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CN113474012B - Epcam抗体和epcam-car-t细胞 - Google Patents

Epcam抗体和epcam-car-t细胞 Download PDF

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CN113474012B CN202080010959.7A CN202080010959A CN113474012B CN 113474012 B CN113474012 B CN 113474012B CN 202080010959 A CN202080010959 A CN 202080010959A CN 113474012 B CN113474012 B CN 113474012B
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Abstract

本发明涉及人源化单克隆抗人EpCAM抗体，例如单链可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:4的氨基酸的VL。本发明还涉及嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包括：(i)本发明的单链可变片段(scFv)、(ii)跨膜结构域、(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。

Description

EPCAM抗体和EPCAM-CAR-T细胞
序列表、表格或计算机程序的引用
序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2020年1月22日，并且大小为18.5千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并在此通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明涉及人源化EpCAM抗体和EpCAM-CAR-T细胞，其可用于肿瘤的过继性免疫基因治疗领域。
背景技术
免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)构建体对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的最常见方法。可以将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞注入到患者体内(称为过继性细胞转移或ACT)，其代表一种有效的免疫治疗方法[1，2]。与化学疗法或抗体相比，CAR-T技术的优点在于，重编程改造的T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“一种活的药物”)[1，2]。
CAR通常由以下组成：在N末端部分的单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域、以及与激活CD3-ζ结构域串联的若干个胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4-1BB)、CD27或其它共刺激结构域。(图1)[3]。CAR的演变从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)再到第三代CAR(具有若干个共刺激结构域)。生成具有多重共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)使得CAR-T细胞杀伤活性增加，并改善了CAR-T细胞持久性，从而增强了其抗肿瘤活性。
图1显示了CAR的结构。左图显示了第一代CAR(无共刺激结构域)的结构。中图显示了第二代CAR(一个共刺激结构域)的结构。右图显示了第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)[3]。
EpCAM
EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule(上皮细胞粘附分子))(CD326)抗原是一种39-40kDa的细胞表面糖蛋白，其由EpCAM基因编码。EpCAM在细胞粘附、生长、增殖、炎症、癌症和转移中起关键作用。它在多种类型的肿瘤中是高度过表达的：在乳腺癌中35.6％；在卵巢癌中69％；在非小肺癌中86％；在结肠直肠癌中>86％。EpCAM在许多正常组织中均有表达，但在肿瘤组织中的表达显著更高。最近用siRNA、单克隆抗EpCAM抗体、双特异性抗体和CAR-T细胞证实了靶向EpCAM。
人EpCAM蛋白由314个氨基酸组成：24-265，胞外结构域；266-288，跨膜结构域；289-314，细胞质结构域。EpCAM涉及WNT、ERK、AKT存活信号传导，并且在运动、增殖和细胞生长中起作用。EpCAM也是循环肿瘤细胞和癌症干细胞的标志物。
附图说明
图1显示了CAR的结构。左图显示了第一代CAR(无共刺激结构域)的结构。中图显示了第二代CAR(一个共刺激结构域)的结构。右图显示了第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)[3]。
图2显示了EpCAM CAR构建体的结构。使用第二代CAR。
图3显示了25.4％的人源化EpCAM-CAR-T细胞(CD28共刺激，实施例2，PMC 306)对抗人F(ab)2呈阳性，而23％的人源化EpCAM-CAR-T细胞对抗小鼠F(ab)2呈阳性。
图4显示了35.2％的人源化EpCAM-CAR-T细胞(4-1BB共刺激，实施例3，PMC 710)对抗小鼠F(ab)2呈阳性。
图5显示了小鼠EpCAM-CAR-T细胞具有EpCAM的低表达，并且仅2.23％的小鼠EpCAM-CAR-T细胞通过抗小鼠F(ab)2检测到。
图6A证实了人源化EpCAM-CAR细胞对结肠直肠癌(HT29细胞)的高细胞毒性。
图6B证实了人源化EpCAM-CAR细胞对结肠癌(Lovo细胞)的细胞毒性。
图6C证实了人源化EpCAM-CAR细胞对卵巢癌(OVCAR-3细胞)的高细胞毒性。
图6D证实了人源化EpCAM-CAR细胞对宫颈癌(Hela细胞)的细胞毒性。
图6E证实了人源化EpCAM-CAR细胞对乳腺癌(SKBR-3细胞)的细胞毒性。
图7比较了人源化EpCAM-CAR-T细胞(PMC376)和小鼠EpCAM-CAR-T细胞在Lovo靶细胞中的细胞毒性。
