CN109485734B

CN109485734B - 一种靶向bcma和cd19的双特异性嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN109485734B
Application number: CN201811645915.2A
Authority: CN
Inventors: 李光超; 郭锦涛; 丁雯; 曾剑华; 罗敏; 莫文俊
Original assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2038-12-30
Also published as: CN109485734A

Abstract

本发明涉及一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域包括抗BCMA和抗CD19的抗原结合域。本发明的嵌合抗原受体有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效缩小实体瘤灶，有效提高肿瘤的治疗效果。

Description

一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用，具体为以特异靶点BCMA和CD19为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

目前，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤的临床试验中已取得了令人欣喜的结果，为CAR技术治疗复发难治性多发性骨髓瘤(MM)带来了曙光。多发性骨髓瘤是一种起源于骨髓中浆细胞的恶性疾病，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。

BCMA(CD269)表达于成熟的B细胞和浆细胞，在MM中也有广泛的表达。针对BCMA的ADC药物(GSK2857916)和双靶向抗体药物(BI836909)现正处于一期临床和临床前研发过程中。目前以B细胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen，BCMA，CD269)为靶点而开发的新一代CAR-T的多个临床试验数据显示，靶向BCMA的CAR-T疗法在多发性骨髓瘤的治疗中取得巨大成功。然而，类似于CD19CAR试验中B细胞急性淋巴细胞白血病复发，BCMA-CAR治疗观察到MM复发，BCMA阳性和BCMA阴性恶性细胞复发。前者表明缺乏效力和持久性，后者表明抗原通过的选择性压力逃逸。

最初认为发性骨髓瘤起源于浆细胞的恶变，免疫学和分子生物学研究提示：多发性骨髓瘤起源于前B细胞恶变，或起源于较前B更早的造血前体细胞的恶变。因此，清除早期起源的恶变的B细胞将极大提高多发性骨髓瘤的治疗效果，延缓复发。此外，多发性骨髓瘤作为B细胞系肿瘤通常不表达CD19，因此CD19不作为多发性骨髓瘤免疫治疗的靶标。然而有一些报告指出，微量的具有耐药性，疾病复发特性的多发性骨髓瘤克隆，具有B细胞表型(即CD19阳性)。去年U Penn和Novartis在NEJM上报道的文章指出，多发性骨髓瘤肿瘤干细胞特性是CD19阳性。一例被报道的多发性骨髓瘤病例中，尽管99.5％的恶性增生的浆细胞上都缺乏CD19的表达，但经过只针对CD19的CAR-T治疗后该患者依旧获得完全治愈。因此，CD19是清除复发、难治和抗药性多发性骨髓瘤细胞的潜在治疗靶标。

采用BCMA抗原作为胞外域用于治疗B细胞相关疾病都有公开，但是抗原结合结构域结合得太强，那么CAR T细胞诱导大规模细胞因子释放，导致视为“细胞因子风暴”的可能致死的免疫反应；但如果抗原结合结构域结合太弱，那么CAR T细胞无法在清除癌细胞方面呈现充足治疗功效。而现有技术中，CN 106687483A公开了人源化抗BCMA嵌合抗原受体治疗癌症，其通过施用表达CAR遗传修饰的T细胞的方法，从而实现治疗与B细胞成熟抗原蛋白(BCMA)的表达相关的疾病。CN 104788573A公开了了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输后，CD19的表达量会降低，容易逃过免疫机制。

因此，制备一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，不仅有效提高T细胞的杀伤作用且能够有效避免靶点逃逸，必能提供多发性骨髓瘤一个更有效的治疗选择。

发明内容

针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体不仅能够有效提高T细胞杀伤信号并且可以有效地避免发生靶点逃逸现象引起的多发性骨髓瘤复发。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，所述包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域包括抗BCMA和抗CD19的抗原结合域。

根据本发明，所述胞外结构域为抗BCMA和抗CD19的单链抗体或抗BCMA和抗CD19的单域抗体，其中，对于抗BCMA抗原结合域和抗CD19抗原结合域的顺序对于嵌合抗原的效果不会造成影响，连接顺序例如可以是抗BCMA抗原结合域-linker-抗CD19抗原结合域，或抗CD19抗原结合域-linker-抗BCMA抗原结合域，这样的顺序的调整都不会对嵌合抗原受体的效果产生影响。

本发明中，发明人发现通过将抗BCMA抗体和抗CD19抗体采用linker连接后，得到的双特异性抗体制备成嵌合抗原受体，不仅能够有效提高T细胞加强杀伤信号，还能有效避免发生靶点逃逸现象，不仅如此，发明人还发现抗BCMA抗原结合域和抗CD19抗原结合域的连接顺序不会对嵌合抗元受体的效果产生影响，本发明中将BCMA-linker-CD19命名为B(G)19，将CD19-linker-BCMA命名为19(G)B。

根据本发明，所述抗BCMA和抗CD19的双特异性抗体中的抗BCMA的抗原结合域和抗CD19的抗原结合域采用linker连接，本申请选用的是(G4S)3linker序列，具体如下：

(G4S)3Linker的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：GGGGSGGGGSGGGGS；

(G4S)3Linker的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)：

GGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGcGGAGGAAGC.

根据本发明，优选地，所述抗BCMA和抗CD19的抗原结合域的氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示，具体序列如下：

BCMA-linker-CD19B(G)19(SEQ ID NO.1)：

DIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT；

CD19-linker-BCMA 19(G)B(SEQ ID NO.2)：

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSS.

