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CN118159667A - 检测重复扩展序列的方法 - Google Patents

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CN118159667A
CN118159667A CN202280053833.7A CN202280053833A CN118159667A CN 118159667 A CN118159667 A CN 118159667A CN 202280053833 A CN202280053833 A CN 202280053833A CN 118159667 A CN118159667 A CN 118159667A
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CN
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gene
sequence
nucleic acid
repeat
primer
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CN202280053833.7A
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庄松船
李月丽
王思佳
刘题明
谢秀凤
连雅慧
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National University Hospital Singapore Pte Ltd
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National University of Singapore
National University Hospital Singapore Pte Ltd
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Abstract

本公开尤其涉及检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的方法，所述方法包括：i)使所述两个或更多个基因的每一个的核酸样品与以下接触：a)与各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中所述基因包含核苷酸重复序列，并且其中所述不同靶序列在所述核苷酸重复序列的上游或下游，和b)与由所述两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中所述共同靶序列位于所述核苷酸重复序列内并且位于由所述基因特异性引物结合的相反链上；和ii)分析所述扩增产物。

Description

检测重复扩展序列的方法
本公开涉及分子生物学领域。特别地，说明书教导了检测核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的方法，以及在受试者中筛查多重重复扩展疾病的方法。
背景技术
散布在整个人类基因组中的简单序列重复的扩展现在已知会直接引起超过35种人类疾病。最常见的重复扩展疾病是由三核苷酸重复引起的，尽管四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和甚至十二核苷酸重复扩展也已被确定为其他疾病中的潜在突变。
重复扩展疾病通常表现出明显不同的表型，并且由于广泛的临床重叠和其他伴随的表型，因此通常难以单独通过体征和症状来区分。因此，分子遗传学检测对于鉴定致病突变以确认有症状个体的疾病状态是必要的。若干种疾病是由位于不同基因座的常见重复扩展突变引起的，例如CGG或GCG重复扩展引起脆性X综合征(FXS)、若干种类型的眼咽远端型肌病、眼咽肌营养不良以及发育性癫痫性脑病，CCG重复扩展引起一种类型的智力发育和伴有白质脑病的眼咽肌病，CAG重复扩展引起亨廷顿病和若干种类型的脊髓小脑性共济失调(SCA)，CTG重复扩展引起1型强直性肌营养不良、亨廷顿病样2和Fuchs角膜内皮营养不良，而TTTCA五核苷酸重复扩展引起若干种类型的家族性成人肌阵挛性癫痫和脊髓小脑性共济失调。可能需要多轮遗传学检测来实现对受影响个体的正确诊断，这导致额外的成本和时间。
因此，存在对克服或至少减轻上述提及的问题中的一个或多个的需求。
发明内容
本文公开了一种检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的方法，该方法包括：i)使核酸样品在两个或更多个基因的每一个的扩增条件下与以下接触：a)特异性地与各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在核苷酸重复序列的上游或下游，和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；和ii)分析扩增产物。
本文公开了一种用于检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列的存在或不存在的试剂盒，该试剂盒包括：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物。
本文公开了包含从受试者获得的核酸样品的组合物，该组合物包含a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；
其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物。
本文公开了一种在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病的方法，该方法包括：i)使来自受试者的核酸样品在扩增条件下与以下接触：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；和ii)分析扩增产物以在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病。
本文公开了一种在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病并治疗该受试者的方法，该方法包括：i)使来自受试者的核酸样品在扩增条件下与以下接触：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；ii)分析扩增产物以在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病；和iii)治疗被发现患有至少一种多重重复扩展疾病的受试者。
附图说明
现在将参考附图通过仅为非限制性实例的方式来描述本发明的一些实施方案，附图中：
图1.FMR1和AFF2双重TP-PCR反应的示意图。指示了基因座特异性侧翼引物退火位置(黑色和灰色箭头，其中其末端标记有星形符号)，在重复中的TP引物退火位置也是如此(黑色和灰色箭头)。灰色箭头指示较差的扩增，因为TP引物离基因座特异性引物更远，或者因为中断介导的错配。显示了仅携带正常FMR1和正常AFF2等位基因(A)、扩展的FMR1等位基因和扩展的AFF2等位基因(C)的样品的预期电泳图模式。黑色矩形表示FMR1 CGG或AFF2CCG三核苷酸。灰色矩形表示如每个矩形上方所示的非CGG或非CCG三核苷酸。
图2.来自正常、FMR1前突变和FMR1全突变男性和女性DNA样品的FMR1(FAM/深灰色)和AFF2(HEX/浅灰色)双重TP-PCR产物的电泳图。电泳图展示了FAM和HEX二者(左)、仅FAM(中)和仅HEX(右)荧光通道。深灰色峰指示FAM标记的FMR1 TP-PCR产物，而浅灰色峰指示HEX标记的AFF2 TP-PCR产物。将正常等位基因与扩展的等位基因分开的阈值重复尺寸由垂直虚线指示。
图3.来自AFF2前突变和全突变DNA样品的FMR1(FAM/深灰色)和AFF2(HEX/浅灰色)双重TP-PCR产物的电泳图。电泳图展示了在FAM和HEX二者(左)、仅FAM(中)和仅HEX(右)荧光通道。深灰色峰指示FAM标记的FMR1 TP-PCR产物，而浅灰色峰指示HEX标记的AFF2 TP-PCR产物。将正常等位基因与扩展的等位基因分开的阈值重复尺寸由垂直虚线指示。
图4.AFF2 CCG重复尺寸和结构分布。A，AFF2 CCG重复尺寸(x轴)和频率(y轴)在非裔美国人(灰色填充)、高加索人(未填充)、中国人(黑色填充)、印度人(深灰色粗条纹)和马来人(灰色正斜杠)群体中的群体分布。B，Zhong等人(灰色)和本研究(黑色)中的中国人等位基因频率分布的比较。C，Zhong等人(浅灰色)和本研究(灰色)中的高加索人等位基因频率分布的比较。D，描绘了具有不同FMR1 CGG和AFF2CCG重复尺寸组合的X染色体的群体分布(顶部)，以及常见和变异型AFF2等位基因的群体重复尺寸分布和丰度(底部)的热图。
图5.AFF2 CCG重复结构的光谱和相应的TP-PCR电泳图模式。A，具有rs868914124(T)参考核苷酸的常见正常等位基因。B，具有rs868914124(C)变体核苷酸的变体正常等位基因。C，具有rs868914124(T)参考核苷酸和rs1389911365(T)变体核苷酸的变体正常等位基因。D，具有rs868914124(C)变体核苷酸和三个连续的非CCG中断的全突变等位基因。“+”指示非CCG中断，而“+++”指示三个连续的非CCG中断。最左边111bp的孤立峰是由重复段上游的TP引物退火产生的。rs868914124(T)常见等位基因的第一重复产生的TP-PCR产物迁移为138bp片段。来自rs868914124(C)稀有等位基因的第一重复产生的TP-PCR产物迁移为132bp片段。重复内的中断导致错配的TP引物配对，这导致了峰簇内的无峰间隙。