图8显示了人源化EpCAM-CAR(PMC376)针对HT29、Lovo-1、OVCAR-3和SKBR3细胞分泌高水平的IFN-γ。完成了三次独立的实验。
图9A-9B显示了人源化EpCAM-CAR-T细胞(PMC376)显著降低了Lovo-1肿瘤体积(9A)和肿瘤重量(9B)。p<0.05：在图9A和9B中均为EpCAM-CAR-T细胞(新鲜和冷冻的)相对于PBS和T细胞。
图10显示了用人源化EpCAM-CAR-T细胞治疗的小鼠并未降低体重。
具体实施方式
定义
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种受体蛋白，其已进行改造以给予T细胞靶向特异性蛋白的新能力。该受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能组合到单个受体内。CAR是一种融合蛋白，其包含能够与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T小体(T-body)”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够与抗原结合的胞外结构域”意指可以与某种抗原结合的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”意指已知作为结构域起作用的任何寡肽或多肽，其通过传递信号以激活或抑制细胞中的生物过程。
如本文所用，“CDR”是抗体的VH或VL链的互补决定区，其对于与抗原的结合而言至关重要。
如本文所用，“结构域”意指多肽中的一个区域，其独立于其它区域而折叠成特定结构。
如本文所用，“人源化抗体”是衍生自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人体中天然产生的抗体变体的相似性。例如，小鼠抗体开发出来后，可以对编码该抗体的DNA进行测序。然后可以确定对应于抗体CDRs的DNA序列。可以将CDR序列插入含有人抗体变体的DNA的构建体内，以制备人源化抗体。
如本文所用，“单链可变片段(scFv)”意指衍生自保留结合抗原能力的抗体的单链多肽。scFv的例子包括如下所述的抗体多肽，其通过重组DNA技术形成，并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列相连接。用于改造scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，“肿瘤抗原”意指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
本发明人已从衍生自杂交瘤细胞系AUA1 Ab的小鼠单克隆抗体的重链和轻链可变区开始，设计人源化EpCAM scFv[4，5]。本发明人已制备了基于人源化EpCAM抗体的EpCAM-CAR-T细胞，以靶向过表达EpCAM肿瘤抗原的癌细胞。本发明的EpCAM-CAR-T细胞针对多种癌细胞系具有高细胞毒性。
本发明涉及人源化抗人EpCAM抗体，其包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:4的氨基酸的VL。
在一个实施方案中，人源化抗人EpCAM抗体是单链可变片段(scFv)。ScFv可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。
本发明还涉及嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包括：(i)靶向EpCAM的单链可变片段(scFv)，其中VH具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO:4的氨基酸，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。
在一个实施方案中，CAR结构如图2所示。
在一个实施方案中，共刺激结构域选自由CD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40和DAP10组成的组。优选的共刺激结构域是CD28或4-1BB。
优选的激活结构域是CD3ζ(CD3 Z或CD3 zeta)。
跨膜结构域可以衍生自天然多肽，或者可以是人工设计的。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以来自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包括诸如亮氨酸和缬氨酸疏水性残基的多肽。优选在合成跨膜结构域的每一端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。可选地，短的寡肽接头或多肽接头(例如长度为2-10个氨基酸的接头)可以置于跨膜结构域和胞内结构域之间。在一个实施方案中，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。
本发明提供了编码EpCAM-CAR的核酸。编码CAR的核酸可以通过常规方法，由指定CAR的氨基酸序列进行制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以得自关于每个结构域的氨基酸序列的上述NCBI RefSeq ID或GenBank登录号，并且本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序进行制备。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，并且通过使用聚合酶链反应(PCR)，将得自cDNA文库的DNA片段结合，可以制备本发明的核酸。
可以将编码本发明的CAR的核酸插入载体内，并且可以将载体导入细胞内。例如，可以使用病毒载体，例如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。优选使用缺乏复制能力从而不能在受感染细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可以基于由载体所具有的LTR序列和包装信号序列来选择合适的包装细胞，并使用该包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的例子包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可以用于包装逆转录病毒载体的包装细胞生产的多种逆转录病毒载体，可以从许多公司广泛商购得。