优选地，所述抗BCMA和抗CD19的双特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，具体序列如下：

BCMA-linker-CD19B(G)19(SEQ ID NO.3)：

GACATCGTCCTGACCCAGTCACCTGCCAGCCTGGCCGTCAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATTAATTGCCGCGCTAGCGAATCAGTGTCAGTCATCGGCGCTCACCTGATCCACTGGTATCAGCAAAAGCCTGGGCAGCCACCAAAGCTGCTCATCTATCTCGCCTCCAACCTGGAGACAGGCGTGCCTGCTCGCTTTAGTGGTTCTGGTAGCGGCACCGATTTCACCCTGACTATTTCAAGCCTGCAGGCAGAGGACGCAGCCATATACTATTGCCTGCAGTCCCGGATTTTCCCTCGCACATTCGGCCAGGGCACAAAACTGGAAATCAAAGGATCTACCTCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGCGGCGAAGGCTCAACCAAAGGCCAGGTTCAGCTCGTGCAGTCTGGTTCTGAACTGAAGAAACCCGGTGCATCTGTGAAAGTCTCCTGCAAGGCTTCCGGGTATACTTTCACAGACTACAGTATTAATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGATGGATAAACACAGAAACTAGGGAGCCTGCATACGCCTATGATTTCAGAGGTCGCTTCGTGTTCAGTCTGGATACAAGTGTTTCAACAGCCTATCTGCAAATTAGCTCCCTGAAAGCCGAGGACACCGCAGTTTACTACTGTGCACGGGATTATTCTTACGCTATGGACTATTGGGGGCAGGGCACACTCGTGACAGTGTCTAGCGGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGcGGAGGAGGAAGCGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCTCCTTCACAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGAGTGTCTCTGCCAGACTACGGAGTGTCTTGGATCAGACAGCCTCCTAGAAAGGGACTCGAGTGGCTCGGAGTGATTTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTATTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGcGGcAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGCGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGACCACCTCTTCTCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGGCTGCACAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGATTATAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCACA；

CD19-linker-BCMA 19(G)B(SEQ ID NO.4)：

GAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCTCCTTCACAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGAGTGTCTCTGCCAGACTACGGAGTGTCTTGGATCAGACAGCCTCCTAGAAAGGGACTCGAGTGGCTCGGAGTGATTTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTATTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGcGGAGGcGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGCGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGACCACCTCTTCTCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGGCTGCACAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGATTATAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCACAGGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGcGGAGGAAGCGACATCGTCCTGACCCAGTCACCTGCCAGCCTGGCCGTCAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATTAATTGCCGCGCTAGCGAATCAGTGTCAGTCATCGGCGCTCACCTGATCCACTGGTATCAGCAAAAGCCTGGGCAGCCACCAAAGCTGCTCATCTATCTCGCCTCCAACCTGGAGACAGGCGTGCCTGCTCGCTTTAGTGGTTCTGGTAGCGGCACCGATTTCACCCTGACTATTTCAAGCCTGCAGGCAGAGGACGCAGCCATATACTATTGCCTGCAGTCCCGGATTTTCCCTCGCACATTCGGCCAGGGCACAAAACTGGAAATCAAAGGATCTACCTCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGCGGCGAAGGCTCAACCAAAGGCCAGGTTCAGCTCGTGCAGTCTGGTTCTGAACTGAAGAAACCCGGTGCATCTGTGAAAGTCTCCTGCAAGGCTTCCGGGTATACTTTCACAGACTACAGTATTAATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGATGGATAAACACAGAAACTAGGGAGCCTGCATACGCCTATGATTTCAGAGGTCGCTTCGTGTTCAGTCTGGATACAAGTGTTTCAACAGCCTATCTGCAAATTAGCTCCCTGAAAGCCGAGGACACCGCAGTTTACTACTGTGCACGGGATTATTCTTACGCTATGGACTATTGGGGGCAGGGCACACTCGTGACAGTGTCTAGC。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域。

根据本发明，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域。

根据本发明，所述共刺激信号传导结构域为人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人4-1BB胞内区。

根据本发明，所述胞外结构域和跨膜结构域是通过铰链区连接的，所述铰链区包含IgG1铰链区和/或CD8α铰链区。

根据本发明，所述双特异性嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽都是可行的，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，优选为CD8α信号肽或Secretory信号肽。

本发明的双特异性嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子可以为EFα或任何一种高表达的启动子，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，启动子的存在不会对本发明的双特异性嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述双特异性嵌合抗原受体包括信号肽、结合BCMA和CD19抗原的胞外结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。

根据本发明，所述双特异性嵌合抗原受体为CD8α信号肽，结合BCMA和CD19抗原的胞外结构域，CD8α铰链区，CD8α跨膜结构域，4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。

根据本发明，所述双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.5-6所示的序列，所述SEQ ID NO.5-6所示的氨基酸序列具体如下：

B(G)19CAR(SEQ ID NO.5)：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

19(G)B CAR(SEQ ID NO.6)：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGERATINCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAAIYYCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSINWVRQAPGQGLEWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

