CN118259018B - C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用 - Google Patents
C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,涉及生物医学技术领域,包括C1s抗体在制备ITP诊断中的应用,所述C1s抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本申请中通过具体实施例对C1s抗体在诊断ITP中的具体应用,提供了可靠的实验依据,为后期进一步研发ITP的诊断方法提供了思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用。
背景技术
ITP免疫性血小板减少症是一种常见的出血性疾病,由于免疫系统异常导致血小板数量减少。ITP的发病率在成人和儿童中都有所不同,其中育龄期女性和60岁以上的老年人更容易患病。全球范围内,ITP的发病率约为5~10/10万。
目前,ITP的诊断主要是采取排除法[候明,胡豫.成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版),中华血液学杂志,2020,41(8):617-623.]:①至少连续2次血常规检查示血小板计数减少(<100×109/L),外周血涂片镜检血细胞形态无明显异常;②脾脏一般不增大;③骨髓检查:ITP患者骨髓细胞形态学特点为巨核细胞增多或正常,伴成熟障碍;④须排除其他继发性血小板减少症:自身免疫性疾病、甲状腺疾病、淋巴系统增殖性疾病、骨髓增生异常综合征(MDS)、再生障碍性贫血(AA)、各种恶性血液病、肿瘤浸润、慢性肝病、脾功能亢进、普通变异型免疫缺陷病(CVID)、感染、疫苗接种等所致继发性血小板减少,血小板消耗性减少,药物所致血小板减少,同种免疫性血小板减少,妊娠期血小板减少,先天性血小板减少及假性血小板减少。另一种临床诊断ITP的方法是:对疑似ITP患者进行ITP的方案治疗,治疗有效则诊断为ITP。由此可见,现对于ITP尚缺乏有效的诊断方法和诊断标志物。另需要补充 ITP与C1s间可能的关系的背景知识,以便引入进行本专利开发的意义和临床应用可能性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中没有ITP诊断标志物,且诊断方法存在特异性不高、易与其他疾病混淆等技术问题。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,所述C1s抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-10所示,其中, SEQ ID NO:1-3为C1s抗体的重链基因序列,SEQID NO:4-5为C1s抗体的重链氨基酸序列,SEQ ID NO:6-8为C1s抗体的轻链基因序列,SEQID NO:9-10为C1s抗体的轻链氨基酸序列。优选的,所述诊断产品包括试剂盒及检测试剂,所述试剂盒及检测试剂以C1s抗体作为待测靶点C1s的特异性检测试剂。
本申请还提供了一种用于ITP诊断的试剂盒,所述试剂盒以血小板上C1s为检测靶点。
优选的,所述试剂盒还包括医学上可接受的其他试剂。
本申请还提供了C1s抗体在制备ITP产品中的应用的非诊断性验证方法,所述验证方法包含以下内容:
S1:抗体性能验证实验;
S2: C1s抗体FITC标记实验;
S3:血小板C1s-FITC流式检测实验。
优选的,所述抗体性能验证实验包括ELISA结合实验及SDS-PAGE检测。
优选的,所述血小板C1s-FITC流式检测实验包括两组实验,两组实验分别为正常人血小板C1s-FITC流式检测实验及血小板减少的C1s-FITC流式检测实验。
优选的,所述血小板C1s-FITC流式检测包含以下步骤:
A1:标本的采集及处理;
A2:染色和固定细胞;
具体包括阴性对照及样本检测:
阴性对照:取50ulPBS(ph7.2)加入已标记的A1试管中,再加入1ul全血,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
样本检测:取50ulPBS加入已标记的B1试管中,再加入1ul全血,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
A3:上机检测、分析结果。
综上所述,本申请中通过具体实施例对C1s抗体在ITP诊断中的具体应用,提供了可靠的实验依据,为后期进一步研发ITP的诊断方法提供了思路。
附图说明
图1为本发明一实施方式中C1s抗体SDS-PAGE检测示意图(R:还原SDS-PAGE;N-R:非还原SDS-PAGE);
图2为本发明一实施方式中展示了活化C1s膜结合的血小板的检测,其中,A:对血小板进行标记(CD61阳性门里为血小板);B:血小板检测的同型对照;C:正常对照活化C1s膜结合的血小板的检测;D:非ITP血小板减少活化C1s膜结合的血小板的检测;E:ITP活化C1s膜结合的血小板的检测;F:正常对照组(NC)、非ITP血小板减少组(CC)、ITP组间活化C1s膜结合的血小板差异统计学分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步地详细说明。
