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CN112126627B - 一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用 - Google Patents

一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用 Download PDF

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CN112126627B
CN112126627B CN202011055337.4A CN202011055337A CN112126627B CN 112126627 B CN112126627 B CN 112126627B CN 202011055337 A CN202011055337 A CN 202011055337A CN 112126627 B CN112126627 B CN 112126627B
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corneal epithelial
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immortalized
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用，包括以下步骤：将实验犬麻醉后，采集角膜组织，收集角膜上皮组织，进行上皮细胞原代培养；将纯化后的原代犬角膜上皮细胞进行携带SV40T抗原基因的病毒转染，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。本发明方法建立的细胞易于培养，增殖快，且具有血清依赖性，无肿瘤变，有利于进行角膜相关疾病致病机理、药物开发和疾病防治的体外研究，提供基础材料制备方法。

Description

一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用。
背景技术
犬作为最常见的伴侣动物，近年来其饲养数目不断提升。由于犬生性好动，加之眼部解剖结构的特殊性，由外伤、真菌、细菌、病毒等原因造成的角膜疾病成为常见的眼科疾病。角膜上皮细胞层作为角膜的最外层，能参与先天性免疫反应，能感应病原体存在并发出信号从而激活角膜防御系统。角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学等都是极为重要的手段，常用于研究细胞代谢产物、病原感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响。体外培养的原代犬角膜上皮细胞(canine cornealepithelial cells，cCEpi)，容易衰老，传代次数有限，且活体采样需要动物数量较多，降低了动物福利，且难以满足体外研究需求。SV40T抗原被随机整合到宿主基因组，表达后的SV40T抗原可导致细胞永生化，是目前建立永生化细胞系的常用方法之一。本技术方法通过转染SV40T成功建立犬角膜上皮细胞的永生化细胞系(Immortalized canine cornealepithelial cells,cCEpi-SV40T)，在连续传代后能稳定表达细胞的生物学特性，未见衰老，且具有血清依赖性，无瘤化特征，可以作为犬角膜疾病研究或者药物筛选等体外研究使用，减少动物使用，提高动物福利。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法和应用，该方法建立的细胞易于培养，增殖快，且具有血清依赖性，无肿瘤变，有利于进行角膜相关疾病致病机理、药物开发和疾病防治的体外研究。
为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，包括以下步骤：
将实验犬麻醉后采集角膜组织，收集角膜上皮组织，进行上皮细胞原代培养；
将纯化后的原代犬角膜上皮细胞进行携带SV40T抗原基因的病毒转染，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。
进一步的，将永生化犬角膜上皮细胞接种细菌，检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的mRNA表达量；引物序列如下：
