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CN118139974A - 获得修饰的腺相关病毒衣壳的方法 - Google Patents

获得修饰的腺相关病毒衣壳的方法 Download PDF

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CN118139974A CN202280070178.6A CN202280070178A CN118139974A CN 118139974 A CN118139974 A CN 118139974A CN 202280070178 A CN202280070178 A CN 202280070178A CN 118139974 A CN118139974 A CN 118139974A
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amino acid
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S·A·莱戈茨基
T·E·舒加娃
P·M·格尔朔维奇
A·A·纳多林斯基
P·A·雅科夫列夫
D·V·莫洛佐夫
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Abstract

本申请涉及基因疗法和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及产生修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳的方法和通过所述方法产生的修饰的AAV衣壳，以及编码所述修饰的衣壳的分离的核酸和用于将异源核酸序列递送至受试者的基于重组腺相关病毒的载体，所述载体包含所述修饰的衣壳。

Description

获得修饰的腺相关病毒衣壳的方法
技术领域
本申请涉及基因疗法和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及产生修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳的方法和通过所述方法产生的修饰的AAV衣壳，以及编码所述修饰的衣壳的分离的核酸和用于将异源核酸序列递送至受试者的基于重组腺相关病毒的载体，所述载体包含所述修饰的衣壳。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种小型(25nm)、独立的复制缺陷型无包膜病毒。已经在人和灵长类动物中描述了许多不同的AAV血清型。腺相关病毒基因组由(+或-)单链DNA(ssDNA)构成，长度约为4,700个核苷酸。在基因组DNA分子的末端，有末端反向重复序列(ITR)。基因组包含两个开放阅读框(ORF)：Rep和Cap，其含有编码各种蛋白质产物的几个可变阅读框。rep产物对AAV复制至关重要，而三种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)以及其他可变产物由Cap基因编码。VP1、VP2和VP3蛋白以1:1:10的比例存在以形成二十面体衣壳(Xie Q.et al.Theatomic structure of adeno-associated virus(AAV-2),a vector for human genetherapy.Proc Natl Acad Sci USA,2002；99:10405-10410)。在重组AAV(rAAV)载体产生过程中，将ITR两侧的表达盒包装到AAV衣壳中。AAV复制所需的基因不包含在盒中。重组AAV被认为是用于体内基因转移的最安全和最广泛使用的病毒载体之一。载体可以感染多种组织类型的细胞，以提供强而持续的转基因表达。它们也是非致病性的，并且具有低免疫原性特征(High KA et al.,"rAAV human trial experience"Methods Mol Biol.2011；807:429-57)。
在开发有效基因疗法领域的研究的紧迫目的之一是优化载体以改善给定载体的某些特性。
各种AAV血清型的特征在于对不同宿主细胞表面受体的亲和力，它们对这些受体具有嗜性。因此，AAV2的主要已知受体是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，辅助受体是整联蛋白异二聚体aVβ5、1型成纤维细胞生长因子受体和肝细胞生长因子受体c-Met。AAV12与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和唾液酸结合。AAV4和AAV5分别与N-和O-连接的唾液酸结合。AAV5激活血小板衍生的生长因子受体。此外，已经在AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与其组装过程、基因组的包壳化、对宿主细胞表面上不同类型受体的亲和力之间建立了关系(GovindasamyL.et.al.Structural insights into adeno-associated virus serotype 5.JVirol.2013Oct；87(20):11187-99)。
国际申请WO2012145601描述了具有变体衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)病毒体，其中与野生型AAV相比，当通过玻璃体内注射给药时，AAV病毒体表现出对视网膜细胞更大的感染性。
国际申请WO2013158879描述了一种腺相关病毒(AAV)载体，用于向受试者递送包含衣壳蛋白VP1的异源核酸序列，该衣壳蛋白VP1包含一个或多个赖氨酸置换，其中一个赖氨酸置换是K137R，其中所述赖氨酸置换有效抑制所述衣壳蛋白的泛素化，从而提高所述AVV载体在靶细胞中的转导效率。
迄今为止，仍需要与野生型AAV相比具有改进性质的AAV，例如，其具有增强的转导能力、更大的特异性转导靶器官和组织细胞的能力、增加的衣壳容量、增加的AAV病毒基因组包装效率，以及由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高的生成效率。
发明内容
本发明的作者已经发现，根据本发明的用于产生修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳的方法意想不到地使得可以产生与不含这些修饰的AAV衣壳(野生型AAV衣壳)相比具有一种或多种改进性质的修饰的AAV衣壳，所述一种或多种改进性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在一个方面，本发明涉及一种产生修饰的AAV衣壳的方法，包括：
a)确定修饰的AAV的壳粒(capsomere)蛋白中的氨基酸，这些氨基酸位于衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域；
b)将修饰的AAV衣壳与模板衣壳进行结构比对，以确定修饰AAV的来自相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面区域的每个氨基酸与模板衣壳中与其最接近的氨基酸之间的成对对应性，作为被认为是潜在置换的初始氨基酸的结构类似物，
其中模板衣壳被理解为是指结构相似的病毒衣壳，所述病毒选自除AAV之外的细小病毒科；
c)成对比较步骤b)中确定的修饰的AAV衣壳和模板衣壳的氨基酸残基，以鉴定修饰的AAV衣壳和模板衣壳在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中的结构差异；
d)选择诱变位置，其中用于诱变的氨基酸残基位于修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域，并且在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中在修饰的AAV衣壳与模板衣壳之间具有结构差异；
e)使用以下原则之一在步骤d)中选择的位置选择用于诱变的氨基酸残基：
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为具有更大体积的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为在壳粒之间具有增加或减少的极性接触数量的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
f)在修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中引入在步骤d)-e)中选择的一个或多个氨基酸置换。
在本发明的一些实施方案中，产生修饰的AAV衣壳的方法进一步包括检查步骤f)中产生的具有一个或多个氨基酸置换的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进性质，其中一种或多种改进性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在本发明的一些实施方案中，产生修饰的AAV衣壳的方法进一步包括检查步骤f)中产生的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进性质，并选择与不含这些修饰的AAV衣壳相比具有一种或多种改进性质的修饰的AAV衣壳，其中所述一种或多种改进性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自：人AAV、猿AAV或禽AAV。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15或AAV16。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，所述结构相似的模板衣壳选自：细小病毒B19、人博卡病毒1(HBoV1)、牛细小病毒(BVP)。
在一个方面，本发明涉及一种用于产生基于重组腺相关病毒的病毒载体的修饰的AAV衣壳，所述修饰的AAV衣壳通过包括以下的方法产生：
a)确定修饰的AAV的壳粒蛋白中的氨基酸，这些氨基酸位于衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域；
b)将修饰的AAV衣壳与模板衣壳进行结构比对，以确定修饰AAV的来自相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面区域的每个氨基酸与模板衣壳中与其最接近的氨基酸之间的成对对应性，作为被认为是潜在置换的初始氨基酸的结构类似物，
其中模板衣壳被理解为是指结构相似的病毒衣壳，所述病毒选自除AAV之外的细小病毒科；
c)成对比较步骤b)中确定的AAV衣壳和模板衣壳的氨基酸残基，以鉴定修饰的AAV衣壳和模板衣壳在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中的结构差异；
d)选择诱变位置，其中用于诱变的氨基酸残基位于修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域，并且在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中在修饰的AAV衣壳与模板衣壳之间具有结构差异；
e)使用以下原则之一在步骤d)中选择的位置选择用于诱变的氨基酸残基：
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为具有更大体积的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为在壳粒之间具有增加或减少的极性接触数量的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
f)在修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中引入在步骤d)-e)中选择的一个或多个氨基酸置换；
并且，如有必要，还包括
g)检查步骤f)中产生的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进性质，并选择与不含这些修饰的AAV衣壳相比具有一种或多种改进性质的修饰的AAV衣壳，其中所述一种或多种改进性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自：人AAV、猿AAV或禽AAV。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15或AAV16。
一方面，本发明涉及一种用于产生基于重组腺相关病毒的病毒载体的修饰的AAV衣壳，其包含具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP1：SEQ ID No:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包含：
a)具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP1：SEQ ID No:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368；
b)对应于其蛋白VP1的修饰的AAV衣壳蛋白VP2，所述修饰的AAV衣壳蛋白VP2具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No:16、22、28、34、40、46、52，58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364或370；
c)对应于其蛋白VP1的修饰的AAV衣壳蛋白VP3，所述修饰的AAV衣壳蛋白VP3具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No:18、24、30、36、42、48、54，60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366或372。
一方面，本发明涉及编码任何上述修饰衣壳的分离的核酸。
一方面，本发明涉及一种用于向受试者递送异源核酸序列的基于重组腺相关病毒的载体，所述载体包含：
1)任何上述修饰的衣壳，和
2)异源核酸序列，其包含促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中表达的调节序列。
在一些实施方案中，基于重组腺相关病毒的载体具有异源核酸序列的表达产物，其为治疗性多肽或报告多肽。
附图说明
图1是旨在用于克隆AAV衣壳基因随机变体文库的质粒pAAV接头的环状示意图。
GFP是编码绿色荧光蛋白的序列，
PolyA是多聚腺苷酸化信号，
ITR是腺相关病毒的反向末端重复序列，
T2A是编码来自病毒Thosea asigna的多肽链的自切割肽的序列，
HBG内含子是人β-珠蛋白内含子，
CMV启动子是人巨细胞病毒启动子，
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝细菌复制起点，
EcoRI是EcoRI限制性内切酶识别位点，
AscI是AscI限制性内切酶识别位点。
图2是旨在用于从随机变体文库中产生野生型AAV的重组病毒产物的质粒pAAV-Rep的环状示意图。
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝细菌复制起点，
AAV Rep基因是编码病毒生命周期所需的Rep蛋白的序列，
SwaI是SwaI限制性内切酶识别位点，
NotI是NotI限制性内切酶识别位点。
图3是旨在用于从随机变体文库中产生野生型AAV的重组病毒产物的质粒pHelper的环状示意图。
AmpR是β-内酰胺酶基因，提供对氨苄青霉素的抗性，
Ori是细菌的复制起点，
Adeno E2A是参与病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，
Adeno E4是参与病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，
Adeno VARNA是辅助腺病毒基因序列，负责翻译早期和晚期病毒基因。
图4是旨在用于产生重组AAV血清型5病毒产物的质粒pAAV-RC5的环状图。
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝原核复制起点。
AAV Rep基因是编码腺相关病毒生命周期所需的Rep蛋白的序列，
AAV5 Cap基因是编码腺相关病毒血清型5衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3的重叠核苷酸序列的序列。
图5是旨在用于产生重组AAV血清型9病毒产物的质粒pAAV-RC9的环状图。
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝原核复制起点。
AAV Rep基因是编码腺相关病毒生命周期所需的Rep蛋白的序列，
AAV9 Cap基因是编码腺相关病毒血清型9衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3的重叠核苷酸序列的序列。
图6是显示基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体的生成效率的图。
Vg/ml cf是指每毫升培养液的病毒基因组计数。
AAV5-NullMut-GFP是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV5的载体。
AAV5-01Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-02Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、G226A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-03Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、D286E和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-04Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、L341Y和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-05Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有S2A、C387V和T711S突变的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-06Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、Q421H和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-07Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、P466T和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-08Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S594Q和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-09Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、T614L和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-10Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、N679K和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-11Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、P723V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-12Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、V431Y和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-13Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、A616D和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-14Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、W683R和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-15Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S222A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-16Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、R285L和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-17Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有S2A、Q340A和T711S突变的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-18Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S420F和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-19Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S680A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-20Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、T721V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
图7是显示基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体的生成效率的图。
Vg/ml cf是指每毫升培养液的病毒基因组计数。
AAV5-NullMut-GFP是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV5载体。
AAV5-01Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-21Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变G226A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-22Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变D286E的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-23Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变L341Y的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-24Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变C387V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-25Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变Q421H的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-26Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变P466T的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-27Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S594Q的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-28Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614L的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-29Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变N679K的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-30Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变P723V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-31Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变V431Y的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-32Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变A616D的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-33Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变W683R的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-34Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S222A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-35Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变R285L的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-36Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变Q340A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-37Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S420F的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-38Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S680A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-39Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T721V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
图8是显示基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体的生成效率的图。
Vg/ml cf是指每毫升培养液的病毒基因组计数。
AAV9-NullMut-GFP是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV9的载体。
AAV9-01Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变S232T的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-02Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变D297E的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-03Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351K的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-04Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-05Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变C396V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-06Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变D433Y的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-07Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变L444R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-08Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Y478F的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-09Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变G604N的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-10Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变G627K的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-11Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T625L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1
AAV9-12Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T625V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-13Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变S692T的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-14Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T733V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-15Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变A427R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-16Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变M635D的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-17Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变W695R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-18Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变R296L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-19Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351A的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-20Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Y395F的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-21Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变R434L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-22Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变N691A的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
图9是显示在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1中或在已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中包含点突变的基于rAAV5的产物的细胞转导效率的图。
AAV5-NullMut-GFP是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV5的载体。
