CN118221828B

CN118221828B - Car分子、car细胞和car药物组合物及其应用

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Publication number: CN118221828B
Application number: CN202311161882.5A
Authority: CN
Inventors: 魏建树; 韩为东; 伍志强; 王瑶; 林欣
Original assignee: Beijing Changping Laboratory
Current assignee: Beijing Changping Laboratory
Priority date: 2023-09-08
Filing date: 2023-09-08
Publication date: 2024-12-31
Anticipated expiration: 2043-09-08
Also published as: CN118221828A

Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及CAR分子、CAR细胞和CAR药物组合物及其应用。该CAR分子包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；胞外结构域依次包括抗原结合结构域、多聚化/二聚化结构域。本申请通过对膜外结构进行改造，用以提高CAR分子的聚合能力，有助于提高CAR免疫细胞激活效率、促进形成稳定有序的免疫突触，进而增效CAR免疫细胞的抗瘤功能。

Description

CAR分子、CAR细胞和CAR药物组合物及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及CAR分子、CAR细胞和CAR药物组合物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一，开发新的肿瘤治疗手段势在必行。

近年来，以嵌合抗原受体修饰的T(chimeric antigen receptor modified T,CART)细胞疗法为代表的免疫治疗已经取得了巨大的成功，成为肿瘤治疗领域新的热点。但是，CAR T细胞自身的一些不足极大地限制了CAR T治疗的长期获益，例如CAR T细胞对抗原低表达的肿瘤细胞识别和杀伤能力不足、CAR T细胞由于发生耗竭难以在体内长期维持等。而目前的优化研究主要聚焦在胞内信号域，对CAR分子膜外结构的优化还缺乏系统性研究。因此，开发更优异的CAR T细胞药物具有迫切的需求。

CAR分子结构的改变对T细胞激活效率、下游信号通路和T细胞分化表型等具有重要影响，如何优化CAR分子结构以赋予T细胞更优异的抗肿瘤功能，是CAR T疗法扩展临床应用的基础，也是当前领域内关注的热点问题。目前的优化研究主要聚焦在胞内信号域，对CAR分子膜外结构的优化还缺乏系统性研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了CAR分子、CAR细胞和CAR药物组合物及其应用。本申请通过对膜外结构进行改造，用以提高CAR分子的聚合能力，有助于提高CAR免疫细胞激活效率、促进形成稳定有序的免疫突触，进而增效CAR免疫细胞的抗瘤功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种CAR分子，该CAR分子包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；

胞外结构域依次包括抗原结合结构域、多聚化/二聚化结构域。

在本发明实施方式中，抗原结合结构域、多聚化/二聚化结构域之间可直接连接，也可通过连接序列连接。本发明在此不做具体限定。

在本发明实施方式中，多聚化/二聚化结构域选自由以下多肽片段组成的组：FKBP多肽、FRB多肽、钙调神经磷酸酶多肽、亲环素多肽、细菌性DHFR多肽、PYL1多肽、ABI1多肽、GIB1多肽、GAI多肽，和/或其变异体。

在本发明具体实施方式中，多聚化/二聚化结构域包括FKBP多肽。

在本发明具体实施方式中，FKBP多肽的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

嵌合抗原受体(CAR)是一种细胞表面受体蛋白，它赋予了免疫细胞靶向特定抗原蛋白的能力。从结构上看CAR是由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域三个功能结构域组成。胞外结构域(胞外区常为单链抗体scFv)，负责识别并结合靶抗原；跨膜结构域可将胞外结构域锚定于细胞膜上。当抗原被识别和结合后，产生刺激信号传至胞内结构域，T细胞等免疫细胞被激活并发挥效应功能。

为提高CAR分子的聚合能力，本申请在其膜外段加入了一个或多个串联的FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)结合域，。下面以在CAR膜外段加入两个串联的FKBP为例说明本申请的工作原理：小分子化合物AP1903具有对称结构，可同时结合两个不同CAR分子上的FKBP序列，进而诱导CAR分子形成多聚体(工作原理见图1)，将这一结构命名为可诱导多聚化的CAR(inducible multimerization CAR,imCAR)分子。正常状态下，imCAR主要以单体形式存在(或许存在少量由铰链区介导形成的二聚体)；当加入AP1903后，imCAR分子之间可形成多聚体，从而增加CAR分子的聚合程度。CAR分子分布模式的改变会对胞内激活信号、免疫突触结构、脂筏等产生直接影响，从而可以更高效地诱发激活信号、脱颗粒效应，实现更好的抗肿瘤作用。

本发明的基本原理和对CAR T细胞功能影响的机制如图1所示。

在本发明实施方式中，多聚化/二聚化结构域包括至少一个多肽片段或者至少两个串联重复的多肽片段。

作为优选，多聚化/二聚化结构域包括1～5个多肽片段；例如1、2、3、4、5等。

优选地，多聚化/二聚化结构域包括2～4个串联重复的多肽片段。

在本发明实施方式中，多聚化/二聚化结构域包括2个以上的多肽片段时，多肽片段之间可直接连接，也可通过氨基酸序列连接。

在本发明实施方式中，氨基酸序列中氨基酸个数为0～30个，优选为0～20个，更优选为0～15个。用于连接多肽片段的氨基酸序列可为任意氨基酸序列，只要能够起到连接作用即可。

在本发明具体实施方式中，用于连接多肽片段的氨基酸序列为(GGGGS)_n,其中，n≥1，例如1、2、3、4、5、10、20等。示例性的为SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在本发明实施方式中，抗原结合结构域包括抗体、抗体片段、单链抗体scFv、di-scFv、Fv、Fab、Fab'、(Fab')2、微抗体、双抗体、单结构域抗体sdAb、轻链可变结构域VL或VHH中的至少一种。

