAlzheimer’s disease.Scientific Data,2021.8(1):p.270；Gowrishankar,S.等人，Massive accumulation of luminal protease-deficient axonal lysosomes atAlzheimer's disease amyloid plaques.Proc Natl Acad Sci U S A,2015.112(28):p.E3699-708)。如图7a至b所示，与对照组Ab18/对照或对照/αTfR相比，Ab18/αTfR处理显著降低了斑块周围LAMP1的强度和LAMP1簇的总体数量。TREM2激动对海马体和皮层整体神经元密度的影响是通过NeuN免疫染色来研究的，NeuN是一种神经元核抗原，常用于定量神经元密度(Ghosh,A.等人，An epoxide hydrolase inhibitor reduces neuroinflammationin a mouse model of Alzheimer's disease.Sci Transl Med,2020.12(573)；Mariani,M.M.等人，Neuronally-directed effects of RXR activation in a mouse model ofAlzheimer’s disease.Scientific Reports,2017.7(1):p.42270)。如图7c至7d所示，在Ab18/αTfR、Ab18/对照和对照/αTfR处理之间，海马体和皮层中NeuN的整体强度相似，这表明TREM2激动显著降低了萎缩神经元的水平，但并未改变整体神经元密度。

讨论

Ab18最初是通过筛选与细胞表面TREM2结合而不阻断配体-TREM2相互作用的抗体而确定的。TREM2-DAP12报告细胞检测确定Ab18为候选物，无需涂布在固体表面或与Fc受体结合即可激活细胞。此外，经Ab18处理的小胶质细胞对oAβ脂质的吞噬能力增强。由于EC₅₀值较高，研究人员进行了抗体制备工程，确定了四价TVD-Ig格式，它能显著增强TREM2的激活作用。在小胶质细胞中进行的多项体外研究，包括SYK激活、oAβ-脂质吞噬、向oAβ-脂质迁移以及CSF耗竭下的小胶质细胞生存力，均表明Ab18-TVD Ig具有低纳摩尔范围的有效浓度。一系列机制研究表明，TVD-Ig形式通过增加受体集群增强了TREM2的激活，但不会影响细胞表面或小胶质细胞中TREM2的总体水平。为了进一步克服低浓度抗体进入大脑的问题，利用TfR介导的大分子转运作用，将Ab18/αTfR进一步设计成双特异性。Ab18/αTfR双特异性抗体显著增强了抗体的入脑能力，体内小胶质细胞的参与也得到了证实。最后，Ab18/αTfR双特异性抗体在缓解5XFAD小鼠的淀粉样病理学方面表现出卓越的活性。值得注意的是，Ab18/αTfR双特异性抗体能够在淀粉样蛋白斑块已经开始形成的治疗相关环境中减轻淀粉样蛋白病理变化。免疫荧光染色显示，小胶质细胞-斑块共定位和小胶质细胞吞噬斑块的能力增强，这可能是斑块病理变化减少的机制。出乎意料地，Ab18/αTfR还能减少萎缩神经元，而不影响神经元的整体密度。所有这些益处都表明，Ab18/αTfR对TREM2的激动作用是治疗老年痴呆症和类似神经退行性疾病的可行方法，这些疾病包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、痴呆症、路易体痴呆症(DLB)和其他疾病，包括神经炎症过程和涉及小胶质细胞的过程。