AAV5-01Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-02Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、G226A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-03Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、D286E和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-04Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、L341Y和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-05Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有S2A、C387V和T711S突变的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-06Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、Q421H和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-07Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、P466T和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-08Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S594Q和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-09Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、T614L和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-10Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、N679K和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-11Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、P723V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-12Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、V431Y和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-13Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、A616D和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-14Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、W683R和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-15Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S222A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-16Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、R285L和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-17Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有S2A、Q340A和T711S突变的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-18Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S420F和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-19Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S680A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-20Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、T721V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
图10是显示在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1中包含点突变的基于rAAV5的产物的细胞转导效率的图。
AAV5-NullMut-GFP是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV5的载体。
AAV5-01Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-21Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变G226A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-22Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变D286E的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-23Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变L341Y的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-24Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变C387V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-25Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变Q421H的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-26Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变P466T的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-27Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S594Q的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-28Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614L的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-29Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变N679K的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-30Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变P723V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-31Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含带有V431Y突变的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-32Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变A616D的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-33Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变W683R的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-34Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S222A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-35Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变R285L的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-36Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变Q340A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-37Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S420F的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-38Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S680A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-39Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T721V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
图11是显示在野生型rAAV9衣壳蛋白VP1中包含点突变的基于rAAV9的产物的细胞转导效率的图。
AAV9-NullMut-GFP是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV9的载体。
AAV9-01Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变S232T的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-02Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变D297E的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-03Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351K的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-04Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-05Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变C396V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-06Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变D433Y的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-07Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变L444R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-08Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Y478F的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-09Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变G604N的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-10Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变G627K的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-11Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T625L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-12Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T625V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-13Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变S692T的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-14Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T733V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-15Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变A427R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-16Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变M635D的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-17Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变W695R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-18Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变R296L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-19Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351A的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-20Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Y395F的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-21Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变R434L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-22Mut-GFP是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变N691A的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
图12是显示用在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经含有突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中包含单突变的基于rAAV5的产物进行细胞转导后由转基因编码的目标蛋白的生产效率的图。
AAV5-NullMut-FIX是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV5的载体。
AAV5-01Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-02Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、G226A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-03Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、D286E和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-04Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、L341Y和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-05Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、C387V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-06Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、Q421H和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-07Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、P466T和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-08Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S594Q和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-09Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、T614L和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-10Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、N679K和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-11Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、P723V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-12Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、V431Y和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-13Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、A616D和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-14Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、W683R和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-15Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S222A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-16Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、R285L和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-17Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、Q340A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-18Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S420F和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-19Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、S680A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-20Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A、T721V和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
图13是显示用在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1中包含单突变的基于rAAV5的产物进行细胞转导后由转基因编码的目标蛋白的生产效率的图。
AAV5-NullMut-FIX是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV5的载体。
AAV5-01Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-21Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变G226A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-22Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变D286E的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-23Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变L341Y的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-24Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变C387V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-25Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变Q421H的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-26Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变P466T的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-27Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S594Q的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-28Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614L的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-29Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变N679K的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-30Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变P723V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-31Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变V431Y的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-32Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变A616D的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-33Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变W683R的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-34Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S222A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-35Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变R285L的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-36Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变Q340A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-37Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S420F的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-38Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S680A的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-39Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T721V的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
图14是显示在用包含野生型rAAV9衣壳蛋白VP1突变的基于rAAV9的产物进行细胞转导后由转基因编码的目标蛋白的生产效率的图。
AAV9-NullMut-FIX是指基于具有野生型衣壳蛋白VP1的rAAV9的载体。
AAV9-01Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变S232T的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-02Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变D297E的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-03Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351K的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-04Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-05Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变C396V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-06Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变D433Y的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-07Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变L444R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-08Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Y478F的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-09Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变G604N的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-10Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变G627K的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-11Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T625L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-12Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T625V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-13Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变S692T的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-14Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变T733V的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-15Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含带有突变A427R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-16Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变M635D的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-17Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变W695R的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-18Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变R296L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-19Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Q351A的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-20Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变Y395F的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-21Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变R434L的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
AAV9-22Mut-FIX是指基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)的载体，所述rAAV9包含具有突变N691A的修饰的AAV9衣壳蛋白VP1。
定义和一般方法
除非本文另有定义，否则与本发明有关的所有技术和科学术语将具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数术语，并且复数术语应包括单数术语。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸的杂交和化学的本分类和方法是本领域技术人员众所周知的并广泛应用于本领域。酶反应和纯化方法根据制造商的指南进行，如本领域中常见的，或如本文所述。
术语“天然存在的”、“天然的”或“野生型”用于描述可以在自然界中找到的与人工产生不同的对象。例如，存在于生物体(包括病毒)中的蛋白质或核苷酸序列，可以从自然界的来源中分离出来，并且未经实验室人员有意修改，是天然存在的。
如在本说明书和随附权利要求中使用的，除非上下文另有说明，否则词语“包括”和“包含”或其变体例如“包括”、“包括”、“包含”或“含有”，将被理解为暗示包含指定的整体或整体组，但不排除任何其他整体或整体组。
腺相关病毒(AAV)
细小病毒科(Parvoviridae)病毒是含有DNA的小型动物病毒。细小病毒科可分为两个亚科：其成员感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和其成员感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。到2006年，已经描述了11种腺相关病毒血清型(Mori,S.ET AL.,2004,"Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey:pseudotypingcharacterization of capsid protein",Virology,Τ.330(2):375-83)。2008年描述了腺相关病毒的血清型12(Michael Schmidt ETAL.,Adeno-associated virus type 12(AAV12):a novel AAV serotype with sialic acid-and heparan sulfateproteoglycan-independent transduction activity,J Virol.2008Feb；82(3):1399-406.doi:10.1128/JVI.02012-07)。所有已知的血清型都可以感染多种组织类型的细胞。组织特异性由衣壳蛋白血清型决定；因此，基于腺相关病毒的载体是通过指定所需的血清型来构建的。有关细小病毒和细小病毒科其他成员的更多信息已在文献中进行了描述(Kenneth I.Berns,《Parvoviridae:The Viruses and Their Replication》,Chapter69in Fields Virology(3d Ed.1996))。
所有已知AAV血清型的基因组组构非常相似。AAV的基因组是长度小于约5000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)位于对病毒生命周期至关重要的蛋白质(Rep)的独特编码核苷酸序列以及重叠衣壳蛋白(Cap)的序列的两侧。Cap基因编码形成衣壳的VP蛋白(VP1、VP2和VP3)，以及AAP(蛋白激活腺相关病毒(AAV)组装)(Sonntag F,K,Schmidt K,et al.The assembly-activating protein promotes capsidassembly of different adeno-associated virus serotypes.J Virol.2011；85(23):12686-12697.doi:10.1128/JVI.05359-11)和MAAP(膜相关辅助蛋白)(Ogden PJ,KelsicED,Sinai S,Church GM.Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals aviral gene and enables machine-guided design.Science.2019；366(6469):1139-1143.doi:10.1126/science.aaw2900)。145个核苷酸长的AAV基因组侧翼序列是自我互补的，并且被组构成可以形成形成T形发夹的能量稳定的分子内双链体。这种发夹结构作为病毒DNA复制的起点其作用，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中感染野生型AAV(wtAAV)后，Rep基因(如Rep78和Rep52)分别使用P5启动子和P19启动子表达，并且两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中都具有一定的功能。Rep开放阅读框(Rep ORF)中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白(例如Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经表明编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以在哺乳动物细胞中产生AAV载体。
基于重组腺相关病毒(rAAV)的载体
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。此外，本文中的术语“载体”是指能够转运核酸的病毒颗粒。
如在本说明书中使用的，术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
用途
“向受试者递送异源核酸序列”是将基因插入受试者的细胞和/或组织中。
术语“受试者”、“患者”、“个体”等在本说明书中可互换使用，并且它们指的是适用于本说明书中描述的方法的任何动物。在某些非限制性实施方案中，受试者、患者或个体是人。所述受试者可以是任何年龄的男性或女性。
