CN118184774A - 中和SARS-CoV-2及变异株的全人源抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是SARS‑CoV‑2及其突变株的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本申请涉及抗SARS‑CoV‑2及其突变株的抗体或抗原结合片段，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本申请还涉及所述抗体或抗原结合片段的用途。本申请的抗体或抗原结合片段可用于诊断、预防和/或治疗SARS‑CoV‑2及其突变株感染和/或由所述感染引起的疾病。
Description
本申请是申请日为2022年06月15日、申请号为202210675885X的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是SARS-CoV-2及其突变株的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本申请涉及抗SARS-CoV-2及其突变株的抗体或抗原结合片段，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本申请还涉及所述抗体或抗原结合片段的用途。本申请的抗体或抗原结合片段可用于诊断、预防和/或治疗SARS-CoV-2及其突变株感染和/或由所述感染引起的疾病。
背景技术
SARS-CoV-2刺突糖蛋白(Spike，S)在新型冠状病毒感染和发病机制中起着关键作用。SARS-CoV-2病毒的成熟S蛋白是一种高度糖基化的三聚体，其每个原聚体由1260个氨基酸组成(残基14-1273)，其中S1亚基由672个氨基酸(残基140-685)组成，分为四个结构域：一个N端结构域(NTD)、一个C端结构域(CTD，也称为受体结合结构域，RBD)和两个亚结构域(SD1和SD2)。
SARS-CoV-2S糖蛋白是一种构象机器，通过从亚稳态的未被触发状态、通过前发夹中间态到稳定的融合后状态来介导病毒进入。已经证实血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV-2的主要受体。SARS-CoV-2RBD与其受体ACE2之间的详细相互作用已被两者的复合物结构所揭示。结构上，RBD由两个亚结构域组成：核心和外部亚结构域。位于核心亚结构域一侧的延伸环(残基438-506)呈现一个略微凹陷的表面以支撑ACE2 N端螺旋(α1)。通过对SARS-CoV-2RBD和ACE2之间界面的分析表明，RBD中共有17个残基与ACE2中的20个氨基酸接触，形成了亲水性相互作用网络，主导了病毒与受体的结合。
SARS-CoV-2S糖蛋白的RBD结合靶细胞表面的ACE2受体，起始了SARS-CoV-2的膜融合和随后的病毒入侵过程。S糖蛋白结合质膜上的ACE2(质膜入侵途径)或随后病毒颗粒被宿主细胞内吞(胞内体入侵途径)后，发生第二次裂解(S2’裂解位点)，分别由细胞表面的丝氨酸蛋白酶TMPRSS2或内体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B和L介导(cathepsins B and L)。S2′位点的蛋白酶裂解将融合肽从新形成的S2亚基的N端区域释放出来，进一步破坏SARS-CoV-2S糖蛋白三聚体的稳定性，并可启动S2介导的膜融合级联反应。第二次切割完成后，S2三聚体N端的融合肽插入宿主膜，形成前发夹中间状态。由于前发夹中间状态极不稳定，S2融合蛋白快速且不可逆地重新折叠到稳定的融合后状态。这些巨大的构象重排将病毒和宿主细胞膜拉近，最终导致膜融合。所以，S蛋白决定了病毒的宿主范围和组织嗜性。鉴于S蛋白在病毒入侵过程中至关重要的作用以及其绝大部分都暴露于病毒包膜外，可直接被宿主免疫系统识别的特点，S蛋白是宿主体液免疫和细胞免疫的主要靶点，是宿主中抗体的主要作用位点。因而目前的新冠疫苗策略大多基于全长S糖蛋白或其RBD结构域作为免疫原。
然而，SARS-CoV-2作为RNA病毒，具有突变率高和进化速度快特点。目前，已被世界卫生组织(WHO)指定为值得关注的变种(VOCs)；Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)。Omicron的初始变种BA.1于2021年11月在博兹瓦纳和南非首次被发现，并迅速取代Delta变种，成为世界上最流行的SARS-CoV-2毒株。Omicron的另一变种，BA.2比BA.1变异株传播速度更快，造成的确诊病例已在2022年2月底超过BA.1病例，成为目前主要的全球流行变异株。更可怕的是，Omicron仍在快速突变，产生大量新的亚型内变种。目前大家关注的Omicron亚变种至少包括XE，BA.2.12.1，BA.4和BA.5这几种。
Omicron对疫苗和中和抗体有较强的免疫逃逸能力。研究表明，绝大多数单克隆抗体(mAbs)对BA.1和BA.2的中和活性完全或大幅度丧失。在已被批准或授权的REGN10987(imdevimab)、REGN10933(casirivimab)、LY-CoV555(bamlanivimab)、CB6/LY-CoV016(etesevimab)、S309(sotrovimab)、COV2-2130(cilgavimab)、COV2-2196(tixagevimab)、CT-P59(regdanvimab)、BRII-196(amubarvimab)、BRII-198(romlusevimab)和LY-CoV1404(bebtelovimab)等十一个单抗中，S309对BA.1保留了大部分中和活性(仅降低了约2倍)，但它们的活性被BA.2进一步逃逸。S309(sotrovimab)是一类中和抗体的代表性成员，此类抗体靶向sarbecovirus的高度保守区，即RBD的核心结构域(具有超过85％的相同氨基酸残基)，因而通常出展现广泛的sarbecovirus中和活性，尽管中和活性一般都相对不高。BA.2具有的S371F、D405N和R408S突变，可能贡献了此类sarbecovirus中和抗体的逃逸能力。相反，一些中和抗体如COV2-2130(cilgavimab)对BA.1完全失去了活性，但对BA.2又恢复了活性。
发明内容
在本申请中，发明人开发了具有优良性质的人源抗体，其能够中和SARS-CoV-2及其突变株(Omicron BA.1突变株、Omicron BA.2突变株、Beta突变株和Delta突变株)，阻断或抑制SARS-CoV-2及其突变株与受体ACE2的结合，且不易引发受试者的免疫原性反应。因此，本申请提供的抗体或抗原结合片段具有用于检测、诊断、预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染所导致的疾病的潜力，具有重大的临床价值。
本申请的抗体
第一方面，本申请实施例公开了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白的受体结合区(RBD)，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(I)包含下述三个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：
(a)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO.8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列，
(b)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO.9，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列，和
(c)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO.10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和/或，
(II)包含下述三个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：
(d)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO.14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(e)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO.15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(f)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO.16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列。
在本申请的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
三个根据Kabat编号系统定义重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO.8所示的VH CDR1、如SEQ ID NO.9所示的VH CDR2和如SEQ ID NO.10所示的VH CDR3；以及
三个根据Kabat编号系统定义轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：如SEQ IDNO.14所示的VL CDR1、如SEQ ID NO.15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO.16所示的VL CDR3。