第二方面，编码如第一方面所述的嵌合抗原受体的核酸。

所述核酸具体如SEQ ID NO.7-8之一所示，具体如下：

B(G)19CAR(SEQ ID NO.7)：

ATGGCACTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTCCCTCTCGCACTCCTGCTGCACGCAGCCCGCCCAGACATCGTCCTGACCCAGTCACCTGCCAGCCTGGCCGTCAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATTAATTGCCGCGCTAGCGAATCAGTGTCAGTCATCGGCGCTCACCTGATCCACTGGTATCAGCAAAAGCCTGGGCAGCCACCAAAGCTGCTCATCTATCTCGCCTCCAACCTGGAGACAGGCGTGCCTGCTCGCTTTAGTGGTTCTGGTAGCGGCACCGATTTCACCCTGACTATTTCAAGCCTGCAGGCAGAGGACGCAGCCATATACTATTGCCTGCAGTCCCGGATTTTCCCTCGCACATTCGGCCAGGGCACAAAACTGGAAATCAAAGGATCTACCTCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGCGGCGAAGGCTCAACCAAAGGCCAGGTTCAGCTCGTGCAGTCTGGTTCTGAACTGAAGAAACCCGGTGCATCTGTGAAAGTCTCCTGCAAGGCTTCCGGGTATACTTTCACAGACTACAGTATTAATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGATGGATAAACACAGAAACTAGGGAGCCTGCATACGCCTATGATTTCAGAGGTCGCTTCGTGTTCAGTCTGGATACAAGTGTTTCAACAGCCTATCTGCAAATTAGCTCCCTGAAAGCCGAGGACACCGCAGTTTACTACTGTGCACGGGATTATTCTTACGCTATGGACTATTGGGGGCAGGGCACACTCGTGACAGTGTCTAGCGGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGcGGAGGAGGAAGCGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCTCCTTCACAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGAGTGTCTCTGCCAGACTACGGAGTGTCTTGGATCAGACAGCCTCCTAGAAAGGGACTCGAGTGGCTCGGAGTGATTTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTATTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGcGGcAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGCGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGACCACCTCTTCTCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGGCTGCACAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGATTATAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCACAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAGCGCGGGAGGAAGAAGCTGCTGTATATCTTCAAACAGCCCTTTATGCGGCCAGTTCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCAGCTGTAGATTTCCAGAAGAGGAGGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTCAAATTTTCACGCTCAGCAGACGCTCCTGCTTACCAACAAGGCCAAAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGTCGCCGGGAGGAATACGACGTTCTGGATAAAAGGCGCGGGAGGGACCCAGAGATGGGTGGCAAGCCCAGGCGCAAGAACCCTCAAGAAGGCCTGTATAACGAGCTGCAGAAAGATAAGATGGCAGAAGCCTACTCTGAAATAGGAATGAAGGGCGAGAGACGGCGCGGAAAGGGCCATGATGGCCTCTACCAGGGACTGTCCACCGCCACAAAAGATACCTACGACGCACTCCATATGCAGGCACTGCCTCCTCGGTAA；

19(G)B CAR(SEQ ID NO.8)：

ATGGCACTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTCCCTCTCGCACTCCTGCTGCACGCAGCCCGCCCAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGACCAGGACTGGTGGCTCCTTCACAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGAGTGTCTCTGCCAGACTACGGAGTGTCTTGGATCAGACAGCCTCCTAGAAAGGGACTCGAGTGGCTCGGAGTGATTTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTATTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGcGGAGGcGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGCGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGACCACCTCTTCTCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGGCTGCACAGCGGAGTGCCTAGCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGATTATAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCACAGGCGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGcGGAGGAAGCGACATCGTCCTGACCCAGTCACCTGCCAGCCTGGCCGTCAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATTAATTGCCGCGCTAGCGAATCAGTGTCAGTCATCGGCGCTCACCTGATCCACTGGTATCAGCAAAAGCCTGGGCAGCCACCAAAGCTGCTCATCTATCTCGCCTCCAACCTGGAGACAGGCGTGCCTGCTCGCTTTAGTGGTTCTGGTAGCGGCACCGATTTCACCCTGACTATTTCAAGCCTGCAGGCAGAGGACGCAGCCATATACTATTGCCTGCAGTCCCGGATTTTCCCTCGCACATTCGGCCAGGGCACAAAACTGGAAATCAAAGGATCTACCTCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGCGGCGAAGGCTCAACCAAAGGCCAGGTTCAGCTCGTGCAGTCTGGTTCTGAACTGAAGAAACCCGGTGCATCTGTGAAAGTCTCCTGCAAGGCTTCCGGGTATACTTTCACAGACTACAGTATTAATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGATGGATAAACACAGAAACTAGGGAGCCTGCATACGCCTATGATTTCAGAGGTCGCTTCGTGTTCAGTCTGGATACAAGTGTTTCAACAGCCTATCTGCAAATTAGCTCCCTGAAAGCCGAGGACACCGCAGTTTACTACTGTGCACGGGATTATTCTTACGCTATGGACTATTGGGGGCAGGGCACACTCGTGACAGTGTCTAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAGCGCGGGAGGAAGAAGCTGCTGTATATCTTCAAACAGCCCTTTATGCGGCCAGTTCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCAGCTGTAGATTTCCAGAAGAGGAGGAAGGAGGATGTGAACTGAGGGTCAAATTTTCACGCTCAGCAGACGCTCCTGCTTACCAACAAGGCCAAAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGTCGCCGGGAGGAATACGACGTTCTGGATAAAAGGCGCGGGAGGGACCCAGAGATGGGTGGCAAGCCCAGGCGCAAGAACCCTCAAGAAGGCCTGTATAACGAGCTGCAGAAAGATAAGATGGCAGAAGCCTACTCTGAAATAGGAATGAAGGGCGAGAGACGGCGCGGAAAGGGCCATGATGGCCTCTACCAGGGACTGTCCACCGCCACAAAAGATACCTACGACGCACTCCATATGCAGGCACTGCCTCCTCGGTAA.