发明详述
产生修饰的腺相关病毒衣壳的方法
在一个方面，本发明涉及一种产生修饰的AAV衣壳的方法，包括：
a)确定修饰的AAV的壳粒蛋白中的氨基酸，这些氨基酸位于衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域；
b)将修饰的AAV衣壳与模板衣壳进行结构比对，以确定修饰AAV的来自相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面区域的每个氨基酸与模板衣壳中与其最接近的氨基酸之间的成对对应性，作为被认为是潜在置换的初始氨基酸的结构类似物，
其中模板衣壳被理解为是指结构相似的病毒衣壳，所述病毒选自除AAV之外的细小病毒科；
c)成对比较步骤b)中确定的修饰的AAV衣壳和模板衣壳的氨基酸残基，以鉴定修饰的AAV衣壳和模板衣壳在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中的结构差异；
d)选择诱变位置，其中用于诱变的氨基酸残基位于修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域，并且在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中在修饰的AAV衣壳与模板衣壳之间具有结构差异；
e)使用以下原则之一在步骤d)中选择的位置选择用于诱变的氨基酸残基：
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为具有更大体积的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为在壳粒之间具有增加或减少的极性接触数量的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
f)在修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中引入在步骤d)-e)中选择的一个或多个氨基酸置换。
相互作用界面(或表面)是指一组与相邻五聚体亚单位的氨基酸相互作用的壳粒蛋白多肽链片段，其中五聚体亚单位是指具有正五边形形状且由位于中心孔周围的5种壳粒蛋白组成的衣壳结构元件(L.M.Drouin and M.Agbandje-McKenna.Adeno-associatedvirus structural biology as a tool in vector development.Future Virol.,vol.8,no.12,pp.1183–1199,2013)。
给定亚单位的相互作用界面旨在指所有氨基酸，其至少一个原子与相邻五聚体亚单位的任何原子的距离小于
对于AAV5，计算基于衣壳结构PDB ID:6JCT。
根据计算，AAV5的相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面包括以下范围的AAV5衣壳蛋白VP1残基：220-226、283-293、339-342、385-392、412-435、462-466、590-598、611–626、677–685、721-724。
对于AAV9，基于结构PDB ID:3UX1进行了类似的计算。
根据计算，AAV9的相邻五聚体亚单位的相互作用界面包括以下范围的AAV9衣壳蛋白VP1残基：230-236、294-304、350-353、394-401、421-444、476-480、601–609、622–637、689–697、733–736。
“一个或多个氨基酸置换”是指1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。例如，1至10个氨基酸置换、1至9个氨基酸置换、1至8个氨基酸置换、1至7个氨基酸置换、1至6个氨基酸置换、1至5个氨基酸置换，1至4个氨基酸置换，1至3个氨基酸置换或1至2个氨基酸置换。
在本发明的一些实施方案中，产生修饰的AAV衣壳的方法进一步包括检查步骤f)中产生的具有一个或多个氨基酸置换的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进的性质，其中一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在本发明的一些实施方案中，产生修饰的AAV衣壳的方法进一步包括检查步骤f)中产生的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进的性质，并选择与不含这些修饰的AAV衣壳相比具有一种或多种改进的性质的修饰的AAV衣壳，其中所述一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自：人AAV、猿AAV或禽AAV。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、rAAV.rh8、rAAV.rhlO、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-l、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是野生型AAV衣壳或在蛋白质VP1、VP2和/或VP3中包含一个或多个氨基酸置换的AAV衣壳。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是野生型AAV5衣壳或在蛋白质VP1、VP2和/或VP3中包含一个或多个氨基酸置换的AAV5衣壳。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是在蛋白质VP1中包含氨基酸置换S2A和T711S的AAV5衣壳。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是野生型AAV9衣壳或在蛋白质VP1、VP2和/或VP3中包含一个或多个氨基酸置换的AAV9衣壳。
在用于产生AAV衣壳的方法的一些实施方案中，结构相似的模板衣壳选自：细小病毒B19、人博卡病毒1(HBoV1)、牛细小病毒(BVP)。
根据本发明的修饰的AAV衣壳
在一个方面，本发明涉及一种用于产生基于重组腺相关病毒的病毒载体的修饰的AAV衣壳，所述修饰的AAV衣壳通过包括以下的方法产生：
a)确定修饰的AAV的壳粒蛋白中的氨基酸，这些氨基酸位于衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域；
b)将修饰的AAV衣壳与模板衣壳进行结构比对，以确定修饰AAV的来自相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面区域的每个氨基酸与模板衣壳中与其最接近的氨基酸之间的成对对应性，作为被认为是潜在置换的初始氨基酸的结构类似物，
其中模板衣壳被理解为是指结构相似的病毒衣壳，所述病毒选自除AAV之外的细小病毒科；
c)成对比较步骤b)中确定的AAV衣壳和模板衣壳的氨基酸残基，以鉴定修饰的AAV衣壳和模板衣壳在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中的结构差异；
d)选择诱变位置，其中用于诱变的氨基酸残基位于修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域，并且在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中在修饰的AAV衣壳与模板衣壳之间具有结构差异；
e)使用以下原则之一在步骤d)中选择的位置选择用于诱变的氨基酸残基：
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为具有更大体积的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为在壳粒之间具有增加或减少的极性接触数量的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
f)在修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中引入在步骤d)-e)中选择的一个或多个氨基酸置换；
并且，如有必要，还包括
g)检查步骤f)中产生的修饰的AAV衣壳与没有这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进的性质，并选择与不含这些修饰的AAV衣壳相比具有一种或多种改进的性质的修饰的AAV衣壳，其中所述一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自：人AAV、猿AAV或禽AAV。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳选自以下AAV血清型：AAV:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、rAAV.rh8、rAAV.rhlO、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-l、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是野生型AAV衣壳或在蛋白质VP1、VP2和/或VP3中包含一个或多个氨基酸置换的AAV衣壳。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是野生型AAV5衣壳或在蛋白质VP1、VP2和/或VP3中包含一个或多个氨基酸置换的AAV5衣壳。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是在蛋白质VP1中包含氨基酸置换S2A和T711S的AAV5衣壳。
在修饰的AAV衣壳的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳可以是野生型AAV9衣壳或在蛋白质VP1、VP2和/或VP3中包含一个或多个氨基酸置换的AAV9衣壳。
腺相关病毒基因组DNA(+)-链的“右侧”包含编码三种衣壳蛋白的重叠序列：VP1、VP2和VP3。这些基因的转录从单个启动子p40开始。相应蛋白质的分子量分别为87、72和62kDa。所有这三种蛋白质都是从单个mRNA翻译而来的。转录后，pre-mRNA可以以两种不同的方式剪接，其中较长或较短的内含子被切除以形成2300或2600个核苷酸长的mRNA。
因此，将突变引入Cap基因不仅会影响AAV衣壳蛋白VP1，还会影响AAV VP2和VP3衣壳蛋白。
下面是Cap AAV5基因序列中AAV5衣壳结构蛋白的位置：
1-725aa–VP1、
137-725aa–VP2、
193-725aa–VP3。
下面是Cap AAV9基因序列中AAV9衣壳结构蛋白的位置：
1-737aa-VP1、
138-737aa–VP2、
203-737aa–VP3。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包含具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP1：SEQ ID No:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包含具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP2：SEQ ID No:16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364或370。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包含具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP3：SEQ ID No:18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366或372。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包含：
a)具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP1：SEQ ID No:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368；
b)对应于其蛋白VP1的修饰的AAV衣壳蛋白VP2，所述修饰的AAV衣壳蛋白VP2具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No:16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364或370；
c)对应于其蛋白VP1的修饰的AAV衣壳蛋白VP3，所述修饰的AAV衣壳蛋白VP3具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No:18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366或372。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换G226A(AAV5衣壳VP1 G226A)并且具有SEQ ID No:14的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换G90A(AAV5衣壳VP2 G90A)并且具有SEQ ID No:16的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换G34A(AAV5衣壳VP3 G34A)并且具有SEQ ID No:18的氨基酸序列
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A、G226A和T711S(AAV5衣壳VP1 S2A、G226A和T711S)并且具有SEQ ID No:20的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换G90A和T575S(AAV5衣壳VP2G90A和T575S)并且具有SEQ ID No:22的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换G34A T519S(AAV5衣壳VP3G34A T519S)并且具有SEQ ID No:24的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换D286E(AAV5衣壳VP1 D286E)并且具有SEQ ID No:26的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换D150E(AAV5衣壳VP2 D150E)并且具有SEQ ID No:28的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换D94E(AAV5衣壳VP3 D94E)并且具有SEQ ID No:30的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A、D286E和T711S(AAV5衣壳VP1 S2A、D286E和T711S)并且具有SEQ ID No:32的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换D150E和T575S(AAV5衣壳VP2D150E和T575S)并且具有SEQ ID No:34的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换D94E和T519S(AAV5衣壳VP3D94E和T519S)并且具有SEQ ID No:36的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换L341Y(AAV5衣壳VP1 L341Y)并且具有SEQ ID No:38的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换L205Y(AAV5衣壳VP2 L205Y)并且具有SEQ ID No:40的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换L149Y(AAV5衣壳VP3 L149Y)并且具有SEQ ID No:42的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A、L341Y、T711S(AAV5衣壳VP1 S2A、L341Y、T711S)并且具有SEQ ID No:44的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换L205Y、T575S(AAV5衣壳VP2L205Y、T575S)并且具有SEQ ID No:46的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换L149Y、T519S(AAV5衣壳VP3L149Y、T519S)并且具有SEQ ID No:48的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换С387V(AAV5衣壳VP1С387V)并且具有SEQ ID No:50的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换С251V(AAV5衣壳VP2С251V)并且具有SEQ ID No:52的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换С195V(AAV5衣壳VP3С195V)并且具有SEQ ID No:54的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A、С387V、T711S(AAV5衣壳VP1 S2A、С387V、T711S)并且具有SEQ ID No:56的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换С251V、T575S(AAV5衣壳VP2С251V、T575S)并且具有SEQ ID No:58的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换С195V、T519S(AAV5衣壳VP3С195V、T519S)并且具有SEQ ID No:60的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换Q421H(AAV5衣壳VP1 Q421H)并且具有SEQ ID No:62的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换Q285H(AAV5衣壳VP2 Q285H)并且具有SEQ ID No:64的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换Q229H(AAV5衣壳VP3 Q229H)并且具有SEQ ID No:66的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A Q421H T711S(AAV5衣壳VP1 S2A Q421H T711S)并且具有SEQ ID No:68的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换Q285H T575S(AAV5衣壳VP2Q285H T575S)并且具有SEQ ID No:70的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换Q229H T519S(AAV5衣壳VP3Q229H T519S)并且具有SEQ ID No:72的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换P466T(AAV5衣壳VP1 P466T)并且具有SEQ ID No:74的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换P330T(AAV5衣壳VP2 P330T)并且具有SEQ ID No:76的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换P274T(AAV5衣壳VP3 P274T)并且具有SEQ ID No:78的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A P466T T711S(AAV5衣壳VP1 S2A P466T T711S)并且具有SEQ ID No:80的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换P330T T575S(AAV5衣壳VP2P330T T575S)并且具有SEQ ID No:82的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换P274T T519S(AAV5衣壳VP3P274T T519S)并且具有SEQ ID No:84的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S594Q(AAV5衣壳VP1 S594Q)并且具有SEQ ID No:86的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S458Q(AAV5衣壳VP2 S458Q)并且具有SEQ ID No:88的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S402Q(AAV5衣壳VP3 S402Q)并且具有SEQ ID No:90的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A S594Q T711S(AAV5衣壳VP1 S2A S594Q T711S)并且具有SEQ ID No:92的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S458Q T575S(AAV5衣壳VP2S458Q T575S)并且具有SEQ ID No:94的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S402Q T519S(AAV5衣壳VP3S402Q T519S)并且具有SEQ ID No:96的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换T614L(AAV5衣壳VP1 T614L)并且具有SEQ ID No:98的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换T478L(AAV5衣壳VP2 T478L)并且具有SEQ ID No:100的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换T422L(AAV5衣壳VP3 T422L)并且具有SEQ ID No:102的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A T614L T711S(AAV5衣壳VP1 S2A T614L T711S)并且具有SEQ ID No:104的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换T478L T575S(AAV5衣壳VP2T478L T575S)并且具有SEQ ID No:106的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换(AAV5衣壳VP3 T422L T519S)并且具有SEQ ID No:108的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换N679K(AAV5衣壳VP1 N679K)并且具有SEQ ID No:110的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换N543K(AAV5衣壳VP2 N543K)并且具有SEQ ID No:112的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换N487K(AAV5衣壳VP3 N487K)并且具有SEQ ID No:114的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A N679K T711S(AAV5衣壳VP1 S2A N679K T711S)并且具有SEQ ID No:116的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换N543K T575S(AAV5衣壳VP2N543K T575S)并且具有SEQ ID No:118的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换N487K T519S(AAV5衣壳VP3N487K T519S)并且具有SEQ ID No:120的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换P723V(AAV5衣壳VP1 P723V)并且具有SEQ ID No:122的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换P587V(AAV5衣壳VP2 P587V)并且具有SEQ ID No:124的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换P531V(AAV5衣壳VP3 P531V)并且具有SEQ ID No:126的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换P723V T711S(AAV5衣壳VP1S2A P723V T711S)并且具有SEQ ID No:128的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换P587V T575S(AAV5衣壳VP2P587V T575S)并且具有SEQ ID No:130的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换P531V T519S(AAV5衣壳VP3P531V T519S)并且具有SEQ ID No:132的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换V431Y(AAV5衣壳VP1 V431Y)并且具有SEQ ID No:134的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换V295Y(AAV5衣壳VP2 V295Y)并且具有SEQ ID No:136的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换V239Y(AAV5衣壳VP3 V239Y)并且具有SEQ ID No:138的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A V431Y T711S(AAV5衣壳VP1 S2A V431Y T711S)并且具有SEQ ID No:140的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换V295Y T575S(AAV5衣壳VP2V295Y T575S)并且具有SEQ ID No:142的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换V239Y T519S(AAV5衣壳VP3V239Y T519S)并且具有SEQ ID No:144的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换A616D(AAV5衣壳VP1 A616D)并且具有SEQ ID No:146的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换A480D(AAV5衣壳VP2 A480D)并且具有SEQ ID No:148的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换A424D(AAV5衣壳VP3 A424D)并且具有SEQ ID No:150的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A A616D T711S(AAV5衣壳VP1 S2A A616D T711S)并且具有SEQ ID No:152的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换A480D T575S(AAV5衣壳VP2A480D T575S)并且具有SEQ ID No:154的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换A424D T519S(AAV5衣壳VP3A424D T519S)并且具有SEQ ID No:156的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换W683R(AAV5衣壳VP1 W683R)并且具有SEQ ID No:158的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换W547R(AAV5衣壳VP2 W547R)并且具有SEQ ID No:160的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换W491R(AAV5衣壳VP3 W491R)并且具有SEQ ID No:162的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A W683R T711S(AAV5衣壳VP1 S2A W683R T711S)并且具有SEQ ID No:164的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换W547R T575S(AAV5衣壳VP2W547R T575S)并且具有SEQ ID No:166的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换W491R T519S(AAV5衣壳VP3W491R T519S)并且具有SEQ ID No:168的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S222A(AAV5衣壳VP1 S222A)并且具有SEQ ID No:170的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S86A(AAV5衣壳VP2 S86A)并且具有SEQ ID No:172的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S30A(AAV5衣壳VP3 S30A)并且具有SEQ ID No:174的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A S222A T711S(AAV5衣壳VP1 S2A S222A T711S)并且具有SEQ ID No:176的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S86A T575S(AAV5衣壳VP2S86A T575S)并且具有SEQ ID No:178的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S30A T519S(AAV5衣壳VP3S30A T519S)并且具有SEQ ID No:180的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换R285L(AAV5衣壳VP1 R285L)并且具有SEQ ID No:182的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换R149L(AAV5衣壳VP2 R149L)并且具有SEQ ID No:184的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换R93L(AAV5衣壳VP3 R93L)并且具有SEQ ID No:186的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A R285L T711S(AAV5衣壳VP1 S2A R285L T711S)并且具有SEQ ID No:188的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换R149L T575S(AAV5衣壳VP2R149L T575S)并且具有SEQ ID No:190的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换R93L T519S(AAV5衣壳VP3R93L T519S)并且具有SEQ ID No:192的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换Q340A(AAV5衣壳VP1 Q340A)并且具有SEQ ID No:194的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换(AAV5衣壳VP2 Q204A)并且具有SEQ ID No:196的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换Q148A(AAV5衣壳VP3 Q148A)并且具有SEQ ID No:198的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A Q340A T711S(AAV5衣壳VP1 S2A Q340A T711S)并且具有SEQ ID No:200的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换Q204A T575S(AAV5衣壳VP2Q204A T575S)并且具有SEQ ID No:202的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换Q148A T519S(AAV5衣壳VP3Q148A T519S)并且具有SEQ ID No:204的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S420F(AAV5衣壳VP1 S420F)并且具有SEQ ID No:206的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S284F(AAV5衣壳VP2 S284F)并且具有SEQ ID No:208的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S228F(AAV5衣壳VP3 S228F)并且具有SEQ ID No:210的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A S420F T711S(AAV5衣壳VP1 S2A S420F T711S)并且具有SEQ ID No:212的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S284F T575S(AAV5衣壳VP2S284F T575S)并且具有SEQ ID No:214的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S228F T519S(AAV5衣壳VP3S228F T519S)并且具有SEQ ID No:216的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S680A(AAV5衣壳VP1 S680A)并且具有SEQ ID No:218的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S544A(AAV5衣壳VP2 S544A)并且具有SEQ ID No:220的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S488A(AAV5衣壳VP3 S488A)并且具有SEQ ID No:222的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A S680A T711S(AAV5衣壳VP1 S2A S680A T711S)并且具有SEQ ID