在本发明提供的具体实施例中，抗原结合结构域为单链抗体scFv。该scFv序列需根据靶抗原种类进行设计。

在本发明提供的实施方式中，抗原结合结构域的靶抗原选自：CD19、CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、CD22、CD23、CD28、CD30、CD33、CD35、CD38、CD40、CD42c、CD43、CD44、CD44v6、CD47、CD49D、CD52、CD53、CD56、CD70、CD72、CD73、CD74、CD79A、CD79B、CD80、CD82、CD85A、CD85B、CD85D、CD85H、CD85K、CD96、CD107a、CD112、CD115、CD117、CD120b、CD123、CD146、CD148、CD155、CD185、CD200、CD204、CD221、CD271、CD276、CD279、CD280、CD281、CD301、CD312、CD353、CD362、BCMA、CD16V、CLL-1、Igκ、TRBC1、TRBC2、CKLF、CLEC2D、EMC10、EphA2、FR-a、FLT3LG、FLT3、Lewis-Y、HLA-G、ICAM5、IGHA1/IgA1、IL-1RAP、IL-17RE、IL-27RA、MILR1、MR1、PSCA、PTCRA、PODXL2、PTPRCAP、ULBP2、AJAP1、ASGR1、CADM1、CADM4、CDH15、CDH23、CDHR5、CELSR3、CSPG4、FAT4、GJA3、GJB2、GPC2、GPC3、IGSF9、LRFN4、LRRN6A/LINGO1、LRRC15、LRRC8E、LRIG1、LGR4、LYPD1、MARVELD2、MEGF10、MPZLI1、MTDH、PANX3、PCDHB6、PCDHB10、PCDHB12、PCDHB13、PCDHB18、PCDHGA3、PEP、SGCB、vezatin、DAGLB、SYT11、WFDC10A、ACVR2A、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶、钙粘素24、DLK1、GFRA2、GFRA3、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EFNB1、EPOR、FGFR2、FGFR4、GALR2、GLG1、GLP1R、HBEGF、IGF2R、UNC5C、VASN、DLL3、FZD10、KREMEN2、TMEM169、TMEM198、NRG1、TMEFF1、ADRA2C、CHRNA1、CHRNB4、CHRNA3、CHRNG、DRD4、GABRB3、GRIN3A、GRIN2C、GRIK4、HTR7、APT8B2、NKAIN1、NKAIN4、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1I、CACNG8、CACNG4、CLCN7、KCNA4、KCNG2、KCNN3、KCNQ2、KCNU1、PKD1L2、PKD2L1、SLC5A8、SLC6A2、SLC6A6、SLC6A11、SLC6A15、SLC7A1、SLC7A5P1、SLC7A6、SLC9A1、SLC10A3、SLC10A4、SLC13A5、SLC16A8、SLC18A1、SLC18A3、SLC19A1、SLC26A10、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A5、SLC35E2、SLC38A6、SLC38A9、SLC39A7、SLC39A8、SLC43A3、TRPM4、TRPV4、TMEM16J、TMEM142B、ADORA2B、BAI1、EDG6、GPR1、GPR26、GPR34、GPR44、GPR56、GPR68、GPR173、GPR175、LGR4、MMD、NTSR2、OPN3、OR2L2、OSTM1、P2RX3、P2RY8、P2RY11、P2RY13、PTGE3、SSTR5、TBXA2R、ADAM22、ADAMTS7、CST11、MMP14、LPPR1、LPPR3、LPPR5、SEMA4A、SEMA6B、ALS2CR4、LEPROTL1、MS4A4A、ROM1、TM4SF5、VANGL1、VANGL2、C18orf1、GSGL1、ITM2A、KIAA1715、LDLRAD3、OZD3、STEAP1、MCAM、CHRNA1、CHRNA3、CHRNA5、CHRNA7、CHRNB4、KIAA1524、NRM.3、RPRM、GRM8、KCNH4、黑皮质素1受体、PTPRH、SDK1、SCN9A、SORCS1、CLSTN2、内皮素转换酶样-1、溶血磷酸受体2、LTB4R、TLR2、嗜中性酪氨酸激酶1、MUC16、B7-H4、ERBB2、HER3、EGFR变体III(EGFRvIII)、HGFR、FOLR1、MSLN、CA-125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、间皮素、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、L1-CAM、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、VEGFR1、VEGFR2、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-α2、双唾液酸神经节苷脂(GD2和GD3)、肿瘤相关碳水化合物抗原(CA-125、CA-242、Tn和唾液酰-Tn)、4-1BB、5T4、BAFF、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR1、CCR4、FAP、纤连蛋白外结构域-B(ED-B)、GPNMB、IGF-1受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、ITB5、ITGAX、embigin、PDGF-Rα、ROR1、多配体聚糖1、TAG-72、腱生蛋白C、TRAIL-R1、TRAIL-R2、NKG2D-配体、提呈肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合物(MHC)分子、PR1/HLA-A2、谱系特异性或组织特异性组织抗原、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD24、CD25、CD34、CD80、CD86、CD133、CD138、CD152、CD319、endoglin、以及MHC分子中的一种或几种。

在本发明具体实施例中，CAR分子的靶抗原选自CD19、CD20、表皮生长因子受体(EGFR)中的至少一种。

在本发明实施方式中，跨膜结构域选自CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD4、CD5、CD8、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD134、CD137、CD154、ICOS、OX40、DAP10、DAP12中的一种或多种的跨膜结构域，或其截短序列。

在本发明提供的具体实施例中，跨膜结构域为CD8a跨膜结构域。

在本发明实施方式中，胞内结构域包括共刺激结构域和激活结构域。

在本发明实施方式中，共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10、DAP12中的至少一种。

在本发明提供的具体实施例中，共刺激结构域为4-1BB。

在本发明实施方式中，激活结构域选自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10、DAP12中的至少一种。

在本发明提供的具体实施例中，激活结构域为CD3ζ。

在本发明实施方式中，本发明CAR分子还包括铰链结构域(Hinge)，铰链结构域设置于多聚化/二聚化结构域与跨膜结构域之间。铰链结构域和跨膜结构域共同构成铰链和跨膜结构域。

在本发明实施方式中，多聚化/二聚化结构域和铰链结构域之间可直接连接，也可通过连接序列连接。本发明在此不做具体限定。

在本发明实施方式中，铰链结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS、CD154中的一种或多种的铰链结构域，或其截短序列。

