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CN118146386A - 抗体变体 - Google Patents

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CN118146386A
CN118146386A CN202410188644.1A CN202410188644A CN118146386A CN 118146386 A CN118146386 A CN 118146386A CN 202410188644 A CN202410188644 A CN 202410188644A CN 118146386 A CN118146386 A CN 118146386A
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tnfα
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E·M·富勒
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Tillotts Pharma AG
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Abstract

本发明涉及一种抗体，其与TNFα结合并包含经修饰的Fc区。本发明的抗体具有对蛋白水解降解的改进抗性和良好的效应子功能和/或药代动力学特性。

Description

抗体变体
本申请是申请日为2018年09月11日、优先权日为2017年09月19日、申请号为201880060805.1、发明名称为“抗体变体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及经修饰的抗体，其具有对蛋白水解降解的改进抗性和改变的效应子功能和/或药代动力学特性。该抗体可用于治疗性治疗各种病症，特别是炎性病状。
背景技术
在过去20年，单克隆抗体作为临床药物中的治疗试剂的重要性日益增加。多年来，改善抗体的努力集中在降低它们潜在的免疫原性，从而产生人源化或甚至完全人抗体。另一种方法旨在通过改善其效应子功能来优化抗体。直接效应由抗体的可变抗原结合区介导，而间接效应由恒定Fc区介导。改善效应子功能的努力主要集中在调节Fc区。此外，希望改善治疗性抗体的血清半衰期，这可以减少所需抗体的量，并且可以通过延长治疗间隔而提高其用于患者的便利性。
对于治疗性应用，免疫球蛋白G(IgG)出于若干种原因一直是优选的选择类别；IgG易于纯化、在储存时相对较稳定、可以经静脉内施用、在体内具有延长的生物半衰期并且能够参与一系列生物效应子功能，诸如激活补体依赖性细胞毒性(CDC)和通过各种Fc受体相互作用(抗体依赖性细胞的细胞毒性；ADCC)募集效应细胞。在五种免疫球蛋白类别中，IgG因其与IgG再循环受体-新生儿Fc受体(FcRn)独特的相互作用而表现出最长的生物半衰期。受体的已知功能之一是拯救IgG免于催化降解。已解决的FcRn-Fc共结晶结构已显示，与Fc的相互作用发生在IgG铰接-CH2-CH3区。这种相互作用以严格的pH依赖性方式在6.0-6.5的酸性pH下在内体中发生。结合的IgG分子被再循环回到细胞表面，其中它们在7.4的生理pH下被释放到循环中，而非络合的IgG分子注定要进行溶酶体降解。该再循环是实现IgG延长的半衰期的机制；FcRn-IgG相互作用的调节将因此允许特定控制γ免疫球蛋白和Fc融合蛋白的血清半衰期。
根据应用，可能希望增加或减少IgG的血清滞留时间。对于治疗性应用，较长的半衰期是希望的，因为将需要更少的剂量和更少的注射。已经研究几种增加半衰期的方法，这些方法包括使用聚乙二醇(PEG)、生成白蛋白或Fc融合蛋白以及增强FcRn-IgG相互作用。聚乙二醇化药剂从1990年以来一直在临床应用，并且聚乙二醇化是已建立的用于延长血液中的药物滞留的技术。因为人血清白蛋白(HSA)也由FcRn经由pH依赖性相互作用再循环，因此也已制备几种增强稳定性和半衰期的白蛋白-融合蛋白。此外，与白蛋白或白蛋白结合结构域融合的抗体片段已在临床前研究中证明了延长血清滞留时间。产生Fc融合蛋白是另一种将赋予蛋白质或肽与完整抗体相似特性的策略。
已经研究的Fc区修饰在Saxena(2016)Frontiers in Immunology,第7卷,文章号580中概述。各种Fc突变进一步描述于WO 1998/023289 A1、WO 2000/042072 A2、WO 2010/106180 A2和WO 2014/108198 A1中。
WO 2012/087746 A1和Kinder等人(2013)The Journal Of BiologicalChemistry第288卷,第43期,第30843-30854页研究了抗体的Fc区中的各种突变以用于改善对蛋白水解降解的抗性。
对具有改善的效应子功能、药代动力学和/或对蛋白水解降解的抗性的抗体存在持续需要。
发明内容
本申请的发明人发现，抗体的Fc区中的特异性突变的组合赋予抗体有利的特性，包括对蛋白水解降解的改进抗性和在pH 6下对FcRn增加的亲和力。具有这些突变的抗体具有改善的药代动力学特性。此外，这些抗体与未经修饰的抗体和/或已知的抗体(诸如英利昔单抗(IFX))相比表现出优异的效应子功能。
因此，本发明涉及以下项目[1]至[100]中定义的主题：
[1]一种抗体，其包含TNFα结合结构域和FcRn结合位点，其中所述抗体的氨基酸序列包含：
(i)氨基酸233P、234V、235A，和氨基酸位置236处的缺失；以及
(ii)氨基酸434A或氨基酸252Y、254T和256E。
[2]如项目[1]所述的抗体，其中所述抗体是具有取代E233P、L234V和L235A以及G236缺失的经修饰抗体。
[3]如项目[2]所述的抗体，其中所述抗体进一步具有取代N434A。
[4]如项目[2]所述的抗体，其中所述抗体进一步具有取代M252Y、S254T和T256E。
[5]如前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体的氨基酸序列进一步包含氨基酸239D、330L和332E。
[6]如项目[5]所述的抗体，其中所述抗体是具有取代S239D、A330L和I332E的经修饰抗体。
[7]如项目[1]所述的抗体，其中所述抗体的氨基酸序列包含氨基酸233P、234V、235A、239D、330L、332E和434A，以及氨基酸位置236处的缺失。
[8]如项目[7]所述的抗体，其中所述抗体是具有取代E233P、L234V、L235A、S239D、A330L、I332E和N434A以及G236缺失的经修饰抗体。
[9]如项目[7]或[8]所述的抗体，其包含如SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列。
[10]如项目1所述的抗体，其中所述抗体的氨基酸序列包含氨基酸233P、234V、235A、239D、330L、332E、252Y、254T和256E，以及氨基酸位置236处的缺失。
[11]如项目[10]所述的抗体，其中所述抗体是具有取代E233P、L234V、L235A、S239D、A330L、I332E、M252Y、S254T和T256E以及G236缺失的经修饰抗体。
[12]如项目[10]或[11]所述的抗体，其包含如SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。
[13]如项目1所述的抗体，其中所述抗体的氨基酸序列包含氨基酸233P、234V、235A、326A、332E、333A和434A，以及氨基酸位置236处的缺失。
[14]如项目[13]所述的抗体，其中所述抗体是具有取代E233P、L234V、L235A、K326A、I332E、E333A和N434A以及G236缺失的经修饰抗体。
[15]如项目[13]或[14]所述的抗体，其包含如SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列。
[16]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 6下对人FcRn的亲和力大于英利昔单抗在pH 6下对人FcRn的亲和力。
[17]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 6下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD小于500nM。
[18]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 6下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD小于400nM。
[19]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 6下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD小于300nM。
[20]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 6下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD小于200nM。
[21]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 6下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD在5nM至500nM、或10nM至400nM、或25nM至300nM、或50nM至200nM、或75nM至175nM的范围内。
[22]如前述项目中任一项所述的抗体，其中表征所述在pH 6下对人FcRn的亲和力的所述KD是通过表面等离子体共振(SPR)测定的。
[23]如前述项目中任一项所述的抗体，其在pH 7.4下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD大于10μM。
[24]如前述项目中任一项所述的抗体，其中表征所述在pH 7.4下对人FcRn的亲和力的所述KD是通过表面等离子体共振(SPR)测定的。
[25]如项目[1]至[22]中任一项所述的抗体，其中所述抗体在pH 7.4下对人FcRn的亲和力过低，使得KD值无法通过SPR测定。
[26]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于200pM的KD与人TNFα结合。