No:224的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换S544A T575S(AAV5衣壳VP2S544A T575S)并且具有SEQ ID No:226的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换S488A T519S(AAV5衣壳VP3S488A T519S)并且具有SEQ ID No:228的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换T721V(AAV5衣壳VP1 T721V)并且具有SEQ ID No:230的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换T585V(AAV5衣壳VP2 T585V)并且具有SEQ ID No:232的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换T529V(AAV5衣壳VP3 T529V)并且具有SEQ ID No:234的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含置换S2A T721V T711S(AAV5衣壳VP1 S2A T721V T711S)并且具有SEQ ID No:236的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含置换T585V T575S(AAV5衣壳VP2T585V T575S)并且具有SEQ ID No:238的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含置换T529V T519S(AAV5衣壳VP3T529V T519S)并且具有SEQ ID No:240的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换Q351K(AAV9衣壳VP1 Q351K)并且具有SEQ ID No:242的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换Q214K(AAV9衣壳VP2 Q214K)并且具有SEQ ID No:244的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换Q149K(AAV9衣壳VP3 Q149K)并且具有SEQ ID No:246的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换Q351R(AAV9衣壳VP1 Q351R)并且具有SEQ ID No:248的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换Q214R(AAV9衣壳VP2 Q214R)并且具有SEQ ID No:250的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换Q149R(AAV9衣壳VP3 Q149R)并且具有SEQ ID No:252的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换S232T(AAV9衣壳VP1 S232T)并且具有SEQ ID No:254的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换S95T(AAV9衣壳VP2 S95T)并且具有SEQ ID No:256的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换S30T(AAV9衣壳VP3 S30T)并且具有SEQ ID No:258的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换D297E(AAV9衣壳VP1 D297E)并且具有SEQ ID No:260的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换D160E(AAV9衣壳VP2 D160E)并且具有SEQ ID No:262的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换D95E(AAV9衣壳VP3 D95E)并且具有SEQ ID No:264的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换S692T(AAV9衣壳VP1 S692T)并且具有SEQ ID No:266的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换S555T(AAV9衣壳VP2 S555T)并且具有SEQ ID No:268的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换S490T(AAV9衣壳VP3 S490T)并且具有SEQ ID No:270的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换D433Y(AAV9衣壳VP1 D433Y)并且具有SEQ ID No:272的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换D296Y(AAV9衣壳VP2 D296Y)并且具有SEQ ID No:274的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换D231Y(AAV9衣壳VP3 D231Y)并且具有SEQ ID No:276的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换T625L(AAV9衣壳VP1 T625L)并且具有SEQ ID No:278的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换T488L(AAV9衣壳VP2 T488L)并且具有SEQ ID No:280的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换T423L(AAV9衣壳VP3 T423L)并且具有SEQ ID No:282的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换T625V(AAV9衣壳VP1 T625V)并且具有SEQ ID No:284的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换T488V(AAV9衣壳VP2 T488V)并且具有SEQ ID No:286的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换T423V(AAV9衣壳VP3 T423V)并且具有SEQ ID No:288的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换N691A(AAV9衣壳VP1 N691A)并且具有SEQ ID No:290的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换N554A(AAV9衣壳VP2 N554A)并且具有SEQ ID No:292的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换N489A(AAV9衣壳VP3 N489A)并且具有SEQ ID No:294的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换C396V(AAV9衣壳VP1 C396V)并且具有SEQ ID No:296的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换C259V(AAV9衣壳VP2 C259V)并且具有SEQ ID No:298的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换C194V(AAV9衣壳VP3 C194V)并且具有SEQ ID No:300的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换Y478F(AAV9衣壳VP1 Y478F)并且具有SEQ ID No:302的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换Y341F(AAV9衣壳VP2 Y341F)并且具有SEQ ID No:304的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换Y276F(AAV9衣壳VP3 Y276F)并且具有SEQ ID No:306的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换R296L(AAV9衣壳VP1 R296L)并且具有SEQ ID No:308的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换R159L(AAV9衣壳VP2 R159L)并且具有SEQ ID No:310的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换R94L(AAV9衣壳VP3 R94L)并且具有SEQ ID No:312的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换T733V(AAV9衣壳VP1 T733V)并且具有SEQ ID No:314的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换T596V(AAV9衣壳VP2 T596V)并且具有SEQ ID No:316的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换T531V(AAV9衣壳VP3 T531V)并且具有SEQ ID No:318的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换A427R(AAV9衣壳VP1 A427R)并且具有SEQ ID No:320的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换A290R(AAV9衣壳VP2 A290R)并且具有SEQ ID No:322的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换A225R(AAV9衣壳VP3 A225R)并且具有SEQ ID No:324的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换M635D(AAV9衣壳VP1 M635D)并且具有SEQ ID No:326的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换M498D(AAV9衣壳VP2 M498D)并且具有SEQ ID No:328的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换M433D(AAV9衣壳VP3 M433D)并且具有SEQ ID No:330的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换L444R(AAV9衣壳VP1 L444R)并且具有SEQ ID No:332的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换L307R(AAV9衣壳VP2 L307R)并且具有SEQ ID No:334的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换L242R(AAV9衣壳VP3 L242R)并且具有SEQ ID No:336的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换G604N(AAV9衣壳VP1 G604N)并且具有SEQ ID No:338的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换G467N(AAV9衣壳VP2 G467N)并且具有SEQ ID No:340的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换G402N(AAV9衣壳VP3 G402N)并且具有SEQ ID No:342的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换G627K(AAV9衣壳VP1 G627K)并且具有SEQ ID No:344的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换G490K(AAV9衣壳VP2 G490K)并且具有SEQ ID No:346的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换G425K(AAV9衣壳VP3 G425K)并且具有SEQ ID No:348的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换W695R(AAV9衣壳VP1 W695R)并且具有SEQ ID No:350的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换W558R(AAV9衣壳VP2 W558R)并且具有SEQ ID No:352的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换W493R(AAV9衣壳VP3 W493R)并且具有SEQ ID No:354的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换Q351A(AAV9衣壳VP1 Q351A)并且具有SEQ ID No:356的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换Q214A(AAV9衣壳VP2 Q214A)并且具有SEQ ID No:358的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换Q149A(AAV9衣壳VP3 Q149A)并且具有SEQ ID No:360的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换Y395F(AAV9衣壳VP1 Y395F)并且具有SEQ ID No:362的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换Y258F(AAV9衣壳VP2 Y258F)并且具有SEQ ID No:364的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换Y193F(AAV9衣壳VP3 Y193F)并且具有SEQ ID No:366的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP1，其包含置换R434L(AAV9衣壳VP1 R434L)并且具有SEQ ID No:368的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP2，其包含置换R297L(AAV9衣壳VP2 R297L)并且具有SEQ ID No:370的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV衣壳包括修饰的AAV9衣壳蛋白VP3，其包含置换(AAV9衣壳VP3 R232L)并且具有SEQ ID No:372的氨基酸序列。
相对于相应的野生型衣壳计算修饰的AAV衣壳中的所有上述一个或多个置换。
野生型AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 WT)的天然存在序列由SEQ ID No:2的氨基酸序列表示，野生型AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 WT)的天然存在序列由SEQ ID No:4的氨基酸序列表示，野生型AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 WT)的天然存在序列由SEQ IDNo:6的氨基酸序列表示。
野生型AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1 WT)的天然存在序列由SEQ ID No:373的氨基酸序列表示，野生型AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2 T)的天然存在序列由SEQ ID No:375的氨基酸序列表示，野生型AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3 WT)的天然存在序列由SEQID No:377的氨基酸序列表示。
本发明的作者发现，上述修饰的AAV衣壳与不含所述修饰的AAV衣壳(野生型AAV衣壳)相比具有一种或多种改进的性质，所述一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
编码根据本发明的修饰衣壳的分离的核酸
一方面，本发明涉及编码任何上述修饰衣壳的核酸。
在本发明的任何实施方案中，核酸分子可以是分离的。
在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”是指核苷酸的精确序列，不论是否被修饰，确定核酸的片段或区域，不论是否含有非天然核苷酸，并且是双链DNA或RNA，单链DNA或RNA，或所述DNA的转录产物。
如在本说明书中使用的，作为非限制性实例，多核苷酸包括通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，作为非限制性实例，包括重组手段，即从重组文库或细胞基因组，采用普通的克隆技术和PCR等克隆核酸序列，以及通过合成手段。
此处还应包括，本发明不涉及在其天然染色体环境中，即在天然状态下的核苷酸序列。本发明的序列已经被分离和/或纯化，即它们被直接或间接地取样，例如通过复制。因此，此处还应提及通过重组遗传学，例如通过宿主细胞获得或通过化学合成获得的分离的核酸。
除非另有说明，否则对核苷酸序列的提及包括其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸应理解为包含其具有其互补序列的互补链的核酸。
“分离的”核酸分子是从至少一种核酸分子-杂质中鉴定和分离的核酸分子，前者在抗体核酸的天然来源中结合至杂质。分离的核酸分子不同于在自然条件下发现的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在自然条件下存在于细胞中的核酸分子。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸是DNA。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G226A的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1G226A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:13的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G90A的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2G90A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:15的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G34A的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3G34A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:17的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2A、G226A和T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A、G226A和T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:19的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G90A和T575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 G90A和T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:21的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G34AT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 G34A T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:23的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D286E的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1D286E)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:25的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D150E的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2D150E)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:27的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D94E的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 D94E)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:29的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2A、D286E和T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A、D286E和T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:31的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D150E和T575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 D150E和T575S)的核酸，所述核酸具有SEQID No:33的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D94E和T519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 D94E和T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:35的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L341Y的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1L341Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:37的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L205Y的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2L205Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:39的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L149Y的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3L149Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:41的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2A、L341Y、T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A、L341Y、T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:43的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L205Y、T575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 L205Y、T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:45的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L149Y、T519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 L149Y、T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:47的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换С387V的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1С387V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:49的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换С251V的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2С251V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:51的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换С195V的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3С195V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:53的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2A、С387V、T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A、С387V、T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:55的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换С251V、T575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2С251V、T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:57的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换С195V、T519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3С195V、T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:59的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q421H的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1Q421H)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:61的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q285H的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2Q285H)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:63的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q229H的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3Q229H)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:65的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AQ421H T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A Q421H T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:67的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q285HT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 Q285H T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:69的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q229HT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 Q229H T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:71的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P466T的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1P466T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:73的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P330T的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2P330T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:75的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P274T的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3P274T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:77的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AP466T T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A P466T T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:79的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P330TT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 P330T T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:81的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P274TT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 P274T T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:83的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S594Q的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1S594Q)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:85的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S458Q的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2S458Q)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:87的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S402Q的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3S402Q)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:89的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AS594Q T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A S594Q T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:91的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S458QT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 S458Q T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:93的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S402QT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 S402Q T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:95的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T614L的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1T614L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:97的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T478L的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2T478L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:99的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T422L的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3T422L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:101的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AT614L