第二方面，本申请实施例一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白的受体结合区(RBD)。所述抗体或其抗原结合片段包含：
(I)重链可变区，所述重链可变区包含选自如下(a)～(c)任一所述的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个，三个，4个或5个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列；或
(c)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；以及
(II)轻链可变区，所述轻链可变区包含选自如下(d)～(f)任一所述的氨基酸序列：
(d)SEQ ID NO.4所示的序列；
(e)与SEQ ID NO.4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列；或
(f)与SEQ ID NO.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO.2所示的序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO.4所示的序列的轻链可变区。
在本申请的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段还包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在本申请的某些实施例中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在本申请的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在本申请的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。
在本申请的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO.2所示的重链可变区(VH)；和如SEQ ID NO.4所示的轻链可变区(VL)。
在本申请的某些实施例中，第一或第二方面所述的抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在本申请的某些实施例中，第一或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项或多项：
(1)特异性结合SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD，所述突变株包括SARS-CoV-2 Omicron BA.1突变株、Omicron BA.2突变株、Beta突变株和Delta突变株；
(2)阻断或抑制SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD对Ace2受体的结合，和/或阻断或抑制SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD对细胞的感染；
(3)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD；
(4)预防和/或治疗SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD的感染或与SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD感染相关的疾病(例如COVID-19)。
在本文中，本申请任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可以包括变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守性置换)氨基酸残基的保守性置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。
衍生的抗体
本申请任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常而言，单克隆抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)对其与SARS-CoV-2的结合无影响。因而，本申请刚公开的抗体或其抗原结合片段还可以包括此类衍生化的形式。例如，可以将本申请的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其他方式)于一个或多个其他分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本申请的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
在本申请的某些实施例中，本申请的单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在本文中，本申请所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，Dynabeads@)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
在本申请的某些实施例中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。
在本申请的某些实施例中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本申请的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
抗体的制备
本申请任一方面所述的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请抗体的重链可变区和轻链可变区基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的抗体。
本申请任一方面所述的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(SARS-CoV-2 N蛋白不同片段制备及在荧光层析中的应用，期刊，生物工程学报，发表时间2021.06.28)。例如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
为此，本申请提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本申请的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在本申请的某些实施例中，所述分离的核酸分子编码本申请的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，本申请提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本申请的分离的核酸分子。在本申请的某些实施例中，本申请的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在另一个方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含本申请的分离的核酸分子或本申请的载体。此类宿主细胞包括，原核细胞例如大肠杆菌细胞(TG1)，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞(例如CHO-K1、CHO-S、CHODG44)，例如小鼠细胞、人细胞等)。
在另一个方面，提供了制备本申请的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
抗体的应用
另一方面，本申请实施例公开了一种试剂盒，其包括本申请提供的抗体或其抗原结合片段。
在本申请的某些实施例中，本申请提供的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
为此，本申请公开的试剂盒还包括第二抗体，所述第二抗体特异性识别所述抗体或其抗原结合片段。任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
另外一方面，本申请实施例公开了一种用于检测SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD在样品中的存在或其水平的方法，所述突变株选自SARS-CoV-2 Omicron BA.1突变株、OmicronBA.2突变株、Beta突变株和Delta突变株，所述方法包括使用本申请公开的抗体或其抗原结合片段。
在本申请的某些实施例中，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；例如，所述抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素；例如，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。
另外一方面，本申请实施例公开了所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD，所述突变株选自OmicronBA.1突变株、Omicron BA.2突变株、Beta突变株和Delta突变株；