第三方面，本发明提供一种病毒载体，包括第二方面所述的核酸。

根据本发明，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第四方面，本发明提供一种T细胞，采用如第一方面所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体和/或真核表达质粒转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞。

本发明中，所述T细胞具有良好的靶向杀伤作用，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤反应性质。

第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第三方面所述的病毒载体与包装辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第五方面所述的重组慢病毒。

第七方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的病毒载体、如第四方面所述的T细胞、如第五方面所述的重组慢病毒或如第六方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞、免疫细胞或在肿瘤治疗药物中的应用。

根据本发明，所述肿瘤为B细胞肿瘤，优选为多发性骨髓瘤、B细胞白血病和B细胞淋巴瘤。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过将嵌合抗原受体中的胞外结构域设置为抗BCMA和抗CD19的抗原结合域，不仅能够有效提高T细胞加强杀伤信号，还能有效避免发生靶点逃逸现象，从而延缓肿瘤复发；

(2)本发明的双特异性嵌合抗原受体表达阳性率为26.98％和17.99％，有效杀伤表达CD19和/或BCMA的细胞，而对双阴性细胞K562无杀伤作用，具有高的专一性和良好的治疗效果。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的序列示意图；

图2(a)为慢病毒表达载体pLVX-BCMA CAR元件示意图，图2(b)为慢病毒表达载体pLVX-BCMA CAR质粒图谱；

图3(a)为慢病毒表达载体pLVX-CD19CAR元件示意图，图3(b)为慢病毒表达载体pLVX-CD19CAR质粒图谱；

图4(a)为慢病毒表达载体pLVX-B(G)19CAR元件示意图，图4(b)为慢病毒表达载体pLVX-B(G)19CAR质粒图谱；

图5(a)为慢病毒表达载体pLVX-19(G)B CAR元件示意图，图5(b)为慢病毒表达载体pLVX-19(G)B CAR质粒图谱；

图6为流式检测K562细胞表达CAR-T的情况结果图，其中，图6(a)为K562细胞表达BCMA-CAR的结果，图6(b)为K562细胞表达CD19-CAR的结果；

图7为Daudi和Jurkat细胞表达CAR-T的情况结果图其中，图7(a)为Daudi细胞表达BCMA-CAR的结果，图7(b)为Daudi细胞表达CD19-CAR的结果，图7(c)为Jurkat细胞表达BCMA-CAR的结果，图7(d)为Jurkat细胞表达CD19-CAR的结果；

图8为流式检测BCMA CAR的表达，其中纵坐标为FITC标记的人BCMA蛋白；

图9为流式检测CD19CAR的表达，其中纵坐标为FITC标记的人CD19蛋白；

图10为CART与检测细胞共培养后上清中IFN-gama的分泌结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的设计

本实施例构建了抗BCMA和抗CD19的双特异性嵌合抗原受体(B(G)19和19(G)B)、抗BCMA的嵌合抗原受体和抗CD19的嵌合抗原受体，序列示意图如图1所示，该嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列(Leader)，与BCMA和CD19抗原特异性结合的双特异性抗体序列、抗BCMA的单域抗体和抗CD19的单域抗体，CD8α的铰链区(Hinge)和跨膜区序列(Transmembrane)，4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列，具体各部分序列如下：

CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：MALPVTALLLPLALLLHAARP；

CD8α信号肽(leader)的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)：

ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCACGCCCT；

CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；

CD8α铰链区(hinge)的核苷酸序列(SEQ ID NO.14)：

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；

CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列(SEQ ID NO.15)：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

CD8α跨膜区(TM)的核苷酸序列(SEQ ID NO.16)：

ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC；

4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列(SEQ ID NO.17)：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

4-1BB胞内共刺激域(ICD)的核苷酸序列(SEQ ID NO.18)：

AAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTG；

CD3ζ信号传导域的氨基酸序列(SEQ ID NO.19)：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

CD3ζ信号传导域的核苷酸序列(SEQ ID NO.20)：

AGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGG.

实施例2：构建抗BCMA的嵌合抗原受体表达载体

(1)全基因合成B(G)19CAR、19(G)B CAR、BCMA CAR和CD19CAR序列，用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR和空载体，于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；

(2)pLVX-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接：

连接体系如下：

于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。

抗BCMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-BCMA CAR的元件见图2(a)，载体图谱见图2(b)；抗CD19的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-CD19CAR的元件见图3(a)，载体图谱见图3(b)；抗BCMA和抗CD19的双特异性嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-B(G)19CAR的元件见图4(a)，载体图谱见图4(b)；抗CD19和抗BCMA的双特异性嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-19(G)B CAR的元件见图5(a)，载体图谱见图5(b)。

实施例3：慢病毒包装

分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：

(1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，总质量为10μg；

(2)将上述质粒加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养6h；

(3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。

实施例4：CAR-T细胞的扩增

每位志愿者采30ml的全血，将外周血与生理盐水1:1进行稀释，在离心管内加入Ficoll，缓缓加入稀释后的外周血，1500rpm离心30min轻轻吸取PBMC层移入另一离心管内；