图6.(A)全突变男性FX0229和(B)其全突变舅父FX0230的AFF2CCG重复结构和相应的TP-PCR电泳图模式。A，全突变等位基因携带rs868914124(C)稀有变体和在重复8-10处的三个连续的非CCG中断。B，具有rs868914124(C)稀有变体和多个非CCG中断的全突变等位基因。“+++”指示三个连续的非CCG中断。
图7.(A)全突变男性DNA_25926和(B)其前突变子代DNA_3802的AFF2 CCG重复结构和相应的TP-PCR电泳图模式。A，携带rs868914124(C)稀有变体和在重复6-8处的三个连续的非CCG中断的全突变等位基因。B，携带rs868914124(T)常见参考核苷酸的22个CCG重复的正常等位基因，以及具有rs86891412(C)稀有变体和在重复6-8处的三个连续的非CCG中断的约137个重复的前突变等位基因。“+++”指示三个连续的非CCG中断。
图8.七个常见SCA重复基因座的多重三引物PCR。SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12和DRPLA重复结构和引物退火位置的示意图(A)以及每个重复基因座的预期TP-PCR电泳图(B)。星号指示荧光团标签。每个基因座的正常等位基因重复尺寸的上限由垂直虚线指示。
图9.七重TP-PCR毛细管电泳图产生自对七个SCA重复基因座的任一个处的扩展呈阴性的DNA样品。上图显示了在所有四个荧光团通道(Fam、Vic、Ned和Pet)打开的情况下可见的表示来自所有七个重复基因座的TP-PCR产物的电泳峰。下面的四个图显示了相同但一次打开一个荧光团通道的情况下的毛细管电泳图。每个基因座的正常等位基因重复尺寸的上限由垂直虚线指示。
图10.受SCA影响的DNA样品的七重TP-PCR毛细管电泳图结果。对于每个样品，仅显示其中荧光团通道显示了在相关SCA基因座处的重复扩展的电泳图。样品对ATXN1(顶行)、ATXN2(第二行)、ATXN3(第三行)、CACNA1A(第四行)、ATXN7(第五行)、PPP2R2B(第六行)和ATN1(底行)中的CAG重复扩展呈阳性。每个基因座的正常等位基因重复尺寸的上限由垂直虚线指示。
具体实施方式
本说明书教导了一种检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的方法，该方法包括：i)使核酸样品在两个或更多个基因中的每一个的扩增条件下与以下接触：a)特异性地与各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在核苷酸重复序列的上游或下游，和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；和ii)分析扩增产物。
在一个实施方案中，该方法是检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的同步方法
在不受理论约束的情况下，本发明人开发了一种同时筛查患者的两个或更多个可疑基因中重复扩展突变的存在的策略，并使用两个实例在本发明公开中描述了其应用。该策略采用单管测定来筛查造成不同的重复扩展疾病的多个遗传基因座，所述重复扩展疾病由相同类型重复的扩展引起。本文所示的特异性测定采用多重三引物PCR(TP-PCR)，通过使用差异标记的基因座特异性侧翼引物和通用三引物(TP)引物，来检测涉及例如不同基因中存在的三核苷酸重复序列的扩展突变。显示重复尺寸在致病尺寸范围内，或超过最大正常重复尺寸的任何基因座处的扩展产物，可以通过毛细管电泳快速鉴定和确定尺寸。单个扩增反应提供了多种疾病基因的可靠一步突变筛查，从而大大缩短了受影响个体的诊断的漫长过程。该策略可以应用于同时筛查共享相同重复序列的疾病基因的任意组。
在一个实施方案中，扩增产物根据尺寸进行分离。在一个实施方案中，与参考相比，基因的扩增产物的尺寸变化指示基因中存在重复扩展序列。在一个实施方案中，与参考相比，基因的扩增产物的尺寸没有变化指示基因中不存在重复扩展序列。
术语“检测、“确定”、“测量”、“评估”、“评定”和“测定”在本文中可互换使用，是指任何形式的测量，并包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。评定可以是相对或绝对的。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则涵盖以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
如本文所用，术语“核酸”和等价术语，例如“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNA)，其包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。核酸可以是双链的或单链的。提及单链核酸包括提及有义或反义链。多核苷酸的主链可包括如通常可在RNA或DNA中发现的糖和磷酸基团，或者修饰或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸或其类似物的互补物、片段和变体。
术语“引物”在本文中用于指能够在例如PCR技术中用作引物的任何单链寡核苷酸序列。因此，根据本公开的“引物”是指单链寡核苷酸序列，其能够充当引物延伸产物合成的起始点，所述引物延伸产物与待复制的核酸链基本相同(对于正向引物)，或者与待复制的核酸链的反向互补物基本相同(对于反向引物)。引物可适用于例如PCR技术。单链包括，例如，由单链核苷酸序列形成的发夹结构。
引物的设计，例如其长度和特异性序列，取决于靶核苷酸序列的性质和引物的使用条件，例如温度和离子强度。
引物可以由本文所述的核苷酸序列组成，或者可以是包含本文所述序列或落在本文所述序列内的10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100个或更多个核苷酸，条件是它们适合于在严格条件下特异性地结合靶序列。在一个实施方案中，引物序列的长度小于35个核苷酸，例如引物序列的长度小于34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22或21个核苷酸。
可以对引物或探针的长度或序列进行轻微修改，以维持给定情况下所需的特异性和敏感性。在本公开的一个实施方案中，本文所述的探针和/或引物的长度可以例如在任意方向上延伸1、2、3、4或5个核苷酸，或者减少1、2、3、4或5个核苷酸。
引物序列可以使用本领域公知的任何方法合成。
术语“互补的”是指核苷酸或核酸之间的碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间，或寡核苷酸引物和待测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间的碱基配对。互补的核苷酸通常是A和T(或A和U)，或C和G。当经过最佳排列和比较，并具有适当的核苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸与另一条链的至少约80％的核苷酸(通常为另一条链的至少约90％至95％的核苷酸，且更优选另一条链的约98％至100％的核苷酸)配对时，两个单链RNA或DNA分子被认为是互补的。备选地，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下将与其互补物杂交时，存在互补性。典型地，当在一段至少14至25个的核苷酸上有至少约65％的互补性，优选至少约75％，且更优选至少约90％的互补性时，将发生选择性杂交。
如本文所用，术语“杂交”是指两个单链多核苷酸非共价地结合形成稳定的双链多核苷酸的过程。所得(通常)双链多核苷酸是“杂交体”。形成稳定杂交体的多核苷酸群体的比例在本文中称为“杂交度”
典型地，杂交条件将包括小于约1M，更通常小于约500mM和小于约200mM的盐浓度。杂交温度可低至5℃，但通常大于22℃，更通常大于约30℃，且优选超过约37℃。杂交通常在严格条件(即探针将与其靶子序列杂交的条件)下进行。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境下是不同的。较长的片段可能需要更高的杂交温度来进行特异性杂交。由于其他因素可能影响杂交的严格性，包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，因此参数的组合比单独的任一个的绝对度量更重要。通常，严格条件被选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热力学熔点(Tm)低约5℃。Tm是平衡状态下50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸组成下)。典型地，严格条件包括在pH 7.0至8.3和至少25℃的温度下至少0.01M至不超过1M Na离子浓度(或其他盐)的盐浓度。例如，5X SSPE(750mM NaCl，50mM Na磷酸盐，5mM EDTA，pH 7.4)和25-30℃的温度的条件适合于等位基因特异性探针杂交。