在本申请的某些实施例中，所述试剂盒通过所述的方法来检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平。在一些实施例中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，可选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
另外一方面，本申请实施例公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请公开的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；可选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如法匹拉韦，瑞德西韦，干扰素等。
在本申请的某些实施例中，在所述药物组合物中的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供，以便同时、分开或相继施用。在一些实施例中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在一些实施例中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
另一方面，本申请实施例公开了一种用于中和样品中SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD的毒力的方法。该方法包括将包含SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD的样品与本申请实施例公开的抗体或其抗原结合片段接触。
另一方面，本申请实施例公开了所述的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力，或用于预防或治疗受试者的SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD感染或与SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD感染相关的疾病(例如COVID-19)。
在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物，例如人；
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。
本申请公开的抗体或其抗原结合片段、或者本申请的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。可选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本申请的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种可选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本申请的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本申请公开的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，可选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个可选的实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
本申请公开的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本申请的抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本申请公开的抗体或其抗原结合片段的“治疗有效量”可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
在本申请实施例中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
术语定义
在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本申请，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所述，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCoV”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain，RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文所述，术语“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎。
如本文所述，术语“S蛋白”和“spike蛋白”均指SARS-CoV-2的表面刺突蛋白，其上具有受体结合结构域(RBD)，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文所述，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对包括一条轻链(L)和一条重链(H))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且根据重链的不同可对应将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约三个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文所述，术语：“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文所述，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linearantibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文所述，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指，在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。可选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本申请的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本申请的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文所述，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗原结合片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗原结合片段(Ward等人,Nature 341:544546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗原结合片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗原结合片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文所述，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗原结合片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗原结合片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文所述，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗原结合片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文所述，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本申请的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本申请的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本申请的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)2，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
如本文所述，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure2:1121-1123(1994))。
如本文所述，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗原结合片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗原结合片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本申请提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗原结合片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