作为优选，铰链结构域的氨基酸个数为0～100个，优选为0～80，更优选15～60。

在本发明提供的具体实施例中，铰链结构域为CD8a铰链结构域或其截短序列。

在本发明优选实施例中，CAR分子依次由scFV、FKBP结构域、CD8a铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域连接而成。其中，CD8a铰链和跨膜结构域包括CD8a铰链结构域和CD8a跨膜结构域。FKBP结构域由一个或多个FKBP片段组成，多个FKBP片段之间可通过氨基酸序列连接。

在本发明具体实施例中，CAR分子结构为：scFV-(FKBP结构域)_m-CD8a铰链结构域(或其截短序列)-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。其中，m≥1，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。

在本发明具体实施例中，CAR分子包括imCAR19、imCAR20、imCAR-EGFR、idCAR19、idCAR20、idCAR-EGFR、imCAR19-T1、imCAR19-T2、idCAR19-T1、idCAR19-T2。

其中，idCAR表示包含一个FKBP多肽、可诱导二聚体化的CAR分子；imCAR表示包含两个FKBP多肽、可诱导多聚化的CAR分子；T1表示hinge区截短一半的CAR分子。T2表示hinge区全部截短的CAR分子，即该分子不包括CD8a铰链结构域(或其截短序列)。

在本发明实施方式中，CAR分子的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、22、23、25、26任一所示的氨基酸序列；

2)与1)中任一所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。例如与1)中任一所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施方式中，imCAR分子结构为：scFV-(FKBP结构域)₂-CD8a铰链结构域-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。

在本发明具体实施方式中，imCAR19的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施方式中，imCAR20的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施方式中，imCAR-EGFR的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施方式中，idCAR分子结构为：scFV-FKBP结构域-CD8a铰链结构域-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。

在本发明具体实施方式中，idCAR19的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施方式中，idCAR20的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施方式中，idCAR-EGFR的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施例中，imCAR-T1分子结构为：scFV-(FKBP结构域)₂-CD8a铰链结构域截短一半的序列-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。

在本发明具体实施方式中，imCAR19-T1的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施例中，imCAR-T2分子结构为：scFV-(FKBP结构域)₂-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。此分子结构不包括CD8a铰链结构域或其截短序列。

在本发明具体实施方式中，imCAR19-T2的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施例中，idCAR-T1分子结构为：scFV-FKBP结构域-CD8a铰链结构域截短一半的序列-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。

在本发明具体实施方式中，idCAR19-T1的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在本发明具体实施例中，idCAR-T2分子结构为：scFV-FKBP结构域-CD8a跨膜结构-4-1BB共刺激结构域-CD3ζ激活结构域。此分子结构不包括CD8a铰链结构域或其截短序列。

在本发明具体实施方式中，idCAR19-T2的氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供了编码上述CAR分子的多核苷酸。

在本发明具体实施方式中，编码CAR分子中FKBP多肽的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明提供的具体实施例中，编码抗原结合结构域的核苷酸序列为编码单链抗体scFv的核苷酸序列。该scFv序列需根据靶抗原种类进行设计。

在本发明实施方式中，编码CAR分子的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、49、50、52、53任一所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、49、50、52、53任一所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与1)或2)中任一所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与1)或2)中任一所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码imCAR19的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码imCAR20的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码imCAR-EGFR的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码idCAR19的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码idCAR20的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码idCAR-EGFR的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码imCAR19-T1的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码imCAR19-T2的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码idCAR19-T1的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

在本发明具体实施方式中，编码idCAR19-T2的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列的互补序列或简并序列；

3)与SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。例如与SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种载体，该载体包括上述多核苷酸；载体选自质粒、细菌、病毒中的至少一种。

作为优选，载体可使用缺乏复制能力、无法在转染细胞中自我复制的病毒载体例如逆转录病毒载体(包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、痘苗病毒载体或HSV载体等。

在本发明的具体实施例中，载体为慢病毒载体。

第四方面，本发明还提供了一种CAR细胞，该CAR细胞包括上述多核苷酸，和/或载体；该细胞为免疫细胞；

作为优选，免疫细胞为T细胞、NK细胞、树突状细胞或巨噬细胞。

在本发明的具体实施例中，免疫细胞为T细胞。

第五方面，本发明提供了一种CAR药物组合物，包括上述CAR分子、多核苷酸、载体、CAR细胞中的至少一种，以及桥接因子。

在本发明实施方式中，桥接因子包括但不限于雷帕霉素(rapamycin)或其类似物、库马霉素(coumermycin)或其衍生物、赤霉素或其衍生物、脱落酸(ABA)或其衍生物、甲氨蝶呤或其衍生物、环孢菌素A或其衍生物、FKCsA或其衍生物、甲氧苄啶(Tmp)-FK506结合蛋白(FKBP)合成配体(SLF)或其衍生物中的至少一种。

在本发明具体实施方式中，桥接因子包括但不限于AP1903、AP20187、AP21967、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司、佐他莫司中的至少一种。

本发明通过添加AP1903等桥接因子，可诱导多聚化的CAR分子连接聚合而成CAR分子聚合物。

在上述组合物中，CAR分子和/或CAR细胞中的CAR分子，以及桥接因子，可以为单独包装形式存在，也可以为聚合物形式存在。

第六方面，本发明提供了上述CAR分子、多核苷酸、载体、CAR细胞或CAR药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

在本发明实施方式中，抗肿瘤药物用于预防和/或治疗肺癌、淋巴癌、血癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、骨髓瘤、默克尔细胞癌等。

第七方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物，包括上述CAR细胞和/或CAR药物组合物，以及药学上可接受的辅料。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

1、本发明CAR分子聚合物通过提高对免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)的磷酸化、形成稳定有序免疫突触，可以更高效地诱发激活信号、脱颗粒效应，实现更好的抗肿瘤作用。

2、本发明可诱导多聚化的CAR分子及其聚合物极大程度提高了CAR T细胞激活效率，促进形成稳定有序的免疫突触，从而提高了CAR T细胞的抗肿瘤功能，同时，CAR分子聚合物可以显著阻遏肿瘤抗原刺激引发的T细胞耗竭，进一步提高了抗肿瘤疗效，为肿瘤患者提供了更优的治疗选择。