引物与靶序列的“特异性结合”或“特异性杂交”意指在所使用的实验条件下，例如在严格杂交条件下，引物与靶序列区域的部分或与整个靶序列(根据需要)形成双链体(双链核苷酸序列)，并且在这些条件下，引物不与待分析样品中存在的核苷酸序列的其他区域形成双链体。
术语“重复扩展序列”可指已经过扩展突变，导致核苷酸重复序列延长超过正常重复尺寸的核苷酸重复序列。
在一个实施方案中，重复扩展序列是三核苷酸重复扩展序列。在其他实施方案中，重复扩展序列是四核苷酸或五核苷酸重复扩展序列或其他长度的重复扩展序列，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的重复序列。
在一个实施方案中，核苷酸重复序列是三核苷酸重复序列。在一个实施方案中，三核苷酸重复序列选自(CGG)n、(CCG)n、(CAG)n、(CTG)n、(GCC)n、(GGC)n、(GAA)n或(TTC)n，其中n为2至200或更大。(CGG)n重复序列包括(GCG)n和(GGC)n。类似地，(CCG)n序列包括(CGC)n和(GCC)n，并且(CTG)n序列包括(TGC)n和(GCT)n。
如本文提及的“通用引物”可与由两个或更多个基因共享的“共同靶序列”结合，其中“共同靶序列”位于核苷酸重复序列内并且位于由基因特异性引物结合的相反链上。
如本文提及的“基因特异性引物”可指特异性地与特定基因结合但不与其他基因结合的引物。
术语“基因”广泛用于指与生物功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或此类编码序列表达所需的调控序列。术语基因可应用于特定的基因组序列，以及应用于由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括非表达核酸段，其例如形成其他蛋白的识别序列。非表达的调控序列包括启动子和增强子，调控蛋白(例如转录因子)与之结合，导致相邻或附近序列的转录。
在一个实施方案中，通用引物与共同靶序列结合，所述共同靶序列包含5、6、7、8、9、10个或更多个连续的三核苷酸重复或由其组成。在一个实施方案中，通用引物与(CGG)5(SEQ ID NO:15)结合。在一个实施方案中，通用引物与(CTG)5(SEQ ID NO:16)结合。
在一个实施方案中，通用引物与共同靶序列结合，所述共同靶序列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个连续的四核苷酸、五核苷酸或更多核苷酸的重复单元或由其组成。在一个实施方案中，五核苷酸重复序列是(TTTCA)n，其包括(CATTT)n和(ATTTC)n。
在一个实施方案中，通用引物包含独特尾部序列。在一个实施方案中，通用引物包含独特5'尾部序列。术语“独特尾部序列”或“独特5'尾部序列”是指在严格条件下不与核酸样品中任何基因或基因间区域中的任何区域杂交序列，其用于检测重复扩展序列的存在或不存在。
在一个实施方案中，该方法包括提供特异性地结合通用引物的独特5'尾部序列的尾部引物。将独特5'尾部序列添加到通用引物中，并提供特异性地与独特5'尾部序列结合的尾部引物，可改善重复尺寸确定的准确性。
在一个实施方案中，基因特异性引物被标记。每个基因特异性引物可以例如用不同的荧光团标记，以使来自每个基因的扩增产物能够彼此区分。例如，可以使用FAM或Hex标记。
在一个实施方案中，荧光标记可以在光谱的蓝色、黄色、绿色和远红色区域中有活性。在优选实施方案中，可用于本公开的方法的荧光标记物的非限制性实例包括：荧光标记物或报告染料，例如6-羧基荧光素(6FAMTM)、NEDTM(Applera Corporation)、HEXTM或VICTM(Applied Biosystems)；TAMRATM标记物(Applied Biosystems,CA,USA)、ROX。本领域技术人员将理解，在根据本公开的方法中也可以使用其他替代性荧光标记。
在另一个实施方案中，可以使用化学发光标记，例如钌探针；以及放射性标记，例如氚化胸苷形式的氚。32-磷也可用作放射性标记。
备选地，标记可选自电致发光标签、磁性标签、亲和力或结合性标签、核苷酸序列标签、位置特异性标签和/或具有特定物理性质(例如不同的尺寸、质量、回转、离子强度、介电性质、极化或阻抗)的标签。
在一个实施方案中，可检测标记可以直接或间接附着于引物上。在一个实施方案中，标记的引物是反向引物。在一个实施方案中，可检测标记包括附着在探针的5'端的荧光部分。在最优选的实施方案中，标记选自6-FAM和NED。
在备选实施方案中，用核酸嵌入荧光团检测核酸。优选地，嵌入荧光团是SYBRGreen或EvaGreen等。本领域技术人员将理解，可以使用在光谱的蓝色、黄色、绿色和远红色区域中有活性的其他嵌入荧光团。将进一步理解的是，根据本公开内容，可以使用其他嵌入荧光团。
本文提及的术语“样品”可来源于生物流体、细胞、组织、器官或生物体，其包括将进行拷贝数变化的筛查的具有至少一个核酸序列的核酸或核酸混合物。在某些实施方案中，样品具有至少一个核酸序列，怀疑其拷贝数已经过变化。此类样品包括但不限于痰/口腔液、羊水、血液、血液级分或细针活检样品、尿液、腹膜液、胸膜液等。尽管样品通常取自人受试者(例如患者)，但样品可以取自任何哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、山羊、绵羊、牛、猪等。样品可以如从生物来源获得的直接使用或在改变样品的特性的预处理后使用。例如，这种预处理可以包括从血液制备血浆、稀释粘性流体等等。预处理的方法还可涉及但不限于过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、离心、冷冻、冻干、浓缩、扩增、核酸片段化、干扰组分的灭活、试剂的添加、裂解等。在对于样品采用此类预处理方法的情况下，此类预处理方法通常使得目的核酸保留在测试样品中，有时浓度与未经处理的测试样品(例如，即，未经受任何此类预处理方法的样品)中的浓度成比例。
对照样品可以是阴性或阳性对照样品。“阴性对照样品”或“未受影响的样品”是指包括已知或预期具有重复序列的核酸的样品，所述重复序列具有在非致病范围内的重复数量。“阳性对照样品”或“受影响的样品”已知或预期具有重复序列，所述重复序列具有在致病范围内的重复数量。阴性对照样品中重复序列的重复通常并未扩展超过正常范围，而阳性对照样品中重复序列的重复通常已经扩展超过正常范围。因此，可以将测试样品中的核酸与一个或多个对照样品进行比较。
本文中的术语“生物流体”是指取自生物源的液体，并且包括例如血液、血清、血浆、痰、灌洗液、脑脊液、尿液、精液、汗液、泪液、唾液等。如本文所用，术语“血液”、“血浆”和“血清”明确涵盖其级分或经加工的部分。同样，在样品取自活检、拭子、涂片等的情况下，“样品”明确涵盖来源于活检、拭子、涂片等的经加工的级分或部分。
“标记”是指能够产生可测量信号并与多核苷酸共价或非共价连接的报告分子(例如荧光团)。
在一个实施方案中，该方法包括使用尺寸分离技术或测序技术分析扩增产物。尺寸分离技术可以是基于电泳的技术(例如毛细管电泳)。例如，可以使用通过尺寸分离聚合物进行的毛细管电泳。荧光标记的PCR产物(经由使用5'端标记的引物)在其通过聚合物填充的毛细管迁移和分辨时经由激光激发进行检测。另一种尺寸分离技术是平板凝胶PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。PCR产物可以使用5'端标记的引物进行荧光标记，并在其通过平板凝胶迁移和分辨时经由激光激发进行检测。PCR产物也可以经由5'端标记的引物或经由在PCR过程期间掺入放射性同位素标记的核苷酸进行放射性标记，并通过将平板凝胶暴露于X射线胶片来检测。测序技术可以是下一代测序。通过使用长读下一代测序，可以对PCR产物进行测序，并且属于目标基因的所有读段可从最短到最长进行排列，或反之亦然。
如本文提及的两个或更多个基因可以在同一染色体上彼此相邻或彼此接近。备选地，它们可以在不同的染色体上。
在一个实施方案中，两个或更多个基因由FMR1和AFF2组成或包含FMR1和AFF2。FMR1和AFF2位于相邻染色体带中长臂上的同一染色体(X)上。这提供了一种同时测试包括FMR1和AFF2的两个或更多个基因的简单方法，FMR1和AFF2中的任一个都可造成患者表现出的疾病。
在一个实施方案中，该方法包括使核酸样品与以下接触：a)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；b)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；和C)通用引物，其包含与SEQ ID NO:3或(CGG)5(SEQ ID NO 15)的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，两个或更多个基因包括或选自SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12和DRPLA。在一个实施方案中，两个或更多个基因由两个、三个、四个、五个、六个或七个或更多个基因组成，所述基因包括或选自SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12和DRPLA。
在一个实施方案中，两个或更多个基因是HTT和JPH3。
在一个实施方案中，两个或更多个基因由ATXN1、ATXN2、ATXN3、CACNA1A、ATXN7、PPP2R2B和ATN1组成。