[27]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于100pM的KD与人TNFα结合。
[28]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于50pM的KD与人TNFα结合。
[29]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于25pM的KD与人TNFα结合。
[30]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于10pM的KD与人TNFα结合。
[31]如前述项目中任一项所述的抗体，其跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧。
[32]如前述项目中任一项所述的抗体，其以大于对照抗体的量跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧，所述对照抗体包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链。
[33]如前述项目中任一项所述的抗体，其以大于英利昔单抗的量跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧。
[34]如项目[32]或[33]所述的抗体，其中所述量是指在四小时内跨越所述极化细胞单层转运的抗体的质量。
[35]如项目[31]至[34]中任一项所述的抗体，其中跨越极化细胞单层转运的抗体的量比跨越极化细胞单层转运的亲本免疫球蛋白的量大两倍，其中所述亲本免疫球蛋白与所述抗体的不同之处仅在于其Fc区仅具有野生型氨基酸。
[36]如前述项目中任一项所述的抗体，其中在十倍过量的竞争性免疫球蛋白存在下，比英利昔单抗的百分比更大百分比的抗体跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧，其中所述百分比是指跨越所述极化细胞单层转运的免疫球蛋白的总质量。
[37]如项目[36]所述的抗体，其中跨越极化细胞单层转运的抗体的百分比比跨越极化细胞单层转运的亲本免疫球蛋白的百分比大两倍，其中所述亲本免疫球蛋白与所述抗体的不同之处仅在于其Fc区仅具有野生型氨基酸。
[38]如项目[31]至[37]中任一项所述的抗体，其中所述极化细胞单层是极化T84细胞的单层。
[39]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于500nM、或小于300nM、或小于200nM、或小于100nM的KD与CD16a(V)结合。
[40]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于10μM、或小于1μM的KD与CD16a(F)结合。
[41]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于10μM、或小于5μM、或小于1μM的KD与CD16b(NA2)结合。
[42]如前述项目中任一项所述的抗体，其具有抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
[43]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够诱导CD14+CD206+巨噬细胞。
[44]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够以等于或大于英利昔单抗的水平诱导CD14+CD206+巨噬细胞。
[45]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够抑制T细胞增殖。
[46]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够以等于或大于英利昔单抗的程度抑制T细胞增殖。
[47]如前述项目中任一项所述的抗体，其是非岩藻糖基化抗体或具有减少的岩藻糖基化的抗体。
[48]如前述项目中任一项所述的抗体，其包含：(i)VL结构域，所述VL结构域包含具有如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的CDR3区；和(ii)VH结构域，所述VH结构域包含具有如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的CDR3区。
[49]如前述项目中任一项所述的抗体，其包含具有如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH结构域和具有如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL结构域。
[50]如前述项目中任一项所述的抗体，其包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:11、SEQ ID 12、或SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的重链。
[51]如项目[1]至[47]中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：(i)VL结构域，所述VL结构域包含具有如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的CDR3区；和(ii)VH结构域，所述VH结构域包含具有如SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的CDR3区。
[52]如项目[51]所述的抗体，其包含具有如SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的VH结构域和具有如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的VL结构域。
[53]如项目[51]或[52]所述的抗体，其包含具有如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列的重链。
[54]如前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人TNFα特异性结合。
[55]如前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体不与TNFβ显著结合。
[56]如前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
(i)以小于125pM的解离常数(KD)与人TNFα结合；
(ii)与恒河猴TNFα和食蟹猴TNFα交叉反应；
(iii)具有大于英利昔单抗的效能，如通过L929测定所测定；和/或
(iv)能够以至少2的化学计量(抗体:TNFα三聚体)与人TNFα三聚体结合。
[57]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于1nM的KD与来自恒河猴的TNFα结合。
[58]如前述项目中任一项所述的抗体，其以小于1nM的KD与来自食蟹猴的TNFα结合。
[59]如前述项目中任一项所述的抗体，其中在L929测定中测定，所述抗体抑制TNFα诱导的细胞凋亡的效能相对于英利昔单抗的效能(相对效能)大于3，并且其中所述相对效能是在L929测定中以ng/mL计的英利昔单抗的IC50值与在L929测定中以ng/mL计的所述抗体的IC50值的比值。
[60]如前述项目中任一项所述的抗体，其中通过差式扫描荧光法测定，scFv形式的抗体的可变结构域的熔融温度为至少65℃。
[61]如前述项目中任一项所述的抗体，其中通过差式扫描荧光法测定，scFv形式的抗体的可变结构域的熔融温度为至少68℃。
[62]如前述项目中任一项所述的抗体，其中通过差式扫描荧光法测定的熔融温度为至少70℃。
[63]如前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够阻断人TNFα与TNF受体I(TNFRI)之间的相互作用。
[64]如前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够阻断人TNFα与TNF受体II(TNFRII)之间的相互作用。
[65]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够在混合的淋巴细胞反应中抑制外周血液单核细胞的细胞增殖。
[66]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够抑制LPS诱导的CD14+单核细胞的白介素-1β分泌。
[67]如项目[66]所述的抗体，其中抑制LPS诱导的白介素-1β分泌的IC50值小于1nM。
[68]如项目[67]所述的抗体，其中以摩尔计，所述抑制LPS诱导的白介素-1β分泌的IC50值小于阿达木单抗的IC50值。
[69]如前述项目中任一项所述的抗体，其能够抑制LPS诱导的CD14+单核细胞的TNFα分泌。
[70]如项目[69]所述的抗体，其中抑制LPS诱导的TNFα分泌的IC50值小于1nM。
[71]如项目[70]所述的抗体，其中以摩尔计，所述抑制LPS诱导的TNFα分泌的IC50值小于阿达木单抗的IC50值。
[72]如前述项目中任一项所述的抗体，其是免疫球蛋白G(IgG)、优选是IgG1。
[73]如前述项目中任一项所述的抗体，其与野生型抗体相比对蛋白水解降解更具抗性。
[74]如项目[73]所述的抗体，其中所述野生型抗体是英利昔单抗。
[75]如项目[73]所述的抗体，其中所述野生型抗体是免疫球蛋白，其与所述抗体的不同之处仅在于其Fc区仅具有野生型氨基酸。
[76]如项目[73]所述的抗体，其中所述野生型抗体包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链。
[77]如项目[73]至[76]中任一项所述的抗体，其中所述蛋白水解降解包括基质金属蛋白酶3(MMP-3)引起的降解。
[78]如项目[73]至[77]中任一项所述的抗体，其中所述蛋白水解降解包括酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)引起的降解。
[79]如项目[73]至[78]中任一项所述的抗体，其中所述蛋白水解降解包括来自金黄色葡萄球菌菌株V8的内蛋白酶Glu-C(GluC)所引起的降解。
[80]一种核酸，其编码如前述项目中任一项所述的抗体。
