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CN118221830B - T细胞抗原受体及其应用 - Google Patents

T细胞抗原受体及其应用 Download PDF

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CN118221830B CN202410171062.2A CN202410171062A CN118221830B CN 118221830 B CN118221830 B CN 118221830B CN 202410171062 A CN202410171062 A CN 202410171062A CN 118221830 B CN118221830 B CN 118221830B
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Abstract

本发明涉及T细胞抗原受体技术领域，公开了一种T细胞抗原受体及其应用。本发明提供的T细胞抗原受体能够特异性识别并结合HLA‑A*11:01CMVpp65501‑509抗原复合物。经实验验证，本发明提供的T细胞抗原受体能够特异性地被CMV表位肽激活，具有良好的体外杀伤靶细胞的活性，且能够释放IFN‑γ等细胞因子。另外，经过ALA‑SCAN实验和生信全蛋白组比对，排除了本发明提供的T细胞抗原受体的On‑target‑off‑tumor脱靶风险，从而其具有较高的临床应用价值及更好的安全性。

Description

T细胞抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及T细胞抗原受体技术领域，具体涉及一种T细胞抗原受体及其应用。
背景技术
人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)是一种广泛存在的疱疹病毒，其在成人群体中的感染率为50-100％。在免疫系统正常的个体中，CMV的感染通常不显示任何症状。但在免疫系统被抑制的个体中，如艾滋病患者或接受了器官移植的患者，CMV的再度活化可导致严重甚至致死性疾病。CMV的传统疗法包括使用抗病毒药物进行治疗，例如更昔洛韦、膦酸钠和西多福韦等，但是这些药物通常都有一定限制性并且常引起严重的副作用。
细胞受体疗法是一种过继性细胞治疗技术(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT)，其主要通过采集人体自身免疫细胞，经过导入细胞受体并进行体外培养，使其数量扩增并具有靶向性杀伤功能，再回输到患者体内的方式杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞或突变的细胞。T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)是T细胞表面能够特异性识别抗原的表面蛋白，通过将特定TCR序列导入T细胞，可获得特异性识别特定抗原并杀灭含该抗原的细胞的T细胞，从而通过细胞受体疗法对CMV等病毒感染造成的疾病进行治疗。
主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称，人类的MHC被称为人白细胞抗原(HumanLeukocyte antigen,HLA)。HLA呈现高度多态性，并且在不同国家和地区的人群中HLA分型各有不同。我国人群中HLA分型占比最大的是HLA-A3超家族(包含HLA-A11、HLA-A33、HLA-A68、HLA-A31等)，其在中国人群HLA分型中占比约52.7％。
虽然研究人员已经开发出了多种针对CMV的TCR，但是暂未有基于HLA-A3超家族限制性表位的TCR序列相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺乏针对我国人群HLA主要分型限制性表位的TCR及相关高效CMV治疗方法等问题，提供一种T细胞抗原受体及其应用。本发明提供的T细胞抗原受体能够特异性识别并结合HLA-A*11:01CMV抗原复合物，具有良好的杀伤靶细胞活性，可以释放IFN-γ等细胞因子，并且经实验排除了该T细胞抗原受体的On-target/off-tumor脱靶风险。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种T细胞抗原受体，所述T细胞抗原受体特异性识别并结合包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的人巨细胞病毒结合表位。
本发明第二方面提供编码第一方面所述的T细胞抗原受体的核酸分子。
本发明第三方面提供一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包括编码基因和载体序列，其中，所述编码基因由第二方面所述的核酸分子提供。
本发明第四方面提供一种载体细胞，所述载体细胞包含第一方面所述的T细胞抗原受体，和/或，所述载体细胞包含第二方面所述的核酸分子，和/或，所述载体细胞包含第三方面所述的核酸表达载体。
本发明第五方面提供第一方面所述的T细胞抗原受体，和/或，第二方面所述的核酸分子，和/或，第三方面所述的核酸表达载体，和/或，第四方面所述的载体细胞在制备用于预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物和/或疫苗中的应用。
本发明第六方面提供一种用于预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物组合物，所述药物组合物中包含：第一方面所述的T细胞抗原受体，和/或，第二方面所述的核酸分子，和/或，第三方面所述的核酸表达载体，和/或，第四方面所述的载体细胞。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)本发明提供的TCR分子可以识别并结合HLA-A*11:01CMV pp65501-509抗原复合物，更加适合我国人群使用。该TCR分子被特异性CMV表位肽激活后，具有良好的体外杀伤靶细胞的活性，并可释放IFN-γ等细胞因子，从而具有通过细胞受体疗法应用于CMV治疗/预防的潜力。
(2)经过ALA-SCAN实验和生信全蛋白组比对，排除了本发明提供的TCR分子的On-target/off-tumor脱靶风险，明确了该TCR分子具有临床应用价值，并且明确了该TCR分子的使用具有更小的脱靶毒性风险，从而具有更好的安全性。
(3)体外培养扩增含有本发明提供的TCR分子的特异性T细胞的方法简单易操作，直接使用CMV pp65表位肽刺激PBMC进行培养即可，能够实现利用本发明的TCR分子和含有该TCR分子的特异性T细胞的治疗/预防方法的规模化临床应用。
附图说明
图1是实施例1中对未刺激和采用CMV表位肽刺激后的T细胞进行流式检测的CMV+CD8+T细胞占比结果图。
图2是实施例1中ELISpot检测T细胞分泌细胞因子IFN-γ的结果图。
图3是实施例2中体外转录质粒载体的构建示意图。
图4是实施例2获得的TCR mRNA凝胶电泳验证结果图。
图5是实施例3中采用的HLA慢病毒表达质粒图谱。
图6是实施例3中流式检测实验用单克隆细胞的HLA表达量分析图。
图7是实施例3中流式检测电转ZZ1及ZZ2 NFAT-Luc Jurkat的流式分析图。
图8A和图8B是实施例3中酶标仪检测ZZ1-NFAT-Luc Jurkat和ZZ2-NFAT-LucJurkat的NFAT-荧光值统计结果图。
图9是实施例4中流式检测ZZ1 TCR-T及ZZ2 TCR-T特异性比例的流式分析图。
图10是实施例4中EuTDA检测ZZ1 TCR-T及ZZ2 TCR-T对靶细胞的杀伤效率结果图。
图11A和11B是实施例5中ELISA检测ZZ1 TCR-T及ZZ2 TCR-T的细胞因子IFN-γ分泌情况结果图。
图12是实施例6中构建的丙氨酸扫描肽库中表位肽丙氨酸突变位置示意图。
图13是实施例6中ELISPOT检测ZZ1 TCR-T分泌IFN-γ斑点统计图。
图14是实施例6中ELISPOT检测ZZ2 TCR-T分泌IFN-γ斑点统计图。
图15是对比例1中流式检测ZZ3 TCR-T CD8+CMV+阳性占比结果图。
图16是对比例1中酶标仪检测ZZ3-NFAT-Luc Jurkat的NFAT-荧光值统计结果图。
具体实施方式
本发明所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应理解为包含接近这些范围或值的值。对数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明所用术语“T细胞抗原受体(TCR)”是指T细胞识别靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子。TCR的α链和β链的可变区(V区)包含互补决定区(complement-determiningregions，CDRs)和抗体骨架区(Framework region，FR)。CDRs的氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性，FR的主要作用是稳定CDRs的空间构型，以利于CDRs与抗原决定簇间的结合。
本发明中，“TCR”是“T细胞抗原受体”的缩写形式，二者意义相同；“TCR-T细胞”是“含有TCR(分子)的T细胞”的简写形式，二者意义相同；“HLA”是“人白细胞抗原”的缩写形式，二者意义相同；“CMV”是“人巨细胞病毒”的缩写形式，二者意义相同；“MHC”是“主要组织相容性复合体”的缩写形式，二者意义相同；“fP2A”是“furin SGSG p2A”的缩写形式，二者意义相同，以上各组意义相同的术语可以互换使用。