T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A T614L T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:103的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T478LT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 T478L T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:105的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T422LT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 T422L T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:107的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N679K的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1N679K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:109的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N543K的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2N543K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:111的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N487K的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3N487K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:113的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AN679K T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A N679K T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:115的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N543KT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 N543K T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:117的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N487KT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 N487K T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:119的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P723V的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1P723V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:121的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P587V的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2P587V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:123的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P531V的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3P531V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:125的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P723VT711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A P723V T711S)的核酸，所述核酸具有SEQID No:127的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P587VT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 P587V T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:129的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换P531VT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 P531V T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:131的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换V431Y的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1V431Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:133的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换V295Y的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2V295Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:135的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换V239Y的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3V239Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:137的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AV431Y T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A V431Y T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:139的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换V295YT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 V295Y T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:141的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换V239YT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3 AAV5衣壳VP3 V239Y T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:143的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A616D的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1A616D)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:145的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A480D的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2A480D)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:147的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A424D的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3A424D)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:149的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AA616D T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A A616D T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:151的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A480DT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 A480D T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:153的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A424DT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 A424D T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:155的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W683R的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1W683R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:157的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W547R的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2W547R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:159的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W491R的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3W491R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:161的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AW683R T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A W683R T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:163的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W547RT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 W547R T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:165的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W491RT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 W491R T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:167的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S222A的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1S222A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:169的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S86A的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 S86A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:171的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S30A的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 S30A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:173的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AS222A T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A S222A T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:175的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S86AT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 S86A T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:177的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S30AT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 S30A T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:179的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R285L的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1R285L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:181的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R149L的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2R149L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:183的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R93L的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 R93L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:185的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AR285L T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A R285L T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:187的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R149LT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 R149L T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:189的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R93LT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 R93L T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:191的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q340A的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1Q340A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:193的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q204A的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2Q204A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:195的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q148A的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3Q148A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:197的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AQ340A T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A Q340A T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:199的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q204AT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 Q204A T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:201的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q148AT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 Q148A T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:203的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S420F的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1S420F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:205的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S284F的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2S284F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:207的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S228F的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3S228F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:209的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AS420F T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A S420F T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:211的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S284FT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 S284F T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:213的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S228FT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 S228F T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:215的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S680A的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1S680A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:217的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S544A的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2S544A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:219的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S488A的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3S488A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:221的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AS680A T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A S680A T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:223的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S544AT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 S544A T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:225的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S488AT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 S488A T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:227的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T721V的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1T721V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:229的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T585V的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2T585V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:231的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T529V的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3T529V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:233的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S2AT721V T711S的修饰AAV5衣壳蛋白VP1(AAV5衣壳VP1 S2A T721V T711S)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:235的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T585VT575S的修饰AAV5衣壳蛋白VP2(AAV5衣壳VP2 T585V T575S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:237的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T529VT519S的修饰AAV5衣壳蛋白VP3(AAV5衣壳VP3 T529V T519S)的核酸，所述核酸具有SEQ IDNo:239的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q351K的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1Q351K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:241的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q214K的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2Q214K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:243的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q149K的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3Q149K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:245的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q351R的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1Q351R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:247的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q214R的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2Q214R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:249的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q149R的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3Q149R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:251的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S232T的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1S232T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:253的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S95T的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2 S95T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:255的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S30T的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3 S30T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:257的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D297E的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1D297E)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:259的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D160E的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2D160E)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:261的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D95E的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3 