表10：编码抗体重链(H)可变区的DNA序列

表11.编码抗体轻链(L)可变区的DNA序列

抗TREM2抗体的实施方案特别筛选了不阻断TREM2与配体相互作用的候选抗体(如磷脂和oAβ等配体)。磷脂-TREM2和oAβ-TREM2的相互作用已被证明在小胶质细胞的存活、凋亡、去极化、细胞因子表达和淀粉样斑块周围的集聚中发挥着关键作用(Zhao,Y.等人，TREM2 Is a Receptor forβ-Amyloid that Mediates Microglial Function.Neuron,2018.97(5):p.1023-1031.e7；Wang,Y.等人，TREM2 lipid sensing sustains themicroglial response in an Alzheimer's disease model.Cell,2015.160(6):p.1061-71)。以往出版物中报道的TREM2激动剂抗体并没有描述它们是否会影响配体与TREM2的相互作用(Schlepckow,K.等人，Enhancing protective microglial activities with adual function TREM2 antibody to the stalk region.EMBO Mol Med,2020.12(4):p.e11227；Cheng,Q.等人，TREM2-activating antibodies abrogate the negativepleiotropic effects of the Alzheimer's disease variant Trem2(R47H)on murinemyeloid cell function.J Biol Chem,2018.293(32):p.12620-12633；Wang,S.等人，Anti-human TREM2 induces microglia proliferation and reduces pathology in anAlzheimer'sdisease model.J Exp Med,2020.217(9)；Fassler,M.等人，Engagement ofTREM2 by a novel monoclonal antibody induces activation of microglia andimproves cognitive function in Alzheimer’s disease models.Journal ofNeuroinflammation,2021.18(1):p.19；Price,B.R.等人，Therapeutic Trem2 activationameliorates amyloid-beta deposition and improves cognition in the5XFAD modelof amyloid deposition.Journal of Neuroinflammation,2020.17(1):p.238.)。

在一些实施方案中，本公开的抗体(如Ab18)可作为可溶性抗体激活TREM2，而无需固体表面涂布或接合Fc受体。

本公开内容显示，Ab18 TVD-Ig和Ab18 IgG格式可刺激oAβ脂质的吞噬作用。淀粉样斑块天然与脂质和APOE相关(Kiskis,J.等人，Plaque-associated lipids inAlzheimer’s disease brain tissue visualized by nonlinearmicroscopy.Scientific Reports,2015.5(1):p.13489；Parhizkar,S.等人，Loss ofTREM2 function increases amyloid seeding but reduces plaque-associatedApoE.Nature Neuroscience,2019.22(2):p.191-204；Liao,C.R.等人，Synchrotron FTIRreveals lipid around and within amyloid plaques in transgenic mice andAlzheimer's disease brain.Analyst,2013.138(14):p.3991-3997；Namba,Y.等人，Apolipoprotein E immunoreactivity in cerebral amyloid deposits andneurofibrillary tangles in Alzheimer'sdisease and kuru plaque amyloid inCreutzfeldt-Jakob disease.Brain Res,1991.541(1):p.163-6；Xiong,F.,W.Ge,andC.Ma,Quantitative proteomics reveals distinct composition of amyloid plaquesin Alzheimer's disease.Alzheimers Dement,2019.15(3):p.429-440)。脂质与Aβ纤维的相互作用有助于形成更具神经毒性的原纤维(Liao,C.R.等人，Synchrotron FTIR revealslipid around and within amyloid plaques in transgenic mice and Alzheimer'sdisease brain.Analyst,2013.138(14):p.3991-3997；Martins,I.C.等人，Lipids revertinert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learningin mice.Embo j,2008.27(1):p.224-33)。APOE与淀粉样蛋白斑块相关，有助于斑块接种，并影响斑块清除(Parhizkar,S.等人，Loss of TREM2function increases amyloidseeding but reduces plaque-associated ApoE.Nature Neuroscience,2019.22(2):p.191-204；Castellano,J.M.等人，Human apoE isoforms differentially regulatebrain amyloid-βpeptide clearance.Sci Transl Med,2011.3(89):p.89ra57；Liu,C.C.等人，Apolipoprotein E and Alzheimer disease:risk,mechanisms and therapy.NatRev Neurol,2013.9(2):p.106-18；Liu,C.C.等人，ApoE4 Accelerates Early Seeding ofAmyloid Pathology.Neuron,2017.96(5):p.1024-1032.e3；Spangenberg,E.等人，Sustained microglial depletion with CSF1Rinhibitor impairs parenchymal plaquedevelopment in an Alzheimer’s disease model.Nature Communications,2019.10(1):p.3758)。

当Ab18的价态增加到四价时，观察到TREM2的激活增加了100倍。激活的增加表现为更强的体外和体内生物效应。ITAM信号通路涉及多价配体，以诱导受体聚集并触发下游信号级联。