随着ACT技术的发展，本领域研究人员开发出多种不同的免疫细胞疗法用于癌症和难以通过现有药物进行有效治疗的病毒性感染疾病的治疗和/或预防。例如CAR-T疗法、TCR-T细胞疗法等。其中，相比于CAR-T疗法而言，TCR-T细胞疗法的优势在于TCR-T细胞不仅能识别细胞膜抗原，还能识别肽-主要组织相容性复合体呈递的细胞内抗原，不受靶细胞表面抗原表达的限制，从而能更广泛地识别靶抗原，诱导更持久的免疫突触形成过程，TCR还可被单个的靶抗原分子激活，对低拷贝数抗原比CAR-T更敏感。然而，TCR只能识别肽-HLA并杀灭具有匹配HLA等位基因的靶细胞，而且HLA分型具有高度多态性，且呈现出较为明显的地区分布特点。因此TCR疗法中进行TCR分子设计和筛选时，对其可以识别并结合的HLA分型表位的选择对于该TCR分子对于特定地区患者的治疗效果具有很大影响。
发明人在研究中还发现，目前TCR-T疗法的研究更多的集中于癌症，尤其是实体瘤治疗方面，对于病毒感染性疾病的TCR-T疗法研究较少。虽然有少数研究人员开发出了一些针对CMV的TCR分子及相应的TCR-T疗法，例如CN113121676A公开的针对CMV pp65表位的TCR分子和CN111875698A公开的靶向HCMV的TCR分子等，但是这些目前开发出的靶向CMV的TCR分子均为特异性识别和结合HLA-A*02表位，该表位属于欧美人群高频HLA亚型，在我国人群中的占比较低，从而不适合我国人群的CMV治疗/预防使用。经过大量研究，本发明的发明人发现，通过筛选获得特定的能够特异性识别HLA-A*11:01亚型表位(该HLA亚型是我国人群的高频亚型)的靶向CMV的TCR分子，能够进一步获得更加适合我国CMV预防和/或治疗使用的产品及方法。此外，发明人经过进一步研究还发现，通过特殊的设计，可以使得上述TCR分子体外导入T细胞后，仅通过较为简单的方法即可实现特异性T细胞的扩增，大幅简化了TCR-T疗法中细胞扩增步骤的操作，更利于该方法的规模应用和推广。
基于上述发现，本发明第一方面提供一种T细胞抗原受体，所述T细胞抗原受体特异性识别并结合包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的人巨细胞病毒结合表位。
ATVQGQNLK(SEQ ID NO:1)
SEQ ID NO:1是HLA-A*11:01CMV pp65501-509抗原复合物的氨基酸序列(即HLA-A*11:01限制性CMV pp65表位抗原复合物的501-509位氨基酸序列)。也即，本发明提供的TCR可以特异性识别并结合该CMV抗原肽-MHC分子复合物，激活TCR-T细胞，进而产生高水平细胞因子并杀灭靶细胞。通常，本发明提供的TCR通过MHC的呈递与来自CMV的抗原肽特异性结合。
优选地，所述TCR是可溶性TCR。
本发明对于提供的TCR的具体结构和序列没有特别限制，任意能够与包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列特异性结合的TCR均属于本发明保护范围。根据本发明的优选实施方式，其中，所述TCR包括至少一个α链可变区和/或至少一个β链可变区。
优选地，所述TCR为包括至少一个α链可变区和至少一个β链可变区的异二聚体。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述α链可变区包括α链的互补决定区，所述β链可变区包括β链的互补决定区。
互补决定区是指TCR序列中能够与HLA-抗原复合物形成精密互补，从而使得TCR分子可以特异性识别该HLA-抗原复合物的序列区段。本发明提供的TCR序列中，α链/β链中的互补决定区可以是一段连续的氨基酸序列，也可是多段不连续的氨基酸序列，只要其能够使得本发明的TCR序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列特异性识别和结合即可。
本发明的发明人在研究中巧妙地发现，当TCR分子中的α链/β链中的互补决定区具有特定的氨基酸序列时，其特异性识别和结合目标序列(如SEQ ID NO:1等)的能力更强。
为了使得TCR具有更好的与靶序列特异性识别和结合的性能，根据本发明的一些优选实施方式，其中，α链的互补决定区包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一种具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)。
VSGNPY(SEQ ID NO:2)
YITGDNLV(SEQ ID NO:3)
CAVRDMEGGNNARLMF(SEQ ID NO:4)
DRGSQS(SEQ ID NO:10)
IYSNGD(SEQ ID NO:11)
CAVKGGYNKLIF(SEQ ID NO:12)
优选地，α链的互补决定区包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一种所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，β链的互补决定区包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中的至少一种具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)。
SNHLY(SEQ ID NO:5)
FYNNEI(SEQ ID NO:6)
CASSEAYGGYNEQFF(SEQ ID NO:7)
SGHRS(SEQ ID NO:13)
YFSETQ(SEQ ID NO:14)
CASSLGGEGDRPQHF(SEQ ID NO:15)
优选地，β链的互补决定区包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中的至少一种所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，α链的互补决定区包括三段不连续的氨基酸序列，依次分别命名为CDR1α、CDR2α、CDR3α，其中，CDR1α包括与SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)；CDR2α包括与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)；CDR3α包括与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)。
优选地，CDR1α包括SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；CDR2α包括SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；CDR3α包括SEQ ID NO:4和/或SEQID NO:12所示的氨基酸序列。
更优选地，CDR1α的氨基酸序列如SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:10所示；CDR2α的氨基酸序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:11所示；CDR3α的氨基酸序列如SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:12所示。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，β链的互补决定区包括三段不连续的氨基酸序列，依次分别命名为CDR1β、CDR2β、CDR3β，其中，CDR1β包括与SEQ ID NO:5和/或SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)；CDR2β包括与SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)；CDR3β包括与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可以为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)。
优选地，CDR1β包括SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；CDR2β包括SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；CDR3β包括SEQ ID NO:7和/或SEQID NO:15所示的氨基酸序列。
更优选地，CDR1β的氨基酸序列如SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:13所示；CDR2β的氨基酸序列如SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:14所示；CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:15所示。
本发明提供的TCR所包含的α链可变区/β链可变区优选分别包括三个不连续的氨基酸序列构成的互补决定区，即α链可变区的互补决定区包括以上CDR1α、CDR2α和CDR3α，β链可变区的互补决定区包括以上CDR1β、CDR2β和CDR3β，其中CDR1α、CDR2α、CDR3α以及CDR1β、CDR2β、CDR3β可按照如上序列进行任意组合，只要TCR可以特异性识别并结合HLA-A*11:01CMV pp65501-509抗原复合物即可。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，α链可变区的互补决定区包括SEQ ID NO:2-4所示的氨基酸序列；β链可变区的互补决定区包括SEQ ID NO:5-7所示的氨基酸序列。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，α链可变区的互补决定区包括SEQ ID NO:10-12所示的氨基酸序列；β链可变区的互补决定区包括SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列。