D95E)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:263的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S692T的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1S692T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:265的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S555T的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2S555T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:267的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换S490T的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3S490T)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:269的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D433Y的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1D433Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:271的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D296Y的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2D296Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:273的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换D231Y的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3D231Y)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:275的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T625L的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1T625L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:277的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T488L的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2T488L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:279的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T423L的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3T423L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:281的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T625V的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1T625V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:283的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T488V的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2T488V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:285的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T423V的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3T423V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:287的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N691A的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1N691A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:289的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N554A的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2N554A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:291的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换N489A的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3N489A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:293的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换C396V的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1C396V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:295的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换C259V的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2C259V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:297的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换C194V的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3C194V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:299的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Y478F的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1Y478F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:301的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Y341F的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2Y341F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:303的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Y276F的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3Y276F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:305的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R296L的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1R296L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:307的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R159L的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2R159L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:309的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R94L的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3 R94L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:311的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T733V的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1T733V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:313的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T596V的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2T596V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:315的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换T531V的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3T531V)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:317的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A427R的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1A427R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:319的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A290R的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2A290R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:321的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换A225R的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3A225R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:323的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换M635D的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1M635D)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:325的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换M498D的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2M498D)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:327的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换M433D的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3M433D)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:329的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L444R的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1L444R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:331的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L307R的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2L307R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:333的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换L242R的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3L242R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:335的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G604N的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1G604N)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:337的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G467N的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2G467N)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:339的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G402N的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3G402N)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:341的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G627K的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1G627K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:343的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G490K的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2G490K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:345的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换G425K的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3G425K)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:347的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W695R的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1W695R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:349的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W558R的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2W558R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:351的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换W493R的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3W493R)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:353的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q351A的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1Q351A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:355的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q214A的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2Q214A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:357的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Q149A的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3Q149A)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:359的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Y395F的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1Y395F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:361的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Y258F的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2Y258F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:363的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换Y193F的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3Y193F)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:365的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R434L的修饰AAV9衣壳蛋白VP1(AAV9衣壳VP1R434L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:367的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换R297L的修饰AAV9衣壳蛋白VP2(AAV9衣壳VP2R297L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:369的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码修饰衣壳的分离核酸包括编码含有置换的修饰AAV9衣壳蛋白VP3(AAV9衣壳VP3 R232L)的核酸，所述核酸具有SEQ ID No:371的核苷酸序列或编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列。
“编码给定修饰蛋白的相应氨基酸序列的任何其他核苷酸序列”是指可替换所述核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些备选DNA序列完全在本领域技术人员的技能范围内。这种变体DNA序列在本发明的范围内。
在一些实施方案中，编码任何上述修饰衣壳的分离核酸包含任何上述核酸序列或其组合。
基于重组腺相关病毒的载体
一方面，本发明涉及一种用于向受试者递送异源核酸序列的基于重组腺相关病毒的载体，其包括：
1)任何上述修饰的衣壳，和
2)异源核酸序列，其包含促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中表达的调节序列。
本说明书中使用的术语“基于重组腺相关病毒的载体”、“基于AAV的重组病毒”、“基于AAV的病毒样颗粒”、“重组病毒AAV毒株”、“重组AAV载体”或“rAAV载体”具有相同的含义。
在本发明的一些实施方案中，rAAV载体包括包含提供产物表达的调节序列的异源核酸序列，其中异源核酸序列的表达产物是治疗性多肽或报告多肽。
根据本发明的rAAV载体不包含编码病毒生命周期必需的蛋白质(Rep)序列以及重叠衣壳蛋白(Cap)序列的基因的核苷酸序列。
在说明书的上述部分中详细表征了衣壳。
如本发明所用的，“提供由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中表达的调节序列”是指影响它们所克隆到的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质因宿主生物而异；在原核生物中，此类控制序列一般包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“调节序列”至少包括所有组分，其存在对于表达和加工是必需的，并且还可以包括附加组分，其存在是有利的，例如前导肽序列。
如在本说明书中使用的，术语“启动子”是指控制一个或多个编码序列的转录的核酸片段，并且通过存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列在结构上进行鉴定，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接调节所述启动子的转录水平的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在典型生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理或发育调节的启动子，例如在化学诱导剂的影响下。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。
用于在真核细胞中，特别是在哺乳动物细胞中高水平产生多肽的启动子应该是强的并且优选在广泛的细胞类型中具有活性。能够在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子在本领域中是众所周知的，因此在本文中没有必要对其进行详细描述。根据本发明的思想，优选使用巨细胞病毒(CMV)启动子。源自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期(IE)区的启动子或启动子/增强子特别适合作为本发明的rAAV5载体的启动子。人巨细胞病毒(hCMV)立即早期(IE)区和由其衍生的功能性表达诱导和/或功能性表达增强片段已在例如ΕΡ0173177和ΕΡ0323997中公开，并且是本领域公知的。因此，hCMV立即早期(IE)区的几个片段可以用作启动子和/或启动子/增强子。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子”可以指位于与编码重组产物的DNA序列相邻的DNA序列。增强子元件通常位于启动子元件的5'方向，或者可以位于编码DNA序列(例如转录或翻译成一种或多种重组产物的DNA序列)的下游或内部。因此，增强子元件可以位于编码重组产物的DNA序列上游或所述序列下游的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多碱基对处。增强子元件可以增加从DNA序列表达的重组产物的量高于与单个启动子元件相关的表达水平。本领域普通技术人员容易获得多种增强子元件。
在本发明的一些实施方案中，包含提供由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中表达的调节序列的异源核酸序列可以在5'-端至3'-端方向上包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因的内含子(血红蛋白亚单位γ1基因)；
编码产物的核酸；
hGH1多聚腺苷酸化信号(人生长激素基因多聚腺苷酸化信号)；
右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，编码产物(转基因)的核酸是至少一种编码蛋白质的基因。在一些实施方案中，转基因编码至少一种小的抑制性核酸。在一些实施方案中，转基因编码至少一种报道分子。在一些实施方案中，小抑制性核酸是miRNA。在一些实施方案中，小抑制性核酸是海绵miRNA或TuD-RNA，其抑制动物中至少一种miRNA的活性。在一些实施方案中，miRNA在靶组织的细胞中表达。在一些实施方案中，靶组织是肝脏、中枢神经系统(CNS)、眼睛、胃肠道、呼吸道、乳房、胰腺、泌尿道或子宫组织的组织。
在一些实施方案中，rAAV载体具有异源核酸序列的表达产物，其是治疗性多肽或报告多肽。
在一些实施方案中，rAAV载体包含编码作为治疗性多肽的产物的异源核酸序列，其中治疗性多肽是选自因子VIII、因子IX或其功能变体的凝血因子。
在一些实施方案中，rAAV载体包含编码作为因子VIII或其功能变体的产物的异源核酸序列。
在一些实施方案中，rAAV载体包含编码作为因子IX或其功能变体的产物的异源核酸序列。
在一些实施方案中，rAAV载体包含编码作为SMN1蛋白(存活运动神经元蛋白)的产物的异源核酸序列。
在一些实施方案中，rAAV载体包含编码作为SARS-cov2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)的RBD-S多肽(S糖蛋白的重组受体结合结构域)的产物的异源核酸序列。
实施例
提供以下实施例以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员将很容易明白，可以在不背离所附实施方案的精神或范围的情况下进行某些变化和修改。
材料和一般方法
重组DNA技术
标准方法用于操作DNA，如Sambrook等人,Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012所述。根据制造商方案使用分子生物学试剂。
基因合成
所需的基因区段由化学合成的寡核苷酸制备。长度为300-4,000bp的基因区段两侧带有单个限制性位点，通过寡核苷酸的退火和连接(包括PCR扩增)组装，随后通过指定的限制性位点进行克隆。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。
DNA序列测定
DNA序列通过Sanger测序确定。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
Infomax的VectorNTI Advance套件版本8.0和SnapGene版本5.1.4.1用于序列创建、作图、分析、注释和说明。
统计数据分析
结果表明平均值±标准偏差(SD)，方差分析(ANOVA)用于比较测试和对照结果，并确定它们具有统计学显著性。
实施例1
基于细小病毒科衣壳结构相似性的AAV5衣壳突变变体的选择
AAV5衣壳突变的设计基于细小病毒科(包括非AAV病毒)内衣壳蛋白的高度结构相似性。置换的选择包括三个步骤：
1)确定AAV5壳粒蛋白中位于衣壳相邻五聚体亚单位相互作用界面区域的氨基酸；
2)将修饰的AAV5衣壳与非AAV细小病毒之一的衣壳(下文称为“模板衣壳”)进行结构比对；
3)成对比较AAV5衣壳和模板衣壳的氨基酸残基。
预先制备AAV5和模板衣壳的三维模型结构；预先制备包括使用SchrodingerSuite中的Prepwizard utility补充结构中缺失的原子。
在步骤1中，相互作用界面是指一组与相邻五聚体亚单位的氨基酸相互作用的壳粒蛋白多肽链片段，其中五聚体亚单位是指具有正五边形形状且由位于中心孔周围的5种壳粒蛋白组成的衣壳结构元件(L.M.Drouin and M.Agbandje-McKenna.Adeno-associatedvirus structural biology as a tool in vector development.Future Virol.,vol.8,no.12,pp.1183–1199,2013)。
第二步包括使用Schrodinger Suite的Structure Alignment utility将AAV5衣壳与模板衣壳进行结构比对。根据比对结果，对于来自相邻五聚体亚单位相互作用界面的每个AAV5氨基酸，确定最接近模板衣壳的氨基酸(初始氨基酸的结构类似物)，这被认为是潜在的置换。如果在离模板衣壳最近的氨基酸附近存在另一个AAV5氨基酸(其距离小于与初始氨基酸的距离)，则不存在初始氨基酸的结构类似物。这里，氨基酸之间的距离通过α-碳原子之间的距离来估计。
在确定了相邻五聚体亚单位相互作用界面的所有氨基酸的结构类似物后，根据实施例2、3和4做出置换决定。
实施例2.基于增加氨基酸残基体积的原则设计突变
在将AAV5衣壳与模板衣壳进行结构比对后，我们得到其氨基酸残基之间的成对结构对应性。在其中一种情况下，根据比较氨基酸侧取代基的范德华体积的结果，决定将初始氨基酸置换为模板衣壳的相应氨基酸(N.J.Darby,S.S.N.J.Darby,and T.E.Creighton,Protein Structure.IRL Press at Oxford University Press,1993；表1)。如果满足以下条件，则引入突变：
1.模板衣壳中氨基酸侧取代基的体积大于初始氨基酸侧取代基的体积，
2.来自模板衣壳的氨基酸不是半胱氨酸或甲硫氨酸。
从潜在置换的氨基酸中排除半胱氨酸和甲硫氨酸是由于它们具有显著的反应性，特别是可氧化性。
表1.氨基酸侧取代基的范德华体积(N.J.Darby,S.S.N.J.Darby,andT.E.Creighton,Protein Structure.IRL Press at Oxford University Press,1993.)
表2显示了应用本主题方法使用三种模板衣壳设计AAV5衣壳中的突变的结果：HBoV1(PDBid 5urf)、B19(PDBid 1s58)、BPV(PDBid 4qc8)。第一列包含来自AAV5衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸，其余列包含AAV5与每个衣壳的成对结构比对后产生的氨基酸：HBoV1、B19和BPV。星号表示根据侧取代基的大小标准以及半胱氨酸和甲硫氨酸的禁止置换而适合置换的氨基酸。
给定亚单位的相互作用界面旨在指所有氨基酸，其中至少一个原子与相邻五聚体亚单位的任何原子的距离小于
对于AAV5，计算基于衣壳结构PDB ID：6JCT。
根据计算，其AAV5相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面包括以下范围的AAV5衣壳蛋白VP1残基：220-226、283-293、339-342、385-392、412-435、462-466、590-598、611–626、677–685、721-724。
表2.来自AAV5衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸以及与其结构上对应的壳粒B19、HBoV1和BPV的氨基酸。星号表示侧取代基大于AAV5壳粒的起始氨基酸的氨基酸。破折号表明模板衣壳中没有结构相似的氨基酸。
实施例3.基于增加壳粒之间极性接触数量的原则设计突变。
根据实施例1，在结构上比对AAV5衣壳和模板衣壳后，我们得到其氨基酸残基之间的成对结构对应性。在其中一种情况下，基于对初始氨基酸及其结构类似物的微环境的分析，做出将初始氨基酸置换为模板衣壳的相应氨基酸的决定。特别是，如果在模板衣壳中的一对相应氨基酸中存在具有极性侧取代基的氨基酸，并且在AAV5中存在具有非极性取代基的氨基酸，则做出积极的置换决定，其中两种氨基酸与衣壳的相邻五聚体亚单位具有至少一个极性接触。如果在距侧取代基的除氢以外的任何原子不超过的距离处，存在另一壳粒的另一氨基酸的侧取代基的极性基团的至少一个原子，则假定该氨基酸具有极性接触(表3)。与实施例2类似，半胱氨酸和甲硫氨酸的置换也是不允许的。
表3.具有极性侧取代基的氨基酸列表及其极性基团的原子(根据PDB规范命名)，但氢原子除外。
氨基酸 极性侧基中包含的原子(根据PDB规范命名)
Arg NH1,NH2,CZ,NE
Asn CG,OD1,ND2,
Asp CG,OD1,OD2
Cys SG
Gln CD,OE1,NE2
Glu CD,OE1,OE2
His ND1,CD2,CE1,NE2
Lys NZ
Ser OG
Thr OG1
Tyr OH
表4显示了应用本主题方法使用三种模板衣壳设计AAV5衣壳中的突变的结果：HBoV1(PDBid 5urf)、B19(PDBid 1s58)、BPV(4qc8)。第一列包含来自AAV5衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸，在三种衣壳之一中发现了合适的置换：HBoV1、B19和BPV。其余列包含AAV5与每个衣壳的成对结构比对后产生的氨基酸。星号表示根据极性接触的增加数量标准以及半胱氨酸和甲硫氨酸的禁止置换，适合置换的氨基酸。
表4.显示具有合适置换的AAV5衣壳位置及衣壳HBoV1、B19和BPV与其对应的氨基酸。星号表示根据壳粒之间极性接触的增加数量标准而适合置换的氨基酸。
实施例4.基于减少壳粒之间极性接触数量原则的突变设计
根据实施例1，在结构上比对AAV5衣壳和模板衣壳后，我们得到其氨基酸残基之间的成对结构对应性。在其中一种情况下，基于对初始氨基酸及其结构类似物的微环境的分析，做出将初始氨基酸置换为模板衣壳的相应氨基酸的决定。特别是，如果在AAV5衣壳中的一对相应氨基酸中存在与相邻五聚体亚单位形成至少单一极性接触的极性氨基酸残基，而在模板衣壳中存在非极性氨基酸残基，则做出积极的置换决定。此外，与实施例2类似，半胱氨酸或甲硫氨酸残基不考虑用于置换。
表5显示了应用本主题方法使用三种模板衣壳设计AAV5衣壳中的突变的结果：HBoV1(PDBid 5urf)、B19(PDBid 1s58)、BPV(4qc8)。第一列包含来自AAV5衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸，在三种衣壳之一中发现了合适的置换：HBoV1、B19和BPV。剩余的列包含AAV5与每个模板衣壳的成对结构比对后产生的氨基酸。星号表示根据极性接触的增加数量标准以及半胱氨酸和甲硫氨酸的禁止置换，适合置换的氨基酸。
表5.显示具有合适置换的AAV5衣壳位置及衣壳HBoV1、B19和BPV与其对应的氨基酸。星号表示根据壳粒之间极性接触的减少数量标准适合置换的氨基酸。
实施例5.基于细小病毒科衣壳结构相似性的AAV9衣壳突变变体的选择
AAV9衣壳突变的设计基于细小病毒科(包括非AAV病毒)内壳粒蛋白的高度结构相似性。置换的选择包括三个步骤：
1)确定AAV9壳粒蛋白中位于衣壳相邻五聚体亚单位相互作用界面区域的氨基酸；
2)将修饰的AAV9衣壳与非AAV细小病毒之一的衣壳(下文称为“模板衣壳”)进行结构比对；
3)成对比较AAV9衣壳和模板衣壳的氨基酸残基。
预先制备AAV9和模板衣壳的三维模型结构；预先制备包括使用SchrodingerSuite中的Prepwizard utility补充结构中缺失的原子。
在步骤1中，相互作用界面是指一组与相邻五聚体亚单位的氨基酸相互作用的壳粒蛋白多肽链片段，其中五聚体亚单位是指具有正五边形形状且由位于中心孔周围的5种壳粒蛋白组成的衣壳结构元件(L.M.Drouin and M.Agbandje-McKenna.Adeno-associatedvirus structural biology as a tool in vector development.Future Virol.,vol.8,no.12,pp.1183–1199,2013)。
第二步包括使用Schrodinger Suite的Structure Alignment utility将AAV9衣壳与模板衣壳进行结构比对。根据比对结果，对于来自相邻五聚体亚单位相互作用界面的每个AAV9氨基酸，确定最接近模板衣壳的氨基酸(初始氨基酸的结构类似物)，这被认为是潜在的置换。如果在离模板衣壳最近的氨基酸附近存在另一个AAV9氨基酸(其距离小于与初始氨基酸的距离)，则不存在初始氨基酸的结构类似物。这里，氨基酸之间的距离通过α-碳原子之间的距离来估计。
在确定了相邻五聚体亚单位相互作用界面的所有氨基酸的结构类似物后，根据实施例6、7和8做出置换决定。
实施例6.基于增加氨基酸残基体积的原则设计突变
在将AAV9衣壳与模板衣壳进行结构比对后，我们得到其氨基酸残基之间的成对结构对应性。在其中一种情况下，根据比较氨基酸侧取代基的范德华体积的结果，决定将初始氨基酸置换为模板衣壳的相应氨基酸(N.J.Darby,S.S.N.J.Darby,and T.E.Creighton,Protein Structure.IRL Press at Oxford University Press,1993；表1)。如果满足以下条件，则引入突变：
1.模板衣壳中氨基酸侧取代基的体积大于初始氨基酸侧取代基的体积，
2.来自模板衣壳的氨基酸不是半胱氨酸或甲硫氨酸。
从潜在置换的氨基酸中排除半胱氨酸和甲硫氨酸是由于它们具有显著的反应性，特别是可氧化性。
表6显示了应用本主题方法使用三种模板衣壳设计AAV9衣壳中的突变的结果：HBoV1(PDBid 5urf)、B19(PDBid 1s58)、BPV(PDBid 4qc8)。第一列包含来自AAV9衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸，其余列包含AAV9与每个衣壳的成对结构比对后产生的氨基酸：HBoV1、B19和BPV。星号表示根据侧取代基的大小标准以及半胱氨酸和甲硫氨酸的禁止置换而适合置换的氨基酸。
给定亚单位的相互作用界面旨在指所有氨基酸，其中至少一个原子与相邻五聚体亚单位的任何原子的距离小于
对于AAV9，计算基于结构PDB ID：3UX1。
根据计算，其AAV9相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面包括以下范围的AAV9衣壳蛋白VP1残基：230-236、294-304、350-353、394-401、421-444、476-480、601–609、622–637、689–697、733–736。
表6.来自AAV9衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸以及与其结构上对应的壳粒B19、HBoV1和BPV的氨基酸。星号表示侧取代基大于AAV9壳粒的起始氨基酸的氨基酸。破折号表明模板衣壳中没有结构相似的氨基酸。
实施例7.基于增加壳粒之间极性接触数量的原则设计突变。
根据实施例5，在结构上比对AAV9衣壳和模板衣壳的结果后，我们得到其氨基酸残基之间的成对结构对应性。在其中一种情况下，基于对初始氨基酸及其结构类似物的微环境的分析，做出将初始氨基酸置换为模板衣壳的相应氨基酸的决定。特别是，如果在模板衣壳中的一对相应氨基酸中存在具有极性侧取代基的氨基酸，并且在AAV9中存在具有非极性取代基的氨基酸，则做出积极的置换决定，其中两种氨基酸与衣壳的相邻五聚体亚单位具有至少一个极性接触。如果在距侧取代基的除氢以外的任何原子不超过的距离处，存在另一壳粒的另一氨基酸的侧取代基的极性基团的至少一个原子，则假定该氨基酸具有极性接触(表3)。与实施例6类似，半胱氨酸和甲硫氨酸的置换也是不允许的。
表7显示了应用本主题方法使用三种模板衣壳设计AAV9衣壳中的突变的结果：HBoV1(PDBid5urf)、B19(PDBid1s58)、BPV(4qc8)。第一列包含来自AAV9衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸，在三种衣壳之一中发现了合适的置换：HBoV1、B19和BPV。剩余的列包含AAV9与每个衣壳的成对结构比对后产生的氨基酸。星号表示根据极性接触的增加数量标准和半胱氨酸和甲硫氨酸的禁止置换，适合置换的氨基酸。