通过使用双特异性抗体靶向TfR将Ab18送入脑，使抗体脑浓度增加了10倍以上。增加的抗体脑进入表现为改善淀粉样斑块病理的体内有益作用。

在一些实施方案中，发明人观察到通过Ab18处理增强了斑块周围的小胶质细胞聚集，增加了斑块的吞噬作用。

Ab18/αTfR处理后，斑块近端萎缩性神经突的数量和染色强度均显著减少，神经元损伤减轻。虽然TREM2激动作用增加了脂质-oAβ的吞噬作用，但这不会对神经元造成旁观者有害损害。TREM2激动作用与凋亡神经元清除之间的积极联系与这种抗体结构在治疗神经退行性疾病和障碍中的效用一致，包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、痴呆、路易体痴呆(DLB)和其他疾病，包括神经炎症过程和涉及小胶质细胞的疾病。

上面描述的实施方案仅通过示例的方式提出，并不打算作为对本公开的概念和原则的限制。因此，本领域普通技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，元件及其配置和安排的各种变化是可能的。在以下实施方案中阐述了本发明的各种特征和方面。

示例性实施方案

1.特异性结合TREM2的经分离的双特异性抗体，所述抗体包含：

第一部分，其包含多个第一特异性结合位点，每个第一特异性结合位点都能与TREM2结合；和

第二部分，其包含能与TfR结合的第二特异性结合位点。

2.根据实施方案1所述的双特异性抗体，其中所述多个第一特异性结合位点包括四个第一特异性结合位点。

3.经分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合TREM2，并且所述抗体与选自TREM2-Ab1Rb、TREM2-Ab2Rb、TREM2-Ab6Rb、TREM2-Ab12Rb、TREM2-Ab16Rb、TREM2-Ab22Rb、TREM2-Ab26Rb、TREM2-Ab2HuRb、TREM2-Ab8HuRb和TREM2-Ab19HuRb的抗体竞争与TREM2表位的结合。

4.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与1H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:1)、2H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:4)、12H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:7)、16H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:10)、22H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:13)、26H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:16)、H2-Hu-HCDR1-AA(SEQ ID NO:19)、H8-Hu-HCDR1-AA(SEQ ID NO:22)或H19-Hu-HCDR1-AA(SEQ ID NO:25)具有至少80％同一性的第一V_H CDR；

(b)与1H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:2)、2H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:5)、12H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:8)、16H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:11)、22H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:14)、26H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:17)、H2-Hu-HCDR2-AA(SEQ ID NO:20)、H8-Hu-HCDR2-AA(SEQ ID NO:23)或H19-Hu-HCDR2-AA(SEQ ID NO:26)具有至少80％同一性的第二V_H CDR；

(c)与1H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:3)、2H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:6)、12H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:9)、16H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:12)、22H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:15)、26H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:18)、H2-Hu-HCDR3-AA(SEQ ID NO:21)、H8-Hu-HCDR3-AA(SEQ ID NO:24)或H19-Hu-HCDR3-AA(SEQ ID NO:27)具有至少80％同一性的第三V_H CDR；

(d)与1K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:28)、2K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:30)、6K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:32)、12K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:34)、16K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:36)、22K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:38)、26K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:40)、2L-Hu-LCDR1-AA(SEQ ID NO:42)、8L-Hu-LCDR1-AA(SEQ ID NO:44)或19L-Hu-LCDR1-AA(SEQ ID NO:46)具有至少80％同一性的第一V_L区；

(e)与1K-LCDR2-AA(三肽GAS)、2K-LCDR2-AA(三肽GAS)、6K-LCDR2-AA(三肽GAS)、12K-LCDR2-AA(三肽KAS)、16K-LCDR2-AA(三肽KAS)、22K-LCDR2-AA(三肽RIS)、26K-LCDR2-AA(三肽QAS)、2L-Hu-LCDR2-AA(三肽EVS)、8L-Hu-LCDR2-AA(三肽TNN)或19L-Hu-LCDR2-AA(三肽DVT)具有至少80％同一性的第二V_L CDR；和

(f)与1K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:29)、2K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:31)、6K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:33)、12K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:35)、16K-LCDR3-AA(SEQ ID NO.37)、22K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:39)、26K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:41)、2L-Hu-LCDR3-AA(SEQ ID NO:43)、B09(SEQ ID NO:27)、8L-Hu-LCDR3-AA(SEQ ID NO:45)或19L-Hu-LCDR3-AA(SEQ IDNO:47)具有至少80％同一性的第三V_L CDR。