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，α链可变区包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDMEGGNNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRAKRSGSG(SEQ ID NO:8)
MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRAKRSGSG(SEQ ID NO:16)
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，β链可变区包括SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCASSEAYGGYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPKVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(SEQ ID NO:9)
MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSLGGEGDRPQHFGDGTRLSILEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS(SEQ ID NO:17)
优选地，所述TCR中，α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地，所述TCR中，α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
本发明提供的TCR中，α链可变区和β链可变区可以通过任意本领域中TCR分子的α链可变区和β链可变区常见的连接方式进行连接从而形成完整的异二聚体TCR分子。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述TCR中，α链可变区与β链可变区直接连接或间接连接。直接连接是指α链可变区与β链可变区的氨基酸序列直接相连(例如通过二硫键等相连)的连接方式；间接连结是指在α链可变区与β链可变区之间通过其他氨基酸序列(通常可以称为“连接序列”)连接，例如α链可变区与β链可变区分别与连接序列中的不同片段通过二硫键等方式连接，或者α链可变区与β链可变区均与连接序列中的同一片段通过二硫键等方式连接等。
优选地，所述TCR中，α链可变区与β链可变区间接连结。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，α链可变区可以通过fp2A序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示)与β链可变区连接。
SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:55)
本发明对于提供的TCR分子中α链与β链恒定区序列没有特别限制，只要其能够与具有上述特征的α链可变区与β链可变区结合，形成稳定且具有本发明所需功能的TCR分子即可。
为了提高外源TCR表达效率，根据本发明的优选实施方式，其中，所述TCR包括α链恒定区与β链恒定区，所述α链恒定区包括与SEQ ID NO:26具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)；所述β链恒定区包括与SEQ ID NO:27具有至少80％同源性的氨基酸序列(例如同源性可为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、100％，或者也可以为上述任意两个值形成的范围及任意中间值)。
IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ IDNO:26)
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS(SEQ ID NO:27)
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述TCR包括α链恒定区、α链可变区与β链恒定区、β链可变区，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，α链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，β链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。
优选地，所述TCR的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述TCR包括α链恒定区、α链可变区与β链恒定区、β链可变区，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，α链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，β链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。
优选地，所述TCR的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示。
本发明第二方面提供编码第一方面所述的T细胞抗原受体的核酸分子。
任意能够编码本发明提供的TCR的核酸分子(包括DNA和RNA)均属于本发明的保护范围。基于密码子的简并性，本领域技术人员能够根据前述TCR序列的特征自行设计并合成能够编码本发明提供的TCR的不同核酸分子。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:28(编码SEQ IDNO:2所示的CDR1α)、SEQ ID NO:29(编码SEQ ID NO:3所示的CDR2α)、SEQ ID NO:30(编码SEQ ID NO:4所示的CDR3α)、SEQ ID NO:36(编码SEQ ID NO:10所示的CDR1α)、SEQ ID NO:37(编码SEQ ID NO:11所示的CDR2α)、SEQ ID NO:38(编码SEQ ID NO:12所示的CDR3α)中至少一种所示的核苷酸序列。
GTCTCCGGAAACCCCTAT(SEQ ID NO:28)
TACATCACTGGTGATAACCTGGTG(SEQ ID NO:29)
TGTGCGGTGCGTGACATGGAAGGGGGTAATAACGCTCGGCTGATGTTT(SEQ ID NO:30)
GACCGTGGCAGTCAGAGC(SEQ ID NO:36)
ATCTACAGCAATGGCGAT(SEQ ID NO:37)
TGCGCCGTTAAAGGGGGCTACAACAAGCTGATCTTC(SEQ ID NO:38)
根据本发明的优选实施方式，其中，所述核酸分子还包括SEQ ID NO:31(编码SEQID NO:5所示的CDR1β)、SEQ ID NO:32(编码SEQ ID NO:6所示的CDR2β)、SEQ ID NO:33(编码SEQ ID NO:7所示的CDR3β)、SEQ ID NO:39(编码SEQ ID NO:13所示的CDR1β)、SEQ IDNO:40(编码SEQ ID NO:14所示的CDR2β)、SEQ ID NO:41(编码SEQ ID NO:15所示的CDR3β)中至少一种所示的核苷酸序列。
AGCAACCACCTCTAC(SEQ ID NO:31)
TTTTACAACAACGAGATC(SEQ ID NO:32)
TGCGCCTCTTCCGAAGCCTACGGTGGCTACAACGAGCAGTTTTTC(SEQ ID NO:33)
TCTGGCCACCGCTCT(SEQ ID NO:39)
TACTTCTCCGAGACCCAG(SEQ ID NO:40)
TGCGCCTCCTCCTTGGGCGGGGAGGGCGACAGGCCTCAGCACTTT(SEQ ID NO:41)
根据本发明的优选实施方式，其中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:34(编码SEQ IDNO:8的α链可变区)、SEQ ID NO:35(编码SEQ ID NO:9的β链可变区)、SEQ ID NO:42(编码SEQ ID NO:16的α链可变区)和SEQ ID NO:43(编码SEQ ID NO:17的β链可变区)中的至少一种所示的核苷酸序列。