Figure BDA0002710700720000021
进一步的，检测方法如下：将荧光定量反应体系Ⅰ和Ⅱ混合于96孔板中，盖上封口膜后于4℃瞬离。离心后放入荧光定量PCR仪中反应，反应条件为：95℃反应30s预变性→95℃持续10s→60℃持续30s进行40个循环反应；
GAPDH、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的基因在其反应物的荧光信号到达阈值时的循环次数为Ct值；基因表达量采用相对定量的方法计算，GAPDH作为内参基因；采用2-ΔΔCT法对各个的Ct值进行分析，基因相对表达量的计算公式为2-ΔΔCt；
其中ΔΔCt＝(待测样品目的基因平均Ct值-待测样品GAPDH平均Ct值)-(对照样品目的基因平均Ct值-对照样品GAPDH平均Ct值)；
荧光定量PCR反应体系Ⅰ：
Figure BDA0002710700720000031
荧光定量PCR反应体系Ⅱ：
Figure BDA0002710700720000032
进一步的，分别取培养好的原代犬角膜上皮细胞、不同代永生化犬角膜上皮细胞和293T细胞，采用如下引物，进行SV40T检测；
上游引物：AGTGGCTGGGCTGTTCTTTT；
下游引物：ATGGGAGCAGTGGTGGAATG。
5.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，采样前3天，实验犬眼周剃毛，双眼氯霉素滴眼液点眼，每天4次，采样前1h实验犬静滴甘露醇，甘露醇的用量为1g/kg体重。
进一步的，采样时，实验犬采用吸入麻醉加球后麻醉，将麻醉后的犬侧卧保定在手术台上，术眼朝上，保证采样眼虹膜面与手术台面平行。
进一步的，采样前采用乳酸钠林格注射液冲洗结膜囊及眼睑。
进一步的，采集角膜组织的方法为：眼科显微镜下，采集厚度280～320μm的角膜组织，放于3mL预热培养基的离心管中，立即转移到超净台。
进一步的，采集角膜组织后，用含1×双抗的预热PBS冲洗角膜组织，随后将角膜组织剪成小块，放入3mL,1.2IU/mL Dispase II酶中，37℃消化45min；消化结束后，1000r/min，离心5min，弃掉消化液，加入3mL预热培养基转移到无菌dish中，在眼科显微镜下，将上皮与基质剥离；收集剥离后的上皮组织，PBS清洗3次，离心弃PBS后，无菌剪碎，接种细胞瓶，静置培养24h后换液；后每两天换液1次，约1周细胞汇合。
进一步的，携带SV40T抗原基因的病毒转染方法为：去掉原代犬角膜上皮细胞原有的培养基，PBS洗3次，加入稀释后的携带SV40T抗原基因的病毒液；按照4μg/mL浓度加入聚凝胺，1200g，37℃离心1h；离心后，37℃细胞培养箱静置培养48h后，更换培养基，后续根据细胞生长情况，换液和传代；培养大约7天后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化分离细胞；DMEM/F12完全培养基终止消化，吹打悬浮细胞并计数，使细胞密度为5个/mL，取细胞悬液200μL/孔加入96孔板，使得每孔含1个细胞，培养一周后观察。
进一步的，角膜上皮细胞生长至50％时，转移至24孔板继续培养，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。
进一步的，对携带SV40T抗原基因的病毒采用MOI＝1:20的转染复数转染原代犬角膜上皮细胞。
本发明还提供上述方法在角膜相关疾病药物研发中的应用。
本发明提供的技术方案实现了以下有益效果：
本技术方法通过转染SV40T成功建立犬角膜上皮细胞的永生化细胞系，在连续传代后能稳定表达细胞的生物学特性，未见衰老，且具有血清依赖性，无瘤化特征，可以作为犬角膜疾病研究或者药物筛选等体外研究使用，减少动物使用，提高动物福利。
首次通过向犬角膜上皮细胞导入外源基因，建立了犬永生化角膜上皮细胞系，改善了现在宠物相关疾病研究细胞系缺乏的现状；其次，永生化的细胞系，减少了犬的使用数量，提高了动物福利；第三，该方法建立的细胞易于培养，增殖快，且具有血清依赖性，无肿瘤变，有利于进行角膜相关疾病致病机理、药物开发和疾病防治的体外研究，提供基础材料制备方法。
附图说明
图1SV40T基因检测和不同代数的永生化犬角膜上皮细胞形态特征。(A)SV40T基因检测结果。293T：阳性对照，已知表达SV40T。P2 cCEpi：未转染原代犬角膜上皮细胞。P5、10、20、30cCEpi-SV40T：不同代转染后犬角膜上皮细胞。(B)第10代永生化犬角膜上皮细胞形态(40×)。(C)第20代永生化犬角膜上皮细胞形态(40×)。(D)第30代永生化犬角膜上皮细胞形态(40×)。(E)第40代永生化犬角膜上皮细胞形态(40×)。