[81]一种载体或质粒，其包含如项目80所述的核酸。
[82]一种细胞，其包含如项目[80]所述的核酸或如项目[81]所述的载体或质粒。
[83]一种制备如项目[1]至[79]中任一项所述的抗体的方法，其包括在允许编码所述抗体的核酸表达的条件下，在培养基中培养如项目[82]所述的细胞，并且从所述细胞或从所述培养基中回收所述抗体。
[84]如项目[1]至[79]中任一项所定义的抗体，其用于治疗炎性病症或TNFα相关病症的方法中。
[85]根据项目[84]所使用的抗体，其中所述炎性病症选自下文“待治疗的病症”部分中所列出的疾病和病症的列表。
[86]根据项目[84]所使用的抗体，其中所述炎性病症是胃肠道的炎性病症。
[87]根据项目[86]所使用的抗体，其中所述胃肠道的炎性病症是炎性肠病。
[88]根据项目[86]或[87]所使用的抗体，其中所述胃肠道的炎性病症是克罗恩病。
[89]根据项目[88]所使用的抗体，其中所述克罗恩病选自由回肠、结肠、回肠结肠、和/或孤立性上克罗恩病(胃、十二指肠和/或空肠)组成并且包括非狭窄/非穿透、狭窄、穿透和肛周疾病行为的组，从而允许上文所提及的任一者的定位和疾病行为的任何组合。
[90]根据项目[86]或[87]所使用的抗体，其中所述胃肠道的炎性病症是溃疡性结肠炎。
[91]根据项目[90]所使用的抗体，其中所述溃疡性结肠炎选自由以下组成的组：溃疡性直肠炎、乙状结肠炎、直肠乙状结肠炎、左侧结肠炎、溃疡性大肠炎(pan-ulcerativecolitis)和储袋炎。
[92]根据项目[86]或[87]所使用的抗体，其中所述胃肠道的炎性病症是显微镜结肠炎。
[93]根据项目[84]所使用的抗体，其中所述炎性病症是关节炎。
[94]根据项目[84]或[93]所使用的抗体，其中所述炎性病症是类风湿性关节炎。
[95]根据项目[84]至[94]中任一项所使用的抗体，其中所述方法包括向受试者口服施用所述抗体。
[96]根据项目[84]至[94]中任一项所使用的抗体，其中所述方法包括局部施用所述抗体。
[97]一种药物组合物，其包含如项目[1]至[79]中任一项所述的抗体。
[98]一种用于改善针对TNFα的抗体的胞吞转运的方法，其包括引入取代E233P、L234V和L235A，删除G236并且引入以下其它一个或多个取代(a)或(b)：
(a)M252Y、S254T和T256E
(b)N434A；
并且任选地进一步引入本文所述的一个或多个其它取代。
[99]一种用于延长针对TNFα的抗体的血浆半衰期的方法，其包括引入取代E233P、L234V和L235A，删除G236并且引入以下其它一个或多个取代(a)或(b)：
(a)M252Y、S254T和T256E
(b)N434A；
并且任选地进一步引入本文所述的一个或多个其它取代。
[100]一种改善针对TNFα的抗体对蛋白水解降解的抗性的方法，其包括引入取代E233P、L234V和L235A，删除G236并且引入以下其它一个或多个取代(a)或(b)：
(a)M252Y、S254T和T256E
(b)N434A；
并且任选地进一步引入本文所述的一个或多个其它取代。
附图说明
图1：在L929测定中抗TNFα抗体变体中和人TNFα的效能。示出了TNFα抗体变体和参考英利昔单抗的剂量应答曲线。
图2：抗TNFαIgG变体跨越极化T84细胞的转运。在添加后4小时，抗TNFα抗体变体和英利昔单抗(IFX)从顶侧至基底外侧储集器的量。表示为ng/cm2。误差条指示两个至四个个体单层的SD。
图3：在过量的骨髓瘤IgG存在下抗TNFαIgG变体跨越极化T84细胞的转运。在添加后4小时，在10倍过量的人骨髓瘤IgG存在下，从顶侧转运至基底外侧储集器的抗TNFαIFX和Ab变体的量。表示为ng/cm2。误差条指示三个至四个个体单层的SD。
图4：ADCC活性。抗TNFα抗体变体和Ab-wt对ADCC的诱导。
图5：相对于IFX的诱导，每种化合物对CD14+CD206+巨噬细胞的诱导。4次独立实验的汇总数据。条表示平均值，误差条表示SEM。
图6：每种化合物相对于IFX对T细胞增殖的抑制。3次独立实验的汇总数据。条表示平均值，误差条表示SEM。
图7：MMP-3对蛋白水解降解的抗性。
图8：IdeS对蛋白水解降解的抗性。
图9：GluC对蛋白水解降解的抗性。
图10：定点诱变的示意性图式。
具体实施方式
本发明涉及一种抗体，其能够与TNFα结合并包含经修饰的Fc区。该抗体具有对蛋白水解降解的改进抗性。该抗体进一步具有在pH 6下对人FcRn的高亲和力和在pH 7.4下对人FcRn的低亲和力。该抗体的氨基酸序列包含氨基酸233P、234V、235A，以及氨基酸位置236处的缺失(EU编号)。该抗体进一步包含氨基酸434A或氨基酸252Y、254T和256E(EU编号)。
在整个本说明书和权利要求中，一般在提及可变结构域中的残基(大概地，轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时使用Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences ofImmunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU指数”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中所报导的EU指数，该文献明确地通过引用并入本文)。除非本文中另外陈述，否则提及抗体可变结构域中的残基编号意指通过Kabat编号系统获得的残基编号。除非本文中另外陈述，否则提及抗体恒定域中的残基编号意指通过EU编号系统获得的残基编号(参见例如WO 2006/073941)。
抗体
在本申请的上下文中，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA、或IgD类(或其任何子类)的蛋白质，并且包括所有常规已知的抗体和其功能性片段。在本发明的上下文中，抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”定义为亲本抗体的抗原结合片段或其它衍生物，其基本上维持这种亲本抗体的一种或多种特性。抗体/免疫球蛋白的“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”定义为保留抗原结合区的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常见于抗体的一个或多个高变区，即CDR-1、CDR-2和/或CDR-3区。本发明的抗体可以是双功能或多功能构建体的一部分。
优选地，抗体是单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单一克隆的抗体，包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆，而不是指产生所述抗体的方法。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术(包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合)来制备。(Harlow和Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual"CSH Press 1988,Cold Spring Harbor N.Y.)。
在其它实施方式(包括涉及在人类中体内使用抗TNFα抗体的实施方式)中，可以使用嵌合、灵长类化、人源化、或人抗体。在一个优选的实施方式中，抗体是人抗体或人源化抗体、更优选地单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。
在另一个特定实施方式中，本发明的抗体是免疫球蛋白、优选地免疫球蛋白G(IgG)。本发明的IgG的子类不限于并且包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。优选地，本发明的IgG属于子类1、2或4，即它分别是IgG1、IgG2、或IgG4分子。最优选地，本发明的IgG属于子类1，即它是IgG1分子。
TNFα结合结构域
本发明的抗体的TNFα结合结构域不受特定限制。它可以源自能够与TNFα结合的任何抗体。
优选地，本发明的抗体与TNFα特异性结合。如本文所用，当抗体能够区分人TNFα与一种或多种参考分子时，该抗体“特异性识别”人TNFα、或与人TNFα“特异性结合”。优选地，与每种参考分子结合的IC50值比与TNFα结合的IC50值大至少1000倍。在其最一般的形式中(并且在不提及定义参考时)，“特异性结合”是指例如根据本领域已知的特异性测定方法所测定的，抗体区分人TNFα与不相关生物分子的能力。这类方法包含但不限于免疫印迹法和ELISA测试。例如，可以进行标准ELISA测定。通常，结合特异性的测定是通过并非使用单一参考生物分子，而是使用一组约三至四种不相关分子(诸如乳粉、BSA、运铁蛋白等)来进行的。在一个实施方式中，特异性结合是指抗体区分人TNFα与人TNFβ的能力。
本发明的抗体包含VL结构域和VH结构域。VL结构域包含CDR1区(CDRL1)、CDR2区(CDRL2)、CDR3区(CDRL3)和框架区。VH结构域包含CDR1区(CDRH1)、CDR2区(CDRH2)、CDR3区(CDRH3)和框架区。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要有助于抗原结合的六个高变区之一。六个CDR的最常使用的定义之一是由Kabat E.A.等人,(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH公开号91-3242提供的。如本文所用，CDR的Kabat定义仅适用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。然而，如本文所用的重链可变结构域的CDR1(CDR H1或H1)是通过以下残基(Kabat编号)定义的：它以位置26开始并在位置36之前结束。
在一个特定实施方式中，本发明的抗体包含：(i)VL结构域，所述VL结构域包含具有如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的CDR3区；和(ii)VH结构域，所述VH结构域包含具有如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的CDR3区。