ATGGCGTCTGCTCCTATCAGCATGCTAGCTATGTTGTTCACCTTGAGCGGATTGAGGGCTCAGTCCGTAGCGCAGCCGGAGGATCAGGTCAATGTGGCGGAGGGCAATCCCCTGACCGTTAAGTGCACTTACAGCGTCTCCGGAAACCCCTATCTGTTTTGGTACGTGCAGTACCCCAACAGGGGTCTGCAGTTCCTGTTAAAGTACATCACTGGTGATAACCTGGTGAAAGGCAGTTACGGCTTCGAGGCCGAGTTCAACAAGTCCCAGACCTCCTTTCACCTGAAGAAGCCCTCGGCTCTGGTCTCCGACTCTGCGCTGTACTTCTGTGCGGTGCGTGACATGGAAGGGGGTAATAACGCTCGGCTGATGTTTGGCGACGGGACCCAGCTGGTAGTCAAGCCCAACATCCAGAATCCAGATCCAGCCGTGTACCAGCTGCGCGACTCCAAAAGCAGCGACAAATCGGTTTGTCTATTCACCGACTTCGACTCCCAAACTAATGTCAGTCAGTCCAAGGACTCTGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGTCCATGGATTTCAAGTCCAACTCCGCCGTAGCATGGTCTAACAAGAGCGACTTTGCCTGCGCCAACGCGTTCAACAACTCTATCATCCCCGAGGACACGTTCTTTCCCTCTCCGGAGTCCTCCTGCGACGTGAAGCTCGTGGAGAAATCTTTTGAGACCGACACAAATTTGAACTTCCAGAACCTGTCAGTCATCGGCTTCCGCATCCTTCTGTTGAAGGTCGCGGGATTCAACCTCCTGATGACCCTCCGCCTTTGGTCTTCCCGGGCCAAGCGCAGCGGTTCGGGC(SEQ ID NO:34)
ATGGATACCTGGCTGGTGTGCTGGGCTATTTTCTCCCTGCTCAAGGCCGGTCTCACCGAACCGGAGGTGACCCAGACTCCCTCTCACCAGGTCACCCAGATGGGCCAGGAGGTGATTTTGCGCTGCGTGCCCATCAGCAACCACCTCTACTTCTATTGGTACCGCCAAATCCTAGGCCAGAAAGTGGAGTTCCTGGTGTCCTTTTACAACAACGAGATCAGCGAGAAAAGCGAGATTTTCGATGACCAGTTCAGCGTGGAGCGCCCTGACGGCTCCAACTTTACGCTCAAGATCCGATCCACCAAGCTGGAGGACTCGGCAATGTATTTCTGCGCCTCTTCCGAAGCCTACGGTGGCTACAACGAGCAGTTTTTCGGCCCGGGGACCCGCCTGACTGTGCTGGAGGACCTTAAGAACGTGTTCCCACCGAAGGTGGCGGTTTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATAAGCCACACTCAGAAGGCGACTCTCGTCTGTCTGGCGACAGGCTTCTACCCTGATCATGTGGAGCTGAGTTGGTGGGTCAACGGTAAGGAGGTGCATTCGGGCGTGTCTACCGATCCTCAGCCACTTAAAGAACAGCCTGCCCTGAACGACTCTCGTTATTGTCTGTCATCCCGCCTGCGCGTCTCTGCCACGTTCTGGCAGAACCCGCGCAACCACTTCCGTTGCCAGGTGCAATTCTACGGATTATCCGAGAATGACGAGTGGACCCAGGACCGCGCCAAGCCTGTGACCCAGATCGTCTCTGCTGAAGCATGGGGCCGAGCAGACTGCGGGTTCACGTCTGAGAGCTATCAGCAGGGAGTGCTGTCCGCTACCATCTTGTACGAGATTCTGCTGGGCAAGGCTACACTGTACGCAGTGCTGGTTTCCGCCCTTGTACTGATGGCCATGGTGAAGCGCAAGGACAGTAGAGGC(SEQ ID NO:35)
ATGAAATCTCTTCGCGTGCTGCTGGTGATTTTGTGGCTCCAGCTGTCTTGGGTCTGGTCTCAGCAGAAGGAGGTGGAACAGAACTCCGGACCTTTGTCGGTGCCGGAGGGCGCCATTGCTTCCCTCAACTGCACTTATTCTGACCGTGGCAGTCAGAGCTTCTTTTGGTACCGCCAGTACAGTGGCAAGTCGCCGGAGCTGATCATGTTTATCTACAGCAATGGCGATAAGGAGGATGGGCGCTTCACGGCGCAGCTTAACAAAGCTTCCCAGTACGTGAGCCTTCTCATTCGCGACAGCCAGCCGAGTGACTCCGCAACCTACCTGTGCGCCGTTAAAGGGGGCTACAACAAGCTGATCTTCGGTGCCGGCACCCGCCTGGCCGTGCACCCGTATATCCAGAACCCCGAGCCAGCGGTGTACCAGTTGAAGGACCCGCGCTCGCAGGACTCCACCCTGTGCCTGTTCACCGATTTCGACTCCCAAATTAACGTGCCAAAGACTATGGAGAGCGGTACGTTTATCACCGACAAAACCGTGCTGGACATGAAGGCCATGGATTCCAAGAGCAACGGCGCTATCGCTTGGTCCAACCAGACCTCCTTCACCTGCCAGGACATCTTCAAGGAGACCAATGCCACCTATCCTAGTTCCGACGTGCCCTGTGACGCAACACTAACCGAGAAGTCATTCGAGACCGACATGAACCTCAACTTCCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTCAAGGTTGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTCCGGCTTTGGTCTTCGCGTGCCAAGCGCAGCGGTTCCGGC(SEQ ID NO:42)
ATGGGGTCCCGCCTGCTGTGCTGGGTACTCCTGTGCCTGCTGGGAGCTGGACCAGTGAAGGCTGGAGTTACTCAGACTCCCCGTTACCTCATAAAAACGCGTGGTCAGCAGGTCACTCTGTCATGCAGCCCCATCTCTGGCCACCGCTCTGTATCGTGGTACCAGCAGACACCTGGGCAGGGTCTGCAGTTCCTGTTTGAGTACTTCTCCGAGACCCAGCGCAACAAGGGCAACTTCCCGGGTAGATTCTCTGGGCGACAGTTCAGCAATAGCCGGTCTGAGATGAACGTGTCCACCCTCGAGCTTGGTGATTCCGCTCTGTACCTGTGCGCCTCCTCCTTGGGCGGGGAGGGCGACAGGCCTCAGCACTTTGGTGACGGCACTCGACTTAGTATCCTGGAGGACCTGCGCAATGTGACCCCACCCAAGGTGTCGCTGTTCGAGCCCTCCAAGGCAGAGATCGCCAACAAGCAGAAGGCGACTCTGGTCTGTCTGGCGCGTGGCTTTTTCCCCGACCATGTCGAGCTGAGCTGGTGGGTCAACGGTAAAGAGGTCCACTCAGGCGTCTCGACCGACCCCCAGGCCTACAAGGAGAGCAACTATTCCTACTGCTTGTCTTCCAGATTACGGGTGAGCGCAACTTTTTGGCACAACCCCCGCAACCACTTTAGGTGTCAGGTGCAGTTCCATGGACTTTCTGAAGAAGATAAATGGCCTGAAGGGAGCCCTAAGCCCGTCACCCAGAACATCAGCGCCGAGGCCTGGGGCCGCGCGGACTGTGGCATCACCTCCGCTAGCTACCACCAAGGCGTGCTGTCTGCGACCATCCTGTACGAGATTCTGCTAGGCAAAGCTACACTGTACGCCGTGTTGGTGAGCGGCCTGGTCCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC(SEQ ID NO:43)优选地，所述核酸分子还包括SEQ ID NO:56(编码SEQ IDNO:26所示的α链恒定区)、SEQ ID NO:57(编码SEQ ID NO:27所示的β链恒定区)中的至少一种所示的核苷酸序列。
ATCCAGAACCCCGAGCCCGCCGTGTACCAGCTGAAGGACCCCAGGAGCCAGGACAGCACCCTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGAGCGGCACCTTCATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGAAGGCCATGGACAGCAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAACCAGACCAGCTTCACCTGCCAGGACATCTTCAAGGAGACCAACGCCACCTACCCCAGCAGCGACGTGCCCTGCGACGCCACCCTGACCGAGAAGAGCTTCGAGACCGACATGAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATGGGCCTGAGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCAGC(SEQ ID NO:56)
GAGGACCTGAGGAACGTGACCCCCCCCAAGGTGAGCCTGTTCGAGCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAACAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCCAGGGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGAGCACCGACCCCCAGGCCTACAAGGAGAGCAACTACAGCTACTGCCTGAGCAGCAGGCTGAGGGTGAGCGCCACCTTCTGGCACAACCCCAGGAACCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTCCACGGCCTGAGCGAGGAGGACAAGTGGCCCGAGGGCAGCCCCAAGCCCGTGACCCAGAACATCAGCGCCGAGGCCTGGGGCAGGGCCGACTGCGGCATCACCAGCGCCAGCTACCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACAGC(SEQID NO:57)