3、CAR分子多聚化显著降低了炎性因子的分泌。炎性因子的降低不仅有助于降低CAR T治疗的毒副作用、提高临床应用中的安全性、减轻患者治疗时的痛苦；同时，CAR分子的功能受到小分子药物的严格调控，且本发明中应用的桥接因子(如小分子药物AP1903)具有体内代谢快、敏感性高、毒性低的优点。通过控制小分子药物的给予剂量，可以实现对CART细胞功能的精准调控，进一步提高了临床安全性。

4、本发明的方法具有操作简便、稳定可靠、适宜工业化生产等优点。

附图说明

图1示imCAR分子工作原理示意图；

图2示可诱导多聚化的CAR分子的结构和感染效率；

A中，CAR分子为不包含FKBP多肽的CAR分子结构；idCAR分子为包含一个FKBP多肽、可诱导二聚体化的CAR分子；imCAR分子为包含两个FKBP多肽、可诱导多聚化的CAR分子；

B中，vehicle为阴性对照组；mCherry为一种红色荧光蛋白；

图3示诱导imCAR19分子多聚化提高第一激活信号强度；Rnod-4为一种钙离子荧光探针；

图4示诱导CAR分子多聚化提高了CAR T细胞脱颗粒效应；

图5示诱导CAR分子多聚化提高了CAR T细胞杀伤肿瘤细胞能力；

图6示诱导imCAR分子多聚化阻遏了T细胞耗竭；

图7示诱导imCAR分子多聚化改变了因子表达谱；IFN-gama为干扰素γ；GranzymeB为一种丝氨酸蛋白酶；Perforin为穿孔素；

图8示不同结构的idCAR19和imCAR19分子的脱颗粒功能检测；

图9示不同结构CAR分子聚合物介导的细胞亲合力研究。

附图中英文释义：

Antigen：抗原；

ITAM：基于免疫受体酪氨酸的激活基序(Immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif)；

Lck：淋巴细胞蛋白质酪氨酸激酶；

ZAP-70：一种酪氨酸蛋白激酶；

Fyn：一种酪氨酸蛋白激酶；

CD8a hinge and transmembrane domain：CD8a铰链和跨膜结构域；

Cell membrane：细胞膜；

FITC：异硫氰酸荧光素；

Mean MFI of EGFP(-basal)：EGFP的平均荧光强度(-本底)；

EGFP：即增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein)；

Positive rate：阳性率；

Double positive rate：双阳性率；

Lysis efficiency：裂解效率；

T Cells Bound：T细胞结合；

Force：亲合力。

具体实施方式

本发明公开了CAR分子、CAR细胞和CAR药物组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)是一种在生物体中广泛存在、进化上高度保守的组成型蛋白质。FKBP已在从酵母到人的许多真核生物中发现，并且充当用于含有脯氨酸残基的蛋白质的蛋白质折叠蛋白伴侣。连同亲环蛋白一起，FKBP属于亲免蛋白家族。FKBP涉及多种细胞功能，包括蛋白质折叠、细胞信号传导、细胞凋亡和转录。它们通过直接结合和改变其靶蛋白的构象来发挥其功能，因此充当分子开关。

AP1903(AP1903)是二聚化剂，其通过交联FKBP结构域起作用，启动蛋白的二聚化或多聚化。

单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过5～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。

可诱导二聚体化的CAR：inducibledimerization CAR,idCAR。

可诱导多聚化的CAR：inducible multimerization CAR,imCAR。

在本发明提供的具体实施例中，scFV、FKBP、CD8a铰链结构域、CD8a跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域的氨基酸序列和核苷酸序列在序列表中呈现。

表1CAR分子或其片段的氨基酸和核苷酸序列

本发明中所用试剂、仪器或生物材料等均可通过商业渠道获得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1imCAR分子的制备

如图2A所示，CAR分子包括依次由scFV、2个FKBP片段、CD8a铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域连接而成。其具体制备方法如下：

以imCAR19为例。基因合成2*FKBP核苷酸序列，2*FKBP核苷酸序列如下：acgcgtatgagaggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaactggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctatgagaggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaact

在获得CAR19质粒基础上，利用同源重组技术，将2*FKBP序列插入到CAR19分子中scFV和CD8a铰链结构域之间。经感受态转化，挑取克隆测序验证后，得到目的imCAR19质粒。

采用上述制备方法分别制备获得imCAR19、imCAR20、imCAR-EGFR。

实施例2idCAR分子的制备

如图2A所示，CAR分子包括依次由scFV、1个FKBP片段、CD8a铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域连接而成。其具体制备方法如下：

以idCAR19为例。基因合成FKBP核苷酸序列，FKBP核苷酸序列如下：acgcgtatgagaggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaact

在获得CAR19质粒基础上，利用同源重组技术，将FKBP序列插入到CAR19分子中scFV和CD8a铰链结构域之间。经感受态转化，挑取克隆测序验证后，得到目的idCAR19质粒。

采用上述制备方法分别制备获得idCAR19、idCAR20、idCAR-EGFR。

对比例1CAR分子的制备

如图2A所示，CAR分子包括依次由scFV、CD8a铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域连接而成。其具体制备方法如下：

全基因合成CAR19-T2A-EGFP核苷酸序列，其中5’端包含BamH I酶切位点GGATCC，3’端包含Sal I酶切位点GTCGAC。

其中CAR19分子全序列为：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacaca

gactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaa

attggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaagg

ttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaa

cagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggt

gggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtcc

gtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagt

ggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactc

caagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacgg

tggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaacgcgtaccacgacgccagcgccgc

gaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcgggg

ggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtcctt

ctcctgtcactggttatcaccctttactgctctagaaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatga

gaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgga

attcagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaat

ctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaag

gaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaa

ggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgc

ccttcacatgcaggccctgccccctcgc

T2A序列为：

ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct

EGFP序列为：

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccac

aagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggca

agctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatg

aagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaa

ctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaa

ggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcag

aagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccag

cagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaa

gaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagc

tgtacaagtaa

三段序列直接连接。

随后将合成的CAR19-T2A-EGFP核苷酸序列用BamHI和SALI内切酶进行双酶切，跑胶回收得到携带双粘性末端的基因序列A。

从百恩维生物科技有限公司购买PLVX-EF1a-IRES-puro原始载体，用BamHI和SALI内切酶进行双酶切，跑胶回收得到携带双粘性末端的基因序列B。

将基因序列A和B按照3：1的比例混合，加入T4连接酶室温连接30分钟，随后取10ul产物进行感受态转化。挑取3个克隆送测序，测序验证正确后得到目的CAR19过表达载体。