本申请提供了C1s抗体在的制备及其在ITP诊断产品中的应用,所述C1s抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-10所示,其中, SEQ ID NO:1-3为C1s抗体的重链基因序列,SEQID NO:4-5为C1s抗体的重链氨基酸序列,SEQ ID NO:6-8为C1s抗体的轻链基因序列,SEQID NO:9-10为C1s抗体的轻链氨基酸序列。
所述诊断产品包括检测试剂、检测试剂盒。
本申请中的C1s抗体按照氨基酸序列由上海百英生物技术有限公司制备。
以下结合具体实施例对本申请上述内容进行阐述。
实施例1:C1s抗体性能验证
S1:ELISA结合实验
包被:包被 2μg/mL B22750901,100μL/well,37℃ 1h,洗板 6 次,拍干;
封闭:酪蛋白封闭液200μL/well,温度保持25℃ ,持续时间1h,洗板 6 次,拍干;
结合:首孔400nM,用封闭液3倍稀释,11 个梯度,末孔空白,100μL/well, 25℃ 1h,洗 6 次,拍干;
HRP:Anti-Mouse Fc specific HRP用封闭液1:65000 稀释,100μL/well, 25℃1h,洗板 6 次,拍干;
显色:100μL/well 显色液,室温避光显色 4min;
终止:50μL/well 终止液;
读数:OD450;
结论:制备的C1s抗体与C1s抗原具有良好的结合效果。
表1: C1s抗体与C1s抗原结合情况表
结合 nM | 400 | 133.33 | 44.44 | 14.81 | 4.93 | 1.64 | 0.548 | 0.182 | 0.060 | 0.020 | 0.007 | 0 | EC50 |
C1s抗体 | 1.455 | 1.389 | 1.391 | 1.433 | 1.408 | 1.245 | 0.882 | 0.456 | 0.219 | 0.104 | 0.114 | 0.044 | 0.4029 |
阳性对照 | 1.434 | 1.257 | 1.168 | 1.157 | 1.124 | 0.968 | 0.68 | 0.385 | 0.189 | 0.102 | 0.064 | 0.044 | 0.5121 |
阴性对照 | 0.046 | 0.045 | 0.046 | 0.049 | 0.044 | 0.066 | 0.046 | 0.041 | 0.042 | 0.046 | 0.042 | 0.046 | |
blank | 0.052 | 0.05 | 0.045 | 0.048 | 0.047 | 0.06 | 0.044 | 0.045 | 0.044 | 0.045 | 0.044 | 0.039 |
S2:SDS-PAGE检测
样品变性处理:还原加热99℃ 6min;非还原加热99℃ 3min;
加样:10µL/孔 电泳(ve180):180V电压,设定时间 40min,当溴酚蓝跑至红色胶条处即可结束电泳;
染色脱色:设置染脱时间13min;
使用凝胶成像仪,设置参数为白光并进行拍照。
请参阅图1,结果显示,重组C1s抗体还原SDS-PAGE上为两条带,非还原SDS-PAGE为一条带。
实施例2:C1s抗体FITC标记实验
S1:用天平称取FITC溶于DMSO中,配成浓度10mg/mL的溶液;
S2:用超滤管将C1s抗体的缓存体系置换成10mM的碳酸缓冲液体系:将抗体分别加入超滤管,并加入10mM的碳酸缓冲液,5000*g 30min,4度30min。
S3:重复步骤S2两次;
S4:将超滤好的抗体吸出,加入EP管,加入5UL的FITC溶液,放入恒温混匀仪上反应3h(25度,500转)。
S5:反应完的抗体进行超滤:将抗体分别加入超滤管,并加入2mL 0.2M PH=7.4PBS(EDTA)缓冲液。5000×g 30min,4度离心。
S6:重复步骤S5两次;
S7:取出超滤完的抗体,用200uL 0.2M PH=7.4 PBS(EDTA)缓冲液对超滤管进行润洗,将润洗液加入到抗体中。
实施例3:
血小板C1s-FITC流式检测实验
(一)、血小板正常(100~300×109)样本C1s-FITC流式检测:
1、标本采集:使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取静脉血2mL。
2、染色和固定细胞:
①阴性对照,取50uL PBS(ph=7.2)加入已标记的A1试管中,再加入1ul全血,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
②样本检测,取50uL PBS加入已标记的B1试管中,再加入1uL全血,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5uL,涡旋振荡后避孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
3、上机检测、分析结果。用FACSComp调整仪器前向角(FSC)、侧向角(SSC)、荧光一(FL1)、荧光二(FL2)的电压及补偿。以SSC为纵坐标,CD61-PE为横坐标获取数据(见图2-A),在A图上分别选定血小板群设门(见图2-A),用CELLQuest软件获取5000个血小板进行分析,以IgG1-PE作同型对照(见图2-B),计算C1s阳性血小板占的比例(见图2-C)。