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:58所示。
ATGGCGTCTGCTCCTATCAGCATGCTAGCTATGTTGTTCACCTTGAGCGGATTGAGGGCTCAGTCCGTAGCGCAGCCGGAGGATCAGGTCAATGTGGCGGAGGGCAATCCCCTGACCGTTAAGTGCACTTACAGCGTCTCCGGAAACCCCTATCTGTTTTGGTACGTGCAGTACCCCAACAGGGGTCTGCAGTTCCTGTTAAAGTACATCACTGGTGATAACCTGGTGAAAGGCAGTTACGGCTTCGAGGCCGAGTTCAACAAGTCCCAGACCTCCTTTCACCTGAAGAAGCCCTCGGCTCTGGTCTCCGACTCTGCGCTGTACTTCTGTGCGGTGCGTGACATGGAAGGGGGTAATAACGCTCGGCTGATGTTTGGCGACGGGACCCAGCTGGTAGTCAAGCCCAACATCCAGAATCCAGATCCAGCCGTGTACCAGCTGCGCGACTCCAAAAGCAGCGACAAATCGGTTTGTCTATTCACCGACTTCGACTCCCAAACTAATGTCAGTCAGTCCAAGGACTCTGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGTCCATGGATTTCAAGTCCAACTCCGCCGTAGCATGGTCTAACAAGAGCGACTTTGCCTGCGCCAACGCGTTCAACAACTCTATCATCCCCGAGGACACGTTCTTTCCCTCTCCGGAGTCCTCCTGCGACGTGAAGCTCGTGGAGAAATCTTTTGAGACCGACACAAATTTGAACTTCCAGAACCTGTCAGTCATCGGCTTCCGCATCCTTCTGTTGAAGGTCGCGGGATTCAACCTCCTGATGACCCTCCGCCTTTGGTCTTCCCGGGCCAAGCGCAGCGGTTCGGGCGCTACCAACTTTTCGTTGCTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAACCCGGGCCCTATGGATACCTGGCTGGTGTGCTGGGCTATTTTCTCCCTGCTCAAGGCCGGTCTCACCGAACCGGAGGTGACCCAGACTCCCTCTCACCAGGTCACCCAGATGGGCCAGGAGGTGATTTTGCGCTGCGTGCCCATCAGCAACCACCTCTACTTCTATTGGTACCGCCAAATCCTAGGCCAGAAAGTGGAGTTCCTGGTGTCCTTTTACAACAACGAGATCAGCGAGAAAAGCGAGATTTTCGATGACCAGTTCAGCGTGGAGCGCCCTGACGGCTCCAACTTTACGCTCAAGATCCGATCCACCAAGCTGGAGGACTCGGCAATGTATTTCTGCGCCTCTTCCGAAGCCTACGGTGGCTACAACGAGCAGTTTTTCGGCCCGGGGACCCGCCTGACTGTGCTGGAGGACCTTAAGAACGTGTTCCCACCGAAGGTGGCGGTTTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATAAGCCACACTCAGAAGGCGACTCTCGTCTGTCTGGCGACAGGCTTCTACCCTGATCATGTGGAGCTGAGTTGGTGGGTCAACGGTAAGGAGGTGCATTCGGGCGTGTCTACCGATCCTCAGCCACTTAAAGAACAGCCTGCCCTGAACGACTCTCGTTATTGTCTGTCATCCCGCCTGCGCGTCTCTGCCACGTTCTGGCAGAACCCGCGCAACCACTTCCGTTGCCAGGTGCAATTCTACGGATTATCCGAGAATGACGAGTGGACCCAGGACCGCGCCAAGCCTGTGACCCAGATCGTCTCTGCTGAAGCATGGGGCCGAGCAGACTGCGGGTTCACGTCTGAGAGCTATCAGCAGGGAGTGCTGTCCGCTACCATCTTGTACGAGATTCTGCTGGGCAAGGCTACACTGTACGCAGTGCTGGTTTCCGCCCTTGTACTGATGGCCATGGTGAAGCGCAAGGACAGTAGAGGC(SEQ ID NO:58)
根据本发明的另一种特别优选的实施方式，其中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示。
ATGAAATCTCTTCGCGTGCTGCTGGTGATTTTGTGGCTCCAGCTGTCTTGGGTCTGGTCTCAGCAGAAGGAGGTGGAACAGAACTCCGGACCTTTGTCGGTGCCGGAGGGCGCCATTGCTTCCCTCAACTGCACTTATTCTGACCGTGGCAGTCAGAGCTTCTTTTGGTACCGCCAGTACAGTGGCAAGTCGCCGGAGCTGATCATGTTTATCTACAGCAATGGCGATAAGGAGGATGGGCGCTTCACGGCGCAGCTTAACAAAGCTTCCCAGTACGTGAGCCTTCTCATTCGCGACAGCCAGCCGAGTGACTCCGCAACCTACCTGTGCGCCGTTAAAGGGGGCTACAACAAGCTGATCTTCGGTGCCGGCACCCGCCTGGCCGTGCACCCGTATATCCAGAACCCCGAGCCAGCGGTGTACCAGTTGAAGGACCCGCGCTCGCAGGACTCCACCCTGTGCCTGTTCACCGATTTCGACTCCCAAATTAACGTGCCAAAGACTATGGAGAGCGGTACGTTTATCACCGACAAAACCGTGCTGGACATGAAGGCCATGGATTCCAAGAGCAACGGCGCTATCGCTTGGTCCAACCAGACCTCCTTCACCTGCCAGGACATCTTCAAGGAGACCAATGCCACCTATCCTAGTTCCGACGTGCCCTGTGACGCAACACTAACCGAGAAGTCATTCGAGACCGACATGAACCTCAACTTCCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTCAAGGTTGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTCCGGCTTTGGTCTTCGCGTGCCAAGCGCAGCGGTTCCGGCGCGACGAATTTCTCCTTACTAAAGCAAGCGGGAGACGTGGAGGAGAACCCGGGGCCCATGGGGTCCCGCCTGCTGTGCTGGGTACTCCTGTGCCTGCTGGGAGCTGGACCAGTGAAGGCTGGAGTTACTCAGACTCCCCGTTACCTCATAAAAACGCGTGGTCAGCAGGTCACTCTGTCATGCAGCCCCATCTCTGGCCACCGCTCTGTATCGTGGTACCAGCAGACACCTGGGCAGGGTCTGCAGTTCCTGTTTGAGTACTTCTCCGAGACCCAGCGCAACAAGGGCAACTTCCCGGGTAGATTCTCTGGGCGACAGTTCAGCAATAGCCGGTCTGAGATGAACGTGTCCACCCTCGAGCTTGGTGATTCCGCTCTGTACCTGTGCGCCTCCTCCTTGGGCGGGGAGGGCGACAGGCCTCAGCACTTTGGTGACGGCACTCGACTTAGTATCCTGGAGGACCTGCGCAATGTGACCCCACCCAAGGTGTCGCTGTTCGAGCCCTCCAAGGCAGAGATCGCCAACAAGCAGAAGGCGACTCTGGTCTGTCTGGCGCGTGGCTTTTTCCCCGACCATGTCGAGCTGAGCTGGTGGGTCAACGGTAAAGAGGTCCACTCAGGCGTCTCGACCGACCCCCAGGCCTACAAGGAGAGCAACTATTCCTACTGCTTGTCTTCCAGATTACGGGTGAGCGCAACTTTTTGGCACAACCCCCGCAACCACTTTAGGTGTCAGGTGCAGTTCCATGGACTTTCTGAAGAAGATAAATGGCCTGAAGGGAGCCCTAAGCCCGTCACCCAGAACATCAGCGCCGAGGCCTGGGGCCGCGCGGACTGTGGCATCACCTCCGCTAGCTACCACCAAGGCGTGCTGTCTGCGACCATCCTGTACGAGATTCTGCTAGGCAAAGCTACACTGTACGCCGTGTTGGTGAGCGGCCTGGTCCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC(SEQ ID NO:59)
本发明第三方面提供一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包括编码基因和载体序列，其中，所述编码基因由第二方面所述的核酸分子提供。