采用上述制备方法分别制备获得CAR19、CAR20、CAR-EGFR。

注意：实施例和对比例的所有CAR分子下游均由T2A序列连接表达GFP荧光蛋白，用于CAR T细胞的分选和分析。

试验例1可诱导多聚化的CAR分子的表达及分布研究

一、感染效率测定和分布的测定方法

取慢病毒感染后第2天的CAR T细胞，利用流式细胞仪对细胞中GFP荧光蛋白的表达进行检测，GFP表达阳性的细胞即被认为是CAR表达阳性的CAR T细胞。

构建CAR分子和mCherry荧光蛋白的融合蛋白表达载体，制备成慢病毒后对Jurkat细胞进行感染，随后利用流式细胞仪对mCherry荧光蛋白阳性的Jurkat细胞进行分选纯化。随后利用荧光共聚焦显微镜直接观察Jurkat细胞中CAR-mCherry的表达和分布情况。

二、实验结果

上述实施例成功制备了CAR T-19、idCAR T-19和imCAR T-19细胞，细胞感染效率稳定在30-60％之间。由图2A可见，CAR T-19、、idCAR T-19和imCAR T-19细胞的感染效率类似。

本试验例检测了imCAR19分子在Jurkat细胞中的表达分布情况，如图2B可见，在正常状态下imCAR19分子以弥散状态均匀分布于细胞膜上，当加入10nM浓度的AP1903后30分钟，可以看到imCAR19分子发生了明显的聚集，并以斑块样状态分布于细胞膜上。

试验例2可诱导多聚化的CAR分子产生激活信号的研究

一、实验方法

(1).CAR T细胞激活效率的检测：

1).Western blotting检测相关激酶的磷酸化：

在培养第5天流式分选CAR T-19细胞后继续培养至第10天，用无血清培养基培养3个小时后，按照效靶比＝1:1与Nalm6细胞(人急性B淋巴白血病细胞系)混合，实验组加入终浓度为10nM的AP1903，对照组加入相同体积的PBS。在共培养不同时间后，850g离心30s，收集细胞，随后加入细胞裂解液和磷酸酶抑制剂，提取蛋白。测定蛋白浓度后，上样40μg蛋白，检测CD3ζ、Zap70等磷酸化水平。

2).胞内钙离子浓度检测：

方法1：分选的CAR T-19细胞培养至第10天，对CAR T细胞进行计数，每个96孔板(白色酶标板)孔中加入1×10⁵的CAR T细胞，用无血清培养基培养3个小时，随后加入工作浓度为5mM的Rhod-4钙离子荧光探针孵育1小时，并利用多功能酶标仪检测钙离子探针荧光信号强度，计为0时间点对照，激发波长为540nm，发射波长为590nm。并随后加入等量的Nalm6细胞与CAR T细胞混合，实验组加入终浓度为10nM的AP1903，对照组加入相同体积的PBS。在共培养不同时间点，利用多功能酶标仪检测钙离子探针荧光信号强度，统计计算信号变化。

方法2：利用慢病毒感染制备稳定表达钙离子依赖型GFP蛋白(jGCaMP7s)，此蛋白包括一个与钙调蛋白(CaM)融合的环状排列GFP(cpGFP)和一个来自肌球蛋白轻链激酶(Rs20，也称为M13)的钙调蛋白结合肽。钙调蛋白依赖的构象变化及其与M13和GFP的相互作用调节GFP发色团环境并影响荧光。因此，可以通过检测GFP的信号强度来反应细胞内钙离子的浓度变化。

在此细胞系基础上，本试验例制备了过表达CAR分子的Jurkat细胞。对Jurkat-CAR细胞进行计数，用无血清培养基培养12个小时后加入等量的Nalm6细胞与Jurkat-CAR细胞混合，实验组加入终浓度为10nM的AP1903，对照组加入相同体积的PBS。在共培养不同时间点，利用流式检测Jurkat细胞中GFP的信号强度变化。

二、实验结果

图3为诱导imCAR19分子多聚化提高第一激活信号强度。CAR T-19细胞与Nalm6细胞以1:1的比例混合，(A、B).加入AP1903不影响CAR T-19胞内钙离子浓度的升高。加入AP1903诱导imCAR19形成多聚体，明显提高了胞内钙离子浓度，且钙离子升高持续的时间更长。(C).在抗原刺激10分钟后，检测T细胞激活相关激酶的磷酸化水平。结果显示，诱导imCAR19分子多聚化，可显著提高相关激酶的磷酸化水平，Zap70的磷酸化水平提高尤为显著。RFU(relative fluorescence unit,相对荧光强度单位)，*p≤0.05，**p≤0.01。

通过加入AP1903诱导imCAR分子形成多聚体，从钙离子浓度检测结果可以看出，诱导imCAR分子多聚化后，CAR T细胞产生的激活信号更强且维持的时间更长。抗原刺激10分钟后相关激酶磷酸化检测显示，诱导imCAR分子多聚化显著提高了T细胞激活相关通路上关键激酶的磷酸化水平。

试验例3可诱导多聚化的CAR分子的功能研究-脱颗粒效应

一、实验方法

流式检测CD107a的表达，是脱颗粒效应的指标。脱颗粒效应检测实验步骤如下：CAR T细胞培养第10天，对CAR T细胞进行计数，按效靶比＝1:1的比例进行共培养(1×10⁵细胞每96孔板孔)，肿瘤细胞包括：Nalm6(人急性B淋巴白血病细胞系)、Raji(人淋巴瘤细胞)、过表达人CD19的A549(人非小细胞肺癌细胞)，同时加入终浓度为10nM的AP1903诱导imCAR分子形成多聚体。加入15μl的CD107a抗体，共培养4小时后，检测CAR T细胞中CD107a的表达。

