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CN118147082A - 一种人声带白斑永生化上皮细胞及其培养方法和应用 - Google Patents

一种人声带白斑永生化上皮细胞及其培养方法和应用 Download PDF

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CN118147082A
CN118147082A CN202410400512.0A CN202410400512A CN118147082A CN 118147082 A CN118147082 A CN 118147082A CN 202410400512 A CN202410400512 A CN 202410400512A CN 118147082 A CN118147082 A CN 118147082A
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周水洪
傅子铭
王勤瑛
鲍洋洋
陈哲
钟江涛
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First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
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Abstract

本发明涉及一种人声带白斑永生化上皮细胞及其培养方法和应用，属于细胞培养技术领域。本发明提供了一种人声带白斑永生化上皮细胞：命名为hVCL‑MSDEP01，于2024年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202432，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，是一株新的细胞。该细胞状态良好，外形呈现鳞状上皮样表现，细胞大小无明显差别，均一性好。本发明的人声带白斑永生化上皮细胞具有很好的上皮细胞特性，能够表达永生化特征性蛋白，相比喉鳞状细胞癌上皮细胞系生长速度更低，凋亡率更高，能够作为声带白斑基础研究的细胞模型，为声带白斑发生发展为喉癌的基础研究提供了极为重要的实验材料。

Description

一种人声带白斑永生化上皮细胞及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人声带白斑永生化上皮细胞及其培养方法和应用。
背景技术
声带白斑是喉癌常见的癌前病变，临床上多是喉镜下声带组织上不易拭去的白色斑块，组织学类型较多，包含单纯鳞状上皮增生、轻、中、重度异型增生以及原位癌。明确声带白斑发生发展到喉癌的机制对于喉癌的预防至关重要。由于声带白斑组织病变体积较小且没有合适的体外永生化声带白斑上皮细胞系，相关的研究多局限于组织水平，缺乏良好的永生化上皮细胞模型。未经永生化处理的声带白斑上皮细胞普遍存在衰老迅速、培养周期短的问题，多在10代以内出现细胞生长缓慢、体积增大、胞内空泡增多、胞核增大、细胞间距增加等细胞衰老现象。体外获得的上皮细胞数量仍不足以进行多项分子学实验，增加了实验的成本和周期。声带白斑上皮细胞有原代细胞，但由于不是肿瘤细胞不具有体外无限增殖性，所以一直没有稳定的声带白斑上皮细胞系。同时，声带白斑的病变组织通常很小，组织重量平均在0.3-0.4g，刨除需要送检病理科的组织后剩下的样本量约在0.1-0.2g左右，所以其他学科领域的细胞培养方法对于声带白斑上皮细胞的提取与培养具有很大难度。申请人前期研究体外成功构建人白斑上皮细胞三维培养模型(CN110484488A)，但是利用该人白斑上皮细胞三维培养模型的构建方法培养白斑细胞获得的声带白斑原代细胞，但其未进行永生化处理，而且其声带白斑原代细胞获得率较低，其原代培养需要相对较多的样本量，在原代培养的过程中，声带白斑上皮层与基底层的分离较困难，耗费时间较久，且后期容易出现成纤维细胞抑制上皮细胞生长的情况，降低培养成功率，这进一步限制了永生化的声带白斑上皮细胞系的建立。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种人声带白斑永生化上皮细胞及其培养方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种人声带白斑永生化上皮细胞，所述人声带白斑永生化上皮细胞命名为hVCL-MSDEP01，于2024年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202432，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明提供了一种新的人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01，STR位点和Amelogenin位点鉴定结果显示，本发明的人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01与细胞库里所有细胞均无法匹配，是一株新的细胞系。