用生理盐水洗涤PBMC多次，转入X-VIVO培养基(含50ng/mL的OKT3，300IU/mL的IL-2)中进行培养，PBMC分离后，需要用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养，而后每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持在0.5×10⁶-1×10⁶/mL，连续观察10天。

通过流式细胞仪检测K562细胞中CAR的表达，结果如图6所示，从图6(a)和图6(b)可以看出，K562细胞是BCMA和CD19双阴性细胞；K562-BCMA稳转细胞系的BCMA表达百分数为99.2％；K562-CD19稳转细胞系的CD19表达百分数为100％。

通过流式细胞仪检测Daudi和Jurkat细胞中CAR的表达，结果如图7所示，从图7(a)和图7(b)可以看出，Daudi细胞同时表达CD19和BCMA，表达99.7％BCMA和100％CD19，从图7(c)和图7(d)可以看出，Jurkat细胞同时表达CD19和BCMA，表达99.5％BCMA和100％CD19。

实施例5：慢病毒感染T细胞

利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000g，离心2h；弃上清，加入1×10⁶的T细胞(CD3阳性>90％)，1000g，离心10min，于37℃、5％CO₂和一定湿度的细胞培养箱内培养，第二日重复上述过程。

感染5天后测定CAR的表达，利用FITC-Labeled Human BCMA(货号BCA-HF2H1，Acrobiosystems)与抗BCMA抗体scFv(αBCMA)的结合，通过流式细胞仪检测CAR的表达，结果如图8所示；从图8的结果显示，BCMA CAR的表达阳性率为8.93％，19(G)B CAR的表达阳性率为31.88％，B(G)19CAR的表达阳性率为35.53％，T mock细胞(未转染的T细胞)和CD19CAR-T细胞不表达BCMA CAR。

同样利用FITC-Labeled Human CD19(20-291)Protein,Fc Tag(货号CD9-HF251，Acrobiosystems)与抗CD19抗体scFv(来源于FMC63克隆，αCD19)的结合，通过流式细胞仪检测CAR的表达，结果如图9所示；从图9的结果显示，CD19CAR的表达阳性率为65.15％，19(G)BCAR的表达阳性率为26.98％，B(G)19CAR的表达阳性率为17.99％，T mock细胞(未转染的T细胞)和BCMA CAR细胞不表达CD19CAR。

实施例6：ELISA检测细胞系与CAR-T细胞共培养上清中IFN-γ的水平

分别将K562、K562-CD19(稳定表达CD19的K562细胞)，K562-BCMA(稳定表达BCMA的K562细胞)和RPMI 8226细胞按照5×105细胞/孔接种24孔板。按每孔5×105细胞分别加入CAR-T、未转染的T细胞(T mock)细胞，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12小时后；采用人IL-2、IFN-γELISA检测试剂盒(欣博盛生物)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)，结果如图10所示。

从图10可以看出，BCMA CAR-T细胞与BCMA阳性的细胞(K562-BCMA,Daudi和Jurkat)共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较BCMA阴性细胞(K562和K562-CD19)组有显著性升高；CD19CAR-T细胞与CD19阳性的细胞(K562-CD19,Daudi和Jurkat)共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较CD19阴性细胞(K562和K562-BCMA)有显著性升高，双特异性CAR-T细胞B(G)19和19(B)与CD19和BCMA单阳性或双阳性靶细胞共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较双阴性细胞K562显著性升高。

综上所述，BCMA CAR-T细胞能特异性的杀伤BCMA阳性的细胞(K562-BCMA,Daudi和Jurkat)，而对BCMA阴性细胞(K562和K562-CD19)几乎没有杀伤能力。此外，CD19CAR-T细胞能特异性的杀伤CD19阳性的细胞(K562-CD19,Daudi和Jurkat)，而对CD19阴性细胞(K562和K562-BCMA)几乎没有杀伤能力，而本申请的双特异性CAR-T细胞B(G)19和19(B)能够有效杀伤表达CD19和/或BCMA的细胞，而对双阴性细胞K562无杀伤作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用

<130> 2018

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile

20 25 30

Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp

180 185 190

Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

260 265 270

Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

275 280 285

Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys

325 330 335

Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala

340 345 350

Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met

355 360 365

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

385 390 395 400

Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

405 410 415

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr

420 425 430

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser

435 440 445

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

450 455 460

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala

465 470 475 480

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

485 490 495

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

500

<210> 2

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

165 170 175

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

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Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

260 265 270

Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val

275 280 285

Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

290 295 300

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro

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Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

325 330 335

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser

340 345 350

Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

355 360 365

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

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Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro

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Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

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420 425 430

Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr

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Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr

450 455 460

Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

485 490 495

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

500

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

gacatcgtcc tgacccagtc acctgccagc ctggccgtca gcctgggcga gagagccacc 60

attaattgcc gcgctagcga atcagtgtca gtcatcggcg ctcacctgat ccactggtat 120

cagcaaaagc ctgggcagcc accaaagctg ctcatctatc tcgcctccaa cctggagaca 180

ggcgtgcctg ctcgctttag tggttctggt agcggcaccg atttcaccct gactatttca 240

agcctgcagg cagaggacgc agccatatac tattgcctgc agtcccggat tttccctcgc 300

acattcggcc agggcacaaa actggaaatc aaaggatcta cctccggctc cgggaagccc 360

ggaagcggcg aaggctcaac caaaggccag gttcagctcg tgcagtctgg ttctgaactg 420

aagaaacccg gtgcatctgt gaaagtctcc tgcaaggctt ccgggtatac tttcacagac 480

tacagtatta attgggttcg ccaagctcct ggacagggac tggagtggat gggatggata 540

aacacagaaa ctagggagcc tgcatacgcc tatgatttca gaggtcgctt cgtgttcagt 600

ctggatacaa gtgtttcaac agcctatctg caaattagct ccctgaaagc cgaggacacc 660

gcagtttact actgtgcacg ggattattct tacgctatgg actattgggg gcagggcaca 720

ctcgtgacag tgtctagcgg cggcggagga tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga 780

agcgaagtga agctgcagga gagcggacca ggactggtgg ctccttcaca gtctctgagc 840

gtgacctgta ccgtgtccgg agtgtctctg ccagactacg gagtgtcttg gatcagacag 900

cctcctagaa agggactcga gtggctcgga gtgatttggg gcagcgagac cacctactac 960

aacagcgccc tgaagagcag gctgaccatc atcaaggaca acagcaagag ccaggtgttc 1020

ctgaagatga acagcctgca gaccgacgac accgccatct actactgcgc caagcactac 1080

tactacggcg gcagctacgc catggactat tggggacagg gcaccagcgt gacagtgtct 1140

agcggaggag gcggcagcgg aggaggagga tctggaggag gcggcagcga tattcagatg 1200

acccagacca cctcttctct gagcgccagc ctgggcgaca gagtgaccat ctcttgcagg 1260

gccagccagg acatcagcaa gtacctgaat tggtaccagc agaagcccga cggcaccgtg 1320

aagctgctga tctaccacac cagcaggctg cacagcggag tgcctagcag attcagcgga 1380

agcggcagcg gcacagatta tagcctgacc atcagcaacc tggagcagga ggacatcgcc 1440

acctactttt gccagcaggg caacaccctg ccttacacct ttggcggagg caccaagctg 1500

gagatcaca 1509

<210> 4

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

gaagtgaagc tgcaggagag cggaccagga ctggtggctc cttcacagtc tctgagcgtg 60

acctgtaccg tgtccggagt gtctctgcca gactacggag tgtcttggat cagacagcct 120

cctagaaagg gactcgagtg gctcggagtg atttggggca gcgagaccac ctactacaac 180

agcgccctga agagcaggct gaccatcatc aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcctg 240