如本文所述，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabillyet al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。在本申请的某些实施例中，术语“嵌合抗体”可包括例如人鼠嵌合抗体，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。在本申请的某些实施例中，术语“嵌合抗体”可包括如此的抗体，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如个体人抗体序列)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人共有胚系抗体序列)。
为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将一个抗体的可变区连接至另一个抗体(例如人免疫球蛋白)的恒定区。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常可选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常可选为κ恒定区。
如本文所述，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地，人源化抗体的至少一个或两个但通常仅有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人源(例如鼠)抗体，受体框架可以天然存在的人框架，或与其相比具有约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的CDR区移植入人源框架序列(参见,基于同源建模技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计[J].中国老年学杂志,2015,第16期,ISSN:1005-9202)。
本申请的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(例如鼠)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性B细胞中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。
如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。相应地，术语“重排抗体序列”是指，已经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程而产生的特异性抗体的序列。在本申请中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(va ria ble)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本申请中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germline sequence)”，由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列，由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。
如本文所述，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文所述，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文所述，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M的解离平衡常数(KD)结合抗原。
如本文所述，术语“中和活性”是指抗体或抗原结合片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗原结合片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本文所述，术语“同一性”用于指两个蛋白质、两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有三个位置匹配)。通常，在将两个序列比对具有最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文所述，术语“保守性置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守性置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守性置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本申请中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本申请中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所述，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th.ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括氯化钠。防腐剂包括各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文所述，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文所述，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本申请的目的，有益或所需的临床结果包括，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文所述，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本申请的有益效果
本申请提供了与SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD感染，或与SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD具有特异性结合能力的抗体或抗原结合片段。其中，SARS-CoV-2的突变株包括SARS-CoV-2 Omicron BA.1突变株、SARS-CoV-2 OmicronBA.2突变株、SARS-CoV-2 Beta突变株和SARS-CoV-2 Delta突变株。具体而言，这些单克隆抗体与SARS-CoV-2的S蛋白RBD区域上的表位结合并中和SARS-CoV-2。本申请的单克隆抗体能够抑制SARS-CoV-2的RBD蛋白与受体ACE2的结合。
附图说明
图1为本申请实施例提供的抗体Amb1(左图)、Amb2(右图)的蛋白电泳结果。
图2为本申请实施例提供的抗体Amb1、Amb2以及重组蛋白ACE2-hFc分别与野生型新冠病毒RBD蛋白的结合活性ELISA检测结果。
图3为本申请实施例提供的抗体Amb1、Amb2以及重组蛋白ACE2分别与野生型新冠病毒RBD蛋白和新冠病毒Omicron BA.1突变株的RBD蛋白亲和力测定曲线图。
图4为本申请实施例提供的抗体Amb1和Amb2分别与Omicron BA.1突变株、OmicronBA.2突变株以及野生型新冠假病毒的中和活性测定曲线。
图5为本申请实施例提供的抗体Amb1和Amb2分别与Beta突变株、Delta突变株假病毒的中和活性测定曲线。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
除非特别指明，本申请中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本申请，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。
全人源抗新冠病毒scFv抗体库的构建与筛选
采用一步法总RNA提取试剂TRIzol裂解从灭活疫苗接种者(三针)抽取的10mL全血中分离的人外周血单核细胞(PBMC)，提取总RNA。然后采用oligo-dT作为引物，进行逆转录PCR反应，分别制备cDNA，并将cDNA等体积混合。使用人抗体特征序列引物(参见Generationand Characterization of a Recombinant Human CCR5-specific Antibody:a phagedisplay approach for rabbit antibody humanization，《The Journal of biologicalchemistry》2000年275卷46期36073-8页)扩增抗体基因VH，Vκ和Vλ，进一步利用重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)获得Vκ-linker-VH和Vλ-linker-VH，再经过限制性内切酶Sfi I单酶切，采用T4 DNA连接酶将酶切片段分别连入预先切好的噬菌体展示用载体pComb3XSS中。连接产物经过乙醇沉淀脱盐后，采用电转化方法，转入TG1细菌感受态，构建成库容分别为1.5×109和2.2×109的单链抗体(scFv)库，用于后续筛选。该过程基本参考(Barbas,C.F.,III；Burton,D.R.；Scott,J.K.,Silverman,G.J.Eds.(2001)Phage Display:A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York,736pages.)