本发明提供的核酸表达载体用于体外表达本发明提供的TCR。也即，通过将该核酸表达载体导入体外细胞，可以实现本发明提供的TCR的表达。
本发明提供的核酸表达载体中，编码基因即用于编码表达本发明提供的TCR分子的核酸序列，其特征如前所述，在此不再赘述。载体序列通常由核酸表达载体的出发载体(通常为质粒载体)提供，其作用在于负载编码基因并将其引入细胞内促使TCR分子在细胞内进行表达。任意本领域中常用于构建体外表达体系的载体均可适用于本发明。
本发明进一步提供所述核酸表达载体的构建方法。任意本领域中常见的体外表达载体的构建方法均可适用于本发明提供的核酸表达载体的构建，只要其能够将上述编码基因引入载体序列中，并使其可以在体外细胞中进行表达即可，具体不再赘述。
本发明第四方面提供一种载体细胞，所述载体细胞包含第一方面所述的T细胞抗原受体，和/或，所述载体细胞包含第二方面所述的核酸分子，和/或，所述载体细胞包含第三方面所述的核酸表达载体。
本发明提供的载体细胞可以用于体外表达本发明提供的TCR分子，也可以用于相应的CMV预防/治疗方法中，或用于制备相关药物。任意能够上述目的的本领域中的常见细胞均可适用于本发明。例如，可以选用T细胞(尤其是来源于患者自身的T细胞)作为载体细胞，并向其中导入上述TCR、核酸分子或核酸表达载体，以用于制备用于CMV治疗/预防的细胞药物组合物等产品。
又例如，还可以选用原核表达载体等本领域中常用于蛋白体外表达的细胞作为载体细胞，向其中导入上述核酸分子或核酸表达载体，以生产用于导入T细胞的TCR分子。
本发明进一步提供所述载体细胞的制备方法。任意本领域中常用的将蛋白(如本发明的TCR)、核酸分子或核酸表达载体引入细胞中的方法均可适用于本发明，例如电转化法、慢病毒转染法等。
本发明第五方面提供第一方面所述的T细胞抗原受体，和/或，第二方面所述的核酸分子，和/或，第三方面所述的核酸表达载体，和/或，第四方面所述的载体细胞在制备用于预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物和/或疫苗中的应用。
本发明对于所述药物的具体成药形式及成分没有特别限定，只要其含有本发明提供的T细胞抗原受体、核酸分子、核酸表达载体、载体细胞中的至少一种即可。
根据本发明的一种示例性的优选实施方式，其中，所述药物/疫苗可以包含融合蛋白作为(主要)活性组分，该融合蛋白含有前述TCR。
优选地，所述融合蛋白还可以含有抗体。
更优选地，所述抗体包括单链抗体(Single chain fragment variable，scFv)、单克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体。优选为单链抗体。
更优选地，所述抗体为人源化抗体。
优选地，所述融合蛋白还可以含有CD3激动剂。
优选地，所述融合蛋白还可以含有特异性靶向CD3的抗体。
本发明第六方面提供一种用于预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物组合物，所述药物组合物中包含：第一方面所述的T细胞抗原受体，和/或，第二方面所述的核酸分子，和/或，第三方面所述的核酸表达载体，和/或，第四方面所述的载体细胞。
本发明提供的药物组合物中，所述TCR、核酸分子、核酸表达载体以及载体细胞均可作为药物组合物的(主要)活性组分(之一)。根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述药物组合物中还可以包括药学上可接受的辅料(例如缓冲剂、防腐剂、稳定剂等)。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述药物组合物中还可以包括其他活性组分，例如与本发明提供的TCR、核酸分子、核酸表达载体以及载体细胞共同使用时对于其作用效果没有或基本没有不利影响，且对于人体不会产生或基本不会产生(严重)副作用的药物等(例如可用于预防/治疗CMV感染的抗病毒药物、抗体、疫苗制剂等)。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，涉及人体样品采集及检测的实验已经过相关人员知情同意。未做特殊说明的情况下，采用的试剂/材料均为购自正规化学/生物试剂或材料供应商的商购产品，试剂的纯度均为分析纯。
以下实施例中，未做特殊说明的情况下，操作温度均为室温(25±5℃)。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的TCR-T细胞的制备、扩增以及其杀伤效果验证情况。
TCR-T细胞的制备和扩增
1、实验材料
2、实验方法
利用化学合成的CMV表位肽刺激来源于HLA-A*11:01健康供者以及不同癌种患者外周血单个核细胞(PBMC)。经2轮CMV表位肽刺激后，采用流式分析法和酶联免疫斑点实验(Enzyme linked immunospot assay,ELISpot)对特异性T细胞进行检测，以确认获得CMV特异性T细胞。具体方法如下：
采集HLA-A*11:01供者外周血，使用密度梯度离心的方式分离外周血中的PBMC。将分离得到的PBMC按一定细胞密度接种于孔板中，使用含人血清、GM-CSF(厦门特宝生物工程股份有限公司)及IL-2(北京双鹭药业股份有限公司)等细胞因子的X-VIVO15(LONZA)进行培养。
使用X-VIVO15溶解HLA-A*11:01CMV表位肽(金斯瑞；具体序列如SEQ ID NO:1所示)配制成浓度为100μg/mL的CMV表位肽溶液，过滤除菌，备用。细胞培养至第2天及第4天时，各加入一次无菌CMV表位肽溶液进行刺激，终浓度为5μg/mL。
细胞培养总周期为约14天，培养过程中每2-3天观察一次细胞，使用培养基进行半量换液，并使用细胞计数仪记录活细胞密度、细胞悬液体积和细胞活率。在第14天，用鼠抗人CD8抗体(Biolegend)及HLA-A*11:01CMV表位四聚体(MBL)染色对T细胞进行流式检测。实验结果见图1。通过与对照T细胞组(未进行CMV表位肽刺激)对比可以看出，采用CMV多肽刺激后确认有CMV特异性T细胞。使用流式分选仪分选出CD8阳性且四聚体阳性的目标T细胞群。
以IFN-γ作为待测细胞因子进行ELISpot检测。取一定量细胞并使用X-VIVO15培养基进行洗涤。用含10％FBS的X-VIVO15重悬细胞后，按每孔2×104的细胞数，将细胞接种于Elispot-IFN-γ检测板中(Mabtech)。使用10μg/mL的CMV表位肽(MBL)刺激18-24小时后进行抗体孵育及显色。将孔板放置在室温阴凉避光处，待其自然晾干后使用C.T.L S6对免疫斑点进行成像和读取，结果详见图2。
通过图1和图2可看出，本发明提供的特异性T细胞扩增方法可以获得HLA-A*11:01CMV特异性T细胞，而且与未经过CMV表位肽刺激的对照T细胞组(图2中A-C孔)相比，经刺激的CMV pp65组(图2中D-F孔)检测到显著更多的斑点，说明经过体外刺激扩增的CD8+T细胞能够特异性识别CMV pp65表位肽并分泌IFN-γ等细胞因子。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的TCR的体外转录质粒载体构建和mRNA制备。
1、实验材料
名称 厂家 货号
无核酶水(非DEPC处理) Invitrogen AM9932
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(100) Qiagen 210212
单细胞序列特异性扩增试剂盒 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 P621-01
HotStarTaq Master Mix Kit(250) Qiagen 203443
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q33230
DL500DNA Marker TaKaRa 3590A
6×Loading Buffer TaKaRa 9156
2、实验方法
参照图3的质粒谱图，以pUC57质粒(金斯瑞)作为载体质粒，在其中插入TCR的编码基因(简称为TCRα/β编码基因)，构建出TCR的核酸表达载体。其中，TCR的编码基因包括α链和β链的编码基因，α链的编码基因(图中的TRA ORF部分)包括α链可变区编码基因和α链恒定区编码基因；β链的编码基因(图中的TRB ORF部分)包括β链可变区编码基因和β链恒定区编码基因；α链和β链的编码基因之间通过内部自裂解猪捷申病毒(Porcine teschovirus)的2A序列(p2A序列)连接，具体序列详见表1。
表1
体外转录质粒载体构建：将委托南京金斯瑞公司合成的TCRα/β编码基因序列(包含BamHI、SacI酶切位点)通过BamHI、SacI限制性内切酶酶切，克隆到pUC57质粒的BamHI、SacI酶切位点之间，该质粒中，在BamHI酶切位点下游含有Kozak序列(GCCACC)，在SacI酶切位点上游含有双终止密码子序列(TGATAA)。
利用构建好的体外转录质粒载体，采用如下方法进行mRNA制备：
采用表2的体系对体外转录质粒载体进行线性化，反应体系配置完成后置于50℃下恒温反应过夜(不超过18h)，反应结束后升温至80℃保温20min使体系中的酶失活。
表2
名称 添加量
质粒 5μg
NEBufferTM r3.1 4μL
BspQI 2μL
无核酶水 至终体积40μL
使用DNA Clean Beads(DNA磁珠)对反应产物中的线性化质粒进行纯化。纯化产物进行电泳验证和浓度检测后，按照表3配制体外转录体系，配置完成后37℃孵育2.5h。孵育结束后，在反应体系中加入4μL的DNase I，37℃孵育15min，以消化转录的DNA模板。
表3
名称 添加量
模板(纯化的线性化质粒) 1μg