表7.显示具有合适置换的AAV9衣壳位置及其对应的衣壳氨基酸：HBoV1、B19和BPV。星号表示根据壳粒之间极性接触的增加数量标准适合置换的氨基酸。
AAV9 B19 HBoV1 BPV
A427 G R* I
L439 Y* K* L
M635 L D* D
W695 R* W W
实施例8.基于减少壳粒之间极性接触数量的原则设计突变
根据实施例5，在结构上比对AAV9衣壳和模板衣壳的结果后，我们得到其氨基酸残基之间的成对结构对应性。在其中一种情况下，基于对初始氨基酸及其结构类似物的微环境的分析，做出将初始氨基酸置换为模板衣壳的相应氨基酸的决定。特别是，如果在AAV9衣壳中的一对相应氨基酸中存在与相邻五聚体亚单位形成至少单一极性接触的极性氨基酸残基，而在模板衣壳中存在非极性氨基酸残基，则做出积极的置换决定。此外，与实施例6类似，半胱氨酸或甲硫氨酸残基不考虑用于置换。
表8显示了应用本主题方法使用三种模板衣壳设计AAV9衣壳中的突变的结果：HBoV1(PDBid 5urf)、B19(PDBid 1s58)、BPV(4qc8)。第一列包含来自AAV9衣壳的相邻五聚体亚单位相互作用界面的氨基酸，在三种衣壳之一中发现了合适的置换：HBoV1、B19和BPV。剩余的列包含AAV9与每个模板衣壳的成对结构比对后产生的氨基酸。星号表示根据极性接触的增加数量标准以及半胱氨酸和甲硫氨酸的禁止置换，适合置换的氨基酸。
表8.显示具有合适置换的AAV9衣壳位置及衣壳HBoV1、B19和BPV与其对应的氨基酸。星号表示根据壳粒之间极性接触的减少数量标准适合置换的氨基酸。
实施例9.AAV5衣壳变体文库的产生
AAV5衣壳变体文库通过Cap基因序列的随机诱变产生(Davidsson M等人,2016)。简而言之，从头组装Cap基因血清型5(GenBank ID AF085716.1)的野生型序列，然后使用尿嘧啶-DNA糖基化酶将合成的野生型AAV5衣壳基因片段化，使用不具有校对活性的DNA聚合酶将所得片段组装成全长Cap基因(导致序列中的随机突变)。将全长突变变体克隆到载体质粒pAAV-接头(图1)中的AscI/EcoRI限制性位点，与绿色荧光蛋白(GFP)处于共同阅读框中，从而产生多样化的AAV5衣壳随机文库，此后使用该文库来选择具有增加的转导活性的衣壳变体。
在CHO-K1-S细胞上体外阳性选择了转导活性增加的病毒颗粒。此外，对于转导，我们使用了在碘克沙醇梯度中使用超速离心纯化的颗粒。48小时后，收获细胞并分离基因组DNA用于随后扩增能够有效转导的病毒基因组序列。所得序列随后被重新克隆并重新产生以用于随后的选择迭代以富集具有最高转导效率的变体文库。经过5轮选择后，对30个克隆的衣壳基因进行测序，以确定最成功的突变及其组合。测序结果显示，AAV5 VP1中的主要突变组合为S2A、T711S以及AAV5 VP1中含有S2A、T711S、S651A的衣壳变体，约占克隆的20％。还选择了在AAV5 VP1中包含突变S651A的衣壳变体。这些衣壳变体被克隆到用于产生病毒颗粒的载体中，并进一步用于可视化和比较相对于野生型AAV5的转导谱。
实施例10.生成然后从所得序列文库中选择重组病毒颗粒
为了产生并随后从所得序列文库中选择重组病毒颗粒，开发了如下一系列质粒：载体质粒、包含Rep基因序列的质粒，以及包含病毒颗粒复制所需的腺病毒基因的构建体。
载体质粒pAAV-接头(图1)(旨在将AAV血清型5衣壳基因的随机变体文库与报告蛋白克隆到一个阅读框中)如下产生：使用在HindIII/EcoRI位点的限制酶-连接酶克隆方法，将原始构建体pAAV-GFP中修饰的绿色荧光蛋白的序列置换为从头合成的序列T2A-GFP，且从5'端添加EcoRI限制性位点和从3'端添加HindIII限制性位点。
包含Rep基因序列的质粒pAAV-Rep(图2)如下产生：从头克隆AAV血清型2(GenBankID AF043303.1)的合成Rep基因序列，且将5'端的PciI限制性位点和3'端的PsiI限制位点添加到质粒pGEM-TEasy(Promega,USA)，该质粒也用PciI/PsiI限制酶(New EnglandBiolabs,USA)处理。
用于产生重组病毒颗粒的腺病毒基因来源于构建体pHelper(图3)，其包含AmpR-一种提供对氨苄青霉素的抗性的β-内酰胺酶基因，Ori-细菌中的复制起点，Adeno E2A-参与病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，Adeno E4-参与病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，Adeno VARNA-负责翻译早期和晚期病毒基因的辅助腺病毒基因序列。
实施例11.AAV5和AAV9衣壳的突变变体的产生
野生型AAV血清型5衣壳(GenBank ID AF085716.1)和野生型AAV血清型9衣壳(GenBank ID AY530579.1)的基因序列是从头合成的，其中将5'端的SwaI位点和3'端的NotI位点分别纳入每个合成序列；在用SwaI/NotI限制性内切酶(New England Biolabs,USA)处理后，将每个序列克隆到质粒载体pAAV-Rep(图2)中，该载体也用SwaI/NotI限制酶(New England Biolabs,USA)预处理，产生以下质粒：pAAV-RC5(图4)，包含野生型AAV血清型5衣壳序列并进一步包含AAV Rep基因序列；和pAAV-RC9(图5)，包含野生型AAV血清型9衣壳序列并进一步包含AAV Rep基因序列。
根据制造商的说明，使用商业QuikChange II定点诱变试剂盒(Agilent，USA)将突变引入野生型AAV衣壳序列。使用QuikChange Primer Design软件(Agilent，USA)开发PCR引物(表9、表10)。简而言之，分别使用质粒pAAV-RC5或pAAV-RC9作为模板进行基于定点诱变的程序。为了引入突变，第一步包括在单独的试管中对每个突变体和补充有相应寡核苷酸的对照样品进行PCR反应。第二步包括根据制造商的方案用限制酶处理以去除模板质粒DNA，用所得混合物转化感受态大肠杆菌XL-1Blue细胞。使用PCR分析所得克隆的目标质粒中的特定区域，选择的突变体在使用前进行测序。
表9.用于AAV衣壳血清型5基因序列的定点诱变的引物核苷酸序列。
带有置换的密码子以粗体突出显示。
以类似的方式，将突变引入AAV血清型5衣壳的前导变体，其同时包含突变S2A和T711S，通过实施例9和10中描述的靶向进化产生。
表10.用于AAV衣壳血清型9基因序列的定点诱变的引物核苷酸序列。
带有置换的密码子以粗体突出显示。
实施例11.基于修饰的腺相关病毒血清型5(rAAV5)产生载体的效率
为了产生具有修饰的血清型5衣壳的rAAV颗粒，使用聚乙烯亚胺(PEI，线性，MW25000，Polyscinces,Inc.)同时用以下3种质粒转染HEK293生产细胞：
1)用包含腺病毒核苷酸序列的质粒(辅助质粒)，所述核苷酸序列编码组装rAAV颗粒所需的蛋白质和RNA；
2)用包含腺相关病毒血清型2的Rep基因的天然核苷酸序列，以及修饰Cap基因序列的质粒，所述修饰Cap基因序列选自：SEQ ID NO:7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217、223、229、235的核苷酸序列或编码具有SEQ ID No:8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230或236的氨基酸序列的蛋白质VP1，以及来自所用核苷酸序列的可变阅读框的蛋白质VP2和VP3的任何其他核苷酸序列，其中
VP2可具有SEQ ID No:10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232或238的任一氨基酸序列；
并且VP3可具有SEQ ID No:12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240的任一氨基酸序列；
3)用包含异源rAAV颗粒基因组的质粒，该基因组编码旨在递送到患者细胞中的目标基因。
这组基因在72小时内提供了rAAV病毒颗粒的组装和目标基因组在其中的包壳化。转染后72小时，对生产细胞进行裂解(TAKARA BIO INC,Japan)以释放rAAV颗粒，所得载体在37℃下用DNAaseI(Invitrogen,USA)处理2小时，然后在56℃下用蛋白酶K(Invitrogen,USA)再处理2小时。使用由特异于GFP序列的正向引物5’-ACCACATGAAGCAGCACGAC-3’、反向引物5’-TCAGCTCGATGCGGTTCAC-3’和探针5’-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3’组成的寡核苷酸组，通过定量PCR(TaqMan,Applied Biosystems,USA)证实所得rAAV颗粒的滴度。
本发明的作者意想不到地发现在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中存在一种或多种选自G226A、D286E、L341Y、C387V、Q421H、P466T、S594Q、T614L、N679K、P723V、V431Y、A616D、W683R、S222A、R285L、Q340A、S420F、S680A、T721V的突变导致具有上述突变的rAAV载体的转基因包装效率在统计学上可靠地增加。例如，定量PCR显示编码目标GFP基因的包装异源rAAV颗粒基因组的拷贝数发生变化(图6、图7)。
在同时存在突变S2A和T711S(AAV5-01Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到7.1倍，从2.51E+09vg/ml至1.78E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、G226A和T711S(AAV5-02Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到5.4倍，从2.51E+09vg/ml至1.36E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、D286E和T711S(AAV5-03Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到3.5倍，从2.51E+09vg/ml至8.79E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、L341Y和T711S(AAV5-04Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到5.8倍，从2.51E+09vg/ml至1.46E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、C387V和T711S(AAV5-05Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到4.8倍，从2.51E+09vg/ml至1.21E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、Q421H和T711S(AAV5-06Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到2.1倍，从2.51E+09vg/ml至5.27E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、P466T和T711S(AAV5-07Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到6.2倍，从2.51E+09vg/ml至1.56E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、S594Q和T711S(AAV5-08Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到5.9倍，从2.51E+09vg/ml至1.48E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、T614L和T711S(AAV5-09Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到6.8倍，从2.51E+09vg/ml至1.71E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、N679K和T711S(AAV5-10Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到3.3倍，从2.51E+09vg/ml至8.28E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、P723V和T711S(AAV5-11Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到5.0倍，从2.51E+09vg/ml至1.26E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、V431Y和T711S(AAV5-12Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到2.4倍，从2.51E+09vg/ml至6.03E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、A616D和T711S(AAV5-13Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到3.6倍，从2.51E+09vg/ml至9.04E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、W683R和T711S(AAV5-14Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到4.6倍，从2.51E+09vg/ml至1.15E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、S222A和T711S(AAV5-15Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到1.5倍，从2.51E+09vg/ml至3.77E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、R285L和T711S(AAV5-16Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到2.5倍，从2.51E+09vg/ml至6.28E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、Q340A和T711S(AAV5-17Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到1.8倍，从2.51E+09vg/ml至4.52E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、S420F和T711S(AAV5-18Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到4.4倍，从2.51E+09vg/ml至1.10E+10vg/ml。
在同时存在突变S2A、S680A和T711S(AAV5-19Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到3.0倍，从2.51E+09vg/ml至7.53E+09vg/ml。
在同时存在突变S2A、T721V和T711S(AAV5-20Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组数量增加到5.2倍，从2.51E+09vg/ml至1.31E+10vg/ml。
在存在单突变G226A(AAV5-21Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,9倍，从2,74E+09vg/ml至1,07E+10vg/ml。
在存在单突变D286E(AAV5-22Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,4倍，从2,74E+09vg/ml至6,58E+09vg/ml。
在存在单突变L341Y(AAV5-23Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,7倍，从2,74E+09vg/ml至7,40E+09vg/ml。
在存在单突变C387V(AAV5-24Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到4,8倍，从2,74E+09vg/ml至1,32E+10vg/ml。
在存在单突变Q421H(AAV5-25Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,2倍，从2,74E+09vg/ml至8,77E+09vg/ml。
在存在单突变P466T(AAV5-26Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,7倍，从2,74E+09vg/ml至4,66E+09vg/ml。
在存在单突变S594Q(AAV5-27Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,1倍，从2,74E+09vg/ml至8,50E+09vg/ml。
在存在单突变T614L(AAV5-28Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,5倍，从2,74E+09vg/ml至4,11E+09vg/ml。
在存在单突变N679K(AAV5-29Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,5倍，从2,74E+09vg/ml至6,85E+09vg/ml。
在存在单突变P723V(AAV5-30Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,2倍，从2,74E+09vg/ml至8,77E+09vg/ml。
在存在单突变V431Y(AAV5-31Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,4倍，从2,74E+09vg/ml至6,58E+09vg/ml。
在存在单突变A616D(AAV5-32Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,6倍，从2,74E+09vg/ml至4,39E+09vg/ml。
在存在单突变W683R(AAV5-33Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,3倍，从2,74E+09vg/ml至3,56E+09vg/ml。
在存在单突变S222A(AAV5-34Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,8倍，从2,74E+09vg/ml至4,93E+09vg/ml。
在存在单突变R285L(AAV5-35Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,1倍，从2,74E+09vg/ml至5,76E+09vg/ml。
在存在单突变Q340A(AAV5-36Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,4倍，从2,74E+09vg/ml至3,84E+09vg/ml。
在存在单突变S420F(AAV5-37Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,5倍，从2,74E+09vg/ml至9,59E+09vg/ml。
在存在单突变S680A(AAV5-38Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,2倍，从2,74E+09vg/ml至6,03E+09vg/ml。
在存在单突变T721V(AAV5-39Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到5,1倍，从2,74E+09vg/ml至1,40E+10vg/ml。
实施例12.基于修饰的腺相关病毒血清型9(rAAV9)产生载体的效率
为了产生具有修饰的血清型9衣壳的rAAV颗粒，使用聚乙烯亚胺(PEI，线性，MW25000，Polyscinces,Inc.)同时用以下3种质粒转染HEK293生产细胞：
1)用包含腺病毒核苷酸序列的质粒(辅助质粒)，所述核苷酸序列编码组装rAAV颗粒所需的蛋白质和RNA；
2)用包含腺相关病毒血清型2的Rep基因的天然核苷酸序列，以及修饰Cap基因序列的质粒，所述修饰Cap基因序列选自：SEQ ID NO:241、247、253、259、265、271、277、283、289、295、301、307、313、319、325、331、337、343、349、355、361或367的核苷酸序列或编码具有SEQ ID No:242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368的氨基酸序列的蛋白质VP1，以及来自所用核苷酸序列的可变阅读框的蛋白质VP2和VP3的任何其他核苷酸序列，其中
VP2可具有SEQ ID No:244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364或370的任一氨基酸序列；
并且VP3可具有SEQ ID No:246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366或372的任一氨基酸序列；
3)用包含异源rAAV颗粒基因组的质粒，该基因组编码旨在递送到患者细胞中的目标基因。
这组基因在72小时内提供了rAAV病毒颗粒的组装和目标基因组在其中的包壳化。转染后72小时，对生产细胞进行裂解(TAKARA BIO INC,Japan)以释放rAAV颗粒，所得载体在37℃下用DNAaseI(Invitrogen,USA)处理2小时，然后在56℃下用蛋白酶K(Invitrogen,USA)再处理2小时。使用由特异于GFP序列的正向引物5’-ACCACATGAAGCAGCACGAC-3’、反向引物5’-TCAGCTCGATGCGGTTCAC-3’和探针5’-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3’组成的寡核苷酸组，通过定量PCR(TaqMan,Applied Biosystems,USA)证实所得rAAV颗粒的滴度。
本发明的作者意想不到地发现在野生型rAAV9衣壳蛋白VP1中存在一种或多种选自S232T、D297E、Q351K、Q351R、C396V、D433Y、L444R、Y478F、G604N、G627K、T625L、T625V、S692T、T733V、A427R、M635D、W695R、R296L、Q351A、Y395F、R434L、N691A的突变导致具有上述突变的rAAV载体的转基因包装效率显著增加。例如，定量PCR显示编码目标GFP基因的包装异源rAAV颗粒基因组的拷贝数发生变化(图8)。
在存在突变S232T(AAV9-01Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,9倍，从6,32E+09vg/ml至1,19E+10vg/ml。
在存在突变D297E(AAV9-02Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,2倍，从6,32E+09vg/ml至2,03E+10vg/ml。
在存在突变Q351K(AAV9-03Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,5倍，从6,32E+09vg/ml至9,30E+09vg/ml。
在存在突变Q351R(AAV9-04Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,5倍，从6,32E+09vg/ml至1,60E+10vg/ml。
在存在突变C396V(AAV9-05Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,9倍，从6,32E+09vg/ml至1,17E+10vg/ml。
在存在突变D433Y(AAV9-06Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,9倍，从6,32E+09vg/ml至1,85E+10vg/ml。
在存在突变L444R(AAV9-07Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,9倍，从6,32E+09vg/ml至1,23E+10vg/ml。
在存在突变Y478F(AAV9-08Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到5,0倍，从6,32E+09vg/ml至3,14E+10vg/ml。
在存在突变G604N(AAV9-09Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,5倍，从6,32E+09vg/ml至1,61E+10vg/ml。
在存在突变G627K(AAV9-10Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,8倍，从6,32E+09vg/ml至1,14E+10vg/ml。
在存在突变T625L(AAV9-11Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到4,6倍，从6,32E+09vg/ml至2,91E+10vg/ml。
在存在突变T625V(AAV9-12Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到5,7倍，从6,32E+09vg/ml至3,62E+10vg/ml。
在存在突变S692T(AAV9-13Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,1倍，从6,32E+09vg/ml至1,32E+10vg/ml。
在存在突变T733V(AAV9-14Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,0倍，从6,32E+09vg/ml至1,89E+10vg/ml。
在存在突变A427R(AAV9-15Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,6倍，从6,32E+09vg/ml至9,86E+09vg/ml。
在存在突变M635D(AAV9-16Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,9倍，从6,32E+09vg/ml至1,21E+10vg/ml。
在存在突变W695R(AAV9-17Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到1,5倍，从6,32E+09vg/ml至9,41E+09vg/ml。
在存在突变R296L(AAV9-18Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到3,0倍，从6,32E+09vg/ml至1,93E+10vg/ml。
在存在突变Q351A(AAV9-19Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到2,0倍，从6,32E+09vg/ml至1,29E+10vg/ml。
在存在突变Y395F(AAV9-20Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到4,6倍，从6,32E+09vg/ml至2,91E+10vg/ml。
在存在突变R434L(AAV9-21Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到4,0倍，从6,32E+09vg/ml至2,50E+10vg/ml。
在存在突变N691A(AAV9-22Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，包装病毒基因组的量增加到4,5倍，从6,32E+09vg/ml至2,85E+10vg/ml。
实施例13.用在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中包含点突变的基于rAAV5的产物提高细胞转导效率。
实验设计：
将SK-Hep1细胞接种到12孔板的孔中。将细胞接种到补充有谷氨酰胺、10％牛血清的EMEM生长培养基中。细胞接种密度为10,000个细胞/cm2。在转导运行期间，预先制备的细胞以1,250vg/细胞的MOI进行转导。所有样品一式三份运行。完整细胞用作阴性对照。
使用Guava EasyCyte流式细胞仪和GuavaSoft软件通过GFP报告蛋白信号的强度测量转导效率。
本发明的作者意想不到地发现在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中存在一种或多种选自G226A、D286E、L341Y、C387V、Q421H、P466T、S594Q、T614L、N679K、P723V、V431Y、A616D、W683R、S222A、R285L、Q340A、S420F、S680A、T721V的突变导致具有上述突变的rAAV载体的转基因递送效率在统计学上显著增加。例如，流式细胞术显示，在用具有野生型AAV5衣壳蛋白VP1或携带一种或多种选自以下突变的野生型AAV5衣壳蛋白VP1：G226A、D286E、L341Y、C387V、Q421H、P466T、S594Q、T614L、N679K、P723V、V431Y、A616D、W683R、S222A、R285L、Q340A、S420F、S680A、T721V(在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中)的基于rAAV的产物转导SK-Hep1系后48小时GFP阳性细胞量变化(图9、图10)。
在同时存在突变S2A和T711S(AAV5-01Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.16倍，从20.11％至43.44％。
在同时存在突变S2A、G226A和T711S(AAV5-02Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.02倍，从20.11％至40.69％。
在同时存在突变S2A、D286E和T711S(AAV5-03Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.90倍，从20.11％至38.17％。
在同时存在突变S2A、L341Y和T711S(AAV5-04Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.75倍，从20.11％至35.27％。
在同时存在突变S2A、C387V和T711S(AAV5-05Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.10倍，从20.11％至42.22％。
在同时存在突变S2A、Q421H和T711S(AAV5-06Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.64倍，从20.11％至32.97％。
在同时存在突变S2A、P466T和T711S(AAV5-07Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.41倍，从20.11％至28.35％。
在同时存在突变S2A、S594Q和T711S(AAV5-08Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.08倍，从20.11％至41.82％。
在同时存在突变S2A、T614L和T711S(AAV5-09Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.36倍，从20.11％至47.50％。
在同时存在突变S2A、N679K和T711S(AAV5-10Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.67倍，从20.11％至33.55％。
在同时存在突变S2A、P723V和T711S(AAV5-11Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.87倍，从20.11％至37.60％。
在同时存在突变S2A、V431Y和T711S(AAV5-12Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.27倍，从20.11％至25.54％。
在同时存在突变S2A、A616D和T711S(AAV5-13Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.12倍，从20.11％至42.63％。
在同时存在突变S2A、W683R和T711S(AAV5-14Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.26倍，从20.11％至25.33％。
在同时存在突变S2A、S222A和T711S(AAV5-15Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.57倍，从20.11％至31.57％。
在同时存在突变S2A、R285L和T711S(AAV5-16Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.38倍，从20.11％至27.75％。
在同时存在突变S2A、Q340A和T711S(AAV5-17Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.45倍，从20.11％至29.15％。
在同时存在突变S2A、S420F和T711S(AAV5-18Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.57倍，从20.11％至31.57％。
在同时存在突变S2A、S680A和T711S(AAV5-19Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1.68倍，从20.11％至33.78％。
在同时存在突变S2A、T721V和T711S(AAV5-20Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2.01倍，从20.11％至40.41％。
在存在单突变G226A(AAV5-21Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,29倍，从20,11％至34,10％。
在存在单突变D286E(AAV5-22Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,27倍，从20,11％至33,57％。
在存在单突变L341Y(AAV5-23Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,41倍，从20,11％至37,08％。
在存在单突变C387V(AAV5-24Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,85倍，从20,11％至48,62％。
在存在单突变Q421H(AAV5-25Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,52倍，从20,11％至40,05％。
在存在单突变P466T(AAV5-26Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,33倍，从20,11％至34,94％。
在存在单突变S594Q(AAV5-27Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,60倍，从20,11％至42,26％。