(二)血小板数量减少(<100×109)的C1s-FITC流式检测实验
1、标本采集:使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取静脉血2mL。
2、标本处理:离心,3000rpm,5min,离心后轻轻取出放于试管架上。
3、染色和固定细胞:
①阴性对照,取40uL PBS加入已标记的A1试管中,再加入10uL上层血浆,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5uL,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
②样本检测,取40uL PBS加入已标记的A1试管中,再加入10uL上层血浆,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5uL,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
3、上机检测、分析结果。用FACSComp调整仪器前向角(FSC)、侧向角(SSC)、荧光一(FL1)、荧光二(FL2)的电压及补偿。以SSC为纵坐标,CD61-PE为横坐标获取数据(见图2-A),在A图上分别选定血小板群设门(见图2-A),用CELLQuest软件获取5000个血小板进行分析,以IgG1-PE作同型对照(见图2-B),计算C1s阳性血小板占的比例(见图2-D、E)。
请参阅图2,结果显示,ITP患者C1s阳性血小板的比例显著高于正常人群和其它类型的血小板减少患者(见图2-D、E、F)。
综上所述,本申请中通过具体实施例对C1s抗体在ITP诊断中的具体应用,提供了可靠的实验依据,为后期进一步研发ITP的诊断方法提供了思路。
Claims (8)
1.C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于:所述C1s抗体的序列如SEQ IDNO:1-10所示,其中, SEQ ID NO:1-3为C1s抗体的重链基因序列,SEQ ID NO:4-5为C1s抗体的重链氨基酸序列,SEQ ID NO:6-8为C1s抗体的轻链基因序列,SEQ ID NO:9-10为C1s抗体的轻链氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的 C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于:所述诊断产品包括试剂盒及检测试剂,所述试剂盒及检测试剂以C1s抗体作为待测靶点C1s的特异性检测试剂。
3.根据权利要求1所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,该应用包括非诊断性验证方法,所述非诊断性验证方法包含以下内容:
S1:抗体性能验证实验;
S2: C1s抗体FITC标记实验;
S3:血小板C1s-FITC流式检测实验。
4.根据权利要求3所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,所述抗体性能验证实验包括ELISA结合实验及SDS-PAGE检测。
5.根据权利要求3所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,所述血小板C1s-FITC流式检测实验包括两组实验,两组实验分别为正常人血小板C1s-FITC流式检测实验及血小板减少的C1s-FITC流式检测实验。
6.根据权利要求5所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,所述血小板C1s-FITC流式检测包含以下步骤:
A1:标本的采集及处理;
A2:染色和固定细胞;
具体包括阴性对照及样本检测:
阴性对照:取ph7.2的50ulPBS加入已标记的A1试管中,再加入1ul全血,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,1500rpm离心5min,吸取上清,再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
样本检测:取50ulPBS加入已标记的B1试管中,再加入1ul全血,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,1500rpm离心5min,吸取上清,再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
A3:上机检测、分析结果。
7.一种用于ITP诊断的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒以血小板上C1s为检测靶点,所述试剂盒还包括权利要求1所述的C1s抗体。
8.根据权利要求7所述的一种用于ITP诊断的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括医学上可接受的其他试剂。
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