二、实验结果

图4显示诱导CAR分子多聚化提高了CAR T细胞脱颗粒效应。CAR T-19和imCAR T-19细胞分别与Nalm6(A)、Raji(B)、A549-CD19(C)以及imCAR T-20细胞与Raji(D)共培养4小时后，检测CAR T细胞CD107a的表达。(E).统计结果显示，AP1903的加入不会改变CAR T-19细胞的CD107a阳性率，但是可以显著提高imCAR T-19和imCAR T-20的CD107a阳性率。**p≤0.01。

可见，通过加入AP1903诱导imCAR分子形成多聚体，可以有效增强CAR T细胞的脱颗粒效应。

试验例4可诱导多聚化的CAR分子的功能研究-肿瘤杀伤效应

一、实验方法

肿瘤杀伤效率的检测方法如下：通过流式分选纯化GFP阳性的CAR T细胞，在培养第10天，对CAR T细胞计数，按照不同效靶比(1：1至1：20)与携带luciferase(萤火虫荧光素酶)的肿瘤细胞共培养，肿瘤细胞包括：Nalm6(人急性B淋巴白血病细胞系)、Raji(人淋巴瘤细胞)、A549(人非小细胞肺癌细胞)，实验组加入终浓度为10nM的AP1903诱导imCAR分子形成多聚体，对照组加入等体积的PBS溶液。在共培养24或48小时后，加入荧光素酶底物luciferin，利用多功能酶标仪通过测定化学发光强度来计算肿瘤细胞的杀伤效率。

二、实验结果

图5展示了诱导CAR分子多聚化提高了CAR T细胞杀伤肿瘤细胞能力。在不同效靶比下，CAR T-19和imCAR T-19细胞分别与Nalm6(A)、A549-CD19(B)、Raji(C)共培养24小时，加入AP1903不会影响CAR T-19细胞的杀伤效能，但是可以显著提高imCAR T-19的杀伤功能。(D).以单体形式存在的imCAR T-20在E:T＝1：5条件下对Nalm6(CD20低表达)几乎不产生杀伤，当加入AP1903诱导imCAR T-20形成多聚体后可将杀伤效率提高至50％左右(48小时)。E:T(effector:target,效靶比)，*p≤0.05，**p≤0.01。

可见，加入AP1903诱导imCAR分子形成多聚体可有效提高CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，尤其是对低抗原密度肿瘤细胞杀伤能力的提高尤为显著。试验例5可诱导多聚化的CAR分子的功能研究-T细胞耗竭

一、实验方法

1).肿瘤抗原刺激下CAR T细胞耗竭状态的检测：

imCAR T-19细胞正常培养至第7天，按照效靶比＝1:5与Nalm6细胞混合共培养，共培养过程中不添加IL-2，实验组加入终浓度为10nM的AP1903。共培养2天后(Nalm6细胞基本被全部清除)，更换为含有IL-2的正常培养基继续培养3天，随后对T细胞的PD-1、TIM-3、LAG-3和CD107a(肿瘤细胞再次刺激后)进行检测。

2).正常培养体系下CAR T细胞分化和耗竭表型的检测：

在病毒感染后第三天，在正常CAR T培养体系中每天加入工作浓度为10nM的AP1903(实验组)，培养至病毒感染后第12天，检测imCAR T细胞和普通CAR T细胞中CD45RO、CD62L、CCR7的表达，以此评价诱导CAR分子多聚化和CAR分子结构的改变是否会在培养过程中影响T细胞的分化状态。同时，通过PD-1、TIM-3、LAG-3和CD107a(肿瘤细胞刺激后)的检测，来检测CAR分子多聚化是否会在培养过程中改变T细胞的分化状态和耗竭表型。

二、实验结果

图6展示了诱导imCAR分子多聚化阻遏了T细胞耗竭。(A).体外肿瘤细胞刺激诱导CAR T细胞耗竭实验示意图。(B-E).在共培养过程中，加入AP1903对CAR T-19细胞PD-1、TIM-3和LAG-3的表达没有影响，但是会显著降低imCAR T-19细胞中PD-1、TIM-3和LAG-3的表达。(F).在共培养过程中加入AP1903，显著提高了imCAR T-19细胞二次肿瘤刺激时的脱颗粒功能。(G).正常培养至第13天的CAR T-19和imCAR T-19细胞的CD8比例和分化表型没有显著差异。*p≤0.05，**p≤0.01。

可见，通过体外诱导T细胞耗竭实验，证实了诱导CAR分子多聚化可显著阻遏CAR T细胞的耗竭。

试验例6可诱导多聚化的CAR分子的功能研究-炎性因子分泌

一、实验方法

细胞因子的检测方法如下：通过流式分选纯化GFP阳性的CAR T细胞，在培养第10天，对CAR T细胞计数，按照效靶比＝1：2与Nalm6肿瘤细胞共培养，实验组加入终浓度为10nM的AP1903诱导imCAR分子形成多聚体，对照组加入等体积的PBS溶液。在共培养24小时后，离心收集上清液，利用LEGENDplex多因子检测试剂盒，对IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-10、granzyme-B和perforin等因子的水平进行检测。

二、实验结果

图7展示了诱导imCAR分子多聚化改变了因子表达谱。CAR T-19和imCAR T-19细胞与Nalm6按1:2的比例混合培养24小时。多因子检测结果显示，AP1903的加入不会影响CART-19细胞的因子分泌；加入AP1903诱导imCAR19分子多聚化后，细胞因子分泌水平有明显上调，但整体仍显著低于常规CAR T细胞。*p≤0.05，**p≤0.01。

可见，无论是否添加AP1903诱导CAR分子多聚化，imCART-19的因子分泌水平均显著低于常规CAR T细胞。这提示我们imCAR分子可能赋予了CAR T细胞更“节能”的杀瘤模式。此外，我们也同时检测了idCAR T-19的细胞因子分泌，结果显示idCAR T-19的炎性因子分泌水平相较于常规CAR T-19也有显著降低。