图2.细胞角蛋白12免疫荧光检测结果(200×)
图3.原代及永生化犬角膜上皮细胞生长曲线
注：“**”表示与cCEpi组相比差异极显著(p<0.01)。
图4.细胞生长周期结果
注：“**”表示与cCEpi组相比差异极显著(p<0.01)。
图5.血清依赖性分析
注：“*”表示与0％组相比差异显著(0.01＜p＜0.05)，“**”表示与0％组相比差异极显著(p＜0.01)；“#”表示与20％组相比差异显著(0.01＜p＜0.05)，“##”表示与20％组相比差异极显著(p＜0.01)。
图6.接种伪中间葡萄球菌后永生化犬角膜上皮细胞相关炎性因子的表达
注：“*”表示与对照组相比差异显著(0.01<p<0.05)；“**”表示与对照组相比差异极显著(p<0.01)。
具体实施方式
实施例1
1.材料
1.1试验组织
1岁龄健康比格犬角膜
1.2主要试剂
猿猴空泡病毒40(SV40T)抗原基因病毒液(实验室保存)；DMEM/F12培养基(Sigma，美国)；无内毒素胎牛血清(Lonsera公司，中国)；胰蛋白酶(Amresco公司，美国)；II型胶原酶(Sigma公司，美国)；II型中性蛋白酶(Sigma公司，美国)；L-谷氨酰胺(Sigma公司，美国)；表皮生长因子(Sigma公司，美国)；HEPES缓冲液(Gibco，美国)；细胞角蛋白12单克隆抗体(Abcam，美国)；反转录试剂盒，染料法定量PCR检测试剂盒(Vazyme公司，中国)；山羊抗兔二抗(Abcam，美国)；CCK-8检测试剂盒(Vazyme公司，中国)等。
1.3主要仪器设备
二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；超纯水系统(Millipore，美国)；生物显微镜(Olympus CX22，日本)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；冷冻离心机(Eppendorf，德国)；超低温冰箱(Eppendorf，德国)；PCR仪(BioRad公司，美国)；实时荧光定量PCR系统(BioRad公司，美国)；微量核酸蛋白浓度测定仪(Thermo公司，美国)；超高分辨率激光共聚焦显微镜(Leica，Germany)；高压蒸汽灭菌锅(TOMY公司，日本)；PCR仪(BioRad公司，美国)。
2.试验方法
2.1永生化犬角膜上皮细胞系的构建
2.1.1犬角膜上皮细胞原代培养
采样前3天，实验犬眼周剃毛，双眼氯霉素滴眼液点眼，每天4次，采样前1h实验犬静滴甘露醇(1g/kg体重)。采样时，实验犬采用吸入麻醉加球后麻醉，将麻醉后的犬侧卧保定在手术台上，术眼朝上，以保证采样眼虹膜面与手术台面平行。采用含1×双抗的乳酸钠林格冲洗结膜囊及眼睑内消毒，眼周正常消毒处理。眼科显微镜下，采集厚度约300μm的角膜组织，放于3mL预热培养基的离心管中，立即转移到超净台。用含1×双抗的预热PBS冲洗角膜组织，随后无菌角膜剪将角膜组织剪成小块，放入3mL,1.2IU/mL Dispase II酶中，37℃消化45min。消化结束后1000r/min，离心5min，弃掉消化液，加入3mL预热培养基转移到无菌dish中。眼科显微镜下，无菌将上皮与基质剥离。收集剥离后的上皮组织，PBS清洗3次，离心弃PBS后，无菌剪碎，接种细胞瓶，静置培养24h后换液。后每两天换液一次，约1周细胞汇合。
2.1.2犬角膜上皮细胞的永生化
将状态良好的纯化后的原代犬角膜上皮细胞按105/孔接种6孔板，培养过夜。按照感染复数MOI＝1:20，用完全培养基将携带SV40T抗原基因的病毒稀释。去掉原代犬角膜上皮细胞原有的培养基，PBS洗3次，加入稀释后的SV40T病毒液。按照4μg/mL浓度加入聚凝胺，1200g，37℃离心1h。离心后放37℃细胞培养箱静置培养，感染48h后，更换新鲜的培养基，后续根据细胞生长情况，换液和传代。培养大约7天后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA分离消化细胞。DMEM/F12完全培养基终止消化，吹打悬浮细胞并计数，使细胞密度为5个/mL，取细胞悬液200μL/孔加入96孔板，使得每孔含1个细胞，培养一周后观察。如果角膜上皮细胞生长至50％时，转移至24孔板继续培养，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。