在一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含具有如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH结构域。在另一个更优选的实施方式中，该抗体包含具有如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL结构域。最优选地，本发明的抗体包含：(i)具有如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH结构域和(ii)具有如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个特定实施方式中，本发明的抗体包含：(i)VL结构域，所述VL结构域包含具有如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的CDR3区；和(ii)VH结构域，所述VH结构域包含具有如SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的CDR1区、具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的CDR3区。
在一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含具有如SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的VH结构域。在另一个更优选的实施方式中，该抗体包含具有如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的VL结构域。最优选地，本发明的抗体包含：(i)具有如SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列的VH结构域和(ii)具有如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的VL结构域。
本发明的抗体对人TNFα具有高亲和力。术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约2x10-10M、优选小于1.5x10-10M、优选小于1.25x10-10M、更优选小于1x10-10M、最优选小于7.5x10-11M或甚至小于5x10-11M的解离平衡常数(KD)与人TNFα结合，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪器中所测定。具体而言，如实施例1中所述进行KD的测定。
Fc区的修饰
“经修饰的Fc区”包含借助于如文本所定义的至少一个“氨基酸修饰”或“突变”而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，经修饰的Fc区包含经修饰的FcRn结合位点，该经修饰的FcRn结合位点与天然序列FcRn结合位点或亲本抗体的FcRn结合位点相比具有至少一个氨基酸取代，例如天然序列FcRn结合位点中或亲本抗体的FcRn结合位点中的约一个至约十个氨基酸取代、以及优选地约一个至约五个氨基酸取代。可选地，该抗体可以在FcRn结合位点外部具有修饰，该修饰例如通过结构变化影响对FcRn的亲和力。通常，在pH 6下对人FcRn的亲和力由于该修饰而增加。优选的是，在pH 7.4下对人FcRn的亲和力不受修饰的显著影响。修饰可以通过本身已知的方法产生，例如通过如“AntibodyEngineering-Methods and Protocols”,Patrick Chames编辑,第2版,2012,第31章(ISBN978-1-61779-973-0)中所述的定点诱变产生。
本发明的抗体的氨基酸序列包含位置233处的氨基酸脯氨酸、位置234处的氨基酸缬氨酸、和位置235处的氨基酸丙氨酸，并且进一步具有位置236处的氨基酸缺失(EU编号)。这在本文中称为“233P/234V/235A/236del”。未经修饰的人IgG抗体的位置233处的天然氨基酸是谷氨酸(E)。未经修饰的人IgG抗体的位置234处的天然氨基酸是亮氨酸(L)。未经修饰的人IgG抗体的位置235处的天然氨基酸是亮氨酸(L)。未经修饰的人IgG抗体的位置236处的天然氨基酸是甘氨酸(G)。因此，本发明的抗体可以通过将突变E233P、L234V、L235A和G236del引入抗体来获得。这在本文中称为E233P/L234V/L235A/G236del。优选地，本发明的抗体可通过或通过用脯氨酸取代位置233处的谷氨酸、用缬氨酸取代位置234处的亮氨酸、用丙氨酸取代位置235处的亮氨酸，并且删除位置236处的甘氨酸来获得。
本发明的抗体的氨基酸序列进一步包含：(i)位置434处的氨基酸丙氨酸、或(ii)位置252处的氨基酸酪氨酸、位置254处的氨基酸苏氨酸和位置256处的氨基酸谷氨酸。这在本文中分别称为434A和252Y/254T/256E。未经修饰的人IgG抗体的位置434处的天然氨基酸是天冬酰胺(N)。未经修饰的人IgG抗体的位置252处的天然氨基酸是甲硫氨酸(M)。未经修饰的人IgG抗体的位置254处的天然氨基酸是丝氨酸(S)。未经修饰的人IgG抗体的位置256处的天然氨基酸是苏氨酸(T)。因此，本发明的抗体可以通过将其它一个或多个突变N434A或M252Y/S254T/T256E引入抗体来获得。
也就是说，本发明的抗体的氨基酸序列包含233P/234V/235A/236del/434A或233P/234V/235A/236del/252Y/254T/256E。此氨基酸序列可以通过将突变E233P/L234V/L235A/G236del/N434A或E233P/L234V/L235A/G236del/M252Y/S254T/T256E引入抗体(例如，其Fc区具有未经修饰的或野生型氨基酸序列的抗体)的氨基酸序列中来获得。
Fc区的剩余氨基酸序列可以与典型人IgG的天然氨基酸序列相同。然而，有可能的是，该抗体的氨基酸序列包含一个或多个对天然抗体的Fc区的天然氨基酸序列的额外突变或取代，只要该抗体仍具有TNFα结合活性、在pH 6.0下的FcRn结合活性和一个或多个效应子功能即可。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体具有至少一个、或至少两个、或至少三个额外取代。在一个实施方式中，该抗体的氨基酸序列具有氨基酸239D/330L/332E，这些氨基酸优选地可通过或通过引入取代S239D/A330L/I332E来获得。在另一个实施方式中，该抗体的氨基酸序列具有氨基酸326A/332E/333A，这些氨基酸优选地可通过或通过引入取代K326A/I332E/E333A来获得。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体的氨基酸序列包含
233P/234V/235A/236del/239D/330L/332E/434A。此抗体可以通过将突变
E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/N434A引入抗体(例如，其Fc区具有未经修饰的或野生型氨基酸序列的抗体)的氨基酸序列中来获得。
在另一个优选的实施方式中，本发明的抗体的氨基酸序列包含
233P/234V/235A/236del/239D/330L/332E/252Y/254T/256E。此抗体可以通过将突变
E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/M252Y/S254T/T256E引入抗体(例如，其Fc区具有未经修饰的或野生型氨基酸序列的抗体)的氨基酸序列中来获得。
在另一个优选的实施方式中，本发明的抗体的氨基酸序列包含
233P/234V/235A/236del/326A/332E/333A/434A。此抗体可以通过将突变
E233P/L234V/L235A/236del/K326A/I332E/E333A/N434A引入抗体(例如，其Fc区具有未经修饰的或野生型氨基酸序列的抗体)的氨基酸序列中来获得。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体的Fc区(包括铰链区)包含选自由SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成的组中的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方式中，本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其中已经引入突变E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/N434A。优选地，此抗体进一步包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其中已经引入突变E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/M252Y/S254T/T256E。优选地，此抗体进一步包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其中已经引入突变E233P/L234V/L235A/236del/K326A/I332E/E333A/N434A。优选地，此抗体进一步包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。优选地，此抗体进一步包含具有如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。优选地，此抗体进一步包含具有如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明的抗体的重链具有如SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。优选地，此抗体进一步包含具有如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的轻链。
在本发明的一个优选方面，本发明的抗体是非岩藻糖基化抗体或具有减少的岩藻糖基化的抗体。
如本文所用的术语“具有减少的岩藻糖基化的抗体”是指其中抗体的少于90％的N-聚糖被岩藻糖基化的抗体。用于测定岩藻糖基化百分比的方法在本领域中是已知的。在一个实施方式中，抗体的少于75％、或少于50％、或少于25％的N-聚糖被岩藻糖基化。最优选地，抗体的少于10％的N-聚糖被岩藻糖基化。在一个特定实施方式中，本发明的抗体的N-聚糖不含任何岩藻糖。
优选地，抗体的少于90％的在N297(EU编号)处的N-聚糖被岩藻糖基化。在另一个实施方式中，抗体的少于75％、或少于50％、或少于25％的在N297(EU编号)处的N-聚糖被岩藻糖基化。最优选地，抗体的少于10％的在N297(EU编号)处的N-聚糖被岩藻糖基化。