试验例7不同结构CAR分子聚合物抗肿瘤疗效研究

一、实验方法

为了筛选效果更佳优异的imCAR19分子，构建了三条包含不同hinge长度的imCAR19分子，以及将FKBPs序列转移到膜内的imCAR19分子。作为对照，也同时构建了不同的idCAR19分子。

通过流式分选纯化GFP阳性的CAR T细胞，在培养第10天，对CAR T细胞计数，按照1:1的效靶比与肿瘤细胞Nalm6共培养，实验组加入终浓度为10nM的AP1903诱导imCAR分子形成多聚体，对照组加入等体积的PBS溶液。在共培养4小时后，利用流式细胞仪检测CD107a的表达量以评价不同CAR T细胞的脱颗粒效应。为检测CAR T细胞的杀伤能力，我们按照1：10的效靶比将CAR T细胞与Nalm6肿瘤细胞共培养24小时后，通过流式对剩余活的Nalm6细胞进行计数，以计算出CAR T细胞对Nalm6细胞的杀伤效率。

表2imCAR19和idCAR19分子的改造类型

组别	hinge区类型
		idCAR19	hinge区完整序列
idCAR19-T1	hinge区截短一半
		idCAR19-T2	hinge区全部截短
idCAR19-IN1	将FKBP序列从膜外转移到膜内4-1BB上游
		imCAR19	hinge区完整序列
imCAR19-T1	hinge区截短一半
		imCAR19-T2	hinge区全部截短
imCAR19-IN1	将FKBP序列从膜外转移到膜内4-1BB上游

二、实验结果

图8展示了不同结构的idCAR19和imCAR19分子的脱颗粒功能检测。(A).在原有idCAR19和imCAR19的基础上，将膜外hinge区截短一半或全部截短，分别构建了idCAR19-T1、idCAR19-T2和imCAR19-T1、imCAR19-T2；将FKBP序列从膜外转移到膜内4-1BB上游，分别构建了idCAR19-IN1和imCAR19-IN1。(B).与Nalm6共培养后，CD107a的检测结果显示：hinge截短一半的结构(idCAR19-T1和imCAR19-T1)具有最佳的脱颗粒功能，hinge区全部截短(idCAR19-T2和imCAR19-T2)会显著降低CAR T细胞的脱颗粒效应。当FKBP序列位于膜外时，加入AP1903诱导CAR分子形成二聚体或多聚体都可以显著提高脱颗粒效应，但是当FKBP位于膜内时，加入AP1903不会产生明显变化。(C).hinge区完全截短对CAR T细胞的杀伤功能影响较大，加入AP1903后idCAR T-19T2、imCAR T-19、imCAR T-19T1和imCAR T-19T2的肿瘤杀伤能力均会得到显著提高。当FKBP序列位于膜内时，加入AP1903反而损害了idCAR T-19IN1的抗瘤功能，对imCAR T-19IN1没有显著影响。**p≤0.01。

试验例8不同结构CAR分子聚合物介导的细胞亲合力研究

利用Lumicks公司的Z-MOVI仪器来检测CAR T细胞与肿瘤细胞之间的亲合力。

一、实验方法

1.用无菌PBS中以1:5稀释浓度为0.01％的多聚赖氨酸(PLL)原液，以获得0.002％的浓度。

2.将80μL 0.002％的PLL溶液加入到玻璃芯片中，室温静置10分钟。随后在37℃的干燥培养箱中静置1小时，并使用注射器每10分钟抽吸一次空气来完全干燥，以确保没有液体残留。

3.将预热的PBS加入芯片中，静置5分钟后移除。此步骤重复3次。

4.收获Nalm6细胞，并用适当体积的完全培养基调整其密度至1.8×10⁸个细胞/mL。

5.往芯片储存器中加入20μL制备的细胞悬浮液后，打开阀门，使细胞进入芯片小室，随后关闭阀门，让细胞沉淀并附着在涂层上。

6.将芯片与细胞在37℃的细胞培养箱中培养0.5小时，使Nalm6细胞完全贴附与玻璃芯片上。

7.随后用完全培养基冲洗未贴附的细胞。

8.在芯片储存室中加入20μL的CAR T细胞，密度为1.8×10⁷。打开阀门使CAR T细胞进入铺被了单层Nalm6细胞的玻璃芯片小室，并开始计时。

9.室温共培养3分钟后，用完全培养基冲洗掉未结合Nalm6细胞的CAR T细胞。随后给与0-1000pN的超声振动力。通过高分辨率相机实时追踪从Nalm6细胞上脱落下来的CAR T细胞。

10.通过绘制CAR T细胞从Nalm6细胞上的脱离曲线和统计给与1000pN超声振动力后仍贴附的CAR T细胞数目，来评价CAR T细胞与肿瘤细胞的亲合力。

二、实验结果

如图9所示，加入AP1903对CAR T-19细胞和Nalm6细胞的亲合力没有显著影响。在无AP1903的条件下，imCAR T-19细胞对Nalm6细胞的亲合力显著低于常规CAR T-19细胞，当加入AP1903时，imCAR T-19细胞对Nalm6细胞的亲合力得到显著提高，并显著高于常规CART-19细胞。(A)原代CAR T细胞(B)过表达CAR分子的Jurkat T细胞。**p≤0.01。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种CAR药物组合物，其特征在于，包括CAR分子、编码CAR分子的多核苷酸、含有编码CAR分子的多核苷酸的载体、含有编码CAR分子的多核苷酸的CAR细胞中的至少一种，以及桥接因子AP1903；

所述CAR分子依次包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；

所述胞外结构域依次包括抗原结合结构域、多聚化/二聚化结构域；

所述多聚化/二聚化结构域与所述跨膜结构域相连；

所述多聚化/二聚化结构域为FKBP多肽；

所述多聚化/二聚化结构域包括至少两个串联重复的多肽片段。

2.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述抗原结合结构域为抗体。

3.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述抗原结合结构域包括抗体片段、单链抗体scFv、di-scFv、Fv、Fab、Fab'、(Fab')2、双抗体、单结构域抗体sdAb或VHH中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述抗原结合结构域为微抗体。