CAR-T细胞经由CAR与特异性抗原结合，将信号传递到细胞内，由此激活细胞。表达CAR的细胞的激活根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖率的改善、细胞表面因子中的变化等等作为指标进行确认。例如，从激活细胞中释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)会破坏表达抗原的靶细胞。另外，细胞因子的释放或细胞表面分子中的变化刺激其它免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。
表达CAR的细胞可以用作疾病的治疗剂。治疗剂包括表达CAR的细胞作为活性成分，并且它可以进一步包含合适的赋形剂。
本发明人已制备了人源化抗人EpCAM抗体并对其进行表征。本文的人源化抗人EpCAM抗体对人EpCAM显示出选择性和高亲和力，并且它用于构建单链可变片段(scFv)。本发明人将EpCAM scFv插入第二代CAR内，以生成CAR-T细胞。EpCAM-CAR-T细胞对EpCAM阳性癌细胞呈现出比对未转导的T细胞和模拟CAR-T细胞更高的细胞毒性。
本发明的人源化EpCAM-CAR-T细胞针对EpCAM阳性癌细胞分泌高水平的IFN-γ；通过细胞毒性测定，它们对具有EpCAM过表达的靶癌细胞呈阳性。本发明人证实了，人源化的EpCAM-CAR-T细胞在小鼠异种移植瘤模型中显著降低结肠肿瘤的生长，这表明了EpCAM-CAR-T细胞可以治疗患有EpCAM阳性肿瘤的患者。
本发明的人源化EpCAM单克隆抗体或EpCAM-ScFv相对于小鼠EpCAM ScFv(AUA1抗体)的优点在于人源化的EpCAM scFv对人的免疫原性较低。与具有小鼠ScFv的CAR-T细胞相比，人源化的EpCAM scFv对癌细胞的细胞毒性更强。EpCAM人源化抗体用作CAR-T的治疗剂和其他临床应用是高度有效的。
本文的人源化的EpCAM ScFv可以用于免疫治疗应用：毒素/药物偶联的抗体、单克隆治疗性抗体和CAR-T细胞免疫疗法。
使用本文的人源化EpCAM ScFv的人源化EpCAM-CAR-T细胞有效靶向EpCAM阳性癌细胞系(诸如卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、宫颈癌和其它EpCAM阳性癌症)中的EpCAM抗原。
人源化的EpCAM-CAR-T细胞可以与不同的化学疗法联合使用：检查点抑制剂、靶向疗法、小分子抑制剂和抗体。
人源化EpCAM-CAR-T细胞可以在临床上用于EpCAM阳性癌细胞。
对诸如CD28、4-1BB等共激活结构域的修饰可以用于增加CAR-T细胞的功效。标签偶联的人源化EpCAM scFv可以用于CAR生成。
人源化EpCAM-CAR-T细胞可以与不同的安全开关(诸如t-EGFR、RQR(利妥昔单抗-CD34-利妥昔单抗)、诱导型半胱天冬酶-9等)一起使用。
第三代CAR-T或其它共激活信号传导结构域可以与人源化EpCAM-scFv一起使用，以制备EpCAM-CAR-T。
人源化EpCAM CAR可以与靶向其它肿瘤抗原或肿瘤微环境的CAR(例如VEGFR-1-3、PDL-1)组合。生成具有EpCAM和CD3或其它抗原的双特异性抗体用于治疗。
人源化EpCAM-CAR可以用于生成其它类型的细胞，诸如CAR-天然杀伤(NK)细胞、EpCAM-CAR-巨噬细胞和EpCAM-CAR造血细胞，其可以靶向EpCAM阳性癌症。
本发明提供了被修饰以表达EpCAM-CAR的T细胞、NK细胞、巨噬细胞或造血细胞。
EpCAM-CAR-T细胞可以用于靶向癌症干细胞和循环肿瘤干细胞，所述干细胞针对化学疗法是最具抗性的，并且形成侵袭性肿瘤。
EpCAM-NK细胞、EpCAM-巨噬细胞可以用于靶向不同类型的癌症。
EpCAM-CAR-T细胞可以通过肿瘤内递送至患者以提高安全性。
下述实施例进一步说明了本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为限制性的。
实施例
实施例1.人源化EpCAM VH、VL和scFv序列
EpCAM scFv衍生自小鼠杂交瘤克隆(AUA1[4，5])。确定小鼠克隆AUA1的重链和轻链可变区的序列，并且用于构建人源化的scFv。如Golubovskaya等人(3)中所述完成人源化。EpCAM scFv的结构是：VH-接头-VL。
粗体突出显示了VH的核苷酸序列；下划线突出显示了VL的核苷酸序列；两者之间的(斜体)是编码接头的核苷酸序列。
VH氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
接头氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
VL氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
人源化EpCAM scFv蛋白(SEQ ID NO:5)
实施例2.以CD28作为共刺激结构域的人源化EpCAM-CAR序列
EpCAM-CAR构建体的方案如图3所示。
下述核苷酸序列显示了本发明的EpCAM ScFv-CD8铰链-TM28-CD28-CD3ζ。该结构包括人CD8信号传导肽、EpCAM scFv(VH-接头-VL)、CD8铰链、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ激活结构域(图2)。
EpCAM scFv(VH-接头-VL)-CD8铰链-CD28 TM-CD28-CD3-ζ：
<CD8前导区>
核苷酸
氨基酸
<Nhe I限制性酶切位点>
<AS>
<EpCAM scFv>
VH-接头-VL，关于核酸序列和氨基酸序列参见实施例1。
<Xho I限制性酶切位点>
<CD8铰链>
核苷酸
氨基酸
<CD28跨膜>
核苷酸
氨基酸
<CD28共刺激>
核苷酸
氨基酸
<CD3ζ>
核苷酸
氨基酸
<EcoRI限制性酶切位点>
Gaattc
EpCAM-CAR蛋白的氨基酸序列(PMC376，SEQ ID NO:16)如下，VH以粗体显示，接头以斜体显示，VL是加下划线的。
实施例3.以4-1BB作为共刺激结构域的人源化EpCAM-CAR序列
在本实施例中，除了使用4-1BB作为共刺激结构域代替CD28之外，人源化EpCAM-CAR的序列与实施例2中描述的序列相同。
<41BB共刺激结构域>
核苷酸(SEQ ID NO:17)
氨基酸(SEQ ID NO:18)
CAR氨基酸序列(PMC 710，SEQ ID NO:19)
实施例4.CAR慢病毒制备