本发明的人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01状态良好，细胞内部无明显空泡，外形呈现鳞状上皮样表现，细胞之间分界清楚，大小无明显差别，均一性好。经过鉴定，本发明的人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01能够表达上皮细胞特异性蛋白(Keratin 17/19，E-cadherin、Keratin 8/18)和永生化蛋白(SV40 LT Antigen)；且生长曲线显示其无明显的生长平台期。
本发明成功获得永生化的声带白斑上皮细胞系，为声带白斑的研究提供了良好的研究材料。本发明的人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01为来源于声带的非肿瘤上皮细胞系，该细胞系处于癌前病变范围内，其内部存在部分正常细胞和趋于癌变的细胞。本发明的hVCL-MSDEP01保证了细胞的上皮细胞特性，且与喉鳞状细胞癌上皮细胞系SNU-899相比，永生化声带白斑上皮细胞系生长速度更低，拥有更高的凋亡率，与肿瘤细胞模型之间存在差异，可以作为研究模型，为声带白斑基础研究提供重要的上皮细胞模型。
第二方面，本发明提供了上述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、将声带白斑组织消化后利用PneumaCultTMEx培养基培养得到声带白斑原代上皮细胞；
S2、声带白斑原代上皮细胞继续利用PneumaCultTMEx培养基培养并传代至第2-3代，然后利用SV40慢病毒转染，筛选出SV40表达阳性且稳定的细胞，继续培养1-2代得到转染稳定的细胞，然后利用无血清培养基培养，即得人声带白斑永生化上皮细胞。
本发明利用PneumaCultTMEx培养基培养声带白斑组织消化后的细胞，并进一步培养声带白斑原代上皮细胞以及SV40慢病毒转染后的细胞，最终成功培养出人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01。PneumaCultTMEx培养基是一种无血清培养基，利用PneumaCultEx培养基，不仅更适宜上皮细胞的生长，还能够抑制成纤维细胞的生长，进一步保证了上皮细胞的单一性，本发明利用该培养基能够成功培养出人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01，换成常规含有血清的DMEM/F12等培养基无法实现。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，所述消化利用的消化液的组成为：Advanced DMEM/F12、分散酶II(Dispase II)2～2.4U/mL、胶原酶I40～45μg/mL、胎牛血清(FBS)2～3％和青链霉素1～1.5％。
发明利用CN110484488A专利培养原代细胞并永生化处理，基本无法有效得到永生化的上皮细胞，因其原代细胞获得率较低。本发明通过对消化体系(消化液)的调整：利用Advanced DMEM/F12和2～3％的FBS向组织块提供营养避免组织块与其中的细胞活力降低，1～1.5％青链霉素防止摇床消化时细胞污染；严格把控消化酶酶量，分散酶II使用量应低于2.4U/mL，胶原酶应使用I型，避免使用消化力度更强的IV型。本发明正是利用该消化液对声带白斑组织的细胞进行初步分选，即保证上皮细胞充分消化解离，又能避免成纤维细胞的解离以及上皮细胞的损伤，保留尽可能多的原代上皮细胞；原代上皮细胞获得率较高，进而成功培养出永生化的上皮细胞。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，所述消化利用的消化液的组成为：Advanced DMEM/F12、分散酶II(Dispase II)2～2.4U/mL、胶原酶I40～45μg/mL、胎牛血清(FBS)2％和青链霉素1％。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，步骤S1中，所述声带白斑组织利用消化液消化前，先利用含有青霉素-链霉素的PBS溶液清洗，然后剪切为0.8～1.2mm3的组织块。