5.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述抗原结合结构域的靶抗原选自：CD19、CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、CD22、CD23、CD28、CD30、CD33、CD35、CD38、CD40、CD42c、CD43、CD44、CD44v6、CD47、CD49D、CD52、CD53、CD56、CD70、CD72、CD73、CD74、CD79A、CD79B、CD80、CD82、CD85A、CD85B、CD85D、CD85H、CD85K、CD96、CD107a、CD112、CD115、CD117、CD120b、CD123、CD146、CD148、CD155、CD185、CD200、CD204、CD221、CD271、CD276、CD279、CD280、CD281、CD301、CD312、CD353、CD362、BCMA、CD16V、CLL-1、TRBC1、TRBC2、CKLF、CLEC2D、EMC10、EphA2、FR-a、FLT3LG、FLT3、Lewis-Y、HLA-G、ICAM5、IGHA1/IgA1、IL-1RAP、IL-17RE、IL-27RA、MILR1、MR1、PSCA、PTCRA、PODXL2、PTPRCAP、ULBP2、AJAP1、ASGR1、CADM1、CADM4、CDH15、CDH23、CDHR5、CELSR3、CSPG4、FAT4、GJA3、GJB2、GPC2、GPC3、IGSF9、LRFN4、LRRN6A/LINGO1、LRRC15、LRRC8E、LRIG1、LGR4、LYPD1、MARVELD2、MEGF10、MPZLI1、MTDH、PANX3、PCDHB6、PCDHB10、PCDHB12、PCDHB13、PCDHB18、PCDHGA3、PEP、SGCB、vezatin、DAGLB、SYT11、WFDC10A、ACVR2A、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶、钙粘素24、DLK1、GFRA2、GFRA3、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EFNB1、EPOR、FGFR2、FGFR4、GALR2、GLG1、GLP1R、HBEGF、IGF2R、UNC5C、VASN、DLL3、FZD10、KREMEN2、TMEM169、TMEM198、NRG1、TMEFF1、ADRA2C、CHRNA1、CHRNB4、CHRNA3、CHRNG、DRD4、GABRB3、GRIN3A、GRIN2C、GRIK4、HTR7、APT8B2、NKAIN1、NKAIN4、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1I、CACNG8、CACNG4、CLCN7、KCNA4、KCNG2、KCNN3、KCNQ2、KCNU1、PKD1L2、PKD2L1、SLC5A8、SLC6A2、SLC6A6、SLC6A11、SLC6A15、SLC7A1、SLC7A5P1、SLC7A6、SLC9A1、SLC10A3、SLC10A4、SLC13A5、SLC16A8、SLC18A1、SLC18A3、SLC19A1、SLC26A10、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A5、SLC35E2、SLC38A6、SLC38A9、SLC39A7、SLC39A8、SLC43A3、TRPM4、TRPV4、TMEM16J、TMEM142B、ADORA2B、BAI1、EDG6、GPR1、GPR26、GPR34、GPR44、GPR56、GPR68、GPR173、GPR175、LGR4、MMD、NTSR2、OPN3、OR2L2、OSTM1、P2RX3、P2RY8、P2RY11、P2RY13、PTGE3、SSTR5、TBXA2R、ADAM22、ADAMTS7、CST11、MMP14、LPPR1、LPPR3、LPPR5、SEMA4A、SEMA6B、ALS2CR4、LEPROTL1、MS4A4A、ROM1、TM4SF5、VANGL1、VANGL2、C18orf1、GSGL1、ITM2A、KIAA1715、LDLRAD3、OZD3、STEAP1、MCAM、CHRNA1、CHRNA3、CHRNA5、CHRNA7、CHRNB4、KIAA1524、NRM.3、RPRM、GRM8、KCNH4、黑皮质素1受体、PTPRH、SDK1、SCN9A、SORCS1、CLSTN2、内皮素转换酶样-1、溶血磷酸受体2、LTB4R、TLR2、嗜中性酪氨酸激酶1、MUC16、B7-H4、ERBB2、HER3、EGFR变体III(EGFRvIII)、HGFR、FOLR1、MSLN、CA-125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、间皮素、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、L1-CAM、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、VEGFR1、VEGFR2、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-α2、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、CA-125、CA-242、Tn、4-1BB、5T4、BAFF、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR1、CCR4、FAP、纤连蛋白外结构域-B(ED-B)、GPNMB、IGF-1受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、ITB5、ITGAX、embigin、PDGF-Rα、ROR1、多配体聚糖1、TAG-72、腱生蛋白C、TRAIL-R1、TRAIL-R2、NKG2D-配体、提呈肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合物MHC分子、PR1/HLA-A2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD24、CD25、CD34、CD80、CD86、CD133、CD138、CD152、CD319、endoglin中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述抗原结合结构域的靶抗原为Igκ。

7.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述抗原结合结构域的靶抗原为唾液酰-Tn。

8.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述跨膜结构域选自CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD4、CD5、CD8、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD134、CD137、CD154、ICOS、OX40、DAP10、DAP12中的一种或多种的跨膜结构域。

9.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述胞内结构域包括共刺激结构域和激活结构域；

所述共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10、DAP12中的至少一种；

所述激活结构域选自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10、DAP12中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述CAR分子还包括铰链结构域，所述铰链结构域设置于多聚化/二聚化结构域与跨膜结构域之间；

所述铰链结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS、CD154中的一种或多种的铰链结构域。

11.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述CAR分子的氨基酸序列包括：

SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、22、23、25、26任一所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述编码CAR分子的核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：

3)与1)或2)中任一所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

13.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述载体选自质粒、细菌、病毒中的至少一种。

14.根据权利要求1所述的CAR药物组合物，其特征在于，所述CAR细胞为免疫细胞；

所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、树突状细胞或巨噬细胞。

15.权利要求1-14中任一项所述CAR药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于预防和/或治疗肺癌、淋巴癌、血癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、骨髓瘤、默克尔细胞癌中的一种。

17.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括权利要求1-14中任一项所述CAR药物组合物，以及药学上可接受的辅料。