aagatgaaca gcctgcagac cgacgacacc gccatctact actgcgccaa gcactactac 300

tacggcggca gctacgccat ggactattgg ggacagggca ccagcgtgac agtgtctagc 360

ggcggaggcg gaagcggagg aggaggatct ggaggaggcg gcagcgatat tcagatgacc 420

cagaccacct cttctctgag cgccagcctg ggcgacagag tgaccatctc ttgcagggcc 480

agccaggaca tcagcaagta cctgaattgg taccagcaga agcccgacgg caccgtgaag 540

ctgctgatct accacaccag caggctgcac agcggagtgc ctagcagatt cagcggaagc 600

ggcagcggca cagattatag cctgaccatc agcaacctgg agcaggagga catcgccacc 660

tacttttgcc agcagggcaa caccctgcct tacacctttg gcggaggcac caagctggag 720

atcacaggcg gcggaggatc tggaggagga ggaagcggag gcggaggaag cgacatcgtc 780

ctgacccagt cacctgccag cctggccgtc agcctgggcg agagagccac cattaattgc 840

cgcgctagcg aatcagtgtc agtcatcggc gctcacctga tccactggta tcagcaaaag 900

cctgggcagc caccaaagct gctcatctat ctcgcctcca acctggagac aggcgtgcct 960

gctcgcttta gtggttctgg tagcggcacc gatttcaccc tgactatttc aagcctgcag 1020

gcagaggacg cagccatata ctattgcctg cagtcccgga ttttccctcg cacattcggc 1080

cagggcacaa aactggaaat caaaggatct acctccggct ccgggaagcc cggaagcggc 1140

gaaggctcaa ccaaaggcca ggttcagctc gtgcagtctg gttctgaact gaagaaaccc 1200

ggtgcatctg tgaaagtctc ctgcaaggct tccgggtata ctttcacaga ctacagtatt 1260

aattgggttc gccaagctcc tggacaggga ctggagtgga tgggatggat aaacacagaa 1320

actagggagc ctgcatacgc ctatgatttc agaggtcgct tcgtgttcag tctggataca 1380

agtgtttcaa cagcctatct gcaaattagc tccctgaaag ccgaggacac cgcagtttac 1440

tactgtgcac gggattattc ttacgctatg gactattggg ggcagggcac actcgtgaca 1500

gtgtctagc 1509

<210> 5

<211> 747

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu

20 25 30

Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu

35 40 45

Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr

100 105 110

Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

130 135 140

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu

145 150 155 160

Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro

195 200 205

Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr

210 215 220

Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

275 280 285

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

290 295 300

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

305 310 315 320

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

325 330 335

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

340 345 350

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

355 360 365

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

370 375 380

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

385 390 395 400

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu

420 425 430

Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys

435 440 445

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu

450 455 460

Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

465 470 475 480

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

485 490 495

Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro

500 505 510

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Thr Thr Pro

515 520 525

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

530 535 540

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

545 550 555 560

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

565 570 575

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

580 585 590

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

595 600 605

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

610 615 620

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

625 630 635 640

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

645 650 655

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

660 665 670

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

675 680 685

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

690 695 700

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

705 710 715 720

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

725 730 735

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

740 745

<210> 6

<211> 747

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

35 40 45

Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala

100 105 110

Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

145 150 155 160

Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

165 170 175

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser

195 200 205

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

275 280 285

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser

290 295 300

Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln

305 310 315 320

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu

325 330 335

Glu Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

340 345 350

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr

355 360 365

Tyr Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser

385 390 395 400

Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser

405 410 415

Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

420 425 430

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

435 440 445

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu

450 455 460

Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp

465 470 475 480

Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu

485 490 495

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp

500 505 510

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro

515 520 525

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

530 535 540

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

545 550 555 560

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

565 570 575

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

580 585 590

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

595 600 605

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

610 615 620

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

625 630 635 640

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

645 650 655

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

660 665 670

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

675 680 685

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

690 695 700

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

705 710 715 720

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

725 730 735

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

740 745

<210> 7

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

atggcactgc ctgtgactgc cctgctgctc cctctcgcac tcctgctgca cgcagcccgc 60

ccagacatcg tcctgaccca gtcacctgcc agcctggccg tcagcctggg cgagagagcc 120

accattaatt gccgcgctag cgaatcagtg tcagtcatcg gcgctcacct gatccactgg 180

tatcagcaaa agcctgggca gccaccaaag ctgctcatct atctcgcctc caacctggag 240

acaggcgtgc ctgctcgctt tagtggttct ggtagcggca ccgatttcac cctgactatt 300

tcaagcctgc aggcagagga cgcagccata tactattgcc tgcagtcccg gattttccct 360

cgcacattcg gccagggcac aaaactggaa atcaaaggat ctacctccgg ctccgggaag 420

cccggaagcg gcgaaggctc aaccaaaggc caggttcagc tcgtgcagtc tggttctgaa 480

ctgaagaaac ccggtgcatc tgtgaaagtc tcctgcaagg cttccgggta tactttcaca 540

gactacagta ttaattgggt tcgccaagct cctggacagg gactggagtg gatgggatgg 600

ataaacacag aaactaggga gcctgcatac gcctatgatt tcagaggtcg cttcgtgttc 660

agtctggata caagtgtttc aacagcctat ctgcaaatta gctccctgaa agccgaggac 720

accgcagttt actactgtgc acgggattat tcttacgcta tggactattg ggggcagggc 780

acactcgtga cagtgtctag cggcggcgga ggatctggag gaggaggaag cggcggagga 840

ggaagcgaag tgaagctgca ggagagcgga ccaggactgg tggctccttc acagtctctg 900

agcgtgacct gtaccgtgtc cggagtgtct ctgccagact acggagtgtc ttggatcaga 960

cagcctccta gaaagggact cgagtggctc ggagtgattt ggggcagcga gaccacctac 1020

tacaacagcg ccctgaagag caggctgacc atcatcaagg acaacagcaa gagccaggtg 1080

ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac gacaccgcca tctactactg cgccaagcac 1140

tactactacg gcggcagcta cgccatggac tattggggac agggcaccag cgtgacagtg 1200

tctagcggag gaggcggcag cggaggagga ggatctggag gaggcggcag cgatattcag 1260

atgacccaga ccacctcttc tctgagcgcc agcctgggcg acagagtgac catctcttgc 1320

agggccagcc aggacatcag caagtacctg aattggtacc agcagaagcc cgacggcacc 1380

gtgaagctgc tgatctacca caccagcagg ctgcacagcg gagtgcctag cagattcagc 1440

ggaagcggca gcggcacaga ttatagcctg accatcagca acctggagca ggaggacatc 1500

gccacctact tttgccagca gggcaacacc ctgccttaca cctttggcgg aggcaccaag 1560

ctggagatca caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 1620

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 1680

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1740

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca agcgcgggag gaagaagctg 1800