本发明的声带白斑组织在消化前，先利用含有双抗的PBS溶液清洗，避免细胞污染的问题，将声带白斑组织剪切为0.8～1.2mm3的组织块，加快声带白斑组织的消化速度，节省消化时间。剪切后的组织块更容易被消化，且能够避免因消化时间过长导致成纤维细胞的解离，保证上皮细胞的单一性。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，所述声带白斑组织利用消化液消化前，先利用含有体积百分比为1％的青霉素-链霉素的PBS溶液清洗，然后剪切为1mm3的组织块。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，所述消化的时间为60-120min；优选地，所述消化的时间为100min。本发明通过对消化时间的控制，即保证上皮细胞的充分解离消化，又能避免成纤维细胞的解离消化，能够进一步保证上皮细胞的单一性。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，所述声带白斑组织利用消化液消化，利用含有体积百分比为10％的FBS的DMEM/F12完全培养基终止消化，终止消化后过滤得到细胞悬液，离心，得到细胞沉淀，细胞沉淀利用PneumaCultTMEx培养基重悬后培养至细胞贴壁，细胞贴壁后去除培养基，即得声带白斑原代上皮细胞。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，步骤S1中，所述消化的温度为35～37℃。该消化温度下，即能保证消化液中消化酶的活性，也能保证细胞的良好活性。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，步骤S2中，声带白斑原代上皮细胞利用新鲜PneumaCultTMEx培养基培养，每1-2天更换一次培养基，培养至细胞密度达70％-80％后进行传代培养。所述传代培养为：细胞密度达70％-80％后移除培养基，然后利用含有青霉素-链霉素的PBS溶液清洗，清洗后的细胞利用胰蛋白酶消化液消化，终止消化后过滤，得到细胞悬液，离心，收集细胞沉淀，细胞沉淀利用PneumaCultTMEx培养基重悬，然后按照1：(1～3)传代比例进行培养。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，所述胰蛋白酶消化液为含有0.02％EDTA、0.25％胰蛋白酶的消化液；所述消化的温度为35-37℃，所述消化的时间为3-5min。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，步骤S2中，所述利用SV40慢病毒转染是将声带白斑原代上皮细胞利用含有SV40慢病毒和转染增强剂的PneumaCult Ex培养基培养(3天)，然后换用含有1～1.5％青霉素-链霉素的PneumaCult Ex培养基继续培养，传代培养2-3代后检测SV40表达情况。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，步骤S2中，所述无血清培养基由体积百分比的以下组分组成：混合培养基98.5～99％和青霉素-链霉素1～1.5％；所述混合培养基为PneumaCult Ex培养基和Advanced DMEM/F12培养基的混合物，PneumaCult Ex培养基和Advanced DMEM/F12培养基的体积比为(2.8～3.2):1。
作为本发明所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法的优选实施方式，步骤S2中，所述无血清培养基由体积百分比的以下组分组成：混合培养基99％和青霉素-链霉素1％；所述混合培养基为PneumaCult Ex培养基和Advanced DMEM/F12培养基的混合物，PneumaCult Ex培养基和Advanced DMEM/F12培养基的体积比为3:1。
第三方面，本发明提供了上述人声带白斑永生化上皮细胞在声带白斑研究模型中的应用。
本发明的人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01具有永生化，能够作为细胞模型/研究模型用于声带白斑相关领域的基础研究，为声带白斑的研究提供研究材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种永生化的人声带白斑上皮细胞：人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01，该细胞状态良好，细胞内部无明显空泡，外形呈现鳞状上皮样表现，细胞之间分界清楚，大小无明显差别，均一性好。本发明的人声带白斑永生化上皮细胞具有很好的上皮细胞特性，能够表达永生化特征性蛋白，生长速度较低，凋亡率更高，区别于肿瘤细胞模型，能够作为研究模型。本发明填补了永生化声带白斑上皮细胞系的空白，获得的细胞株具有和体内最接近的性状，且能够稳定提供后续实验的细胞来源，为声带白斑发生发展为喉癌提供了极为重要的实验材料，也为建立稳定的声带白斑细胞体外模型和进一步探索其相关功能奠定了较好的研究基础，对研究声带白斑的形成机理及其治疗方法具有重大意义。
附图说明