5.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:1相同的第一V_H CDR；

(b)包含与SEQ ID NO:2相同的V_H CDR的第二部分；

(c)与SEQ ID NO:3相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:28相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽GAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:29相同的第三V_L CDR。

6.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:4相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:5相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:6相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:30相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽GAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:31相同的第三V_L CDR。

7.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:7相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:8相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:9相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:32相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽GAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:33相同的第三V_L CDR。

8.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:10相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:11相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:12相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:34相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽KAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:35相同的第三V_L CDR。

9.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:13相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:14相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:15相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:36相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽KAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:37相同的第三V_L CDR。

10.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:16相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:17相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:18相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:38相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽RIS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:39相同的第三V_L CDR。

11.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:19相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:20相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:21相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:40相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽QAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:41相同的第三V_L CDR。

12.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:22相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:23相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:24相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:42相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽EVS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:43相同的第三V_L CDR。

13.根据实施方案4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO:25相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:26相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:27相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:44相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽TNN相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:45相同的第三V_L CDR。

14.根据实施方案4所述的抗体，其中所述抗体包含：

(i)与1H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:61)或1H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与1K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:67)或1K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(ii)与2H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:62)或2H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与2K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:68)或2K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(iii)与2H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:62)或2H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与6K LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:69)或6K LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(iv)与12H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:63)或12H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与12K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:70)或12K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(v)与16H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:64)或16H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与16K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:71)或16K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(vi)与22H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:65)或22H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与22K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:72)或22K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(vii)与26H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:66)或26H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与26K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:73)或26K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(viii)与H2-Hu-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:58)或H2-Hu-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与2L-Hu-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:74)或2L-Hu-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(ix)与H8-Hu-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:59)或H8-Hu-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与8L-Hu-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:75)或8L-Hu-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；或

(x)与H19-Hu HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:66)或H19-Hu HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与19L-Hu-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:76)或19L-Hu-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域。

15.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是重组的。

16.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。

17.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价第二特异性结合位点。

18.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人类抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。

19.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体与成像剂缀合。

20.嵌合抗原受体，其包含与根据前述实施方案中任一项所述的单克隆抗体的抗原结合结构域具有至少80％同一性的抗原结合结构域。

21.组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据实施方案1至14中任一项所述的抗体。

22.经分离的多核苷酸分子，其包含编码根据实施方案1至14中任一项所述的抗体的核酸序列。

23.包含抗体V_H结构域的重组多肽，抗体V_H结构域包括TREM2-Ab1Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)；TREM2-Ab2Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)；TREM2-Ab2Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)；TREM2-Ab12Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)；TREM2-Ab16Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)；TREM2-Ab22Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15)；TREM2-Ab26Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)；TREM2-Ab2Hu的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21)；TREM2-Ab8Hu的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)；或TREM2-Ab119Hu的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)。

24.包含抗体V_L结构域的重组多肽，抗体V_L结构域包括TREM2-Ab1Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab2Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab6Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab12Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab16Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab22Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab26Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab2Hu的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab8Hu的V_L结构域的CDR1至CDR3；或TREM2-Ab19Hu的V_L结构域的CDR1至CDR3。

25.经分离的多核苷酸分子，其包含编码根据实施方案23或24所述的多肽的核酸序列。

26.宿主细胞，其包含编码根据实施方案1至14中任一项所述的抗体或根据实施方案23或24所述的重组多肽的一个或多于一个多核苷酸分子。

27.根据实施方案26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

28.表达载体，其包含与H2-Hu-HC-DNA、H8-Hu-HC-DNA、19H-Hu HC-DNA、16H-HC-DNA、22H-HC-DNA、26H-HC-DNA、H2-Hu-HC-DNA、H8-Hu-HC-DNA或H19-Hu-HC-DNA具有至少95％同一性的多核苷酸。

29.表达载体，其包含与20L-LC-DNA、8L-LC-DNA、19L LC-DNA、1K-LC-DNA、2K-LC-DNA、6K-LC-DNA、2K-LC-DNA、16K-LC-DNA、22K-LC-DNA或26K-LC-DNA具有至少95％同一性的多核苷酸。

30.制造抗体的方法，其包括：

(a)在细胞中表达一个或多于一个编码根据实施方案1至14中任一项所述的抗体的V_L链和V_H链的多核苷酸分子；和

(b)从细胞和/或细胞所在的液体培养基中纯化抗体。

Claims (30)