10×Transcrption Buffer 8μL
UTP溶液 8μL
ATP溶液 8μL
CTP溶液 8μL
GTP溶液 8μL
T7 RNA Polymerase Mix 8μL
无RNA酶ddH2O 至终体积80μL
使用DNA Clean Beads(DNA磁珠)对体外转录产物进行纯化。纯化产物经电泳验证和浓度检测后，取100μg纯化产物加入适量体积的无核酶水配制成140μL的RNA溶液，65℃加热5min后再置于冰上冷却5min，获得热变性RNA溶液。然后按表4配制加帽体系，配置完成后37℃反应1.5h。
表4
组分 用量 终浓度
热变性RNA 140μL 0.5μg/μL
10x Capping buffer 20μL 0.5U/μL
牛痘加帽酶(10U/μL) 10μL 2.5U/μL
mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶(50U/μL) 10μL 0.5mM
GTP(10mM) 10μL 0.2mM
SAM(4mM) 10μL 500ng/μL
使用DNA Clean Beads(DNA磁珠)对反应产物进行纯化，获得加帽处理后的TCR mRNA。对其进行BspQI酶切处理后，进行电泳验证，结果详见图4。图中，样品ZZ1、ZZ2和ZZ3分别为核酸表达载体I、II和III经上述处理后获得的mRNA(分别命名为ZZ1 mRNA、ZZ2mRNA和ZZ3 mRNA)酶切产物的电泳结果。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的TCR的激活验证结果。
1、实验材料
实验用细胞的制备：
为了满足HLA-A*11:01限制型TCR序列的功能验证需求，在人淋巴瘤母细胞(K562)的基础上进行改造，构建能够表达不同HLA亚型的稳转细胞株。由于K562细胞表面缺乏HLAI类与II类分子的表达，可以人工构建成单HLA表达细胞系，并作为靶细胞验证HLA限制性的杀伤作用。具体构建方法如下：
HLA过表达慢病毒包装：
(1)取生长状态良好的293FT细胞，接种至T175培养瓶中，每瓶加入20mL Opti-MEM完全培养基(Thermo Fisher Scientific)，接种量约为1.2×107个细胞/瓶，37℃培养过夜，至细胞汇合度达到50-60％，向其中加入按照表5的配方配制的试剂(表中配制量为T175培养瓶一瓶所用量)进行转染，混匀后再放入37℃培养箱继续培养。
表5
*HLA慢病毒表达质粒图谱详见图5。
(2)转染后48h收集培养基上清，置于4℃保存。然后向每个培养瓶中分别加入20mL新鲜的Opti-MEM完全培养基(Thermo Fisher Scientific)，再在37℃下继续培养。
(3)培养72h后再次收集培养基上清，并与步骤(2)收集的48h上清合并，4℃下，4500rpm离心5min，去除沉淀，并将获得的上清液用0.22μm真空过滤瓶过滤，滤液中加入其体积1/5的PEG8000浓缩试剂，混匀后4℃过夜浓缩沉降。
(4)浓缩沉降结束后在4℃下4500rpm离心50min，收集沉淀，用200μL预冷的D-PBS重悬，混匀后50μL/管分装在1.5mL离心管中，-80℃备用。
慢病毒感染目的细胞并获取阳性单克隆：
(1)取培养好的K562野生型细胞配制成3×105个细胞/mL的细胞悬液，按照每孔1mL的用量接种至12孔板，同时每孔加入5μL的聚凝胺促感染试剂和50μL慢病毒，混匀后37℃培养并传代。
(2)传两代后采用细胞流式检测HLA表达情况，以野生型K562细胞作为阴性对照。通过流式检测HLA阳性率与表达量，并将细胞采用流式分选单克隆，选择HLA表达强度前5％的细胞置于至少一个96孔板中进行扩增培养。
(3)以野生型K562细胞作为阴性对照，再次通过流式检测单克隆细胞的HLA表达量，与野生型相比表达量显著升高的视为HLA过表达细胞系，从中选取表达量最高的单克隆作为后续实验用HLA-A*11:01限制型TCR序列的功能验证靶细胞(其流式检测结果如图6所示，K562-HLA-A11:01OE细胞HLA阳性率为98.68％)。
2、实验方法
利用基因工程改造的NFAT-Luc Jurkat细胞，通过检测Luciferase荧光值验证TCR通路的激活状态，具体方法如下：
(1)获得表达TCR的NFAT-Luc Jurkat细胞：
将NFAT-Luc Jurkat细胞培养至2×107个/mL以上的密度，收集细胞，用DPBS(Cytiva)清洗1遍后用R液(Thermo Fisher Scientific)重悬细胞，配制成2×107/mL的细胞悬液，将该细胞悬液按照100μL/管加至1.5mL EP管内，同时分别在需电转CD8 mRNA或TCRmRNA的EP管中分别加入5μg CD8 mRNA(金斯瑞)、5μg ZZ1 TCR mRNA和5μg ZZ2 TCR mRNA，做好标记。电转杯中加入电转E2溶液(Thermo Fisher Scientific)3mL，将电转杯放入电转仪(Thermo Fisher Scientific)杯槽中，用100μL转枪头吸取细胞混合液，电转条件：1400V，20ms，2pulse；将加入的mRNA导入NFAT-Luc Jurkat细胞中，得到表达CD8或TCR的Jurkat细胞。
电转24h后用HLA-A*11:01CMV四聚体(MBL)对上述表达CD8或TCR的Jurkat细胞进行染色，染色结果见图7。从图中可以看出，电转化成功获得能够表达对应转入的mRNA的细胞，并且可以通过HLA-A*11:01CMV四聚检测到表达两种实施例2获得的TCR mRNA的特异性T细胞群。
(2)TCR激活验证：
将表达ZZ1 TCR和ZZ2 TCR的NFAT-Luc Jurkat细胞与前述制备的HLA过表达的K562细胞按照20:1的数量比在37℃下共孵育4h。孵育完成后，DPBS(Cytiva)清洗一遍后每孔加入100μL平衡至室温的Bio-Lite检测试剂(诺唯赞)，避光静置2-5min后，用酶标仪进行检测，结果见图8A和图8B。从图中可以看出，只有负载了CMV pp65表位肽的HLA-A*11:01K562细胞可激活Jurkat Luc荧光。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的TCR-T细胞的杀伤效果验证情况。
1、实验材料
2、实验方法
从健康供体获得外周血，通过Ficoll密度梯度离心分离来自供体的PBMC，并将其重悬于XVIVO15培养基中。用磁珠纯化分离T细胞，并用CD3/CD28磁珠激活T细胞，将其重悬于含有2.5％人自体血清及30IU/mL IL-2的XVIVO15培养基中培养3天。收集细胞，DPBS清洗1遍后用R液重悬细胞，配制成2×107/mL的细胞悬液，将该细胞悬液按照100μL/份加至1.5mL EP管内，分别加入5μg ZZ1 TCR mRNA及ZZ2 TCR mRNA。电转杯中加入E2溶液3mL，将电转杯放入电转仪杯槽中，用100μL转枪头吸取细胞混合液，电转条件：1400V，10ms，3pulse；将TCR mRNA导入激活T细胞中，得到表达TCR的T细胞。
电转24h后用HLA-A*11:01CMV四聚体(MBL)对上述表达TCR的T细胞进行染色。结果详见图9。
培养K562细胞数量至细胞密度达1×107个/mL以上，收集细胞，1640培养基清洗1遍并重悬配制成2×106/mL的细胞悬液，吸取该细胞悬液200μL/孔至48孔细胞培养板，同时加入60μL/孔的200μM多肽(SEQ ID NO:1)再加入1640培养基补齐至400μL/孔，置于37℃过夜孵育。
K562细胞按8×105/mL加入1μL EuTDA染料，置于37℃孵育20分钟，离心，并用1mL1×PBS清洗细胞3次。最后一次洗涤后，用T细胞培养基重悬细胞。
将表达TCR的T细胞(TCR-T细胞，分别含有实施例2中获得的ZZ1 TCR和ZZ2 TCR并进行流式验证，确认TCR mRNA成功转入激活T细胞中)与上述K562细胞分别按照20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1的数量比于37℃共孵育4h。孵育完毕后，500g室温离心5分钟。吸取20μL上清液转移至EuTDA Cytotoxicity Reagents试剂盒的平底96孔板中，每孔加入200μL Eu溶液，室温250rpm震动孵育10分钟。于5小时内用酶标仪记录在激发光330/80，发射光620/10波长下的荧光值，根据各组荧光值计算窗口值和杀伤效率，计算公式如下，结果详见图10((A)为ZZ1 TCR-T；(B)为ZZ2 TCR-T)。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的TCR的T细胞肽敏感性评价结果。
1、实验材料
名称 厂家 货号
D-PBS Cytiva SH30028.02
Human IFN-γPrecoated ELISA Kit 深圳市达科为生物工程有限公司 1110003
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific R5886
胎牛血清 Thermo Fisher Scientific SV30087.02
青链霉素 Thermo Fisher Scientific 15140-122
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
2、实验方法
采用实施例3中的方法获得表达ZZ1 TCR及ZZ2 TCR的T细胞。然后将获得的上述两种TCR-T细胞分别与负载10-5M至10-12M的CMV表位肽的K562按1:1的数量比共孵育18-24h。孵育结束后，收集各组细胞及上清液。使用流式检测细胞CD3+4-1BB+/CD3+比例(％)，绘制拟合曲线估算EC50。通过ELISA检测各组细胞上清中IFN-γ的浓度，绘制拟合曲线估算EC50。