图1为本发明实施例2中声带白斑永生化上皮细胞传代培养1天后的细胞形态；
图2为本发明实施例2中声带白斑永生化上皮细胞传代培养2天后的细胞形态，其中A代表40倍放大图，B代表100倍放大图；
图3为本发明实施例2中声带白斑永生化上皮细胞传代培养4天后的细胞形态；
图4为本发明实施例2中声带白斑永生化上皮细胞基因分型图谱；
图5为本发明实施例3中检材1细胞基因分型图谱；
图6为本发明实施例3中检材2细胞基因分型图谱；
图7为本发明对比例中声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基传代培养1天后的细胞形态；
图8为本发明对比例中声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基传代培养3天后的细胞形态；
图9为本发明对比例中声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基传代培养5天后的细胞形态；
图10为本发明实施例4中细胞特征性蛋白Western Blot检测结果，其中SV40-hVCLP8/P16/P20/P24/P28分别指传代8/16/20/24/28代的声带白斑永生化上皮细胞；
图11为本发明实施例4中SV40-hVCL细胞免疫荧光结果图；
图12为本发明实施例5中SV40-hVCL与SNU-899细胞周期流式结果，其中A代表SV40-hVCL，B代表SNU-899；
图13为本发明实施例6中SV40-hVCL与SNU-899流式细胞凋亡结果，其中A代表SV40-hVCL，B代表SNU-899；
图14为本发明实施例7中细胞生长曲线测定结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PneumaCultTMExMedium(PneumaCultTMEx培养基)，STEMCELL Technologies公司。
实施例1声带白斑永生化上皮细胞的培养
1、声带白斑原代上皮细胞的培养
从声带白斑患者临床手术获取的声带组织上的白色斑块标本中获得的声带白斑组织，4℃保存于含有1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中。
(1)消化消化液：3mLGibco Advanced DMEM/F12+1mL8 U/mL分散酶II+80μL2μg/μL胶原酶I+80μLFBS+1％青链霉素。
本发明的消化液满足：Advanced DMEM/F12、分散酶II(Dispase II)、胶原酶I、胎牛血清(FBS)和青链霉素整个体系中分散酶II(Dispase II)浓度为2～2.4U/mL、胶原酶I浓度为40～45μg/mL、胎牛血清(FBS)浓度为2～3％和青链霉素浓度为1～1.5％均可。
在无菌操作台内，将声带白斑组织转移至含有1％青霉素-链霉素的PBS的溶液中进行清洗2-3遍，用眼科剪和眼科镊对组织进行修剪，剔除组织样本上的血凝块，并剪切为大小1mm3左右的组织块，然后将组织块转移至消化液中，并置于水平恒温摇床上，以70rpm转速在37℃环境下消化100min，然后加入消化液相同体积的含有10％FBS的DMEM/F12完全培养基终止消化；终止消化后用移液枪吹打消化液中的组织块，吹落粘附在组织块上的细胞，得到的混合物用100μm的滤网过滤得到细胞悬液，细胞悬液用1100rpm离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。
(2)原代培养
将上述细胞沉淀用PneumaCultTMEx培养基(STEMCELL)进行重悬，将得到的细胞悬液接种在六孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱进行培养，接种第二天观察细胞贴壁情况，待细胞贴壁后更换新鲜的PneumaCultTMEx培养基，清除培养基中的细胞碎片和死细胞，即得声带白斑原代上皮细胞；之后每1-2天更换一次培养基，每3天在倒置荧光显微镜下拍照记录；待细胞密度增加到70％-80％或一定区域内细胞生长出现接触抑制，可进行细胞传代。
(3)传代培养
待细胞密度增加到70％-80％或细胞增殖至出现接触抑制后，用移液枪移除培养基，用含有1％青霉素-链霉素的PBS溶液清洗2-3遍，加入含有0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液，37℃、5％ CO2消化3-5min，加入胰蛋白酶消化液等体积的含有10％FBS的DMEM/F12培养基消化终止，得到细胞悬液；细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，用PneumaCult Ex培养基重悬，重悬的细胞悬液按照1:2传代比例将细胞重新接种在培养瓶/培养皿中。
2、声带白斑永生化上皮细胞的培养