2.1.3犬角膜上皮细胞SV40T检测
分别取培养好的原代犬角膜上皮细胞、不同代永生化犬角膜上皮细胞和293T细胞，采用表1中的引物，进行SV40T检测。
表1引物序列
Figure BDA0002710700720000071
2.1.4犬角膜上皮细胞鉴定
(1)固定：取原代犬角膜上皮细胞和第5、10、20、30、40代永生化犬角膜上皮细胞，以1×105个/mL的密度接种于放有细胞爬片的24孔培养板中，当细胞生长至80％汇合后，用预冷PBS清洗，加入4％多聚甲醛室温固定30min。
(2)透膜：弃去固定液，PBS清洗3次，每次5min，加入0.3％Triton X-100室温孵育15min以渗透膜。
(3)封闭：弃去透膜液，用5％牛血清白蛋白室温封闭1h。
(4)抗体孵育：弃去封闭液，加入CK12一抗室温孵育1h，阴性对照组用等量PBS代替CK12一抗。用PBS洗涤后，将细胞与荧光标记的二抗在室温下避光孵育1h。
(5)染核：弃去二抗，用PBS清洗3次，加入DAPI染液染核15min。
(6)封片：弃去DAPI染液，PBS清洗3次。将细胞爬片放置于滴有抗荧光淬灭封闭液的载玻片上，并封片。
(7)拍摄：在激光共聚焦显微镜下进行观察并拍摄保存相片。
2.1.5犬角膜上皮细胞增殖分析
通过CCK-8测定绘制细胞生长曲线。按照5×102个/孔细胞的密度将细胞接种96孔板，连续培养7天。在细胞培养24h后，取一列6个孔弃掉培养基，PBS洗3次，每孔加100μL基础培养基和10μL CCK-8试剂，37℃培养箱中培养2h。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值并绘制细胞生长曲线。
2.1.6犬角膜上皮细胞周期、倍体分析
(1)将第2代原代犬角膜上皮细胞、30代永生化犬角膜上皮细胞按1×106浓度接种dish。
(2)待细胞80％以上汇合，PBS洗涤3次。用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA分离消化细胞，37℃消化3-5min。
(3)完全培养基终止消化，吹吸收集细胞，1200r/min离心5min。
(4)弃上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，细胞悬液移至新EP管，1200r/min离心5min。
(5)弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇，吹匀，4℃固定12-24h。
(6)固定好的细胞悬液1200r/min离心5min。
(7)弃上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，细胞悬液1200r/min离心5min。
(8)弃上清，每管加入0.5mL碘化丙啶染色液，缓慢充分重悬细胞，37℃避光温浴30min，4℃存放。(检测前200目滤网对细胞进行过滤)
(9)用流式细胞仪在488nm波长处检测红色荧光，进行数据分析。
(10)DNA倍体分析计算公式:DI＝(样本G0/G1期峰平均荧光强度)/(正常二倍体细胞G0/G1期峰平均荧光强度)
判定标准:DI＝2.0±0.1判定为四倍体；DI＝1.1±0.15判定为近二倍体；D1＝1.0±0.1判定为二倍体。
2.1.7犬角膜上皮细胞血清依赖性分析
将第2代原代犬角膜上皮细胞、30代永生化犬角膜上皮细胞按2×103个/孔接种96孔板，培养12h后，待细胞完全贴壁，将培养基分别替换成含0％、5％、10％、20％的胎牛血清的DMEM/F12培养基，每个浓度3次重复，并将含不同浓度血清的培养基作为空白对照。继续培养24h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃培养箱培养2h。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值并绘制柱状图。
2.2伪中间葡萄球菌感染犬角膜上皮细胞炎症模型构建
2.2.1细菌培养与计数
将伪中间葡萄球菌冻存菌液进行复苏，采用3区划线法传代。挑取单个菌落于营养肉汤培养基震荡培养。收集菌液4000r/min离心5min弃去上清，重复两次后，进行倍比稀释，并用平板计数法计数，调整菌液浓度至106CFU/mL。
2.2.2细胞处理