在另一个实施方式中，抗体在N297处的N-聚糖不含任何岩藻糖。
非岩藻糖基化抗体(有时也称为无岩藻糖基化抗体)可以通过各种方法产生。例如，对CHO细胞中的α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)和GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)进行基因的协同基因敲落可以用于制备完全无岩藻糖基化并且ADCC增强的单克隆抗体变体(参见例如Imai-Nishiya等人(2007)BMC Biotechnol.7,84)。使用锌指核酸酶(ZFN)、裂解编码α1,6-岩藻糖基转移酶的催化核心的区域中的FUT8基因并且因此破坏CHO细胞中的相应酶功能的方法可以用于制备完全缺乏核心岩藻糖的单克隆抗体(参见例如Malphettes等人(2010)Biotechnol.Bioeng.106,774-783)。
具有减少的岩藻糖基化的抗体可以通过以下方法来制备：将诱饵底物(decoysubstrate)(诸如2-脱氧基-2-氟代-2-岩藻糖)添加到培养基中(参见例如Dekker等人(2016)Sci Rep 6:36964)，从而使得岩藻糖向IgG-Fc聚糖中的掺入减少。
在另一个实施方式中，本发明的抗体具有高唾液酸含量。增加唾液酸化可以例如通过同时转染胞苷一磷酸-唾液酸合酶(CMP-SAS)、胞苷一磷酸-唾液酸转运体(CMP-SAT)、和α2,3-唾液酰基转移酶来实现(参见例如Son等人(2011)Glycobiology 21,1019-1028)。
对FcRn的亲和力
本发明的抗体在pH 6下对人FcRn的亲和力较高。在pH 6下抗体与人FcRn的高亲和力结合通常通过表征为KD值小于500nM。优选地，在pH 6下的高亲和力结合的KD值小于400nM、或小于300nM、或小于200nM。例如，表征在pH 6下的亲和力的KD值可以在5至500nM、或10至400nM、或25至300nM、或50至200nM、或100至175nM的范围内。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体在pH 6下对人FcRn的亲和力大于英利昔单抗在pH 6.0下对人FcRn的亲和力。
本发明的抗体对人FcRn的亲和力优选地通过表面等离子体共振(SPR)，例如如本申请的实施例4中所述来测定。
本发明的抗体通常在pH 7.4下对人FcRn具有低亲和力。低亲和力表征为KD值大于1μM。优选地，在pH 7.4下对人FcRn的低亲和力表征为KD值大于2μM、或大于5μM、或大于10μM。
在一个特定实施方式中，在pH 7.4下的低亲和力过低使得KD值无法通过SPR测定。
在一个具体实施方式中，(i)本发明的抗体在pH 7.4下与人FcRn结合的KD值与(ii)在pH 6.0下与人FcRn结合的KD值的比值为至少50。优选地，该比值为至少100、或至少150、或至少200。
抗体的功能特性
本发明的抗体有效跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧。通常，跨越极化细胞单层的转运的量大于英利昔单抗的量，其中抗体比英利昔单抗的量是指质量/cm2的极化细胞单层。相对于跨越极化细胞单层转运的英利昔单抗的量，跨越极化细胞单层转运的抗体的量为至少110％、优选至少120％、更优选至少130％、或至少140％、或至少150％(其中转运的英利昔单抗的量设定为100％)。
此外，在过量的竞争性免疫球蛋白存在下，抗体跨越极化细胞单层从顶侧特异性转运到基底外侧。这在本文中称为特异性转运。
在10倍过量的竞争性免疫球蛋白存在下，跨越极化细胞单层转运的免疫球蛋白的总质量的百分比大于跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧的英利昔单抗的百分比。相对于在10倍过量的不相关抗体存在下跨越极化细胞单层转运的英利昔单抗的百分比，在10倍过量的不相关免疫球蛋白存在下跨越极化细胞单层转运的本发明抗体的百分比为至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％(英利昔单抗设定为100％)。
优选地，极化细胞单层是极化T84细胞的单层。可以如本申请的实施例5中所述，进行模拟胞吞转运过程的转运测定。
本发明的抗体与CD16a(V)、CD16a(F)和CD16b(NA2)结合。
本发明的抗体通常以小于1μM、优选小于500nM、更优选小于100nM的KD与CD16a(V)结合。
本发明的抗体通常以小于10μM、优选小于1μM的KD与CD16a(F)结合。
本发明的抗体通常以小于10μM、优选小于1μM的KD与CD16b(NA2)结合。
本发明的抗体进一步能够诱导CD14+CD206+巨噬细胞。诱导水平优选地与英利昔单抗的诱导水平相当、与其相等、或比其更大。
本发明的抗体进一步能够抑制T细胞增殖。对T细胞增殖的抑制程度优选地与英利昔单抗对T细胞增殖的抑制程度相当、与其相等、或比其更大。
药物组合物和治疗
疾病治疗涵盖治疗已经诊断为患有处于任何临床阶段或临床表现的任何形式疾病的患者；延迟疾病症状或征象的发作或进化或加重或恶化；和/或预防和/或降低疾病的严重程度。
经施用抗TNFα抗体的“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴或人)。在某些方面，人是小儿患者。在某些方面，人是成人患者。
本文中描述组合物，其包含抗TNFα抗体和任选地一种或多种额外治疗剂，诸如下文所述的第二治疗剂。所述组合物通常作为包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分供应。此组合物可以呈任何适合形式(这取决于将其施用于患者的所希望方法)。
抗TNFα抗体可以通过多种途径施用于患者，这些途径诸如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、鞘内、区域或局部(例如粘膜)。在任何给定情况下最适合的施用途径将取决于特定抗体、受试者、以及疾病的性质和严重程度和受试者的身体状况。在一个实施方式中，抗TNFα抗体经静脉内施用。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体经口服施用。如果施用是经由口服途径，则抗体优选地是IgG、最优选地IgG1。
抗TNFα抗体可以以足以允许以0.5mg/kg体重至20mg/kg体重静脉内施用的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方式中，适用于本文所述的组合物和方法中的抗体浓度包括但不限于0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg，或在前述值的任一者之间的范围内的浓度，例如1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg、或10mg/kg至18mg/kg。
根据所治疗的病状、施用途径和受试者的年龄、重量和状况，抗TNFα抗体的有效剂量可以在每次单次(例如推注)施用、多次施用或连续施用约0.001至约750mg/kg，或实现每次单次(例如推注)施用、多次施用或连续施用0.01-5000μg/ml的血清浓度的范围内，或其中的任何有效范围或值。就口服施用而言，血清浓度可能极低或甚至低于检测限。在某些实施方式中，每个剂量可以在约0.5mg至约50mg/千克体重或约3mg至约30mg/千克体重的范围内。抗体可以配制为水溶液。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体经口服施用。如果施用是经由口服途径，则抗体优选地是IgG、最优选地IgG1。如果抗体经口服施用，则抗体的日剂量通常在约0.01mg/kg至约100mg/kg体重、或约0.05mg/kg至约50mg/kg体重、或约0.1mg/kg至约25mg/kg体重、或约0.15mg/kg至约10mg/kg体重、或约0.16mg/kg至约5mg/kg体重、或约0.2mg/kg至约2mg/kg体重、或约0.2mg/kg至约1mg/kg体重范围内。一般来讲，有利的剂量是1至200mg/天、优选地5至100或10至50mg/天的剂量。
药物组合物可以便利地呈每剂量含有预定量的抗TNFα抗体的单位剂型存在。这类单位可以含有0.5mg至5g，例如但不限于1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、750mg、1000mg，或前述值的任何两个之间的任何范围，例如10mg至1000mg、20mg至50mg、或30mg至300mg。根据例如待治疗的病状或施用途径，药学上可接受的载体可以采取广泛范围的形式。
确定有效剂量、总剂量数、以及治疗时长、其抗TNFα抗体完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准的剂量递增研究确定。
可以通过以下制备适用于本文所述的方法的抗TNFα抗体的治疗制剂以作为冻干制剂或水溶液储存：使具有所希望的纯度的抗体与通常在本领域中采用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(其在本文中皆称为“载体”)(即，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗调节剂、非离子洗涤剂、抗氧化剂、和其它各种添加剂)混合。参见Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版(Osol编辑1980)。这类添加剂在所采用的剂量和浓度下必须对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。缓冲剂可以以约2mM至约50mM范围的浓度存在。适合的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐，诸如Tris。
本发明的药物组合物可以进一步包含至少一种盐，例如氯化钠。盐浓度优选地在100mM至200mM范围内，例如约150mM。