噬菌体抗体库的富集筛选及scFV抗体的诱导表达
采用的筛选抗原为纯化新型冠状病毒野生型RBD蛋白(RBD-WT，cat#Z03479，购自Gensript公司)，采用如下方法进行筛选：
用pH＝7.4的PBS溶液稀释抗原，包被96孔板免疫孔，每孔100μL；4℃包被过夜。PBST洗三遍，加入封阻缓冲液200μL/孔，4℃过夜。PBST洗5遍，200μL每孔，用封阻缓冲液稀释文库噬菌体至1×1011，每孔100μL，37℃1.5h。PBST洗板5次，再用PBS洗板3次，每孔加入100μL pH 2.2甘氨酸-HCl洗脱液，立即加入15μL pH9.1 Tris-Hcl中和。将剩余洗脱物与5ml对数期TG1混匀，37℃，220rpm，45min。将上述菌液转移至20ml 2YT/A+/G培养基，培养至对数期，加入辅助噬菌体VCSM13(美国Stratagene)感染，37℃孵育1h，加入卡纳霉素(终浓度为50μg/mL)30℃过夜振摇培养制备成噬菌体单链抗体，用0.1μg/孔SARS-CoV-2 RBD蛋白包被酶标板，二抗是用PBS缓冲液(含5g/mL脱脂奶粉)按1:2000稀释的HRP标记抗M13抗体，进行Phage-ELISA鉴定并测定OD450值。如此反复筛选3次。具体富集筛选方法及scFv段的诱导表达过程基本参考(Barbas,C.F.,III；Burton,D.R.；Scott,J.K.,Silverman,G.J.Eds.(2001)Phage Display:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York,736pages.)。
经过上述试验，获得了scFv段1、scFv段2、scFv段3和scFv段4。scFv段1具有如SEQID NO.1所述氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO.3所述氨基酸序列的轻链可变区。scFv段2具有如SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO.4所述氨基酸序列的轻链可变区。scFv段3具有如SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的重链可变区和如SEQ IDNO.4所述氨基酸序列的重链可变区。scFv段4:具有如SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO.3所述氨基酸序列的重链可变区。
进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版，Public Health Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了scFv段1和scFv段2、scFv段3scFv段4中的CDR序列。其中，如SEQ ID NO.1的重链CDR1～3依次如SEQ ID NO:5～7所示，如SEQ ID NO.2的重链CDR1～3依次如SEQ ID NO:8～10所示，如SEQ ID NO.3的轻链CDR1～3依次如SEQ ID NO:11～13所示，如SEQ ID NO.4的轻链CDR1～3依次如SEQ ID NO:14～16所示。
全抗体的制备
利用质粒提取试剂盒(Qiagen Miniprep Kit，德国QIAGEN)提取阳性克隆的菌液中质粒，并送商业公司测序。测序结果与V-Base基因库(http://www.vbase2.org/)、IMGT(http://www.imgt.org/)、V-QUEST(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)、Ig BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)等数据库中IgG基因序列比较。将测序获得的全抗体可变区基因序列(SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列的编码序列依次如SEQ ID NO.17～20所示)转化成IgG1全抗体形式，全基因合成后以无缝克隆的方法，连接到分泌型哺乳动物表达载体pHL-Sec中(购自Addgene，#99845，由经典的哺乳动物表达质粒pCAGGS改造而来)，以鼠kappa链的前导肽序列(Murine Igκ-chain leadersequence，METDTLLLWVLLLWVPGSTGDJ)代替载体上自带的信号肽序列(MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETG)，并在序列后面添加终止密码子。以此分别构建了重链表达质粒pHL-HC和轻链表达质粒pHL-LC。
将测序正确的pHL-HC和pHL-LC进行无内毒素的大量提取。HEK293F细胞用FreeStyleTM293表达培养基进行悬浮培养，转染前一天以1.0×106cells/mL密度接种于一次性锥形摇瓶中，将接种好的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中，125rpm震荡培养。转染当天进行细胞计数，在细胞密度为2.0×106cells/mL(若超过密度需用培养基进行稀释)，活力大于95％的情况下进行瞬时转染。将重链质粒pHL-HC、轻链质粒pHL-LC和PEI(Polysciences公司，1μg/μL)以1:1:8的比例进行混合(其中，“1”表示1μg/mL cells)制备DNA-PEI复合物，加入待转染的细胞培养瓶中，轻轻摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中继续震荡培养。转染4d后，每天收集上清和细胞对重组蛋白的表达进行动态分析，转染7d后，收集上清。
用0.22μm的微孔滤膜进行抽滤，加入1/10体积的10×pH调节缓冲液(0.5MNa2HPO4，pH7.4)后，直接将含有重组抗体的培养基上清在蛋白纯化系统(AKTA pure25)中以5mL/min的流速通过两个串联的5mL HiTrap Protein G HP预装柱，低流速完成结合后，用结合缓冲液(20mM Na2HPO4，pH7.0)冲洗至280nM处的紫外吸收值不再变化。然后用洗脱缓冲液(0.1Mglycine-HCl，pH2.7)洗脱，在收集管中预先加入1/10体积中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)。以SDS-PAGE偶联溴酚蓝染色检测纯化情况，确定目的蛋白所在的峰，收集目的蛋白并浓缩，用阴离子交换柱和分子筛进一步纯化后，用于下一步实验。可选地，收集上清液，离心去除细胞及其碎片，经Protein G HP SpinTrap离心式少量抗体亲和层析柱纯化后，即可制备少量单抗。纯化方法如下：将离心后的上清与结合缓冲液(20mM Na2HPO4，pH 7.0)等体积混合。加入600μL结合缓冲液，100g离心30s，平衡柱子。重复加入600μL预平衡样品，100g离心30s，轻轻混匀，静止4min，将抗体结合到柱子上。加入600μL结合缓冲液，100g离心30s，洗去杂质。重复两次。加入400μL洗脱缓冲液(0.1M Glycine-HCl，pH2.7)，颠倒混匀，置于含有30μL中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)的2mL EP管中，100g离心30s，重复两次，即可。