永生化犬角膜上皮细胞按106cells/孔接种6孔培养板，待细胞长至80％以上，PBS洗3次，更换无血清培养基，实验组按照MOI＝1：1加入伪中间葡萄球菌继续培养3h。
2.2.3引物设计
针对犬GAPDH、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的mRNA序列，设计相关引物，引物信息如下：
表2.引物序列
Figure BDA0002710700720000091
2.2.4细胞总RNA提取
(1)细胞处理后,弃培养基并用PBS清洗3遍,每孔加入lmL Trizol,吹打,待细胞溶解后分别收集于1.5mL无酶离心管中,静置5min。
(2)向离心管中加入0.2mL氯仿,振荡30s,待充分乳化无分相后,静置5min。
(3)4℃,12000r/min离心15min,取上清400μL移入新的1.5mL离心管中。
(4)加入400μL异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
(5)4℃,12000r/min离心10min,弃去上清。
(6)加入1mL 75％乙醇,轻轻洗涤沉淀，4℃,12000r/min离心5min,弃上清。
(7)室温干燥5min，加入适量的无RNA酶水溶解。
(8)取溶解的RNA测定浓度,调整RNA浓度至900ng/μL,-80℃保存备用。
2.2.5cDNA合成
采用两步法，按试剂盒说明书进行反转录操作。
(1)去除DNA基因组反应体系
Figure BDA0002710700720000101
用移液器轻轻吹打混匀后，将装有混合液的离心管置于PCR仪中反应。反应条件为42℃反应2min→4℃终止。
(2)逆转录反应体系
Figure BDA0002710700720000102
用移液器轻轻吹打混匀后将装有混合液的离心管置于PCR仪中反应。反应条件为50℃反应15min→85℃反应2min→4℃终止。
2.2.6荧光定量PCR检测相关炎性因子
(1)荧光定量PCR反应体系Ⅰ
Figure BDA0002710700720000103
(2)荧光定量PCR反应体系Ⅱ
Figure BDA0002710700720000104
将反应体系Ⅰ和Ⅱ混合于96孔板中，盖上封口膜后于4℃瞬离。离心后放入荧光定量PCR仪中反应，反应条件为：95℃反应30s预变性→95℃持续10s→60℃持续30s进行40个循环反应。
GAPDH、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的基因在其反应物的荧光信号到达阈值时的循环次数为Ct值。本试验的基因表达量采用相对定量的方法计算，GAPDH作为内参基因。采用2-ΔΔCT法对各个的Ct值进行分析，基因相对表达量的计算公式为2-ΔΔCt。
其中ΔΔCt＝(待测样品目的基因平均Ct值-待测样品GAPDH平均Ct值)-(对照样品目的基因平均Ct值-对照样品GAPDH平均Ct值)。
2.3数据处理与分析
试验数据采用SPSS 18.0软件中的One-way ANOVA和Duncan进行统计分析，结果以Mean±SEM的形式表示。p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。
3.结果
3.1.1犬角膜上皮细胞永生化建立及其特征
本试验采用SV40T转染的方法来永生化犬角膜上皮细胞，在原代犬角膜上皮细胞中未发现SV40T的表达，而在不同代永生化犬角膜上皮细胞和293T细胞中能检测到SV40T基因(图1A)，由此结果可知，SV40T基因成功导入犬角膜上皮细胞，并且能随细胞传代稳定表达。在不断传代过程中，永生化犬角膜上皮细胞未发生形态上的变化，一直保持鹅卵石形态(图1B、C、D、E)。
3.1.2犬角膜上皮细胞鉴定结果
选取原代犬角膜上皮细胞及不同代永生化角膜上皮细胞，进行角蛋白12检测，免疫荧光结果如图2。可见，在原代角膜上皮细胞及第5、10、20、30、40代永生化角膜上皮细胞中，角蛋白12均有明显表达；阴性对照组中未见角蛋白12表达。
3.1.3犬角膜上皮细胞生长曲线分析
由图3可知，原代犬角膜上皮细胞和永生化犬角膜上皮细胞连续培养7天，在1d-2d细胞处于潜伏期，3d-5d处于对数生长期，然后细胞进入平台期。第3d开始，永生化细胞活性要高于原代细胞。结果表明永生化犬角膜上皮细胞在体外培养过程中具有正常的增值能力，且好于原代细胞(p＜0.01)。
3.1.4犬角膜上皮细胞周期、倍体分析