可以添加防腐剂以延缓微生物生长，并且可以呈在0.2％-1％(w/v)范围内的量添加。适合的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(例如，氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲铵和对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加等渗调节剂(有时称为“稳定剂”)以确保液体组合物的等渗性并且所述等渗调节剂包括多羟基糖醇、优选地三羟基或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类别的赋形剂，它们的功能范围可以从填充剂至溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上文枚举)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨醇、木糖醇、核醣醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等等，包括诸如纤维醇的环多醇、聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，具有10个残基或更少个残基的肽)；蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如葡聚糖。稳定剂可以在每重量份活性蛋白0.1至10000重量的范围内存在。
可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以有助于溶解该治疗剂以及保护该治疗性蛋白免受搅动诱导的聚集，这也允许该制剂暴露于剪切表面应力而不引起该蛋白质的变性。适合的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨聚糖单醚(-20、-80等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围、或以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
额外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)、蛋白酶抑制剂和共溶剂。
本文的制剂除了其抗TNFα抗体之外还可以含有第二治疗剂。适合的第二治疗剂的实例在下文提供。
根据多种临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度、和患者对抗TNFα抗体的敏感性，给药方案可以从每月一次至每日一次变化。在具体实施方式中，其抗TNFα抗体经每日一次、一周两次、一周三次、每隔一天一次、每5天一次、一周一次、每10天一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次施用，或在前述值的任何两者之间的任何范围内施用，例如经每四天一次至每月一次、每10天一次至每两周一次、或一周两至三次施用等。
待施用的抗TNFα抗体的剂量将根据以下各项而变化：特定抗体、受试者、和疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)、以及所选择的施用途径；合适的剂量可以由本领域的技术人员容易地确定。
本领域的技术人员将认识到，其抗TNFα抗体的个体剂量的最佳数量和间隔将通过所治疗的病状的性质和程度、施用的形式、途径和位置、以及所治疗的特定受试者的年龄和病状确定，并且医师将最终确定待施用的合适剂量。此剂量可以视需要重复多次。如果出现副作用，则可以根据正常临床实践改变或减少剂量的量和/或频率。
待治疗的病症
本发明涉及治疗或预防受试者中人TNFα相关疾病的方法，该方法包含向受试者施用如本文所定义的抗体。术语“TNFα相关病症”或“TNFα相关疾病”是指需要TNFα参与的任何病症、症状或疾病状态的发作、进展或持续。示例性TNFα相关病症包括但不限于广义炎症的慢性和/或自身免疫状态、广义免疫介导的炎性病症、炎性CNS疾病、影响眼睛、关节、皮肤、粘膜、中枢神经系统、胃肠道、尿路或肺的炎性疾病、广义葡萄膜炎的状态、视网膜炎、HLA-B27+葡萄膜炎、贝赛特氏症(s disease)、干眼综合征、青光眼、舍格伦综合征( syndrome)、糖尿病(包括糖尿病神经病变)、抗胰岛素性、广义关节炎的状态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎和赖特尔综合征(Reiter's syndrome)、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)、重症肌无力、肌萎缩侧索硬化、结节病、血管球性肾炎、慢性肾病、膀胱炎、银屑病(包括银屑病关节炎)、脓性汗腺炎、脂膜炎、坏疽性脓皮症、SAPHO综合征(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大和骨炎)、痤疮、斯维特综合征(Sweet's sydrome)、天疱疮、克罗恩病(包括肠外表现)、溃疡性结肠炎、支气管哮喘、超敏感性肺炎、广义过敏、变应性鼻炎、变应性鼻窦炎、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、肺纤维化、韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、巨细胞性动脉炎(Giant cell arteritis)、查格-施特劳斯氏血管炎(Churg-Strauss vasculitis)、结节性多动脉炎、烧伤、移植物抗宿主病、宿主抗移植物反应、器官或骨髓移植后的排斥事件、广义血管炎的全身和局部状态、全身性和皮肤红斑狼疮、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子痫、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、术后炎症(诸如在眼部手术(例如，白内障(眼晶体置换)或青光眼手术)后)、关节手术(包括关节镜手术)、关节相关结构(例如，韧带)处的手术、口腔和/或牙齿手术、微创心血管操作(例如，PTCA、旋切术、支架放置)、腹腔镜检查和/或内窥镜检查腹内和妇科操作、内窥镜检查的泌尿外科操作(例如前列腺手术、输尿管镜检查术、膀胱镜检查、间质性膀胱炎)、或广义围手术期炎症(预防)、大疱性皮炎、中性粒细胞性皮炎、中毒性表皮坏死松解症、脓疱性皮炎、脑型疟、溶血性尿毒症综合征、同种异体移植排斥、中耳炎、蛇咬伤、结节性红斑、骨髓增生异常综合征、原发性硬化性胆管炎、血清阴性脊柱关节病、自身免疫性溶血性贫血、口面部肉芽肿病、增殖性脓性口炎、口疮性口炎、地图样舌、迁移性口腔炎、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington'sdisease)、贝尔面瘫(Bell's palsy)、雅各布氏病(Creutzfeld-Jakob disease)和广义神经退行性疾病。
癌症相关骨质溶解、癌症相关炎症、癌症相关疼痛、癌症相关恶病质、骨转移、急性和慢性形式的疼痛，无论这些是否由TNFα的中央或外周效应造成以及它们是否分类为炎性、伤害性或神经性形式的疼痛、坐骨神经痛、腰痛、腕管综合征、复杂性局部疼痛综合征(CRPS)、痛风、疱疹后神经痛、纤维肌痛、局部疼痛状态、由转移瘤引起的慢性疼痛综合征、痛经。
待治疗的特定病症包括广义关节炎状态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、幼年型关节炎；银屑病，包括银屑病关节炎；炎性肠病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎，包括直肠炎、乙状结肠炎、直肠乙状结肠炎、左侧结肠炎、广泛性结肠炎和全结肠炎、未确定型结肠炎、显微镜结肠炎，包括胶原性和淋巴细胞性结肠炎、结缔组织病中的结肠炎、转流性结肠炎、憩室病中的结肠炎、嗜酸性结肠炎和储袋炎。
最优选地，本发明的抗体用于治疗炎性肠病、特别是克罗恩病、溃疡性结肠炎或显微镜结肠炎。克罗恩病可以是回肠、结肠、回肠结肠或孤立性上克罗恩病(胃、十二指肠和/或空肠)，包括非狭窄/非穿透、狭窄、穿透和肛周疾病行为，从而允许上文所提及的任一者的定位和疾病行为的任何组合。溃疡性结肠炎可以是溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、左侧结肠炎、溃疡性大肠炎和储袋炎。
组合疗法和其它方面
优选地，用其抗TNFα抗体治疗的患者还用另一种常规药剂治疗。例如，罹患炎性肠病(尤其是在患有中度至重度疾病时)的患者通常还用美沙拉嗪(mesalazine)或其衍生物或前药、皮质类固醇(例如，布地奈德(budesonide)或泼尼松龙(prednisolone)(口服或静脉内))、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤/6-巯基嘌呤(6-MP)或甲氨蝶呤、环孢霉素或他克莫司(tacrolimus))治疗。可以向患者共同施用的其它药剂包括其它抗TNFα抗体(例如英利昔单抗、阿达木单抗、依那西普(etanercept)、培戈-瑟托利珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab))、整合素拮抗剂(例如那他珠单抗(natalizumab)、维多利珠单抗(vedolizumab))、抗IL-23抗体(例如MEDI2070)、抗β7抗体(例如依卓利珠单抗(etrolizumab))、JAK/STAT途径中的JAK抑制剂(例如托西替尼(tofacitinib))、和其它。可以向患者施用的其它药剂包括免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤/6-MP或甲氨蝶呤或口服环孢霉素)以便维持稳定和较长时间的缓解。本发明的又另一个方面是将如上文所定义的抗TNFα抗体用于减少炎症。
本发明的又另一个方面是如上文所定义的抗TNFα抗体，其用于减少罹患炎性病状的患者中的炎症。
本发明的另一方面是治疗炎性病状的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的如上文定义的抗TNFα抗体。炎性病状优选地是上文所述的病状之一。
本发明的另一方面是预防炎性病状的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的如上文定义的抗TNFα抗体。炎性病状优选地是上文所述的病状之一。
本发明的又另一个方面是改善针对TNFα的抗体的胞吞转运的方法，其包括引入取代E233P、L234V和L235A，删除G236并且引入以下其它一个或多个取代(a)或(b)：
(a)M252Y、S254T和T256E
(b)N434A；
并且任选地进一步引入本文所述的一个或多个其它取代；以便获得具有改善的胞吞转运的经修饰抗体。经修饰抗体优选地是如上文所述的抗体。
