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CN118259018B - C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用 - Google Patents

C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,涉及生物医学技术领域,包括C1s抗体在制备ITP诊断中的应用,所述C1s抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本申请中通过具体实施例对C1s抗体在诊断ITP中的具体应用,提供了可靠的实验依据,为后期进一步研发ITP的诊断方法提供了思路。

Description

C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及C1s抗体制备及其在ITP诊断中的应用。
背景技术
ITP免疫性血小板减少症是一种常见的出血性疾病,由于免疫系统异常导致血小板数量减少。ITP的发病率在成人和儿童中都有所不同,其中育龄期女性和60岁以上的老年人更容易患病。全球范围内,ITP的发病率约为5~10/10万。
目前,ITP的诊断主要是采取排除法[候明,胡豫.成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版),中华血液学杂志,2020,41(8):617-623.]:①至少连续2次血常规检查示血小板计数减少(<100×109/L),外周血涂片镜检血细胞形态无明显异常;②脾脏一般不增大;③骨髓检查:ITP患者骨髓细胞形态学特点为巨核细胞增多或正常,伴成熟障碍;④须排除其他继发性血小板减少症:自身免疫性疾病、甲状腺疾病、淋巴系统增殖性疾病、骨髓增生异常综合征(MDS)、再生障碍性贫血(AA)、各种恶性血液病、肿瘤浸润、慢性肝病、脾功能亢进、普通变异型免疫缺陷病(CVID)、感染、疫苗接种等所致继发性血小板减少,血小板消耗性减少,药物所致血小板减少,同种免疫性血小板减少,妊娠期血小板减少,先天性血小板减少及假性血小板减少。另一种临床诊断ITP的方法是:对疑似ITP患者进行ITP的方案治疗,治疗有效则诊断为ITP。由此可见,现对于ITP尚缺乏有效的诊断方法和诊断标志物。另需要补充 ITP与C1s间可能的关系的背景知识,以便引入进行本专利开发的意义和临床应用可能性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中没有ITP诊断标志物,且诊断方法存在特异性不高、易与其他疾病混淆等技术问题。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,所述C1s抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-10所示,其中, SEQ ID NO:1-3为C1s抗体的重链基因序列,SEQID NO:4-5为C1s抗体的重链氨基酸序列,SEQ ID NO:6-8为C1s抗体的轻链基因序列,SEQID NO:9-10为C1s抗体的轻链氨基酸序列。优选的,所述诊断产品包括试剂盒及检测试剂,所述试剂盒及检测试剂以C1s抗体作为待测靶点C1s的特异性检测试剂。
本申请还提供了一种用于ITP诊断的试剂盒,所述试剂盒以血小板上C1s为检测靶点。
优选的,所述试剂盒还包括医学上可接受的其他试剂。
本申请还提供了C1s抗体在制备ITP产品中的应用的非诊断性验证方法,所述验证方法包含以下内容:
S1:抗体性能验证实验;
S2: C1s抗体FITC标记实验;
S3:血小板C1s-FITC流式检测实验。
优选的,所述抗体性能验证实验包括ELISA结合实验及SDS-PAGE检测。
优选的,所述血小板C1s-FITC流式检测实验包括两组实验,两组实验分别为正常人血小板C1s-FITC流式检测实验及血小板减少的C1s-FITC流式检测实验。
优选的,所述血小板C1s-FITC流式检测包含以下步骤:
A1:标本的采集及处理;
A2:染色和固定细胞;
具体包括阴性对照及样本检测:
阴性对照:取50ulPBS(ph7.2)加入已标记的A1试管中,再加入1ul全血,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
样本检测:取50ulPBS加入已标记的B1试管中,再加入1ul全血,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
A3:上机检测、分析结果。
综上所述,本申请中通过具体实施例对C1s抗体在ITP诊断中的具体应用,提供了可靠的实验依据,为后期进一步研发ITP的诊断方法提供了思路。
附图说明
图1为本发明一实施方式中C1s抗体SDS-PAGE检测示意图(R:还原SDS-PAGE;N-R:非还原SDS-PAGE);
图2为本发明一实施方式中展示了活化C1s膜结合的血小板的检测,其中,A:对血小板进行标记(CD61阳性门里为血小板);B:血小板检测的同型对照;C:正常对照活化C1s膜结合的血小板的检测;D:非ITP血小板减少活化C1s膜结合的血小板的检测;E:ITP活化C1s膜结合的血小板的检测;F:正常对照组(NC)、非ITP血小板减少组(CC)、ITP组间活化C1s膜结合的血小板差异统计学分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步地详细说明。
本申请提供了C1s抗体在的制备及其在ITP诊断产品中的应用,所述C1s抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-10所示,其中, SEQ ID NO:1-3为C1s抗体的重链基因序列,SEQID NO:4-5为C1s抗体的重链氨基酸序列,SEQ ID NO:6-8为C1s抗体的轻链基因序列,SEQID NO:9-10为C1s抗体的轻链氨基酸序列。
所述诊断产品包括检测试剂、检测试剂盒。
本申请中的C1s抗体按照氨基酸序列由上海百英生物技术有限公司制备。
以下结合具体实施例对本申请上述内容进行阐述。
实施例1:C1s抗体性能验证