细胞周期的结果见图4。由结果可知，第2代原代犬角膜上皮细胞处在G0/G1期的细胞明显多于30代永生化犬角膜上皮细胞，二者差异极显著(p＜0.01)；第2代原代犬角膜上皮细胞处在S期的细胞明显少于30代永生化犬角膜上皮细胞，二者差异极显著(p＜0.01)。说明与原代细胞相比，永生化犬角膜上皮细胞具有更高的增殖活性。
根据流式结果，第2代原代犬角膜上皮细胞的G0/G1期峰平均荧光强度值为48972.43，30代永生化犬角膜上皮细胞G0/G1期峰平均荧光强度值为50083.31。
0.9＜DI＝1.023＜1.1，因此永生化上皮细胞判定为二倍体细胞。
3.1.5犬角膜上皮细胞血清依赖性分析
出现癌化的细胞在体外传代过程中会失去血清依赖性，为鉴定导入SV40T后的永生化犬角膜上皮细胞未出现癌化，本试验采用不同血清浓度来培养细胞，结果如图5：在无血清时，原代细胞和永生化细胞均不能正常生长；血清浓度为5％、10％、20％时，细胞能够增殖。且20％的血清促进增殖的能力要明显高于5％的血清浓度(0.01＜p＜0.05)，因此，永生化犬角膜上皮细胞在体外传代过程中依旧保持血清依赖性，表明在导入SV40T基因后未使犬角膜上皮细胞癌化。
3.2永生化犬角膜上皮细胞相关炎性因子的表达
根据图6所示，永生化犬角膜上皮细胞按照MOI＝1：1接种伪中间葡萄球菌后培养3h,与空白对照组相比，模型组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达量均有极显著升高(p＜0.01)，TLR2 mRNA表达量有显著升高(p＜0.05)。

Claims (8)

1.一种犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将实验犬麻醉后采集角膜组织，收集角膜上皮组织，进行上皮细胞原代培养；
将纯化后的原代犬角膜上皮细胞进行携带SV40T抗原基因的病毒转染，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞；
携带SV40T抗原基因的病毒转染方法为：去掉原代犬角膜上皮细胞原有的培养基，PBS洗3次，加入稀释后的携带SV40T抗原基因的病毒液；按照4μg/mL浓度加入聚凝胺，1200g，37℃离心1h；离心后，37℃细胞培养箱静置培养48h后，更换培养基，后续根据细胞生长情况，换液和传代；培养大约7天后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化分离细胞；DMEM/F12完全培养基终止消化，吹打悬浮细胞并计数，使细胞密度为5个/mL，取细胞悬液200μL/孔加入96孔板，使得每孔含1个细胞，培养一周后观察；
将永生化犬角膜上皮细胞接种细菌，检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的mRNA表达量；引物序列如下：
Figure FDA0003618409880000011
2.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，检测方法如下：将荧光定量反应体系Ⅰ和Ⅱ混合于96孔板中，盖上封口膜后于4℃瞬离；离心后放入荧光定量PCR仪中反应，反应条件为：95℃反应30s预变性→95℃持续10s→60℃持续30s进行40个循环反应；
GAPDH、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TLR2的基因在其反应物的荧光信号到达阈值时的循环次数为Ct值；基因表达量采用相对定量的方法计算，GAPDH作为内参基因；采用2-ΔΔCT法对各个的Ct值进行分析，基因相对表达量的计算公式为2-ΔΔCt；
其中ΔΔCt＝(待测样品目的基因平均Ct值-待测样品GAPDH平均Ct值)-(对照样品目的基因平均Ct值-对照样品GAPDH平均Ct值)；
荧光定量PCR反应体系Ⅰ：
反应液 体积
2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5μL
模板cDNA 2μL
荧光定量PCR反应体系Ⅱ：
Figure FDA0003618409880000021
3.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，分别取培养好的原代犬角膜上皮细胞、不同代永生化犬角膜上皮细胞和293T细胞，采用如下引物，进行SV40T检测；
上游引物：AGTGGCTGGGCTGTTCTTTT；