将声带白斑原代上皮细胞传代至第2-3代时，可以考虑SV40慢病毒转染。为避免非肿瘤细胞在体外培养过程中出现衰老，应尽可能早地转染永生化病毒。
将生长密度在50％-60％的传代至第2代的声带白斑原代上皮细胞从培养箱中取出，用移液枪移除培养基，加入不含有青霉素-链霉素的PBS清洗细胞2-3遍，过程尽可能轻柔避免将贴壁细胞吹落。
取SV40慢病毒(和元生物技术(上海)股份有限公司，H20635，pLenti-CMV-SV40gp6-WPRE)，每1mLPneumaCult Ex培养基中加入10μLSV40慢病毒(滴度：5.38×108TU/mL)和1μL转染增强剂(和元生物技术(上海)股份有限公司)，将培养基和慢病毒混匀得到转染培养基，加入到生长密度约60％-70％的声带白斑原代上皮细胞培养瓶中，摇匀后放入37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜培养。每天利用新配置的转染培养基进行更换，连续3天。转染3天后，将转染培养基更换为含有1％青霉素-链霉素的PneumaCult Ex培养基，每天更换一次并观察细胞状态，避免培养基中出现污染或细胞质内出现空泡。
转染SV40病毒后声带白斑原代上皮细胞3-4天即可长满T25培养瓶，细胞长满后，按照1:2比例进行传代。传代培养2-3代后，利用Western Blot、qPCR等技术检测细胞中SV40表达情况，表达阳性且稳定，继续培养1-2代待慢病毒转染稳定后，将细胞的培养基(含有1％青霉素-链霉素的PneumaCultEx培养基)更换为无血清培养基(74％ PneumaCult Ex培养基+25％ Advanced DMEM/F12+1％青霉素-链霉素)后续进行常规培养，得到声带白斑永生化上皮细胞。
待声带白斑永生化上皮细胞长至密度约70％-80％时考虑冻存细胞。弃培养基，用含有1％青霉素-链霉素的PBS清洗2-3遍，加入含有0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液，37℃、5％ CO2消化3-5min，加入胰蛋白酶溶液等体积的含有10％FBS的DMEM/F12培养基消化终止，得到细胞悬液；细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，利用细胞冻存液重悬细胞沉淀，然后转移至细胞冻存管中，做好标记放入程序性降温冻存盒中；冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，第2天取出冻存管转移至液氮罐中长期保存；所述细胞冻存液为90％PneumaCult Ex培养基+10％ DMSO，或新赛美的无血清细胞冻存液。
实施例2声带白斑永生化上皮细胞的鉴定
1、声带白斑永生化上皮细胞的形态学鉴定
将实施例1得到声带白斑永生化上皮细胞利用无血清培养基(74％ PneumaCultEx培养基+25％ Advanced DMEM/F12+1％青霉素-链霉素)培养1代，利用倒置显微镜观察细胞形态。
声带白斑永生化上皮细胞传代培养1天后的细胞形态如图1所示，结果显示，声带白斑永生化上皮细胞状态良好，细胞内部无明显空泡，外形呈现鳞状上皮样表现，细胞之间分界清楚，大小无明显差别，细胞生长速度良好，可以保证传代后3-4天长满培养瓶。
声带白斑永生化上皮细胞传代培养2天后的细胞形态如图2所示，其中A代表40倍放大图，B代表100倍放大图。结果显示，传代培养2天后，细胞数量相较于前一天可见细胞数量明显增加，细胞整体呈现鳞状上皮样特征，细胞内部无明显空泡，没有出现细胞衰老。
声带白斑永生化上皮细胞传代培养4天后的细胞形态如图3所示，结果显示，传代培养4天后，细胞已生长成片，鳞状上皮样，细胞内无明显空泡，可以进行下次传代。
2、声带白斑永生化上皮细胞的短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)鉴定将实施例1得到声带白斑永生化上皮细胞送中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库进行鉴定。
提取声带白斑永生化上皮细胞的DNA，采用MicroreaderTM21 ID System扩增20个短串联重复序列(STR)位点和Amelogenin性别鉴定位点，使用ABI 3730xl型遗传分析仪进行PCR产物检测，使用GeneMapperID-X软件(Applied Biosystems)对检测结果进行分析，并与ATCC、DSMZ和ExPASy数据库进行比对。
声带白斑永生化上皮细胞DNA扩增后图谱清晰，分型结果良好，声带白斑永生化上皮细胞基因分型图谱如图4所示。
声带白斑永生化上皮细胞的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果及与数据库对比结果如表1所示，表1