在一个实施方案中，两个或更多个基因包括或选自ATXN1、ATXN2、ATXN3、CACNA1A、ATXN7、PPP2R2B、ATN1、TBP、ATXN8、ATXN8OS、AR、HTT、JPH3、TCF4和DMPK，并且由这些基因中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个或全部组成。
在一个实施方案中，两个或更多个基因包括或选自FMR1、AFF2、NUTM2BAS1、LRP12、GIPC1、NOTCH2NLC、RILPL1、PABPN1和ARX，并且由这些基因中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部组成。
在一个实施方案中，两个或更多个基因包括或选自DAB1、SAMD12、STARD7、TNRC6A和RAPGEF2，并且由这些基因中的两个、三个、四个或全部组成。
在一个实施方案中，该方法包括使核酸样品与以下接触：a)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；b)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；c)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；d)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；e)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；f)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成；和/或g)基因特异性引物，其包含与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成，和h)通用引物，其包含与SEQ IDNO:14或(CTG)5(SEQ ID NO:16)的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列或由其组成。
本文公开了一种用于检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的试剂盒，该试剂盒包括：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物。
本文公开了包含从受试者获得的核酸样品的组合物，该组合物包含a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物。
本文公开了一种在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病的方法，该方法包括：i)使来自受试者的核酸样品在扩增条件下与以下接触：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；和ii)分析扩增产物以在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病。
术语“多重复扩展疾病”是指由某些基因中DNA重复基序(例如三核苷酸重复基序)的数量增加超过正常、稳定的阈值(每个基因的阈值不同)而引起的遗传性疾病。该术语旨在包括所有这种性质的疾病，并包括表1中列出的疾病。
表1.由不同重复基序的扩展引起的疾病
在一个实施方案中，一种或多种多重重复扩展疾病包括表1中列出的一种或多种疾病或由表1中列出的一种或多种疾病组成。
在一个实施方案中，一种或多种多重重复扩展疾病包含包括或选自以下的疾病或由其组成：脆性X综合征(FXS)、脆性X相关原发性卵巢功能不全(FXPOI)、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)和脆性XE非综合征性智力障碍(FRAXE NSID)。
在一个实施方案中，该方法区分FXS、FXPOI、FXTAS和FRAXE NSID。
在一个实施方案中，一种或多种多重重复扩展疾病是脊髓小脑性共济失调(SCA)和/或齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)。
在一个实施方案中，该方法区分SCA和DRPLA。在一个实施方案中，该方法区分不同的SCA类型和DRPLA。
在一个实施方案中，一种或多种多重重复扩展疾病是亨廷顿病(HD)和亨廷顿病样2(HDL2)。
在一个实施方案中，该方法区分亨廷顿病(HD)和亨廷顿病样2(HDL2)。
在一个实施方案中，该方法区分不同的眼咽远端型肌病(OPDM)类型、眼咽肌营养不良(OPMD)、伴有白质脑病的眼咽肌病(OPML)和发育性癫痫性脑病(DEE)。
在一个实施方案中，该方法区分不同的家族性成人肌阵挛性癫痫(FAME)类型和脊髓小脑性共济失调(SCA)类型37。
“受试者”或“患者”是指需要治疗的任何单个受试者，包括人、牛、马、猪、山羊、绵羊、狗、猫、豚鼠、兔、鸡、昆虫等。受试者还旨在包括参与临床研究试验但未显示出任何疾病临床体征的任何受试者或参与流行病学研究的受试者，或用作对照的受试者。
本文公开了一种在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病并治疗该受试者的方法，该方法包括：i)使来自受试者的核酸样品在扩增条件下与以下接触：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中不同靶序列在每个基因中的核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中共同靶序列位于核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的基因特异性引物结合的相反链上；其中基因特异性引物和通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；ii)分析扩增产物以在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病；和iii)治疗被发现患有至少一种多重重复扩展疾病的受试者。
术语“治疗”等还包括在至少一段时间内缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制病况的影响。还应理解的是，术语“治疗”等并不意味着病况或其症状被永久缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制，并且因此也涵盖病况或其症状的暂时缓解、减少、减轻、改善或以其他方式的抑制。
治疗受试者的方法可包括向受试者施用药物，或者可包括向受试者提供早期干预管理。
术语“施用”是指使如本文提及的抑制剂与受试者接触、将其施加、注射、输注或提供给受试者。
在整个本说明书和所附的声明中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”之类的变体将被理解为意味着包括所述整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
如本说明书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种方法”包括单种方法以及两种或更多种方法；提及“一种药剂”包括单种药剂以及两种或更多种药剂；提及“本公开”包括本公开教导的单个和多个方面；等等。本文教导和授权的方面涵盖在术语“发明”中。考虑了任何变体和衍生物。
本说明书中对任何现有出版物(或来源于其的信息)的引用，或对任何已知事项的引用，不是且不应被视为对现有出版物(或来源于其的信息)或已知事项构成本说明书所涉及的领域中的公知常识的部分的确认或承认或任何形式的意见。
实施例
现在将参考以下实施例对本发明的某些实施例进行描述，这些实施例仅旨在用于说明的目的，而不旨在限制上文所述主体的范围。
实施例1：FRAXA/FRAXE
材料和方法
生物样品
从出生在National University Hospital,Singapore的161个中国男婴、158个马来男婴和89个印度男婴的408个不相关且匿名的脐带血中提取基因组DNA。来自人类变体DNA组(HD100CAU和HD100AA-2)的另外44个高加索男性DNA样品和14个非裔美国男性DNA样品购自Coriell Cell Repositories(Camden,New Jersey,USA)。在测定验证中使用了由40个正常、17个FMR1前突变阳性、23个FMR1全突变阳性和6个AFF2扩展阳性样品组成的已归档和先前表征的基因组DNA。去识别化的正常和FMR1 CGG重复扩展阳性样品从KK Women’sand Children’s Hospital获得。AFF2 CCG重复扩展阳性样品为来自Baylor College ofMedicine(Houston,TX,USA)和The University of Adelaide(Adelaide,SouthAustralia,Australia)的去识别化的归档样品。六个AFF2 CCG重复扩展阳性样品中的四个是相关的。FX0230和FX0229分别为舅父和外甥，而DNA_25926和DNA_3802为父亲和女儿。
FMR1和AFF2三核苷酸重复的双重TP-PCR