本发明的又另一个方面是用于延长针对TNFα的抗体的血浆半衰期的方法，其包括引入取代E233P、L234V和L235A，删除G236并且引入以下其它一个或多个取代(a)或(b)：
(a)M252Y、S254T和T256E
(b)N434A；
并且任选地进一步引入本文所述的一个或多个其它取代；以便获得具有延长的血浆半衰期的经修饰抗体。经修饰抗体优选地是如上文所述的抗体。相对于未经修饰的抗体(即缺乏所列举突变的相应亲本抗体)的血浆半衰期，可以将血浆半衰期增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
本发明的又另一个方面是改善针对TNFα的抗体对蛋白水解降解的抗性的方法，其包括引入取代E233P、L234V和L235A，删除G236并且引入以下其它一个或多个取代(a)或(b)：
(a)M252Y、S254T和T256E
(b)N434A；
并且任选地进一步引入本文所述的一个或多个其它取代；以便获得具有改善的对蛋白水解降解的抗性的经修饰抗体。经修饰抗体优选地是如上文所述的抗体。
表1.序列表中的序列的概述
实施例
抗体变体
抗TNFα抗体(在下文中称为“亲本抗体”或“Ab-wt”)的若干种变体通过在抗体氨基酸序列的Fc区中引入取代来产生。Ab-wt的轻链具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且Ab-wt的重链具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。突变通过确定的方法、通过定点诱变来引入。简言之，突变通过PCR引入。正向引物被设计成含有预期的突变而反向引物被设计成使得两个引物的5’端背对背(但不重叠)连接(图10)。使PCR运行25个循环(98℃持续10s，64℃持续30s，72℃持续3min)。在使PCR产物在琼脂糖凝胶上运行之前，使用限制酶DpnI从PCR产物池中移除未突变的PCR模板。在PCR产物凝胶纯化之后，连接平端以获得环化质粒，将该环化质粒转化到感受态大肠杆菌细胞中。在过夜孵育之后，挑选若干个克隆，分离质粒DNA并且对其测序以证实已经并入突变。
表2：所产生的抗TNFα抗体的抗体变体(EU编号)
名称 相对于亲本抗体的突变
Ab-wt* 无(＝亲本抗体)
Ab-YTE-DLE-PVAΔG** M252Y/S254T/T256E-S239D/A330L/I332E-E233P/L234V/L235A/G236del
Ab-A-DLE-PVAΔG** N434A-S239D/A330L/I332E-E233P/L234V/L235A/G236del
Ab-A-AEA-PVAΔG** N434A-K326A/I332E/E333A-E233P/L234V/L235A/G236del
*并非根据本发明的抗体；**根据本发明的抗体
实施例1.对TNFα的亲和力
方法：
对TNFα的亲和力通过Biacore测量。使用标准的胺固定Biacore程序制备CM5芯片。在插入CM5芯片之后，引发系统并用BIA标准化溶液(Biacore预防性维持试剂盒2)标准化。将该芯片添加到具有磷酸盐缓冲盐水吐温-20(PBS-T)运行缓冲液的系统中；在固定之前，用50mM NaOH的三次注射引发芯片表面。将蛋白A固定到芯片表面上。为此，将该蛋白质于pH4.5下的10mM乙酸盐缓冲液中稀释至5μg/mL并且注射以便在全部4个流动池中产生约1000RU的结合响应。为了从全部芯片流动池中移除非共价结合的物质，进行三次15秒50mMNaOH洗涤。在蛋白A芯片上，在流动池2和4中捕获抗体，而流动槽1和3用于参考提取。将试验抗体在PBS-T中稀释至10nM并且注射2.5-7.5uL以获得120RU的捕获抗体。如供应商所指导，将分析物TNFα在水中制备成500μg/mL并且进一步于运行缓冲液PBS-T中稀释。将单循环动力学用于评价稳态亲和力。对于每个单周期分析循环，将5种分析物浓度的滴定液注入配体上方，并且然后测量复合物的解离度。使用甘氨酸pH 1.7重新产生表面。采用双重参考方法，其中从没有捕获配体的参考表面(分别为fc 1和3)中减去来自配体结合的捕获表面(fc2和4)的数据。每3-4个循环进行缓冲液的空白注射，并且然后从分析物注射循环中减去，以校正配体捕获表面的微小变化。使用在每次分析运行开始和结束时分析物的重复注射，以检查样品降解或仪器性能的变化。在实验运行期间，所有分析均在25℃下进行，并且将样品架在10℃下孵育。每个实验进行至少三次。使用1:1结合模型以拟合所得动力学数据。
结果：
所有抗体都呈现出类似的对TNFα的结合动力学，从而表明任何引入的修饰尚未导致抗原结合区的显著变化。
表3：如通过SPR测定的人IgG1变体对TNFα的结合动力学
实施例2.效能
方法：
在抗TNFα抗体变体的连续稀释液存在下，使L929细胞与0.25ng/mL的TNFα和1μg/孔的放线菌素D一起孵育。在37℃/5％ CO2下孵育20h后，使用MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)和电子偶联剂(吩嗪硫酸乙酯，PES)测量到增殖性应答。通过代谢活性细胞中存在的脱氢酶将MTS转化成甲臜产物。如通过492nM处的吸光度测量的甲臜产物的量与培养物中活细胞的数量成正比。
结果：
结果在图1中示出。将突变引入抗TNFα抗体的Fc区中不影响效能。
实施例3.对Fcγ受体(CD16a，CD16b)的亲和力
方法：
对FcγR的亲和力通过Biacore测量。使用标准的胺固定Biacore程序制备CM5芯片。在插入CM5芯片之后，引发系统并用BIA标准化溶液(Biacore预防性维持试剂盒2)标准化。将该芯片添加到具有PBS-T运行缓冲液的系统中；在固定之前，用50mM NaOH的三次注射引发芯片表面。使用His标签捕获系统将FcγR固定在芯片表面上。根据Biacore试剂盒说明书，使用约12000RU的沉积在全部4个流动池上的抗体制备抗His标签芯片。为了从全部芯片流动池中移除非共价结合的物质，进行三次30秒10mM甘氨酸pH 1.5洗涤。将Fcγ受体在PBS-T中稀释至0.5-2μg/mL的范围，使用2.5-5.0μL注射到芯片上，从而产生在60与200RU之间的捕获水平。在分析之前将抗体稀释到PBS-T中。将单循环动力学用于评价稳态亲和力。对于每个单周期分析循环，将5种分析物浓度的滴定液注入FcγR配体上方，并且然后测量复合物的解离度。使用推荐的溶液10mM甘氨酸pH 1.5产生表面以获得抗His捕获表面。采用双重参考方法，其中从没有捕获配体的参考表面(分别为fc 1和3)中减去来自配体结合的捕获表面(fc 2和4)的数据。每个抗体滴定循环进行缓冲液的空白注射，并且然后从分析物注射循环中减去，以校正配体捕获表面的微小变化。在实验运行期间，所有分析均在25℃下进行，并且将样品架在10℃下孵育。每个实验进行至少三次。
结果：
引入突变不影响对CD16a(V)、CD16a(F)和CD16b的亲和力。然而，一些抗体变体展现对CD16a增加的亲和力。尤其，Ab-A-DLE-PVAΔG对低亲和力CD16a受体和CD16b具有改善的亲和力。
表4：如通过SPR测定的对Fcγ受体CD16a(V)、CD16a(F)和CD16b的亲和力.示出根据两个或更多个独立实验计算的平均值和标准偏差亲和力。
实施例4.对FcRn的亲和力
方法：
使用具有与抗TNFαIgG1抗体(约500共振单位(RU))偶联的CM5传感器芯片的Biacore 3000仪器，使用如制造商所述的胺偶联化学物质进行SPR。使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)，通过将2.0ug/mL的各蛋白质注射到10mM乙酸钠，pH 4.5中来进行偶联。将HBS-P缓冲液pH 7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％表面活性剂P20)或磷酸盐缓冲液pH6.0(67nM磷酸盐缓冲液、150mM NaCl、0.005％吐温20)用作运行缓冲液和稀释缓冲液。通过在pH 7.4或pH 6.0下将滴定量(1000-31.2nM)的单体His标记的人FcRn(hFcRn)注射到固定的抗体上来测定结合动力学。所有的SPR实验都在25℃下、以40ul/min的流率进行。结合数据是零调整的，并且减去参考细胞值。将由BIAevaluation软件(4.1版)提供的Langmuir 1:1配体结合模型用于测定结合动力学。
结果：
结果显示，野生型抗体Ab-wt以严格的pH依赖性与hFcRn结合。所有工程化抗体变体在pH 6.0下都对FcRn具有较高的亲和力，但保持其pH依赖性并且在pH 7.4下不与受体结合。所有抗体变体与含有野生型IgG1 Fc区的英利昔单抗相比显示出对FcRn改善的结合。
表5：如通过SPR测定的在pH 6.0和pH 7.4下抗TNFα抗体变体对FcRn的亲和力
NA：由于结合较弱而未获得。
实施例5.胞吞转运
方法：
将具有涂覆胶原的具有0.4μm孔径大小的聚四氟乙烯(PTFE)膜的Transwell过滤器(1.12cm2)在完整生长培养基中孵育过夜，之后每孔接种1.0x106个T84细胞。使用MILLICELL-ERS-2伏特-欧姆计(TEER)每日监测跨上皮电阻。将培养物培养4-5天，然后达到汇合度，TEER值为约1000-1300Ωxcm2。在实验之前，使单层在Hank's平衡盐溶液(HBSS)中挨饿1h。随后，将400nM的抗体变体或IFX单独或与具有不相关特异性的4000nM人骨髓瘤IgG一起添加到顶侧Transwell小室中。在添加后0和4h从基底外侧储集器中收集样品。通过ELISA测定基底外侧储集器中的抗体浓度。简言之，用都在PBS中稀释到1μg/ml的重组TNFα或来自山羊的抗人Fc特异性抗体涂覆96孔Maxisorp板过夜。接着，用含有4％脱脂乳的PBS将板在室温下封闭2h，之后用含有0.05％吐温20的PBS洗涤4次。将在胞吞转运实验期间收集的样品添加到孔中并且在室温下孵育2h，之后如上洗涤。使用来自山羊的碱性磷酸酶(ALP)缀合的抗人Fc特异性抗体检测到捕获的抗体变体、IFX或总IgG。通过添加100μL ALP底物使结合可视化并且记录405nM吸收谱。转运的抗体变体、IFX和总IgG的量根据每种个体抗体变体的标准曲线计算。
抗体变体跨越极化人上皮细胞的胞吞转运
结果：
测试工程化抗TNFα抗体变体跨越细胞单层的胞吞转运并将其与作为另一种人IgG1抗TNFα抗体的wt抗体或IFX比较。结果在图2中描绘。wt抗TNFα抗体从顶侧转运到基底外侧储集器。在实现对FcRn改善的结合的工程化变体的抗体组中，与Ab-wt相比，显示出略微更多的Ab-YTE-DLE-PVAΔG在基底外侧处释放。与IFX相比，具有wt Fc区的另一种IgG1抗体Ab-A-DLE-PVAΔG以约1.8倍的更高效率转运。