如图1所示，纯化得到了重组表达的抗体Amb1和Amb2的电泳图，均在50kD和30kD附近各出现一条带，分别代表其重链和轻链。
Amb1和Amb2对不同新型冠状病毒株RBD蛋白的结合活性
1、ELISA检测
用pH＝9.60.1M NaHCO3溶液包被新型新型冠状病毒野生型RBD蛋白(cat#Z03479，Gensript)于酶标板，4℃过夜；3％脱脂奶封闭，37℃孵育1h，加入重组表达的Amb1和Amb2抗体以及ACE2-hFc重组蛋白(对照)，37℃孵育1h；加入酶标抗人Fc片段二抗，37℃孵育1h；显色液显色，2M H2SO4终止反应，酶标仪检测OD450。结果显示具有很高的结合活性，结果如图2所示，Amb1和Amb2抗体对新型冠状病毒株RBD蛋白均显示高于ACE2-hFc的结合活性。
2、BIAcore法测定抗体亲和力
将新型冠状病毒野生型(cat#Z03479，Gensript)和Omicron BA.1突变株RBD蛋白(cat#Z03516，Gensript)稀释于10mM NaAc，尝试不同pH条件下，抗体与CM5芯片的结合能力。pH值设置四个梯度pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5，选取固定效果最好的pH。将RBD稀释于最优pH值下的10mM NaAc，固定在芯片表面，根据公式测定各抗体的目标偶联量RU(ResponseUnit)。以Amb1和Amb2抗体为流动相，所设浓度梯度为2.6nM～333nM或666nM，检测不同浓度的Amb1、Amb2和ACE2-hFc流过芯片表面所产生的响应值。分析在恒温25℃进行，流速为30μL/min。芯片表面再生使用的溶液是100mM H3PO4。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software version(Biacore，Inc.)软件按照1:1结合模式，计算亲和力常数(KD(M))。
结果如图3所示，Amb1和Amb2对野生型RBD的亲和力常数分别为1.51×10-7和1.64×10-7；ACE2-hFc对野生型RBD的亲和力常数为3.09×10-7；Amb1和Amb2对Omicron BA.1突变株RBD的亲和力常数分别为2.05×10-7和3.33×10-7；ACE2-hFc对Omicron BA.1突变株RBD的亲和力常数为5.10×10-7，不仅说明Amb1和Amb2具有与新冠病毒及其突变株的亲和力，并且其亲和力高于受体ACE2本身，具有作为竞争阻断病毒与受体ACE2的结合的阻断剂，从而应用于阻止病毒感染的相关药物或制剂中。
假病毒中和试验
假病毒的制备：提前1天铺设5～6×106个293T细胞于6孔板中，继续培养18～24h，用12μL FuGENE HD(cat#E2311，Promega)转染试剂依照说明书将2μg HIV-1骨架质粒pNL4-3.luc.R-E-和2μg S蛋白表达质粒(SARS-CoV-2野生型、SARS-CoV-2 Omicron BA.1、SARS-CoV-2 BA.2、SARS-CoV-2 Beta或SARS-CoV-2 Delta)共转入293T细胞中。从转染开始至48h后，将6孔板中的培养基吸出，加入到无菌15mL离心管中，3000rpm离心15min，取上清，即为SARS-CoV-2野生型、SARS-CoV-2 Omicron BA.1、SARS-CoV-2 BA.2、SARS-CoV-2 Beta或SARS-CoV-2 Delta的假病毒，冻于-80℃冰箱备用。
提前将病毒从-80℃转移到冰上融化，准备无血清的DMEM。提前一天将293T-ACE2细胞(Yeasen翌圣，货号41107ES03)接种在96孔细胞培养板中，接种量约为1.2×104个细胞/孔，第二天根据细胞密度进行感染。细胞密度在50％左右比较好。用DMEM稀释抗体，第一个EP管抗体浓度为75.0μg/mL，总体积为100μL，后续每个EP管80μLDMEM，将上一管20μL吸至下一管，5倍倍比稀释，共设10个梯度。准备另一个新的96孔板，取假病毒96.0μL+抗体24.0μL(此时抗体浓度为15.0μg/mL)，轻轻混匀后，37℃孵育1h，另设置3孔加入不含抗体的100μL假病毒(96.0μL+DMEM 24.0μL)做对照。弃去96孔细胞培养板中的培养基，加入上述抗体假病毒混合液100μL，6h后换液，48h后检测荧光素酶活性。检测时，提前将板子取出，室温放置30min，同时将检测试剂(cat#DD1201-01，诺唯赞)从-20℃取出解冻，每孔加100μL检测试剂混匀后裂解3min以上。然后用排枪转移到检测板上，置于GloMax 96微孔板发光检测仪检测，用GraphpadPrism软件进行数据处理。
结果如图4、5所示，Amb1和Amb2中和新冠病毒野生型的IC50分别为0.1303μg/mL和0.064μg/mL，Amb1和Amb2中和突变株Omicron BA.1的IC50分别为0.02464μg/mL和0.01549μg/mL，Amb1和Amb2中和Omicron BA.2的IC50分别为0.01126μg/mL和0.02734μg/mL，Amb1和Amb2中和Beta突变株的IC50分别为0.02660μg/mL和0.04516μg/mL。Amb1和Amb2中和Delta突变株的IC50分别为1.220μg/mL，和0.4077μg/mL。
综上所述，本申请公开抗原结合片段scFv对新型冠状病毒的RBD蛋白具有高亲和活性，并通过、基因工程手段制得的Amb1和Amb2对野生型、Beta突变体、Delta突变体、Omicron BA.1和BA.2的假毒均有强效中和作用，具有应对奥密克戎变异株以及不断出现的可逃避疫苗和中和抗体的奥密克戎新变种毒株导致的爆发流行的潜力，具有重大临床应用价值。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白的受体结合区(RBD)，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(I)包含下述三个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：
(a)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO.8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列，