表1结果显示，声带白斑永生化上皮细胞的Amelogenin位点为Amelogenin，STR位点包括D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、vWA、TH01、TPOX和CSF1PO。本发明的声带白斑永生化上皮细胞(检测样品)与ATCC中UACC-732Breast Adenocarcinoma Human细胞、DSMZ中1987-05-01 00:00:00、ExPASy中AIDHC-00138的数据匹配率均低于80％，说明本发明的声带白斑永生化上皮细胞为新细胞。
本发明的声带白斑永生化上皮细胞，命名为人声带白斑永生化上皮细胞hVCL-MSDEP01，于2024年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202432，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例3声带白斑永生化上皮细胞同源性鉴定
收集实施例2的声带白斑永生化上皮细胞的细胞沉淀，记为检材1；采集声带白斑永生化上皮细胞来源的声带白斑组织对应患者的血液，记为检材2。鉴定检材1和检材2是否为同一来源，是否存在交叉污染现象。
取适量检材用Microread Genomic DNA Kit提取DNA，采用MicroreaderTM21 IDSystem扩增20个STR位点和性别鉴定位点，使用ABI 3730xl型遗传分析仪进行PCR产物检测，使用GeneMapperID-X软件(Applied Biosystems)对检测结果进行分析。
检材1和检材2细胞DNA扩增后图谱清晰，分型结果良好，检材1细胞基因分型图谱如图5所示；检材2细胞基因分型图谱如图6所示。
检材1的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果如表2所示，
表2
检材2的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果如表3所示，
表3
表2和表3中，Marker列为检测基因座(位点)，Allele1/2/3为检测基因座分型。出现三个以上基因座有三个分型的，可能有其他来源的人源细胞污染。
表2和表3结果显示，检材1和检材2在20个基因座中的匹配率为100％，两者可视为同一来源。未出现三个以上基因座有三个分型的情况，无人源细胞污染。
对比例
将实施例1得到声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基(DMEM/F12+10％ FBS+1％青霉素-链霉素)培养1代，利用倒置显微镜观察细胞形态。
传代培养第2天及之后可以观察到声带白斑永生化上皮细胞状态开始变差：细胞中可见透亮区，细胞失去鳞状上皮样形态，细胞开始变狭长变形，细胞间分界不再清晰，细胞大小变化差异大，此为细胞趋于衰老的表现。同时细胞生长速度减缓，每日换液仅可见衰老凋亡的细胞并未见细胞生长。
声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基传代培养1天后的细胞形态如图7所示，结果显示，细胞生长速度减缓，细胞形态变狭长，胞质透亮，说明细胞状态不佳。
声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基传代培养3天后的细胞形态如图8所示，结果显示，相较于第1天细胞增殖速度更慢，细胞形态变狭长，胞质透亮，说明细胞状态不佳。
声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基传代培养5天后的细胞形态如图9所示，结果显示，细胞明显增大，相邻细胞之间开始出现细胞融合现象，边界不清，失去鳞状上皮样特征，说明细胞趋近于衰老和生长极限。
综上可知，声带白斑永生化上皮细胞利用含血清培养基培养效果不佳，利用无血清培养基培养效果更好。
实施例4细胞特征性蛋白检测
1、利用Western Blot检测实施例1的声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)和声带白斑原代上皮细胞(Pri-hVCL)的特征性蛋白分别取SV40-hVCL和Pri-hVCL转移至5mL离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，每管加入1mLPBS重悬，细胞悬液转移至1.5mLEP管内，再次1000rpm离心5min。弃上清，每个EP管中加入150μLRIPA裂解液和1.5μL蛋白酶抑制剂混合液(100×)，充分混匀后置于冰上裂解20min。裂解完成后，12000rpm离心5min，将上清液转移至新EP管中并做好标记，用BCA蛋白浓度检测试剂盒定量蛋白浓度。标定每管蛋白浓度后，根据最终体积加入1/4体积的5×蛋白质上样缓冲液，用移液枪轻轻混匀。放入金属加热浴中，100℃加热5min，使蛋白质变性。获得的样本直接用于Western Blot电泳，结果使用软件ImageJ软件分析处理。