在竞争性IgG存在下抗体变体跨越极化人上皮细胞的胞吞转运
结果：
在将抗TNFα抗体变体与10倍过量的人骨髓瘤IgG一起孵育时，在添加后4小时跨越极化T84细胞单层从顶侧转运到基底外侧储集器的免疫球蛋白的总量对于所有抗体而言是相当的。然而，在pH 6.0下对FcRn增加的亲和力导致，在过量的具有不相关特异性的竞争性人IgG存在下，也有显著较高百分比的跨越细胞单层的特异性抗TNFα转运。结果在图3中描绘。
实施例6.ADCC
方法：
使用来自Promega的ADCC报告基因生物活性检测核心试剂盒。简言之，将1x105/mL下的mTNFαCHO-K1靶细胞接种到白(澄清底部)组织培养板上，每孔100μL。将板在37℃和5％CO2下孵育过夜。在第2天，移除95μL的测定培养基并用3x106/mL下的25μL工程化Jurkat效应细胞置换。随后将板在37℃/5％CO2下孵育6h。接近孵育结束时制备BioGloTM试剂。持续10-20min使板与室温平衡，之后每孔添加75μLBioGloTM试剂。在黑暗中孵育5-10min之后，测量荧光。使用4-PL模型以拟合数据。
结果：
结果(参见图4)显示，所有的抗TNFα抗体都诱导了ADCC，但强度有差异。与野生型抗体Ab-wt相比，Ab-A-AEA-PVAΔG显示相似的ADCC活性，而其它抗体变体显示增加的ADCC。具体而言，Ab-A-DLE-PVAΔG具有显著改善的ADCC。
实施例7.调节性巨噬细胞的诱导
方法：
从健康供体的血沉棕黄层中分离出外周血液单核细胞(PBMC)。细胞通过Ficoll梯度离心分离。以相等数目混合两个个体供体的细胞并且以100μL/孔的总体积将混合物的2x105个细胞接种到96孔板中。将板在37℃/5％ CO2下孵育48h。在48h之后，添加抗TNFα抗体变体或IFX以达到10μg/mL的最终浓度。在五个或六个重复中添加每种化合物。最终体积为150μL/孔。将人血清IgG1(Sigma#I5154)用作对照。在添加化合物之后，将混合的淋巴细胞反应(MLR)在37℃/5％CO2下再培养4天。之后，使用PBS/5mM EDTA(PBS/EDTA)洗涤板并将板与50μL/孔的PBS/EDTA在室温下孵育20min。离心板并甩出液体。将抗体在PBS/EDTA中稀释(抗CD14-PE，抗CD206-APC，都以1:10稀释)。将细胞在50μL抗体溶液中再悬浮并在室温下孵育20min。之后，将细胞用PBS/EDTA洗涤并再悬浮于50μL PBS/EDTA中。将染色的样品在FACSFortessa上使用FACSDiva软件分析。使用FlowJo软件进行分析。
结果：
调节性巨噬细胞的诱导在四个独立MLR中分析并且在所有实验中都成功(将IFX与IgG对照比较)。结果在图5中示出。IFX的诱导水平在各实验之间可能不同，这是由于以下事实：每个实验是使用具有个体间差异的不同供体进行的。所有测试的抗TNFα抗体变体都诱导了在各化合物之间具有轻微差异的CD14+CD206+调节性巨噬细胞。Ab-A-DLE-PVAΔG比IFX诱导了更多的调节性巨噬细胞。
实施例8.对T细胞增殖的抑制
方法：
从健康供体的血沉棕黄层中分离出PBMC。细胞通过Ficoll梯度离心分离。以相等数目混合两个个体供体的细胞并且以100μL/孔的总体积将混合物的2x105个细胞接种到96孔板中。将板在37℃/5％CO2下孵育48h。在48h之后，添加抗TNFα抗体变体或IFX以达到10μg/mL的最终浓度。在五个或六个重复中添加每种化合物。最终体积为150μL/孔。将人血清IgG1(Sigma#I5154)用作对照。在添加化合物之后，将混合的淋巴细胞反应(MLR)在37℃/5％CO2下再培养2天。之后，将滴定的胸苷(3H胸苷，0.5微居里/孔)添加到培养物中。将培养物在37℃/5％CO2下孵育18h。样品使用Microbeta Filtermat 96孔收获器收获并且使用装备有单个检测器的Microbeta微孔板计数器分析。针对10秒/孔对样品计数并且转化为每分钟计数(cpm)。
结果：
在三个独立的MLR中测量了对T细胞增殖的抑制，并且如果作为阳性对照的IFX诱导了抑制，则将对T细胞增殖的抑制定义为成功。在各实验中IFX的抑制水平可能不同，这推测是由于调节性巨噬细胞的差异。在每个实验中，计算相对于阳性对照IFX，抗TNFα抗体变体抑制T细胞增殖的潜能。抗体Ab-A-DLE-PVAΔG显示出与IFX相比显著增强的抑制，而Ab-YTE-DLE-PVAΔG的抑制与IFX相当(参见图6)。
实施例9.蛋白酶稳定性
方法：
在还原和非还原条件下进行分析。将来自PerkinElmer蛋白表达试剂盒、具有和不具有还原剂DTT的对应样品缓冲液用于淬灭反应(即，作为终止试剂)。
为了能够区分变体，如下选择每种IgG的蛋白酶量，以使得可以在30小时之间获得降解-时间分布曲线。使用基于微芯片的电泳系统进行分析。
IdeS消化
为了制备工作溶液(ws)，将一份IdeS等分试样在100μL Milli-Q水中重构。将IdeS和样品以1:1(v/v)比组合并彻底均匀化。将溶液在37℃下孵育，在5、10、30、60分钟后拉出样品并用其中一种终止试剂淬灭。蛋白酶/IgG的摩尔比：4:1。
GluC消化
为了制备工作溶液(ws)，用2X GluC反应缓冲液将GluC储备液稀释至50μg/mL的浓度。将GluC和样品以1:1(v/v)比组合并彻底均匀化。将溶液在37℃下孵育，在2、6、24、30小时后拉出样品并用其中一种终止试剂淬灭。IgG/蛋白酶的摩尔比：4:1。
MMP-3消化
用测定缓冲液MMP将胰凝乳蛋白酶储备液稀释至50μg/mL。将0.186mg/mL MMP-3与稀释的胰凝乳蛋白酶以1:1(v/v)比掺杂在一起并且在37℃下孵育30分钟。用最终浓度为2mM的PMSF终止激活。为了制备工作溶液(ws)，在测定缓冲液MMP中将激活的MMP-3稀释至3.72μg/mL。
将MMP-3ws和样品以1:1(v/v)比组合并彻底均匀化。将溶液在37℃下孵育，在2、6、24、30小时后拉出样品并用其中一种终止试剂淬灭。IgG/蛋白酶的摩尔比：98:1。
结果：
测试的抗体变体显示出对MMP-3和IdeS的蛋白水解降解极佳的抗性，和对GluC的降解良好的抗性(参见图7-9)。

Claims (19)

1.一种抗体，其包含TNFα结合结构域和FcRn结合位点，其中所述抗体的氨基酸序列包含，参照EU编号系统：
(i)氨基酸233P、234V、235A，和氨基酸位置236处的缺失；
(ii)氨基酸434A或氨基酸252Y、254T和256E；和
(iii)氨基酸239D、330L和332E；并且其中
所述抗体包含
VL结构域，所述VL结构域包含具有如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的CDRl区、具有如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的CDR3区，和(ii)VH结构域，所述VH结构域包含具有如SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的CDRl区、具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的CDR2区、以及具有如SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列的CDR3区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的氨基酸序列包含氨基酸233P、234V、235A、239D、330L、332E和434A，以及氨基酸位置236处的缺失。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的氨基酸序列包含氨基酸233P、234V、235A、239D、330L、332E、252Y、254T和256E，以及氨基酸位置236处的缺失。
4.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体在pH 6下对人FcRn的亲和力表征为解离常数KD小于300nM，并且在pH 7.4下对人FcRn无亲和力或低亲和力，表征为解离常数KD大于10μM。
5.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体以小于100pM的KD与人TNFα结合。
6.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体以大于对照抗体的量跨越极化细胞单层从顶侧转运到基底外侧，所述对照抗体包含具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重链。
7.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体与英利昔单抗相比对MMP-3和IdeS的蛋白水解降解更具抗性。
8.根据权利要求1所述的抗体，其包含具有如SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的VH结构域和具有如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的VL结构域。
9.如权利要求8所述的抗体，其包含具有如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列的重链。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其用于治疗TNFα相关炎性病状。
11.根据权利要求10所用的抗体，其中所述炎性病状是胃肠道的炎性病症。
12.根据权利要求10所用的抗体，其中所述治疗包括口服施用有效量的所述抗体。
13.根据权利要求10所用的抗体，其中所述抗体经局部施用。
14.一种核酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体在制备用于治疗TNFα相关炎性病状的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述炎性病状是胃肠道的炎性病症。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述治疗包括口服施用有效量的所述抗体。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述抗体经局部施用。
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