对AFF2和FMR1三联体重复扩展的双重筛查利用了三引物(TP)PCR方法，涉及四个引物，Fam标记的FMR1-R(5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA-3’(SEQ ID NO:1))，Hex标记的AFF2-F(5’-CCATGTCGCGGCTTCTAGCTGTCCAGGCTCC-3’(SEQ ID NO:2))，和共享引物TP(5’-TGCTCTGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATACGGCGGCGGCGGCGG-3’(SEQ ID NO:3))以及尾部(5’-TGCTCTGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATA-3’(SEQ ID NO:4))。每个15μl PCR反应含有100ng的基因组DNA，2.5x Q-Solution(Qiagen,Hilden,Germany)，含有1.5mM的MgCl2的1x PCR缓冲液(Qiagen)，2mM dNTP(dGTP/dCTP与dATP/dTTP的比为5:1)(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)，各0.6μM的AFF2-F、FMR1-R和尾部引物，0.0006μM的TP引物以及5U的HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)。在95℃下进行初始15分钟的酶活化，接着是99℃ 45秒，55℃ 45秒和70℃ 8分钟(其中每个延伸周期增加15秒)的40个循环，并最后在72℃下延伸10分钟。
跨越FMR1和AFF2三核苷酸重复的标准PCR
跨越FMR1 CGG重复的标准/常规PCR利用了各0.6μM的引物5’-F1和Fam标记的FMR1-R，而跨越AFF2 CCG重复的PCR利用了Hex标记的AFF2-F和AFF2-R(5’-CGCTGCGGGCTCAGGCGGGCT-3’(SEQ ID NO:5))。除了在每个反应中使用50ng的基因组DNA之外，PCR反应和循环条件类似于上述提及的双重TP-PCR。
毛细管电泳
将2μl双重TP-PCR产物的等分试样与9μl的Hi-DiTM甲酰胺和0.5μl的GeneScanTM500ROXTM染料尺寸标准品(Applied Biosystems,Foster City,California,USA)混合，在95℃下变性5分钟，冷却至4℃，并在使用填充有POP-7TM聚合物的36cm毛细管的3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)中进行分辨。将混合物在1kV下电动注射5秒，并在60℃下电泳40分钟。使用GeneMapperTM软件v4.0(Applied Biosystems)进行分析。如果在初始的毛细管电泳(CE)运行后检测到扩展的等位基因，则使用在10kV下电动注射5秒，并在60℃下电泳40分钟进行第二次CE运行。
将1μl二十分之一稀释的标准PCR产物的等分试样与9μl的Hi-DiTM甲酰胺(AppliedBiosystems)和0.3μl的GeneScanTM500ROXTM染料尺寸标准品(Applied Biosystems)混合，在95℃下变性5分钟，冷却至4℃，并在使用填充有POP-7TM聚合物的36cm毛细管的3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)中进行分辨。将混合物在1.2kV下电动注射23秒，并在60℃下电泳20分钟。
使用GeneMapperTM软件v4.0(Applied Biosystems)进行CE后分析。
数据解读
引物AFF2-F与紧靠AFF2序列的CCG重复上游的AFF2序列退火并产生Hex标记的TP-PCR扩增子，而引物FMRI-R与紧靠FMR1序列的CGG重复下游的FMR1序列退火并产生Fam标记的TP-PCR产物。两种TP-PCR反应都使用常见的三引物(TP)引物和尾部引物，且它们的产物可以使用不同的荧光检测通道分别分析，也可以一起分析。TP引物被设计为与AFF2有义链或FMR1反义链上的任何一段五个CCG三核苷酸最佳退火。当存在连续不间断的一段超过五个的重复时，电泳图将展示出一系列连续的峰，这些峰彼此相距3bp。如果存在非CCG中断，电泳图将展示出荧光峰之间约18bp的间隙，相当于不存在5个荧光峰(图1)。不间断的一段的重复尺寸是连续荧光峰的总数加四(第一个荧光峰产生自与前5个重复退火的TP引物)。对于具有非CCG中断的等位基因，重复尺寸是连续荧光峰的总数加上缺失峰的总数，再加四。在杂合子女性中，将看到超过一定尺寸的峰的荧光强度会下降；较小等位基因的重复尺寸可从下降之前的峰的数量得出，而较大等位基因的重复尺寸可从峰的总数得出(数据未示出)。对于AFF2 TP-PCR反应，最左边的孤立峰不是在重复序列内产生的，而是由TP引物与紧靠CCG重复上游的(CCG)4CCT(SEQ ID NO:6)序列的退火产生的，所述CCG重复定义为在CTG三核苷酸之后开始(图1)。AFF2等位基因的尺寸和结构在结果中进一步详述。
AFF2 CCG重复的测序
除了所有引物都未标记之外，如上所述进行AFF2 TP-PCR和标准/常规PCR。根据制造商的说明,使用珠(Agencourt Bioscience,Beverly,Massachusetts,USA)纯化TP-PCR和标准/常规PCR产物，并使用NanodropTM1000分光光度计(Thermo ScientificTM,Waltham,Massachusetts,USA)进行定量。每个20μl测序反应含有10-50ng纯化的标准PCR或TP-PCR产物，1x Terminator Ready Reaction Mix(Applied Biosystems)，2.5x Q-Solution(Qiagen)和3.2pmol的AFF2-F引物。在96℃下进行初始变性1分钟，接着是98℃10秒、60℃ 5秒和60℃ 4分钟的25次循环。根据制造商的说明，使用Oligo Clean&ConcentratorTM柱(Zymo Research,Irvine,California,USA)纯化延伸产物。将洗脱的纯化延伸产物在Savant 浓缩仪(Thermo Scientific)中真空干燥5分钟，重悬于12μl的Hi-DiTM甲酰胺(Applied Biosystems)中，并在使用填充有POP-7TM聚合物的36cm毛细管的3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)中进行分辨。将混合物在1.2kV下电动注射16秒，并在60℃下电泳20分钟。使用测序分析软件v6.0(Applied Biosystems)进行后CE分析。
结果
对正常样品以及FMR1和AFF2三联体重复扩展阳性样品的双重TP-PCR的评估
X染色体上的FRAXE叶酸敏感性脆性位点与若干种医学病况有关，包括智力障碍、强迫症和卵巢早衰。FRAXE脆性是由AFF2(以前的FMR2)基因(ClinVar:VCV000010526.1)的外显子1中的5'非翻译区(UTR)内的CCG三核苷酸重复的过度扩展引起的。从范围为6-30个重复的正常等位基因过度扩展到>200个重复伴随着重复的CpG甲基化。这反过来又使AFF2表达沉默，AFF2是SEC-L2的亚基，其调节若干个基因的转录。AFF2 CCG重复过度扩展是导致脆性XE非综合征智力障碍(FRAXE NSID；OMIM 309548)(其是一种轻度(IQ 50-70)至临界(IQ 70-85)智力障碍，估计每50000至100000个男性中有一人受其影响)，以及还有其他认知/行为异常(包括强迫症)的遗传突变。矛盾的是，具有少于11个的重复或具有重复内或其附近的微缺失的等位基因在卵巢早衰患者中富集。将中等(31-60)重复尺寸与帕金森病(一种神经退行性运动系统疾病)联系起来的研究尚未得出结论。
FRAXE与X染色体上研究充分的脆性位点FRAXA共享相似的遗传特征，FRAXA具有更明确证明的临床参与。FRAXA位点在FMR1基因的外显子1中的5'UTR内含有CGG重复。FMR1CGG重复过度扩展至>200伴随着CpG甲基化和FMR1基因沉默，这导致脆性X综合征(FXS；OMIM309550)(ClinVar:VCV000009972.1)。FXS是智力障碍最常见的遗传性单基因原因，约每5000个男性中有一人以及每4000至8000个女性中有一人受其影响。前突变等位基因与许多行为特征有关，包括焦虑、强迫症和抑郁症。此外，约五分之一携带前突变等位基因(55-200个CGG重复)的女性患有脆性X相关原发性卵巢功能不全(FXPOI)。在2％的散发性POI和14％的家族性POI患者中鉴定了FMR1前突变，使FXPOI成为整倍体女性中POI最常见的遗传原因。此外，FMR1前突变携带者子集最终将会发展成脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)，这是一种以共济失调、震颤和帕金森综合征为特征的神经退行性疾病，约每4000个超过55岁的男性有1人以及每7800个超过55岁的女性中有1人受其影响。FMR1基因还与帕金森病有关。
尽管FRAXA和FRAXE脆性位点二者都与智力障碍密切相关，但与FXS相比，FRAXENSID的轻度至临界表型可引起确定不足和诊断不足。诊断不足可部分归因于缺乏快速、简单和廉价的测定来筛查FRAXE位点处的重复扩展。尽管已经描述了作为独立测定或多重测定的对FRAXE位点处的重复扩展的标准PCR方法，但它们无法检测大的前突变和全突变等位基因，这些等位基因的检测仍然依赖于Southern印迹分析。因为FRAXE的非综合征性质(即缺乏特征性和一致的临床表现，与例如FXS患者中存在的面部畸形(突出的耳朵、下巴、前额和长脸)和巨睾丸症形成对比)，因此分子诊断对于证实FRAXE至关重要。