永生化相关蛋白：SV40 LT Antigen(90kDa)；上皮细胞相关蛋白：E-Cadherin(120kDa)、Keratin 17/19(48/41kDa)；内参蛋白：GAPDH(36kDa)。
细胞特征性蛋白Western Blot检测结果如图10所示，其中SV40-hVCL P8/P16/P20/P24/P28分别指传代8/16/20/24/28代的声带白斑永生化上皮细胞；结果显示，声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)可以表达上皮细胞特异性蛋白Keratin 17/19，E-cadherin，永生化蛋白SV40 LT Antigen；而声带白斑原代上皮细胞(Pri-hVCL)仅能表达上皮细胞特异性蛋白Keratin 17/19，E-cadherin，不表达永生化蛋白SV40 LT Antigen。
2、利用免疫荧光实验检测实施例1的声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)的特征性蛋白。
消化生长状态良好，稳定传代的SV40-hVCL，传代至12孔板中，充分摇匀后置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养过夜。正常换液培养至12孔板中细胞密度达到70％-80％，弃培养基，用含1％青链霉素的PBS清洗细胞2-3遍，加入适量4％多聚甲醛通用型组织固定液，室温固定15-20min，然后使用含0.1％TritonX-100的PBS溶液清洗细胞2-3遍，每次5min。每孔加入免疫荧光快速封闭液，室温摇床封闭30min。PBS清洗细胞3遍，每次5-10min。4℃孵育一抗过夜。PBS清洗细胞3遍，每次5-10min。室温避光摇床孵育1h。再次PBS清洗细胞3遍，每次5-10min。使用抗荧光衰减封片剂(含DAPI)室温处理10min。置于倒置荧光显微镜下依次观察拍摄明场、FITC场、DAPI场的100×图片。
上皮细胞特征性蛋白：E-Cadherin、Keratin 8/18；成纤维细胞相关蛋白：Vimentin。
SV40-hVCL细胞免疫荧光结果图如图11所示，结果显示，声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)可以表达上皮细胞特异性蛋白Keratin8/18，E-cadherin；不表达成纤维细胞相关蛋白Vimentin。
实施例5细胞生长速度测定
采用流式细胞术检测实施例1的声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)的细胞周期分布。以喉鳞状细胞癌上皮细胞(SNU-899)作为对比。
分别消化收集大约2×105-1×106个生长状态良好、稳定传代的SV40-hVCL与SNU-899，1000rpm离心5min，弃上清。PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心5min，弃上清。加入细胞周期流式检测试剂盒中1mLDNA Staining solution和10μLPermeabilization solution，涡旋振荡5-10s混匀。室温避光孵育30min。选择最低上样速度，在流式细胞仪上检测细胞PI染料染色情况。
SV40-hVCL与SNU-899细胞周期流式结果如图12所示，其中A代表SV40-hVCL，B代表SNU-899；
结果显示，声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)生长速度低于喉鳞状细胞癌上皮细胞(SNU-899)。
实施例6细胞凋亡情况测定
采用流式细胞术检测实施例1的声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)的凋亡程度。以喉鳞状细胞癌上皮细胞(SNU-899)作为对比。
分别消化收集大约1×106-3×106个稳定传代SV40-hVCL和SNU-899细胞，用预冷的PBS离心洗涤两次，弃上清，使用联科生物Annexin V-FITC/PI apoptosis kit检测细胞凋亡。加入500μLApoptosis Positive Control Solution重悬，置冰上孵育30min。用预冷PBS离心洗涤，弃上清。加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5mL，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。单染管中加入5μLAnnexin V-FITC或10μLPI，室温避光孵育5分钟。在流式细胞仪上，用空白管调节FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。通过FITC检测通道(Ex＝488nm；Em＝530nm)检测Annexin V-FITC染色情况和通过PI检测通道(Ex＝535nm；Em＝615nm)检测PI染色情况。