1.一种特异性结合TREM2的经分离的双特异性抗体，所述抗体包含：

第一部分，其包含多个第一特异性结合位点，每个第一特异性结合位点都能与TREM2结合；和

第二部分，其包含能与TfR结合的第二特异性结合位点。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述多个第一特异性结合位点包括四个第一特异性结合位点。

3.一种经分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合TREM2，并且其中所述抗体与选自TREM2-Ab1Rb、TREM2-Ab2Rb、TREM2-Ab6Rb、TREM2-Ab12Rb、TREM2-Ab16Rb、TREM2-Ab22Rb、TREM2-Ab26Rb、TREM2-Ab2HuRb、TREM2-Ab8HuRb和TREM2-Ab19HuRb的抗体竞争与TREM2表位的结合。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与1H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:1)、2H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:4)、12H-HCDR1-AA(SEQID NO:7)、16H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:10)、22H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:13)、26H-HCDR1-AA(SEQ ID NO:16)、H2-Hu-HCDR1-AA(SEQ ID NO:19)、H8-Hu-HCDR1-AA(SEQ ID NO:22)或H19-Hu-HCDR1-AA(SEQ ID NO:25)具有至少80％同一性的第一V_H CDR；

(b)与1H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:2)、2H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:5)、12H-HCDR2-AA(SEQID NO:8)、16H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:11)、22H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:14)、26H-HCDR2-AA(SEQ ID NO:17)、H2-Hu-HCDR2-AA(SEQ ID NO:20)、H8-Hu-HCDR2-AA(SEQ ID NO:23)或H19-Hu-HCDR2-AA(SEQ ID NO:26)具有至少80％同一性的第二V_H CDR；

(c)与1H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:3)、2H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:6)、12H-HCDR3-AA(SEQID NO:9)、16H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:12)、22H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:15)、26H-HCDR3-AA(SEQ ID NO:18)、H2-Hu-HCDR3-AA(SEQ ID NO:21)、H8-Hu-HCDR3-AA(SEQ ID NO:24)或H19-Hu-HCDR3-AA(SEQ ID NO:27)具有至少80％同一性的第三V_H CDR；

(d)与1K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:28)、2K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:30)、6K-LCDR1-AA(SEQID NO:32)、12K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:34)、16K-LCDR1-AA(SEQ IDNO:36)、22K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:38)、26K-LCDR1-AA(SEQ ID NO:40)、2L-Hu-LCDR1-AA(SEQ ID NO:42)、8L-Hu-LCDR1-AA(SEQ ID NO:44)或19L-Hu-LCDR1-AA(SEQ ID NO:46)具有至少80％同一性的第一V_L区；

(e)与1K-LCDR2-AA(三肽GAS)、2K-LCDR2-AA(三肽GAS)、6K-LCDR2-AA(三肽GAS)、12K-LCDR2-AA(三肽KAS)、16K-LCDR2-AA(三肽KAS)、22K-LCDR2-AA(三肽RIS)、26K-LCDR2-AA(三肽QAS)、2L-Hu-LCDR2-AA(三肽EVS)、8L-Hu-LCDR2-AA(三肽TNN)或19L-Hu-LCDR2-AA(三肽DVT)具有至少80％同一性的第二V_L CDR；和

(f)与1K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:29)、2K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:31)、6K-LCDR3-AA(SEQID NO:33)、12K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:35)、16K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:37)、22K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:39)、26K-LCDR3-AA(SEQ ID NO:41)、2L-Hu-LCDR3-AA(SEQ ID NO:43)、B09(SEQ ID NO:27)、8L-Hu-LCDR3-AA(SEQ ID NO:45)或19L-Hu-LCDR3-AA(SEQ ID NO:47)具有至少80％同一性的第三V_L CDR。

5.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:1相同的第一V_H CDR；

(b)包含与SEQ ID NO:2相同的V_H CDR的第二部分；

(c)与SEQ ID NO:3相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:28相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽GAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:29相同的第三V_L CDR。

6.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:4相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:5相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:6相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:30相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽GAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:31相同的第三V_L CDR。

7.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:7相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:8相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:9相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:32相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽GAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:33相同的第三V_L CDR。