最初利用了12个DNA样品来评估双重TP-PCR测定。图2和图3显示了产生自正常男性和女性以及FMR1和AFF2前突变(PM)或全突变(FM)个体的TP-PCR电泳图模式。由AFF2 TP-PCR反应产生的最左边的峰不是由TP引物在AFF2 CCG重复内的退火产生的，所述AFF2 CCG重复在5'侧翼序列的最后一个CTG三核苷酸之后开始。相反，迁移为明显的111bp片段的这个孤立峰由TP引物与紧靠重复段上游的(CCG)4CCT(SEQ ID NO:6)序列的退火产生(图1)。由TP引物与AFF2重复的CCG 1-5的退火而产生的第一个真峰在电泳图上作为明显的138bp片段出现。TP引物退火发生在含有五个连续CCG(CCG 2-6、3-7等)的重复段中的所有其他位置，其中最后的荧光峰由TP引物与重复段的最后五个CCG的退火产生。因此，AFF2等位基因的重复尺寸可以通过计数从重复段内产生的峰的数量(即排除最左边的孤立峰)并将该数量加上四来快速而容易地确定。
不存在超过55个重复的荧光峰指示不存在扩展，而延伸超过55个重复且最高达200个重复的连续荧光峰指示存在前突变(PM)等位基因，并且延伸超过200个重复的荧光峰指示存在全突变(FM)。这些结果指示，双重TP-PCR测定成功检测并准确鉴定了男性和女性DNA样品中的FMR1 CGG和AFF2 CCG重复前突变和全突变(图2和图3)。
群体等位基因分布与重复结构的鉴定
使用双重TP-PCR对总共466个男性DNA样品(包括161个中国人、158个马来人、89个印度人、44个高加索人和14个非裔美国人的DNA)进行基因分型，以确定等位基因尺寸分布(图4和表2)。在各种族中观察到不同的等位基因分布，其中中国人和马来人(分别为32.3％和27.8％)的众数AFF2重复尺寸为18，但高加索人(40.9％)、非裔美国人(50.0％)和印度人(32.6％)为15。与印度人(10-27)、高加索人(9-26)和非裔美国人(14-28)相比，中国人(5-31)和马来人(6-37)的等位基因尺寸范围更宽，这可能部分归因于中国人和马来人的样本大小更大。使用常规分类，24个样品具有最小等位基因(<11个重复)，440个样品具有正常的等位基因(11-30个重复)，以及剩余2个样品具有中等等位基因(31-60个重复)。未观察到前突变和全突变等位基因。这些结果类似于对中国汉族(众数18，范围9-26)和纽约市高加索人(众数16，范围8-34)中AFF2等位基因分布的早期研究(图4A-C)。
携带29个FMR1 CGG重复和18个AFF2 CCG重复组合的染色体是最常见的(图4D，上图)。在筛查的466个男性群体DNA样品中，观察到三种AFF2 TP-PCR电泳图模式。如GenomeReference Consortium Human Build 38(GRCh38)中记录的，最常见的模式存在于459个样品(98.1％)中，其代表了大多数正常和所有的中等等位基因，而通过Sanger测序鉴定另两种模式是由两种单核苷酸多态性(SNP)变体的存在引起的(图4D，下图)。
SNP变体之一，在chrX:148,500,637(rs868914124,GRCh38)处的T>C取代，在AFF2CCG重复的5'起始处将CTG三核苷酸转化为CCG。尽管rs868914124(T)常见等位基因中的AFF2三核苷酸重复在5'侧翼序列的最后一个CTG三核苷酸之后开始(图5A)，但该CTG三核苷酸在rs86891412(C)变体等位基因中成为CCG三核苷酸，从而将AFF2三核苷酸重复段向上游延伸2个CCG或6bp，以在5'侧翼序列的最后一个CAG三核苷酸之后开始(图5B)。因此，从rs868914124(C)变体等位基因的重复段内产生的第一TP-PCR产物作为明显的132bp荧光峰出现(图5B)，与来自rs868934124(T)常见等位基因的138bp第一个荧光峰(图5A)形成对比。在TP-PCR电泳图中，这种尺寸差异显示为与rs868914124(T)常见等位基因的26bp较宽间隙(图5A，C)相比，rs868914124(C)变体等位基因的AFF2 CCG重复的最左边孤立峰和第一个峰之间20bp的较窄间隙(图5B)。
在466个AFF2等位基因中的8个(1.72％)中观察到rs868914124(C)变体(图4D，下图，B行)，其中6个是马来人等位基因。与458个携带rs868941424(T)的样品中的21个相比，具有rs868914124(C)变体的8个样品中的3个含有最小等位基因(<11个重复)。使用Fisher精确检验(双尾)，观察到这种稀有的变体在马来人组中富集(优势比＝6.01；95％置信区间1.06-61.7；P＝0.021)，并且其具有最小等位基因(优势比＝12.3；置信区间1.79-68.4；P＝0.006)。引人关注的是，所有6个AFF2扩展的等位基因(5个全突变和1个前突变)都携带稀有的rs868914124(C)变体，尽管受影响的男性及其舅父的扩展等位基因，以及来自父女对的扩展等位基因在血统上被认为是相同的(图5D和图6和图7)。
与正常FMR1等位基因中常观察到的CGG重复内的AGG中断不同，我们只观察到一个在其重复段内含有非CCG中断的正常AFF2等位基因(0.21％)，即在第五个重复位置处的CTG中断(图4D，下图，C行和图5C)。这种中断是由在chrX:148,500,652(rs1389911365,GRCh38)处的C>T取代引起的。TP引物在包括这种中断的位置处的退火将导致错配的配对，并且无法从该位置产生PCR产物。在TP-PCR电泳图中，引物错配位置处失败的PCR作为无峰的间隙出现(图5C)。
引人关注的是，在所有6个AFF2扩展阳性样品中还观察到新的非CCG中断。基于四个AFF2 FM男性的TP-PCR电泳图模式(其显示峰簇之间有无峰/缺失峰的间隙)，最初怀疑的是重复内的中断(图3)。Sanger测序揭示，在重复的5'端存在一个或多个非CCG中断，其携带与紧靠重复上游5'的一段9个核苷酸相同的序列CCTGTGCAG。中断的数量从一个(图6A)到超过四个(图6B)变化。它们的位置也变化，例如从第8到第10个重复位置(图6A)或从第6到第8个位置(图7)。
我们观察到，在父女对(图7)中，AFF2 CCG重复扩展在父亲(DNA_25926)中是全突变而在女儿(DNA_3802)中是前突变，这指示了先前记录的在传递时的收缩。尽管外甥(FX0229)和舅父(FX0230)的AFF2全突变等位基因(图6)在血统上被认为是相同的，但他们的重复结构由于舅父中存在额外的非CCG中断而不同。这种差异的确切原因或机制尚未得到研究。
对先前表征的样品的双重TP-PCR测定的盲法验证
双重TP-PCR测定的盲法验证中包括82个已归档的和先前表征的基因组DNA。AFF2CCG重复如材料和方法中所述确定尺寸。双重TP-PCR测定准确地对测试中包括的所有40个正常、17个FMR1 PM、23个FMR1 FM和2个AFF2 FM样品进行了分类(表3)。
表2.五个群体中的AFF2 CCG重复等位基因频率。
CH，中国人；ML，马来人；IN，印度人；CAU，高加索人；AA，非商美国人
表3.具有或不具有FMR1或AFF2重复扩展的样品的一致性分析。
实施例2：脊髓小脑性共济失调(SCA)
材料和方法
生物样品
基因组DNA和细胞系从Coriell Cell Repositories(CCR；Coriell Institutefor Medical Research,Camden,NJ,USA)获得。NA06926、NA13536和NA13537各自携带扩展的ATXN1 CAG重复，NA14982携带扩展的ATXN2 CAG重复，GM06151携带扩展的ATXN3 CAG重复，NA03562携带扩展的ATXN7 CAG重复，以及NA13716和NA13717各自携带扩展的ATN1 CAG重复。GM16243携带扩展的FXN GAA重复，GM06907携带扩展的FMR1 CGG重复，以及GM05164和GM06075各自携带扩展的DMPK CTG重复。分别携带扩展的CACNA1A CAG重复和PPP2R2B CAG重复的两个临床DNA样品160920和183254从KK Women’s and Children’s Hospital获得。60个基因型已知的已归档DNA样品从Siriraj Hospital-Mahidol University获得，并包括在测定准确性的盲法评估中。
七重TP-PCR
在含有以下的25-μl反应中进行七重TP-PCR：10ng的基因组DNA，1.5x Q-Solution(Qiagen,Hilden,Germany)，含有1.5mmol/L的MgCl2的1x PCR缓冲液(Qiagen)，由各0.2mmol/L的dATP、dTTP、dCTP和dGTP组成的脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)混合物(RocheApplied Science,Penzberg,Germany)和2单位的HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen)。八个引物(七个荧光标记的基因座特异性引物和一个通用TP引物TP-R)以其各自的最佳工作浓度被包括在内。引物序列、荧光团标签和引物浓度显示于表4和表5中。在SimpliAmp热循环仪(Applied Biosystems-Thermo Fisher Scientific,Foster City,CA,USA)上，热循环由以下组成：在95℃下进行初始聚合酶活化15分钟，接着是98℃ 45秒，60℃ 1分钟和72℃ 2分钟的35个循环，并最后在72℃下延伸5分钟。