下游引物：ATGGGAGCAGTGGTGGAATG。
4.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，采样前3天，实验犬眼周剃毛，双眼氯霉素滴眼液点眼，每天4次，采样前1h实验犬静滴甘露醇，甘露醇的用量为1g/kg体重。
5.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，采集角膜组织的方法为：眼科显微镜下，采集厚度280～320μm的角膜组织，放于3mL预热培养基的离心管中，立即转移到超净台。
6.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，采集角膜组织后，用含1×双抗的预热PBS冲洗角膜组织，随后将角膜组织剪成小块，放入3mL,1.2IU/mL Dispase II酶中，37℃消化45min；消化结束后，1000r/min，离心5min，弃掉消化液，加入3mL预热培养基转移到无菌dish中，在眼科显微镜下，将上皮与基质剥离；收集剥离后的上皮组织，PBS清洗3次，离心弃PBS后，无菌剪碎，接种细胞瓶，静置培养24h后换液；后每两天换液1次，约1周细胞汇合。
7.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，角膜上皮细胞生长至50％时，转移至24孔板继续培养，通过单克隆获得永生化犬角膜上皮细胞。
8.根据权利要求1所述的犬角膜上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，对携带SV40T抗原基因的病毒采用MOI＝1:20的转染复数转染原代犬角膜上皮细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779395A (zh) * 2016-03-22 2016-07-20 西北农林科技大学 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法
CN107881197A (zh) * 2017-11-17 2018-04-06 扬州大学 一种永生化奶牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE347587T1 (de) * 1996-12-24 2006-12-15 Nestle Sa Immortalisierte menschliche epithelzell-linie aus kornea
EP1144597A2 (en) * 1999-01-21 2001-10-17 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
EP2638149B1 (en) * 2010-11-12 2019-05-15 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
CN104531607B (zh) * 2014-12-29 2017-11-07 南京农业大学 犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779395A (zh) * 2016-03-22 2016-07-20 西北农林科技大学 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法
CN107881197A (zh) * 2017-11-17 2018-04-06 扬州大学 一种永生化奶牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Canine corneal epithelial cells possess a sustained proliferative capacity and generate a spontaneously derived cell line;Morita, M等;《EXPERIMENTAL EYE RESEARCH》;20180630;第171卷;第7页右栏第2段、第8页左栏第3段、2.2部分 *
犬穿透性角膜移植手术方法的研究;吴艳菊等;《黑龙江畜牧兽医》;20181220(第24期);1.1-1.5部分 *

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