本发明人制备了人源化的EpCAM-ScFv-CAR构建体，并且将其克隆到慢病毒载体中，所述慢病毒载体对于PMC376具有启动子EF1和CD28共刺激结构域，或者对于PMC710具有MNDU3启动子和41BB共刺激结构域。
通过如[6]中描述的标准程序在293T细胞中生成慢病毒；通过实时PCR确定滴度。
实施例5.从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)
将全血(Stanford Hospital Blood Center，Stanford，CA)从个体或混合供体(取决于所需的血液量)中收集到10mL肝素真空采血管(Becton Dickinson)中。将大约10ml的抗凝血全血与无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液在50ml锥形离心管(PBS，pH 7.4，不含Ca2+和Mg2+)中混合，总体积共20ml。将血液/PBS(20ml)轻轻铺在锥形离心管中的15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)之上，并且将样品在室温下以400xg离心30-40分钟。取出在稀释的血浆/Ficoll界面处的含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，洗涤，并且在室温下以200xg离心10分钟。用血细胞计数器来计数细胞。PBMC用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)洗涤一次，其中含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(GeminiBioproducts，Woodland，CA)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，用于实验或在-80℃下冷冻。
实施例6.来自PBMC的T细胞激活
将分离的PBMC细胞重悬浮于具有300U/mL huIL2(来自1000x原液；Invitrogen)的CAR-T培养基中，并且与CD3-CD28磁珠以1:1的磁珠/细胞比混合。在病毒转导之前，将细胞在CO2的存在下在37℃下孵育24小时。
实施例7.T细胞转导和扩增
在PBMC激活之后，使细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时。向1×106个细胞的每个孔中，加入5×106个慢病毒和2μL/mL Transplus培养基(Alstem，Richmond，CA)(1:500的最终稀释度)。在重复加入病毒之前，将细胞再孵育24小时。然后使细胞在300U/ML IL-2新鲜培养基的持续存在下生长12-14天(总孵育时间取决于所需的CAR-T细胞的最终数目)。每2-3天分析细胞浓度，此时加入培养基以将细胞悬浮液稀释至1×106个细胞/mL。
实施例8.通过FACS染色验证转导
将细胞洗涤并且悬浮于FACS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)加上0.1％叠氮化钠和0.4％BSA)中，然后分成1×106等分试样。
Fc受体用正常山羊IgG(Life Technologies)进行封闭。将1.0ml FACS缓冲液加入每个管中，充分混合并且以300g离心5分钟。
利用生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体或抗人F(ab)2抗体(LifeTechnologies)检测EpCAM scFv；添加生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(LifeTechnologies)作为同种型对照。
将细胞悬浮于FACS缓冲液中，并且通过向每个管中加入100μl的1:1000稀释的正常小鼠IgG(Invitrogen)进行封闭，且在冰上孵育10分钟。将细胞洗涤并重悬浮于100μlFACS缓冲液中，然后用藻红蛋白(PE)标记的链霉抗生物素蛋白(BD Pharmingen，SanDiego，CA)和别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3(eBiocience，San Diego，CA)进行染色。用BDFacsCalibur(BD Biosciences)进行流式细胞术采集，并且用FlowJo(Treestar，Inc.Ashland，OR)进行分析。
图3显示了用人源化EpCAM-CAR慢病毒转导的T细胞(人源化EpCAM-CAR-T细胞)具有可检测水平的人源化的抗EpCAM scFv，其通过抗小鼠F(ab)2抗体或抗人F(ab)2抗体(Jackson Immunoresearch；109-066-097)[1:50]进行检测。23％的人源化EpCAM-CAR-T细胞(CD28共刺激，实施例2，PMC 376)针对抗小鼠F(ab)2呈阳性，而25.4％针对抗人F(ab)2呈阳性。
图4显示了35.2％的人源化EpCAM-CAR-T细胞(4-1BB共刺激，实施例3，PMC 710)针对抗小鼠Fab呈阳性。
除了小鼠scFv序列由AUA1小鼠抗体制备之外，根据实施例2和4-7制备小鼠EpCAM-CAR-T细胞。图5显示了小鼠EpCAM-CAR-T细胞具有EpCAM的低表达，并且仅2.23％的小鼠EpCAM-CAR-T细胞通过抗小鼠F(ab)2检测到。
实施例9.人源化EpCAM-CAR-T细胞的细胞毒性测定
根据制造商的方案，使用ACEA机器检测实时细胞毒性。检测EpCAM-CAR-T细胞(实施例2，CD28共刺激结构域，PMC376)对HT29(结肠直肠腺癌，图6A)、Lovo(结肠癌，图6B)、OVCAR-3(卵巢癌，图6C)、Hela(宫颈癌，图6D)和SKBR-3(乳腺癌，图6E)等EpCAM阳性癌细胞的细胞毒性。
实时细胞毒性测定证实了EpCAM-CAR细胞对结直肠癌、结肠癌和卵巢癌的高细胞毒性(图6A-6C)。EpCAM-CAR-T细胞的细胞毒性在宫颈癌和乳腺癌细胞系中较低(图6D-6E)。据报告，Hela和SKBR3细胞表达较少的EpCAM。
还检测了EpCAM-CAR细胞(实施例3，4-1BB共刺激结构域，PMC710)对Lovo细胞(结肠癌)的细胞毒性。结果与PMC376在Lovo细胞中的结果相似(数据未显示)。
实施例10.细胞毒性测定(比较)