S1:ELISA结合实验
包被:包被 2μg/mL B22750901,100μL/well,37℃ 1h,洗板 6 次,拍干;
封闭:酪蛋白封闭液200μL/well,温度保持25℃ ,持续时间1h,洗板 6 次,拍干;
结合:首孔400nM,用封闭液3倍稀释,11 个梯度,末孔空白,100μL/well, 25℃ 1h,洗 6 次,拍干;
HRP:Anti-Mouse Fc specific HRP用封闭液1:65000 稀释,100μL/well, 25℃1h,洗板 6 次,拍干;
显色:100μL/well 显色液,室温避光显色 4min;
终止:50μL/well 终止液;
读数:OD450;
结论:制备的C1s抗体与C1s抗原具有良好的结合效果。
表1: C1s抗体与C1s抗原结合情况表
结合 nM 400 133.33 44.44 14.81 4.93 1.64 0.548 0.182 0.060 0.020 0.007 0 EC50
C1s抗体 1.455 1.389 1.391 1.433 1.408 1.245 0.882 0.456 0.219 0.104 0.114 0.044 0.4029
阳性对照 1.434 1.257 1.168 1.157 1.124 0.968 0.68 0.385 0.189 0.102 0.064 0.044 0.5121
阴性对照 0.046 0.045 0.046 0.049 0.044 0.066 0.046 0.041 0.042 0.046 0.042 0.046
blank 0.052 0.05 0.045 0.048 0.047 0.06 0.044 0.045 0.044 0.045 0.044 0.039
S2:SDS-PAGE检测
样品变性处理:还原加热99℃ 6min;非还原加热99℃ 3min;
加样:10µL/孔 电泳(ve180):180V电压,设定时间 40min,当溴酚蓝跑至红色胶条处即可结束电泳;
染色脱色:设置染脱时间13min;
使用凝胶成像仪,设置参数为白光并进行拍照。
请参阅图1,结果显示,重组C1s抗体还原SDS-PAGE上为两条带,非还原SDS-PAGE为一条带。
实施例2:C1s抗体FITC标记实验
S1:用天平称取FITC溶于DMSO中,配成浓度10mg/mL的溶液;
S2:用超滤管将C1s抗体的缓存体系置换成10mM的碳酸缓冲液体系:将抗体分别加入超滤管,并加入10mM的碳酸缓冲液,5000*g 30min,4度30min。
S3:重复步骤S2两次;
S4:将超滤好的抗体吸出,加入EP管,加入5UL的FITC溶液,放入恒温混匀仪上反应3h(25度,500转)。
S5:反应完的抗体进行超滤:将抗体分别加入超滤管,并加入2mL 0.2M PH=7.4PBS(EDTA)缓冲液。5000×g 30min,4度离心。
S6:重复步骤S5两次;
S7:取出超滤完的抗体,用200uL 0.2M PH=7.4 PBS(EDTA)缓冲液对超滤管进行润洗,将润洗液加入到抗体中。
实施例3:
血小板C1s-FITC流式检测实验
(一)、血小板正常(100~300×109)样本C1s-FITC流式检测:
1、标本采集:使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取静脉血2mL。
2、染色和固定细胞:
①阴性对照,取50uL PBS(ph=7.2)加入已标记的A1试管中,再加入1ul全血,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
②样本检测,取50uL PBS加入已标记的B1试管中,再加入1uL全血,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5uL,涡旋振荡后避孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
3、上机检测、分析结果。用FACSComp调整仪器前向角(FSC)、侧向角(SSC)、荧光一(FL1)、荧光二(FL2)的电压及补偿。以SSC为纵坐标,CD61-PE为横坐标获取数据(见图2-A),在A图上分别选定血小板群设门(见图2-A),用CELLQuest软件获取5000个血小板进行分析,以IgG1-PE作同型对照(见图2-B),计算C1s阳性血小板占的比例(见图2-C)。
(二)血小板数量减少(<100×109)的C1s-FITC流式检测实验
1、标本采集:使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取静脉血2mL。
2、标本处理:离心,3000rpm,5min,离心后轻轻取出放于试管架上。
3、染色和固定细胞:
①阴性对照,取40uL PBS加入已标记的A1试管中,再加入10uL上层血浆,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5uL,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
②样本检测,取40uL PBS加入已标记的A1试管中,再加入10uL上层血浆,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5uL,涡旋振荡后避光孵育15min,离心(1500rpm,5min),吸取上清(避免吸到红细胞),再加入450uL PBS后充分混匀,待测。
3、上机检测、分析结果。用FACSComp调整仪器前向角(FSC)、侧向角(SSC)、荧光一(FL1)、荧光二(FL2)的电压及补偿。以SSC为纵坐标,CD61-PE为横坐标获取数据(见图2-A),在A图上分别选定血小板群设门(见图2-A),用CELLQuest软件获取5000个血小板进行分析,以IgG1-PE作同型对照(见图2-B),计算C1s阳性血小板占的比例(见图2-D、E)。
请参阅图2,结果显示,ITP患者C1s阳性血小板的比例显著高于正常人群和其它类型的血小板减少患者(见图2-D、E、F)。
综上所述,本申请中通过具体实施例对C1s抗体在ITP诊断中的具体应用,提供了可靠的实验依据,为后期进一步研发ITP的诊断方法提供了思路。