毛细管电泳(CE)
将1-μL荧光标记的TP-PCR产物的等分试样与9μL的Hi-DiTM甲酰胺(AppliedBiosystems)以及0.5μL的GeneScanTM500LIZTM染料尺寸标准(Applied Biosystems)混合，然后将其在95℃下变性5分钟，快速冷却至4℃，并在使用填充有POP-7TM聚合物的36-cm毛细管的3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)中进行分辨。将样品在1kV下电动注射15秒，并在60℃下电泳40分钟。使用GeneMapper 5.0软件(Applied Biosystems)进行GeneScan分析。来自每个基因座的扩增产物可以通过其产物尺寸范围和峰颜色来鉴定。七重TP-PCR产物展示出四种不同颜色的电泳峰，并且可以通过打开所有四个荧光检测通道一起分析，或者使用一个荧光检测通道同时关闭其他通道而分别地分析。
结果
通过单管七重TP-PCR检测扩展的CAG重复
脊髓小脑性共济失调(SCA)是一种神经退行性疾病，其引起小脑的退化，且有时引起脊髓的退化，并且其主要特征是步态共济失调步态、手眼协调不良和口齿不清。这些常染色体显性遗传疾病具有遗传多样性，并且可由常规突变以及重复扩展突变引起。总体来讲，全球范围内SCA的患病率平均为每100,000个体2.7例，其中SCA3最为常见。有超过40种遗传上不同的SCA，其中至少12种是由重复扩展引起的。其中，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12和SCA17是由异常的CAG三核苷酸重复扩展引起的。另一种疾病，齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)，也是由CAG重复扩展引起的，其由于其与其他SCA的异质性和重叠的临床表型而被归类为SCA。
SCA1是由染色体6p22.3上ATXN1基因的外显子8中的CAG重复扩展引起的。非扩展(正常)ATXN1等位基因含有6至44个CAT中断的CAG。当未中断时，含有36至38个CAG的等位基因是可变的正常等位基因，在传播给下一代时其可能扩展到致病性尺寸范围内，但与临床症状本身无关，而含有≥39个CAG的那些是致病性的。SCA2是由染色体12q24.12上ATXN2基因的外显子1中的CAG重复扩展引起的。正常ATXN2等位基因含有14至31个纯的或CAA中断的CAG，且含有32个CAG的那些是具有不确定临床意义的中间等位基因。含有33至500个CAG的等位基因是致病性的。SCA3或马查多-约瑟夫病是由染色体14q32.12上ATXN3基因的外显子10中的CAG重复扩展引起的。正常ATXN3等位基因含有12至44个CAG，而含有45至59个CAG的那些是易扩展的中间等位基因，且具有60至87个CAG的那些是全外显等位基因。SCA6是由染色体19p13.13上CACNA1A基因的外显子47中的CAG重复扩展引起的。正常CACNA1A等位基因含有≤18个CAG，而全外显等位基因含有20至33个CAG。含有19个CAG的CACNA1A等位基因具有不确定的临床意义。SCA7是由染色体3p14.1上ATXN7基因的外显子3中的CAG重复扩展引起的。正常ATXN7等位基因含有7至27个CAG，而含有28至33个CAG的那些是可变的正常等位基因，且具有≥34个CAG的等位突变是致病性的。SCA12是由染色体5q32上PPP2R2B基因的5'区中的CAG重复扩展引起的。正常的PPP2R2B等位基因含有7至32个CAG，而含有51到78个CAG的那些是全外显等位基因。DRPLA是由染色体12p13.31上ATN1基因的外显子5中的CAG重复扩展引起的。正常ATN1等位基因含有6至35个CAG，而含有≥48个CAG的那些是全外显等位基因。
各种SCA类型通常表现出明显不同的表型，并且由于广泛的临床重叠和其他伴随的非共济失调表型，因此通常难以单独通过体征和症状来区分。因此，分子遗传学检测是必要的，并且是鉴定致病突变以确认有症状个体疾病状态的唯一方法。由于在没有已知家族史或疾病特异性症状的情况下很难针对某些基因进行检测，因此鉴定致病基因可能耗时且昂贵。欧洲分子基因诊断质量联盟(European Molecular Genetics Quality Network)建议，所有实验室应最低限度地提供五种最常见的SCA类型(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6和SCA7)的检测，而其他类型的检测将取决于当地的流行情况。
不同SCA中CAG重复的检测和尺寸确定依赖于标准PCR或三引物PCR(TP-PCR)，然后是毛细管电泳。当仅检测到来自正常等位基因的单个片段时，通过标准PCR进行的重复尺寸确定通常必须伴随低通量和劳动密集型的Southern印迹分析来确认非常大的等位基因的存在并估计其重复尺寸，或者通过酶消化来确定扩展的ATXN1等位基因中CAT中断的存在。由Warner等人[24]首次描述的TP-PCR已广泛用于检测造成许多重复扩展疾病的重复扩展，无论扩展尺寸如何。其使用基因座特异性侧翼引物、三引物(TP)引物和尾部引物，并且能够检测非常大的扩展，准确地确定所有正常等位基因和适度扩展的尺寸，并通过不同的TP-PCR电泳图模式鉴定重复段内的中断。
由于在SCA患者中鉴定致病基因之前可能需要进行多轮遗传学检测，因此同时筛查不同疾病基因的三核苷酸重复除了节省多次检测的成本外，还可以促进更快地鉴定致病基因。我们报道了一种新的单管多重TP-PCR测定的开发，该测定能够同时筛查造成一些最常见SCA(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12和DRPLA)的七个基因座处的扩展突变。七重测定使用对每个重复基因座差异标记的基因座特异性侧翼引物，以及在CAG内退火的通用引物。
SCA七重TP-PCR测定利用位于每个疾病基因的CAG重复上游的荧光标记的基因座特异性侧翼引物和在所有CAG重复内退火的通用TP引物，以使来自七个不同SCA基因座的CAG重复能够在单个反应管中共同扩增。每个侧翼引物由四个荧光团(Ned、Vic、Fam或Pet)中的一个标记。此外，每个侧翼引物与其各自的重复段的距离不同，使得产生自一个重复基因座的正常等位基因的电泳峰不会与来自另一个用相同荧光团标记的重复基因座的正常等位的电泳峰重叠(图8)。七个侧翼引物的差异荧光团标记和定位的综合效应是，由每个重复基因座的正常等位基因产生的TP-PCR产物不重叠，并且可以在毛细管电泳后进行区分。重复数量是通过从电泳图左侧开始计数电泳峰来确定的，其中第一个峰代表重复段的前五个纯CAG(图8)。
首先在基因型已知样品上测试七重TP-PCR测定，以确认每个侧翼引物的基因座特异性退火以及在每个扩展的重复基因座处检测扩展的CAG重复。当TP引物与五个连续的CAG重复退火时，TP-PCR产生片段的混合物，每个片段相差一个三联体。所有基因座的最小扩增产物含有五个CAG三联体，除了ATXN3，由于ATXN3的野生型等位基因在第3和第6个三联体位置存在CAA，并且在第4个三联体位置存在AAG，因此ATXN3具有11个三联体(图8A)。电泳图展示了一系列连续的梯状峰(图8B)，因为TP引物在不间断的CAG重复内与多个位置退火(图8A)。每个连续的电泳峰代表TP-PCR产物，其大一个重复或三个碱基对，并且等位基因中的重复尺寸可以从计数峰的数量得出。ATXN1和ATXN2等位基因中可能发生的在重复段中间的非CAG中断的存在阻止了TP-聚合物在这些位置有效退火，导致峰簇之间不存在荧光峰。扩展阴性样品产生由两个位于正常重复尺寸范围内的非扩展(正常)等位基因产生的TP-PCR产物(图9)，而扩展阳性样品另外产生由扩展的等位基因产生的较长TP-PCR产物(图10)。重复尺寸超过特定重复基因座处的正常等位基因尺寸范围上限的样品将指示该重复基因座处的扩展(图10)。
盲法临床样品验证
为了评估七重TP-PCR测定准确鉴定受影响患者样品中七个重复基因座处的扩展的能力，对60个基因型已知的已归档临床DNA样品进行了盲法分析。在TP-PCR和毛细管电泳后，一次打开一个荧光检测通道，以便于对用不同荧光团标记的扩增产物分别进行分析。这使得在七个SCA基因座中的任一个处显示出超出正常等位基因尺寸范围上限的电泳峰的样品能够被明确地鉴定。对于对七个SCA重复扩展中的一个呈阳性的所有31个DNA样品(5个SCA1阳性、7个SCA2阳性、12个SCA3阳性、5个SCA6阳性、1个SCA7阳性和1个DRPLA阳性)，七重TP-PCR正确地检测到了预期SCA重复基因座中的重复扩展(表6)。在所有筛查阳性样品上进行涉及相关重复基因座的侧翼引物和通用TP引物的单重PCR，以确认结果(数据未显示)。在29个扩展阴性的DNA样品的任一个中均没有检测到扩展。
表4.SCA七重TP-PCR引物和预期的TP-PCR产物尺寸
表5.SCA七重预期TP-PCR产物尺寸
表6：60个基因型已知的已归档DNA样品的疾病状态和CAG重复尺寸
参考文献
Zhong,N.等人,A survey of FRAXE allele sizes in three populations.Am JMed Genet,1996.64(2):p.415-9.

Claims (21)

1.一种检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的方法，所述方法包括：