在存在单突变T614L(AAV5-28Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,26倍，从20,11％至33,16％。
在存在单突变N679K(AAV5-29Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,24倍，从20,11％至32,78％。
在存在单突变P723V(AAV5-30Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,58倍，从20,11％至41,67％。
在存在单突变V431Y(AAV5-31Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,27倍，从20,11％至33,46％。
在存在单突变A616D(AAV5-32Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,46倍，从20,11％至38,47％。
在存在单突变W683R(AAV5-33Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,52倍，从20,11％至40,05％。
在存在单突变S222A(AAV5-34Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,34倍，从20,11％至35,31％。
在存在单突变R285L(AAV5-35Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,55倍，从20,11％至40,84％。
在存在单突变Q340A(AAV5-36Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,44倍，从20,11％至37,94％。
在存在单突变S420F(AAV5-37Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,63倍，从20,11％至42,95％。
在存在单突变S680A(AAV5-38Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,71倍，从20,11％至45,06％。
在存在单突变T721V(AAV5-39Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到2,06倍，从20,11％至54,40％。
实施例14.用在野生型rAAV9衣壳蛋白VP1中包含点突变的基于rAAV9的产物提高细胞转导效率。
实验设计：
将HeLa细胞接种到12孔板的孔中。将细胞接种到补充有谷氨酰胺、10％牛血清的EMEM生长培养基中。细胞接种密度为10,000个细胞/cm2。在转导运行期间，预先制备的细胞以100,000vg/细胞的MOI进行转导。所有样品一式三份运行。完整细胞用作阴性对照。
使用Guava EasyCyte流式细胞仪和GuavaSoft软件通过GFP报告蛋白信号的强度测量转导效率。
本发明的作者意想不到地发现在野生型rAAV9衣壳蛋白VP1中存在一种或多种选自S232T、D297E、Q351K、Q351R、C396V、D433Y、L444R、Y478F、G604N、G627K、T625L、T625V、S692T、T733V、A427R、M635D、W695R、R296L、Q351A、Y395F、R434L、N691A的突变导致具有上述突变的rAAV载体的转基因递送效率显著提高。例如，流式细胞术显示，在用具有野生型AAV9衣壳蛋白VP1或携带一种或多种选自以下突变的野生型AAV9衣壳蛋白VP1：S232T、D297E、Q351K、Q351R、C396V、D433Y、L444R、Y478F、G604N、G627K、T625L、T625V、S692T、T733V、A427R、M635D、W695R、R296L、Q351A、Y395F、R434L、N691A(在野生型rAAV9衣壳蛋白VP1中)的基于rAAV的产物转导HeLa系后48小时GFP阳性细胞量变化(图11)。
在存在突变S232T(AAV9-01Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,21倍，从27,53％至33,31％。
在存在突变D297E(AAV9-02Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,25倍，从27,53％至34,41％。
在存在突变Q351K(AAV9-03Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,30倍，从27,53％至35,87％。
在存在突变Q351R(AAV9-04Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,16倍，从27,53％至31,93％。
在存在突变C396V(AAV9-05Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,37倍，从27,53％至37,74％。
在存在突变D433Y(AAV9-06Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,10倍，从27,53％至30,28％。
在存在突变L444R(AAV9-07Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,40倍，从27,53％至38,45％。
在存在突变Y478F(AAV9-08Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,56倍，从27,53％至42,95％。
在存在突变G604N(AAV9-09Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,25倍，从27,53％至34,32％。
在存在突变G627K(AAV9-10Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,24倍，从27,53％至34,14％。
在存在突变T625L(AAV9-11Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,45倍，从27,53％至39,92％。
在存在突变T625V(AAV9-12Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,49倍，从27,53％至41,02％。
在存在突变S692T(AAV9-13Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,38倍，从27,53％至37,99％。
在存在突变T733V(AAV9-14Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,44倍，从27,53％至39,73％。
在存在突变A427R(AAV9-15Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,23倍，从27,53％至33,86％。
在存在突变M635D(AAV9-16Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,22倍，从27,53％至33,59％。
在存在突变W695R(AAV9-17Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,47倍，从27,53％至40,47％。
在存在突变R296L(AAV9-18Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,26倍，从27,53％至34,69％。
在存在突变Q351A(AAV9-19Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,35倍，从27,53％至37,17％。
在存在突变Y395F(AAV9-20Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,48倍，从27,53％至40,74％。
在存在突变R434L(AAV9-21Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,67倍，从27,53％至45,91％。
在存在突变N691A(AAV9-22Mut-GFP)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-GFP)相比，GFP表达细胞的量增加到1,72倍，从27,53％至47,47％。
实施例15.用在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中包含单突变的基于rAAV5的产物进行细胞转导后增加由转基因编码的目标蛋白的产量。
实验设计：
将SK-Hep1细胞接种到12孔板的孔中。将细胞接种到补充有谷氨酰胺、10％牛血清的EMEM生长培养基中。细胞接种密度为10,000个细胞/cm2。在转导运行期间，预先制备的细胞以10,000vg/细胞的MOI进行转导。所有样品一式三份运行。完整细胞用作阴性对照。
使用Human Factor IX ELISA试剂盒评估转导后7天培养液中FIX蛋白的量。我们使用1:50稀释的样品。该程序根据制造商的说明进行。
本发明的作者意想不到地发现在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中存在一种或多种选自G226A、D286E、L341Y、C387V、Q421H、P466T、S594Q、T614L、N679K、P723V、V431Y、A616D、W683R、S222A、R285L、Q340A、S420F、S680A、T721V的突变导致在用具有上述突变的rAAV5载体转导SK-Hep1细胞后FIX蛋白的产生显著增加。例如，酶联免疫测定法(EIA)显示，在用具有野生型AAV5衣壳蛋白VP1或携带一种或多种选自以下突变的野生型AAV5衣壳蛋白VP1：G226A、D286E、L341Y、C387V、Q421H、P466T、S594Q、T614L、N679K、P723V、V431Y、A616D、W683R、S222A、R285L、Q340A、S420F、S680A、T721V(在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或在已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中)的基于rAAV的产物转导SK-Hep1细胞后7天，培养基中FIX蛋白的量增加(图12、图13)。
在同时存在突变的情况下S2A、T711S(AAV5-01Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2.76倍，从628.67ng/ml至1736.67ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、G226A和T711S(AAV5-02Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.85倍，从628.67ng/ml至1161.83ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、D286E和T711S(AAV5-03Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.71倍，从628.67ng/ml至1075.02ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、L341Y和T711S(AAV5-04Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.65倍，从628.67ng/ml至1037.30ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、C387V和T711S(AAV5-05Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2.28倍，从628.67ng/ml至1433.36ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、Q421H和T711S(AAV5-06Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.67倍，从628.67ng/ml至1049.87ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、P466T和T711S(AAV5-07Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.21倍，从628.67ng/ml至763.33ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、S594Q和T711S(AAV5-08Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.26倍，从628.67ng/ml至792.12ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、T614L和T711S(AAV5-09Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2.17倍，从628.67ng/ml至1362.67ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、N679K和T711S(AAV5-10Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.98倍，从628.67ng/ml至1244.76ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、P723V和T711S(AAV5-11Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.69倍，从628.67ng/ml至1062.45ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、V431Y和T711S(AAV5-12Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.12倍，从628.67ng/ml至704.11ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、A616D和T711S(AAV5-13Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2.15倍，从628.67ng/ml至1351.63ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、W683R和T711S(AAV5-14Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.08倍，从628.67ng/ml至678.96ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、S222A和T711S(AAV5-15Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.30倍，从628.67ng/ml至817.27ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、R285L和T711S(AAV5-16Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.16倍，从628.67ng/ml至729.25ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、Q340A和T711S(AAV5-17Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.36倍，从628.67ng/ml至854.99ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、S420F和T711S(AAV5-18Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.19倍，从628.67ng/ml至745.00ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、S680A和T711S(AAV5-19Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.52倍，从628.67ng/ml至955.57ng/ml。
在同时存在突变的情况下S2A、T721V和T711S(AAV5-20Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1.79倍，从628.67ng/ml至1125.00ng/ml。
在存在单突变G226A(AAV5-21Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,56倍，从653,19ng/ml至1020,59ng/ml。
在存在单突变D286E(AAV5-22Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,63倍，从653,19ng/ml至1063,78ng/ml。
在存在单突变L341Y(AAV5-23Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,95倍，从653,19ng/ml至1271,00ng/ml。
在存在单突变C387V(AAV5-24Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,81倍，从653,19ng/ml至1184,04ng/ml。
在存在单突变Q421H(AAV5-25Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,92倍，从653,19ng/ml至1254,12ng/ml。
在存在单突变P466T(AAV5-26Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,73倍，从653,19ng/ml至1130,02ng/ml。
在存在单突变S594Q(AAV5-27Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,88倍，从653,19ng/ml至1228,00ng/ml。
在存在单突变T614L(AAV5-28Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,40倍，从653,19ng/ml至915,81ng/ml。
在存在单突变N679K(AAV5-29Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,21倍，从653,19ng/ml至790,36ng/ml。
在存在单突变P723V(AAV5-30Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,35倍，从653,19ng/ml至881,81ng/ml。
在存在单突变V431Y(AAV5-31Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,34倍，从653,19ng/ml至875,27ng/ml。
在存在单突变A616D(AAV5-32Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,11倍，从653,19ng/ml至727,75ng/ml。
在存在单突变W683R(AAV5-33Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,57倍，从653,19ng/ml至1025,51ng/ml。
在存在单突变S222A(AAV5-34Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,78倍，从653,19ng/ml至1162,68ng/ml。
在存在单突变R285L(AAV5-35Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,47倍，从653,19ng/ml至960,19ng/ml。
在存在单突变Q340A(AAV5-36Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,64倍，从653,19ng/ml至1071,23ng/ml。
在存在单突变S420F(AAV5-37Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,24倍，从653,19ng/ml至809,96ng/ml。
在存在单突变S680A(AAV5-38Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,37倍，从653,19ng/ml至894,87ng/ml。
在存在单突变T721V(AAV5-39Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV5(AAV5-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,96倍，从653,19ng/ml至1280,25ng/ml。
实施例16.在用包含野生型rAAV9衣壳蛋白VP1突变的基于rAAV9的产物转导细胞后增加由转基因编码的目标蛋白的产量。
实验设计：
将CHO-K1-S细胞接种到12孔板的孔中。接种于以下生长培养基：DMEM/F12，添加谷氨酰胺，葡萄糖含量为4.5g/l，5％牛血清。细胞接种密度为10,000个细胞/cm2。在转导运行期间，预先制备的细胞以200,000vg/细胞的MOI进行转导。所有样品一式三份运行。完整细胞用作阴性对照。
使用Human Factor IX ELISA试剂盒评估转导后7天培养液中FIX蛋白的量。我们使用1:25稀释的样品。该程序根据制造商的说明进行。
本发明的作者意想不到地发现在野生型rAAV9衣壳蛋白VP1中存在一种或多种选自以下的突变：S232T、D297E、Q351K、Q351R、C396V、D433Y、L444R、Y478F、G604N、G627K、T625L、T625V、S692T、T733V、A427R、M635D、W695R、R296L、Q351A、Y395F、R434L、N691A导致在用具有上述突变的rAAV载体转导CHO-K1-S细胞后，FIX蛋白的产生显著增加。例如，酶联免疫测定法(EIA)显示，在用携带一种或多种选自以下突变的野生型AAV9衣壳蛋白VP1：S232T、D297E、Q351K、Q351R、C396V、D433Y、L444R、Y478F、G604N、G627K、T625L、T625V、S692T、T733V、A427R、M635D、W695R、R296L、Q351A、Y395F、R434L、N691A转导CHO-K1-S细胞后7天，培养基中FIX蛋白的量增加(图14)。
在存在突变S232T(AAV9-01Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,18倍，从947,5ng/ml至1118,05ng/ml。
在存在突变D297E(AAV9-02Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,20倍，从947,5ng/ml至1137,00ng/ml。
在存在突变Q351K(AAV9-03Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,26倍，从947,5ng/ml至1195,00ng/ml。
在存在突变Q351R(AAV9-04Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,22倍，从947,5ng/ml至1157,17ng/ml。
在存在突变C396V(AAV9-05Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,64倍，从947,5ng/ml至1554,17ng/ml。
在存在突变D433Y(AAV9-06Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,17倍，从947,5ng/ml至1110,50ng/ml。
在存在突变L444R(AAV9-07Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,20倍，从947,5ng/ml至1141,50ng/ml。
在存在突变Y478F(AAV9-08Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2,01倍，从947,5ng/ml至1908,50ng/ml。
在存在突变G604N(AAV9-09Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,26倍，从947,5ng/ml至1197,67ng/ml。
在存在突变G627K(AAV9-10Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,23倍，从947,5ng/ml至1166,67ng/ml。
在存在突变T625L(AAV9-11Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,77倍，从947,5ng/ml至1677,50ng/ml。
在存在突变T625V(AAV9-12Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,83倍，从947,5ng/ml至1736,67ng/ml。
在存在突变S692T(AAV9-13Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,55倍，从947,5ng/ml至1464,83ng/ml。
在存在突变T733V(AAV9-14Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,55倍，从947,5ng/ml至1469,50ng/ml。
在存在突变A427R(AAV9-15Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,65倍，从947,5ng/ml至1563,38ng/ml。
在存在突变M635D(AAV9-16Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,70倍，从947,5ng/ml至1607,00ng/ml。
在存在突变W695R(AAV9-17Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2,32倍，从947,5ng/ml至2201,67ng/ml。
在存在突变R296L(AAV9-18Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,23倍，从947,5ng/ml至1161,83ng/ml。
在存在突变Q351A(AAV9-19Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,48倍，从947,5ng/ml至1402,30ng/ml。
在存在突变Y395F(AAV9-20Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,21倍，从947,5ng/ml至1145,00ng/ml。
在存在突变R434L(AAV9-21Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到1,54倍，从947,5ng/ml至1456,83ng/ml。
在存在突变N691A(AAV9-22Mut-FIX)的情况下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照AAV9(AAV9-NullMut-FIX)相比，蛋白产生量增加到2,33倍，从947,5ng/ml至2203,33ng/ml。

Claims (14)

1.一种产生修饰的AAV衣壳的方法，包括：
a)确定修饰的AAV的壳粒蛋白中的氨基酸，这些氨基酸位于衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域；
b)将修饰的AAV衣壳与模板衣壳进行结构比对，以确定修饰AAV的来自相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面区域的每个氨基酸与模板衣壳中与其最接近的氨基酸之间的成对对应性，作为被认为是潜在置换的初始氨基酸的结构类似物，
其中模板衣壳被理解为是指结构相似的病毒衣壳，所述病毒选自除AAV之外的细小病毒科；
c)成对比较步骤b)中确定的修饰的AAV衣壳和模板衣壳的氨基酸残基，以鉴定修饰的AAV衣壳和模板衣壳在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中的结构差异；
d)选择诱变位置，其中用于诱变的氨基酸残基位于修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域，并且在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中在修饰的AAV衣壳与模板衣壳之间具有结构差异；
e)使用以下原则之一在步骤d)中选择的位置选择用于诱变的氨基酸残基：
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为具有更大体积的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为在壳粒之间具有增加或减少的极性接触数量的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
f)在修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中引入在步骤d)-e)中选择的一个或多个氨基酸置换。
2.根据权利要求1所述的产生修饰的AAV衣壳的方法，进一步包括检查步骤f)中产生的具有一个或多个氨基酸置换的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进的性质，其中一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
3.根据权利要求1所述的产生修饰的AAV衣壳的方法，进一步包括检查步骤f)中产生的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进的性质，并选择与不含这些修饰的AAV衣壳相比具有一种或多种改进的性质的修饰的AAV衣壳，其中所述一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
4.根据权利要求1所述的产生AAV衣壳的方法，其中所述修饰的AAV衣壳选自：人AAV、猿AAV或禽AAV。
5.根据权利要求1所述的产生AAV衣壳的方法，其中所述修饰的AAV衣壳选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15或AAV16。
6.根据权利要求1所述的产生AAV衣壳的方法，其中所述结构相似的模板衣壳选自：细小病毒B19、人博卡病毒1(HBoV1)、牛细小病毒(BVP)。
7.一种用于产生基于重组腺相关病毒的病毒载体的修饰的AAV衣壳，所述修饰的AAV衣壳通过包括以下的方法产生：
a)确定修饰的AAV的壳粒蛋白中的氨基酸，这些氨基酸位于衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域；
b)将修饰的AAV衣壳与模板衣壳进行结构比对，以确定修饰AAV的来自相邻五聚体亚单位之间的相互作用界面区域的每个氨基酸与模板衣壳中与其最接近的氨基酸之间的成对对应性，作为被认为是潜在置换的初始氨基酸的结构类似物，
其中模板衣壳被理解为是指结构相似的病毒衣壳，所述病毒选自除AAV之外的细小病毒科；
c)成对比较步骤b)中确定的AAV衣壳和模板衣壳的氨基酸残基，以鉴定修饰的AAV衣壳和模板衣壳在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中的结构差异；
d)选择诱变位置，其中用于诱变的氨基酸残基位于修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域，并且在衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中在修饰的AAV衣壳与模板衣壳之间具有结构差异；
e)使用以下原则之一在步骤d)中选择的位置选择用于诱变的氨基酸残基：
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为具有更大体积的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
-将修饰的AAV的壳粒蛋白中的初始氨基酸置换为在壳粒之间具有增加或减少的极性接触数量的除半胱氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸；
f)在修饰的AAV衣壳的相邻五聚体亚单位的相互作用界面区域中引入在步骤d)-e)中选择的一个或多个氨基酸置换；
并且，如有必要，还包括
g)检查步骤f)中产生的修饰的AAV衣壳与不含这些修饰的AAV衣壳相比是否存在一种或多种改进的性质，并选择与不含这些修饰的AAV衣壳相比具有一种或多种改进的性质的修饰的AAV衣壳，其中所述一种或多种改进的性质选自：
-提高细胞转导效率，
-增加目标蛋白的产量，
-由于基于重组腺相关病毒(rAAV)的包壳病毒载体的高效产生(组装)而提高生成效率。
8.根据权利要求7所述的修饰的AAV衣壳，其中所述修饰的AAV衣壳选自：人AAV、猿AAV或禽AAV。
9.根据权利要求7所述的修饰的AAV衣壳，其中所述修饰的AAV衣壳选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15或AAV16。
10.一种用于产生基于重组腺相关病毒的病毒载体的修饰的AAV衣壳，其包含具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP1：SEQ ID No:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368。
11.根据权利要求10所述的修饰的AAV衣壳，其包含：
a)具有选自下组的氨基酸序列的修饰的AAV衣壳蛋白VP1：SEQ ID No:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362或368；
b)对应于其蛋白VP1的修饰的AAV衣壳蛋白VP2，所述修饰的AAV衣壳蛋白VP2具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No:16、22、28、34、40、46、52，58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364或370；
c)对应于其蛋白VP1的修饰的AAV衣壳蛋白VP3，所述修饰的AAV衣壳蛋白VP3具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No:18、24、30、36、42、48、54，60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366或372。
12.一种分离的核酸，其编码根据权利要求7至11所述的修饰的衣壳。
13.一种用于向受试者递送异源核酸序列的基于重组腺相关病毒的载体，所述载体包含：
1)根据权利要求7至11中任一项所述的修饰的AAV衣壳，和
2)异源核酸序列，其包含促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中表达的调节序列。
14.根据权利要求13所述的基于重组腺相关病毒的载体，其中所述异源核酸序列的表达产物是治疗性多肽或报告多肽。
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