(b)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO.9，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列，和
(c)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO.10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和/或，
(II)包含下述三个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：
(d)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO.14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(e)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO.15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(f)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO.16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列。
2.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合SARS-CoV-2及其突变株的S蛋白的受体结合区(RBD)，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(I)重链可变区，所述重链可变区包含选自如下(a)～(c)任一所述的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个，三个，4个或5个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列；或
(c)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；以及
(II)轻链可变区，所述轻链可变区包含选自如下(d)～(f)任一所述的氨基酸序列：
(d)SEQ ID NO.4所示的序列；
(e)与SEQ ID NO.4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的保守性置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守性置换、缺失或添加)的序列；或
(f)与SEQ ID NO.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO.2所示的序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO.4所示的序列的轻链可变区。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列；
可选地，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列；
可选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；
可选地，所述抗体为兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
4.分离的核酸分子，其编码权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
5.载体，其包含权利要求4所述的核酸分子；可选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
6.宿主细胞，其包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体。
7.试剂盒，其包括权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；例如，所述抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素；例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
8.药物组合物，其包含权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，所述药学活性剂选自干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦中的至少一种。
10.权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD，所述突变株选自Omicron BA.1突变株、Omicron BA.2突变株、Beta突变株和Delta突变株；或用于中和样品中SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD的毒力；或用于制备药物的用途；
可选地，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平；
可选地，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；例如，所述抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素；例如，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段；
可选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，可选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液；
可选地，所述中和的步骤包括将包含SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD的样品与权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；
可选地，所述药物用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力，或用于预防或治疗受试者的SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD感染或与SARS-CoV-2、或其突变株、或其S蛋白或S蛋白的RBD、或其S1亚基或S1亚基的RBD感染相关的疾病(例如COVID-19)；
可选地，所述受试者是哺乳动物，例如人；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。
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