ctgtatatct tcaaacagcc ctttatgcgg ccagttcaga ccacacaaga ggaagatggc 1860

tgcagctgta gatttccaga agaggaggaa ggaggatgtg aactgagggt caaattttca 1920

cgctcagcag acgctcctgc ttaccaacaa ggccaaaatc agctgtacaa cgagctgaat 1980

ctgggtcgcc gggaggaata cgacgttctg gataaaaggc gcgggaggga cccagagatg 2040

ggtggcaagc ccaggcgcaa gaaccctcaa gaaggcctgt ataacgagct gcagaaagat 2100

aagatggcag aagcctactc tgaaatagga atgaagggcg agagacggcg cggaaagggc 2160

catgatggcc tctaccaggg actgtccacc gccacaaaag atacctacga cgcactccat 2220

atgcaggcac tgcctcctcg gtaa 2244

<210> 8

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

atggcactgc ctgtgactgc cctgctgctc cctctcgcac tcctgctgca cgcagcccgc 60

ccagaagtga agctgcagga gagcggacca ggactggtgg ctccttcaca gtctctgagc 120

gtgacctgta ccgtgtccgg agtgtctctg ccagactacg gagtgtcttg gatcagacag 180

cctcctagaa agggactcga gtggctcgga gtgatttggg gcagcgagac cacctactac 240

aacagcgccc tgaagagcag gctgaccatc atcaaggaca acagcaagag ccaggtgttc 300

ctgaagatga acagcctgca gaccgacgac accgccatct actactgcgc caagcactac 360

tactacggcg gcagctacgc catggactat tggggacagg gcaccagcgt gacagtgtct 420

agcggcggag gcggaagcgg aggaggagga tctggaggag gcggcagcga tattcagatg 480

acccagacca cctcttctct gagcgccagc ctgggcgaca gagtgaccat ctcttgcagg 540

gccagccagg acatcagcaa gtacctgaat tggtaccagc agaagcccga cggcaccgtg 600

aagctgctga tctaccacac cagcaggctg cacagcggag tgcctagcag attcagcgga 660

agcggcagcg gcacagatta tagcctgacc atcagcaacc tggagcagga ggacatcgcc 720

acctactttt gccagcaggg caacaccctg ccttacacct ttggcggagg caccaagctg 780

gagatcacag gcggcggagg atctggagga ggaggaagcg gaggcggagg aagcgacatc 840

gtcctgaccc agtcacctgc cagcctggcc gtcagcctgg gcgagagagc caccattaat 900

tgccgcgcta gcgaatcagt gtcagtcatc ggcgctcacc tgatccactg gtatcagcaa 960

aagcctgggc agccaccaaa gctgctcatc tatctcgcct ccaacctgga gacaggcgtg 1020

cctgctcgct ttagtggttc tggtagcggc accgatttca ccctgactat ttcaagcctg 1080

caggcagagg acgcagccat atactattgc ctgcagtccc ggattttccc tcgcacattc 1140

ggccagggca caaaactgga aatcaaagga tctacctccg gctccgggaa gcccggaagc 1200

ggcgaaggct caaccaaagg ccaggttcag ctcgtgcagt ctggttctga actgaagaaa 1260

cccggtgcat ctgtgaaagt ctcctgcaag gcttccgggt atactttcac agactacagt 1320

attaattggg ttcgccaagc tcctggacag ggactggagt ggatgggatg gataaacaca 1380

gaaactaggg agcctgcata cgcctatgat ttcagaggtc gcttcgtgtt cagtctggat 1440

acaagtgttt caacagccta tctgcaaatt agctccctga aagccgagga caccgcagtt 1500

tactactgtg cacgggatta ttcttacgct atggactatt gggggcaggg cacactcgtg 1560

acagtgtcta gcaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 1620

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 1680

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1740

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca agcgcgggag gaagaagctg 1800

ctgtatatct tcaaacagcc ctttatgcgg ccagttcaga ccacacaaga ggaagatggc 1860

tgcagctgta gatttccaga agaggaggaa ggaggatgtg aactgagggt caaattttca 1920

cgctcagcag acgctcctgc ttaccaacaa ggccaaaatc agctgtacaa cgagctgaat 1980

ctgggtcgcc gggaggaata cgacgttctg gataaaaggc gcgggaggga cccagagatg 2040

ggtggcaagc ccaggcgcaa gaaccctcaa gaaggcctgt ataacgagct gcagaaagat 2100

aagatggcag aagcctactc tgaaatagga atgaagggcg agagacggcg cggaaagggc 2160

catgatggcc tctaccaggg actgtccacc gccacaaaag atacctacga cgcactccat 2220

atgcaggcac tgcctcctcg gtaa 2244

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

ggcggcggag gatctggagg aggaggaagc ggaggcggag gaagc 45

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

atggcactgc cagtgacagc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcacgc 60

cct 63

<210> 13

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 13

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 14

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 15

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 15

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 16

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 17

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 17

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 18

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 18

aagagaggca ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60

acaacccagg aggaggacgg ctgcagctgt cggttcccag aggaggagga gggaggatgt 120

gagctg 126

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 19

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 20

agggtgaagt tttctcggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 120

agagatcccg agatgggagg caagccaagg aggaagaacc ctcaggaggg cctgtataat 180

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tactctgaga tcggcatgaa gggagagcgg 240

agaaggggca agggacacga tggcctgtat cagggcctga gcacagccac caaggacacc 300

tacgatgcac tgcacatgca ggccctgcca cctagg 336

Claims

1.一种靶向BCMA和CD19的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述双特异性嵌合抗原受体为CD8α信号肽，结合BCMA和CD19抗原的胞外结构域，CD8α铰链区，CD8α跨膜结构域，4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成；

所述双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-6之一所示。

2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述结合BCMA和CD19抗原的胞外结构域的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.编码如权利要求1或2所述的双特异性嵌合抗原受体的核酸。

4.一种病毒载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体。

6.根据权利要求5所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。

7.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞转染有编码如权利要求1或2所述的双特异性嵌合抗原受体的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的T细胞，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体和/或真核表达质粒转染到T细胞。

9.根据权利要求8所述的T细胞，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体转染到T细胞。

10.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求4-6任一项所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

11.根据权利要求10所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

12.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1或2所述的双特异性嵌合抗原受体和/或如权利要求10或11所述的重组慢病毒。

13.如权利要求1或2所述的双特异性嵌合抗原受体、如权利要求10或11所述的重组慢病毒或如权利要求12所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞或在制备B细胞肿瘤治疗药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、B细胞白血病和B细胞淋巴瘤。