8.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:10相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:11相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:12相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:34相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽KAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:35相同的第三V_L CDR。

9.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:13相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:14相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:15相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:36相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽KAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:37相同的第三V_L CDR。

10.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:16相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:17相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:18相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:38相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽RIS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:39相同的第三V_L CDR。

11.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:19相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:20相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:21相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:40相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽QAS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:41相同的第三V_L CDR。

12.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:22相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:23相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:24相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:42相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽EVS相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:43相同的第三V_L CDR。

13.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:25相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:26相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:27相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:44相同的第一V_L CDR；

(e)与三肽TNN相同的第二V_L CDR；和

(f)与SEQ ID NO:45相同的第三V_L CDR。

14.根据权利要求4所述的抗体，其中所述抗体包含：

(i)与1H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:61)或1H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与1K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:67)或1K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(ii)与2H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:62)或2H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与2K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:68)或2K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(iii)与2H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:62)或2H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与6K LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:69)或6K LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(iv)与12H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:63)或12H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与12K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:70)或12K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(v)与16H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:64)或16H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与16K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:71)或16K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(vi)与22H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:65)或22H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与22K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:72)或22K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(vii)与26H-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:66)或26H-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与26K-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:73)或26K-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(viii)与H2-Hu-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:58)或H2-Hu-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与2L-Hu-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:74)或2L-Hu-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(ix)与H8-Hu-HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:59)或H8-Hu-HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与8L-Hu-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:75)或8L-Hu-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；或

(x)与H19-Hu HC-AA的V_H结构域(SEQ ID NO:66)或H19-Hu HC-AA的人源化V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与19L-Hu-LC-AA的V_L结构域(SEQ ID NO:76)或19L-Hu-LC-AA的人源化V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是重组的。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA、或其抗原结合片段。

17.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价第二特异性结合位点。

18.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人类抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。

19.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体与成像剂缀合。

20.一种嵌合抗原受体，其包含与根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体的抗原结合结构域具有至少80％同一性的抗原结合结构域。

21.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体。

22.一种经分离的多核苷酸分子，其包含编码根据权利要求1至14中任一项所述的抗体的核酸序列。

23.一种包含抗体V_H结构域的重组多肽，所述抗体V_H结构域包括TREM2-Ab1Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)；TREM2-Ab2Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)；TREM2-Ab2Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)；TREM2-Ab12Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)；TREM2-Ab16Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)；TREM2-Ab22Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15)；TREM2-Ab26Rb的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)；TREM2-Ab2Hu的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21)；TREM2-Ab8Hu的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)；或TREM2-Ab119Hu的V_H结构域的CDR1至CDR3(SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)。

24.一种包含抗体V_L结构域的重组多肽，所述抗体V_L结构域包括TREM2-Ab1Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab2Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab6Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab12Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab16Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab22Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab26Rb的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab2Hu的V_L结构域的CDR1至CDR3；TREM2-Ab8Hu的V_L结构域的CDR1至CDR3；或TREM2-Ab19Hu的V_L结构域的CDR1至CDR3。

25.一种经分离的多核苷酸分子，其包含编码根据权利要求23或24所述的多肽的核酸序列。

26.一种宿主细胞，其包含编码根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或根据权利要求23或24所述的重组多肽的一个或多于一个多核苷酸分子。

27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

28.一种表达载体，其包含与H2-Hu-HC-DNA、H8-Hu-HC-DNA、19H-Hu HC-DNA、16H-HC-DNA、22H-HC-DNA、26H-HC-DNA、H2-Hu-HC-DNA、H8-Hu-HC-DNA或H19-Hu-HC-DNA具有至少95％同一性的多核苷酸。

29.一种表达载体，其包含与20L-LC-DNA、8L-LC-DNA、19L LC-DNA、1K-LC-DNA、2K-LC-DNA、6K-LC-DNA、2K-LC-DNA、16K-LC-DNA、22K-LC-DNA或26K-LC-DNA具有至少95％同一性的多核苷酸。

30.一种制造抗体的方法，其包括：

(a)在细胞中表达一个或多于一个编码根据权利要求1至14中任一项所述的抗体的V_L链和V_H链的多核苷酸分子；和

(b)从细胞和/或细胞所在的液体培养基中纯化抗体。