SV40-hVCL与SNU-899流式细胞凋亡结果如图13所示，其中A代表SV40-hVCL，B代表SNU-899；
结果显示，声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)凋亡明显高于喉鳞状细胞癌上皮细胞(SNU-899)。
实施例7细胞生长曲线测定
细胞计数实验(cell counting kit-8assay，CCK8)检测实施例1的声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)和声带白斑原代上皮细胞(Pri-hVCL)的细胞生长曲线。
消化生长状态良好，稳定传代的SV40-hVCL或Pri-hVCL，传代至96孔板中，另做4个单独培养基的空白孔，充分摇匀后置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养过夜。种板后24h选择4孔细胞和4孔空白孔加入10％培养基体积的CCK8试剂，避免气泡产生，充分摇匀后37℃5％CO2细胞培养箱中培养3h。使用酶标仪测定450nm波长的吸光值(OD值)。
细胞生长曲线测定结果如图14所示，结果显示，声带白斑原代上皮细胞(Pri-hVCL)出现明显的生长平台期，而声带白斑永生化上皮细胞(SV40-hVCL)未见明显的生长平台期。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种人声带白斑永生化上皮细胞，其特征在于，所述人声带白斑永生化上皮细胞命名为hVCL-MSDEP01，于2024年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C202432，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
2.权利要求1所述人声带白斑永生化上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将声带白斑组织消化后利用PneumaCultTMEx培养基培养得到声带白斑原代上皮细胞；S2、声带白斑原代上皮细胞继续利用PneumaCultTMEx培养基培养并传代至第2-3代，然后利用SV40慢病毒转染，筛选出SV40表达阳性且稳定的细胞，继续培养1-2代得到转染稳定的细胞，然后利用无血清培养基培养，即得人声带白斑永生化上皮细胞。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤S1中，所述消化利用的消化液的组成为：Advanced DMEM/F12、分散酶II2～2.4U/mL、胶原酶I 40～45μg/mL、胎牛血清2～3％和青链霉素1～1.5％。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤S1中，所述消化的温度为35～37℃；和/或，所述消化的时间为60-120min。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤S1中，所述声带白斑组织利用消化液消化前，先利用含有青霉素-链霉素的PBS溶液清洗，然后剪切为0.8～1.2mm3的组织块。
6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤S2中，声带白斑原代上皮细胞利用新鲜PneumaCultTMEx培养基培养，每1-2天更换一次培养基，培养至细胞密度达70％-80％后进行传代培养；
和/或，所述传代的比例为1：(1～3)。
7.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤S2中，所述利用SV40慢病毒转染是将声带白斑原代上皮细胞利用含有SV40慢病毒和转染增强剂的PneumaCult Ex培养基培养，然后换用含有1～1.5％青霉素-链霉素的PneumaCult Ex培养基继续培养。
8.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤S2中，所述无血清培养基由体积百分比的以下组分组成：混合培养基98.5～99％和青霉素-链霉素1～1.5％；所述混合培养基为PneumaCult Ex培养基和Advanced DMEM/F12培养基的混合物，PneumaCult Ex培养基和Advanced DMEM/F12培养基的体积比为(2.8～3.2):1。
9.权利要求1所述人声带白斑永生化上皮细胞在声带白斑研究模型中的应用。
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