收集K562细胞，使用细胞计数仪计数，记录活细胞密度和细胞活率。清洗细胞1遍后使用RPMI 1640(Thermo)培养基重悬细胞。按照5×105个细胞每孔的接种量K562接种于24孔板中，共接种9组。向不同组别加入不同浓度的CMV表位肽，使得肽终浓度为10-12M、10- 11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M，负载时间为4小时。收集电转后的TCR-T细胞，使用细胞计数仪计数，记录活细胞密度和细胞活率。使用含10％FBS(Cytiva)的X-VIVO 15重悬细胞并取2×105数量的细胞进行四聚体检测。
收集负载表位肽的K562，使用含10％FBS的XVIVO 15将细胞密度调至1×106个细胞/mL。调整后取100μL细胞悬液加入至96U型孔板中，每组3个复孔。使用含10％FBS的XVIVO15将TCR-T细胞密度调至1×106个细胞/mL，取100μL细胞悬液加入至已经接种有K562靶细胞悬液的96U型孔板中，混合均匀，使得效应细胞与靶细胞数量比即为1:1。TCR-T与K562在37℃共孵育过夜(约18-24小时)后，将96孔板样本离心，取上清进行ELISA-IFN-γ检测(达科为)。
按标签说明将ELISA标准品冻干粉溶解，静置5-10分钟，再用1×稀释液分别稀释至500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL。
使用稀释液将收集的细胞上清稀释10和100倍后，在96孔ELISA板中加入稀释后的样品，每孔100μL。按50μL/孔向标准品及样品孔中加入稀释后的抗体，混匀后盖上封板膜。37℃孵育2小时。孵育结束后，弃去孔内液体，按300μL/孔加入1x washing buffer，停留1分钟后弃去孔内液体，重复此步骤4次。按100μL/孔向样品孔中加入稀释后的亲和素，盖上封板膜，37℃孵育30分钟。孵育结束后再次洗涤孔板，按100μL/孔加入TMB，37℃避光孵育5-30分钟。显色结束后，按100μL/孔加入终止液。终止后10分钟内，用检测波长450nm和校正波长630nm同时读板。根据标准曲线计算每组细胞上清的IFN-γ浓度，使用GraphPad Prism 9对结果进行统计，并绘制拟合曲线，实验结果详见图11A-11B。从图中可以看出，表达实施例2获得的两种TCR mRNA的TCR-T细胞均可识别负载不同浓度CMV pp65抗原肽的HLA-A*11:01K652细胞，并释放IFN-γ等细胞因子，说明这两种TCR-T细胞均可特异性识别表达CMVpp65的细胞并对其进行杀灭。经拟合曲线估算，ZZ1 TCR-T细胞的EC50约为10-5M。虽然ZZ2TCR-T细胞未达到IFN-γ分泌峰值，无法计算EC50，但是实验结果表明，其也具有较好的识别并杀灭负载CMV pp65抗原肽的HLA-A*11:01K652细胞的能力。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的TCR的基序评价结果。
1、实验材料
2、实验方法
采用ALA-SCAN法鉴别本发明提供的TCR中与其功能、稳定性和构象密切相关的特定氨基酸位点，构建的丙氨酸扫描肽库如图12所示(其中的表位肽具体序列可见表6)。
表6
表位肽编号 ID 序列
1 SEQ ID NO:61 AAVQGQNLK
2 SEQ ID NO:62 ATAQGQNLK
3 SEQ ID NO:63 ATVAGQNLK
4 SEQ ID NO:64 ATVQAQNLK
5 SEQ ID NO:65 ATVQGANLK
6 SEQ ID NO:66 ATVQGQALK
7 SEQ ID NO:67 ATVQGQNAK
8 SEQ ID NO:68 ATVQGQNLA
采用实施例4中的方法获得表达ZZ1 TCR及ZZ2 TCR的T细胞。
培养K562细胞至细胞密度达到1×107个/mL以上，收集细胞，1640培养基洗1遍并重悬获得2×106/mL的细胞悬液，吸取该细胞悬液200μL/孔加入48孔细胞培养板，同时每孔加入60μL表位肽(SEQ ID NO:58-65)，1640培养基补齐至400μL/孔，37℃过夜孵育。
将两种表达TCR的T细胞与上述K562细胞分别按照1:2的数量比于37℃共孵育24h，结果见图13-14。从图中可以看出出电转ZZ2 TCR识别的motif为-TVQGQNLK，ZZ1 TCR识别的motif为---QGQ—K。结果表明ZZ2识别的基序更为保守。
对比例1
采用实施例3中的方法，NFAT-Luc Jurkat电转实施例2获得的ZZ3 TCR mRNA，获得表达ZZ3 TCR的Jurkat细胞，其流式检测结果如图15所示。从实验结果可以看出，ZZ3Jurkat细胞无CMV-A*11:01四聚体阳性群。
ZZ3 TCR序列(SEQ ID NO:54)中含有氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的α链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的β链可变区，以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26-27所示的α链恒定区和β链恒定区。其中，α链可变区中包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18-20所示的CDR1α、CDR2α和CDR3α(其编码基因分别如SEQ ID NO:44-46所示)；β链可变区中包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO:21-23所示的CDR1β、CDR2β和CDR3β(其编码基因分别如SEQ ID NO:47-49所示)。
NFAT-Luc报告系统实验结果如图16所示，图中显示对照组荧光值在12至14范围内，ZZ3 Jurkat荧光值为18，与对照组接近，说明该TCR不能被K562-A*11:01-pep激活。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内可对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种T细胞抗原受体，其特征在于，所述T细胞抗原受体特异性识别并结合包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列的人巨细胞病毒结合表位，所述T细胞抗原受体包括至少一个α链可变区和至少一个β链可变区，所述α链可变区包括α链的互补决定区，所述β链可变区包括β链的互补决定区；
其中，α链可变区的互补决定区1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 2-4所示，β链可变区的互补决定区1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示；或者
α链可变区的互补决定区1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 10-12所示，β链可变区的互补决定区1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13-15所示。
2.根据权利要求1所述的T细胞抗原受体，其中，α链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，β链可变区包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
或者，α链可变区包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，β链可变区包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的T细胞抗原受体，其中，所述T细胞抗原受体中，α链可变区与β链可变区直接连接或间接连接。
4.根据权利要求3所述的T细胞抗原受体，其中，所述T细胞抗原受体中，α链可变区与β链可变区间接连接。
5.根据权利要求4所述的T细胞抗原受体，其中，α链可变区通过furin SGSG p2A序列与β链可变区间接连接。
6.编码权利要求1-5中任意一项所述的T细胞抗原受体的核酸分子。
7.一种核酸表达载体，其特征在于，所述核酸表达载体包括编码基因和载体序列，其中，所述编码基因由权利要求6所述的核酸分子提供。
8.一种载体细胞，其特征在于，所述载体细胞包含权利要求1-5中任意一项所述的T细胞抗原受体，和/或所述载体细胞包含权利要求6所述的核酸分子，和/或所述载体细胞包含权利要求7所述的核酸表达载体。
9.权利要求1-5中任意一项所述的T细胞抗原受体，和/或权利要求6所述的核酸分子，和/或权利要求7所述的核酸表达载体，和/或权利要求8所述的载体细胞在制备用于预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物中的应用。
10.权利要求1-5中任意一项所述的T细胞抗原受体，和/或权利要求6所述的核酸分子，和/或权利要求7所述的核酸表达载体，和/或权利要求8所述的载体细胞在用于制备采用TCR-T疗法预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物中的应用。
11.一种用于预防和/或治疗人巨细胞病毒感染造成的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含：权利要求1-5中任意一项所述的T细胞抗原受体，和/或权利要求6所述的核酸分子，和/或权利要求7所述的核酸表达载体，和/或权利要求8所述的载体细胞。
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