在Lovo靶细胞中比较了人源化EpCAM-CAR-T细胞(PMC376)和小鼠EpCAM-CAR-T细胞的细胞毒性。结果显示于图7中。由于小鼠EpCAM CAR在CAR-T细胞中的低表达，小鼠CAR-T细胞对Lovo细胞未呈现出细胞毒性，而人源化EpCAM-CAR-T细胞对Lovo细胞具有高细胞毒性。
实施例11.EpCAM-CAR对EpCAM阳性癌细胞分泌高水平的IFN-γ。
我们收集了RTCA测定中与癌细胞共孵育的EpCAM-CAR-T的上清液，并根据制造商的方案，用来自Fisher的试剂盒进行了ELISA。人源化EpCAM-CAR-T(PMC376)对测试的靶癌细胞分泌高水平的IFN-γ(图8)。人源化EpCAM-CAR-T(PMC710)也对Lovo靶癌细胞分泌高水平的IFN-γ(数据未显示)。
实施例12.EpCAM-CAR-T细胞显著降低了LOVO-1结肠癌异种移植瘤的生长。
我们皮下注射了Lovo-1(结肠)癌细胞，第二天我们静脉注射了新鲜或冷冻的人源化EpCAM-CAR-T细胞。一周后进行了第二次CAR-T细胞的静脉注射。人源化EpCAM CAR-T细胞完全阻断Lovo-1肿瘤生长；在实验结束时并未检测到肿瘤(图9A和9B)。
来自EpCAM-CAR-T细胞治疗组的小鼠并未降低体重(图10)。因此，人源化CAR-T细胞是安全的，并且可以用作针对实体瘤的治疗剂。
参考文献：
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序列表
<110> 普洛迈博生物技术公司
湖南远泰生物技术有限公司
<120> EPCAM抗体和EPCAM-CAR-T细胞
<130> 119995-8022.WO01
<150> US 62/796,975
<151> 2019-01-25
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgaa ctgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60
agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc aactatggca tgaactgggt gcgccaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gatgggctgg attaacacct ataccggcga accgacctat 180
gcggatgatt ttaaaggccg ctttgtgttt agcctggata ccagcgtgag caccgcgtat 240
ctgcagatta gcagcctgaa agcggaagat accgcggtgt attattgcgc gcgctggctg 300
cgcgattttg attattgggg cgcgggcacc accgtgaccg tgagcagcgg tggcggaggt 360
tctggaggcg gtggttcagg tggcggtggt tccgaaattg tgctgaccca gagcccggcg 420
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accagcaaac tggcgaccgg cattccggcg cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat 600
tttaccctga ccattagcag cctggaaccg gaagattttg cggtgtatta ttgccatcag 660
cgcagcagct atccgtatac ctttggcggc ggcaccaaac tggaaattaa a 711
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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65 70 75 80
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Ala Arg Trp Leu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
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Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
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<213> 智人
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 智人
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
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Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile
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Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
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Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe
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Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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ccg 63
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Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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<213> 智人
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
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Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
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Arg
<210> 16
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<213> 智人
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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser
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Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
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Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
195 200 205
Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
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Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
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Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
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Leu Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
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Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
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Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
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Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
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Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
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Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys
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Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
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Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
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Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp
85 90 95
Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Leu Arg Asp Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
195 200 205
Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
245 250 255
Leu Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
305 310 315 320
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
325 330 335
Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490

Claims (10)

1.一种人源化抗人EpCAM抗体，包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:4的氨基酸的VL。
2.一种单链可变片段(scFv)，包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:4的氨基酸的VL。
3.根据权利要求2所述的scFv，其进一步包括位于VH和VL之间的接头。
4.根据权利要求2所述的scFv，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
5.一种嵌合抗原受体融合蛋白(CAR)，其从N末端到C末端包括：
(i)权利要求2所述的scFv，
(ii)跨膜结构域，
(iii)至少一个共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。
6.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述共刺激结构域是CD28或4-1BB。
7.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述激活结构域是CD3ζ。
8.根据权利要求5所述的CAR，其具有SEQ ID NO:16或19的氨基酸序列。
9.一种编码权利要求5所述的CAR的核酸。
10.一种经修饰以表达权利要求5所述CAR的T细胞或自然杀伤细胞。
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