i)使所述核酸样品在所述两个或更多个基因的每一个的扩增条件下与以下接触：a)特异性地与各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中所述基因包含核苷酸重复序列，并且其中所述不同靶序列在所述核苷酸重复序列的上游或下游，和b)与由所述两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中所述共同靶序列位于所述核苷酸重复序列内并且位于由所述基因特异性引物结合的相反链上；其中所述基因特异性引物和所述通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；和
ii)分析所述扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使用尺寸分离技术或测序技术分析所述扩增产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述尺寸分离技术是基于电泳的技术。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述扩增产物根据尺寸进行分离。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中与参考相比，基因扩增产物的尺寸变化指示所述基因中存在重复扩展序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述重复扩展序列是三核苷酸重复扩展序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述三核苷酸重复序列选自(CGG)n、(CCG)n、(CAG)n,、(CTG)n、(GCC)n、(GGC)n、(GAA)n或(TTC)n，其中n为2至200或更大。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述通用引物包含独特的5'尾部序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括提供特异性地与所述通用引物的独特5'尾部序列结合的尾部引物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述通用引物与共同靶序列结合，所述共同靶序列包含5、6、7、8、9、10个或更多个连续的三核苷酸重复或由其组成。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述基因特异性引物被标记。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个基因由FMR1和AFF2组成或包含FMR1和AFF2。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括使所述核酸样品与以下接触：
a)包含与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；
b)包含与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；和
c)包含与(CGG)5(SEQ ID NO:15)或SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列或由其组成的通用引物。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个基因选自SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12和DRPLA。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法包括使所述核酸样品与以下接触：
a)包含与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；
b)包含与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；
c)包含与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；
d)包含与SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；
e)包含与SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；
f)包含与SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物；和/或
g)包含与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸或由其组成的基因特异性引物，以及
h)包含与(CTG)5(SEQ ID NO:16)或SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列或由其组成的通用引物。
16.一种用于检测从受试者获得的核酸样品中的两个或更多个基因中重复扩展序列存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中所述不同靶序列在每个基因中的所述核苷酸重复序列的上游或下游；和
b)与由所述两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中所述共同靶序列位于所述核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的所述基因特异性引物结合的相反链上；
其中所述基因特异性引物和所述通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物。
17.包含从受试者获得的核酸样品的组合物，所述组合物包含a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中所述不同靶序列在每个基因中的所述核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由所述两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中所述共同靶序列位于所述核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的所述基因特异性引物结合的相反链上；
其中所述基因特异性引物和所述通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物。
18.一种在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病的方法，所述方法包括：
i)使来自所述受试者的核酸样品在扩增条件下与以下接触：a)特异性地与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中所述不同靶序列在每个基因中的所述核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由所述两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中所述共同靶序列位于所述核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的所述基因特异性引物结合的相反链上；其中所述基因特异性引物和所述通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物；和
ii)分析所述扩增产物以在所述受试者中筛查所述一种或多种多重重复扩展疾病。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种多重重复扩展疾病包括脆性X综合征(FXS)、脆性X相关原发性卵巢功能不全(FXPOI)、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)和脆性XE非综合征性智力障碍(FRAXE NSID)或由其组成。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种多重重复扩展疾病为脊髓小脑性共济失调(SCA)和/或齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)。
21.一种在受试者中筛查一种或多种多重重复扩展疾病并治疗所述受试者的方法，所述方法包括：
i)使来自所述受试者的核酸样品在扩增条件下与以下接触：a)特异性与两个或更多个基因中各个基因的不同靶序列结合的基因特异性引物，其中每个基因包含核苷酸重复序列，并且其中所述不同靶序列在每个基因中的所述核苷酸重复序列的上游或下游；和b)与由所述两个或更多个基因共享的共同靶序列结合的通用引物，其中所述共同靶序列位于所述核苷酸重复序列内并且位于由每个基因的所述基因特异性引物结合的相反链上；其中所述基因特异性引物和所述通用引物能够从每个基因产生一种或多种扩增产物
ii)分析所述扩增产物以在所述受试者中筛查所述一种或多种多重重复扩展疾病；和
iii)治疗被发现患有至少一种多重重复扩展疾病的受试者。
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