Claims (8)

1.C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于:所述C1s抗体的序列如SEQ IDNO:1-10所示,其中, SEQ ID NO:1-3为C1s抗体的重链基因序列,SEQ ID NO:4-5为C1s抗体的重链氨基酸序列,SEQ ID NO:6-8为C1s抗体的轻链基因序列,SEQ ID NO:9-10为C1s抗体的轻链氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的 C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于:所述诊断产品包括试剂盒及检测试剂,所述试剂盒及检测试剂以C1s抗体作为待测靶点C1s的特异性检测试剂。
3.根据权利要求1所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,该应用包括非诊断性验证方法,所述非诊断性验证方法包含以下内容:
S1:抗体性能验证实验;
S2: C1s抗体FITC标记实验;
S3:血小板C1s-FITC流式检测实验。
4.根据权利要求3所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,所述抗体性能验证实验包括ELISA结合实验及SDS-PAGE检测。
5.根据权利要求3所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,所述血小板C1s-FITC流式检测实验包括两组实验,两组实验分别为正常人血小板C1s-FITC流式检测实验及血小板减少的C1s-FITC流式检测实验。
6.根据权利要求5所述的C1s抗体在制备ITP诊断产品中的应用,其特征在于,所述血小板C1s-FITC流式检测包含以下步骤:
A1:标本的采集及处理;
A2:染色和固定细胞;
具体包括阴性对照及样本检测:
阴性对照:取ph7.2的50ulPBS加入已标记的A1试管中,再加入1ul全血,并分别加入相应的同型对照作为荧光抗体阴性对照5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,1500rpm离心5min,吸取上清,再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
样本检测:取50ulPBS加入已标记的B1试管中,再加入1ul全血,分别加入CD61-PE、C1s-FITC荧光抗体各5ul,涡旋振荡后避光孵育15min,1500rpm离心5min,吸取上清,再加入450ulPBS后充分混匀,待测;
A3:上机检测、分析结果。
7.一种用于ITP诊断的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒以血小板上C1s为检测靶点,所述试剂盒还包括权利要求1所述的C1s抗体。
8.根据权利要求7所述的一种用于ITP诊断的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括医学上可接受的其他试剂。
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