CN118127010A - 一种抑制ATF6α基因的siRNA分子及其应用 - Google Patents
一种抑制ATF6α基因的siRNA分子及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种抑制ATF6α基因的siRNA分子及其应用。所述siRNA分子为如下(1)至(3)中的任意一种；(1)SEQ ID NO：1所示的RNA单链和SEQ ID NO：2所示的RNA单链互补而成的siRNA分子；(2)SEQ ID NO：3所示的RNA单链和SEQ ID NO：4所示的RNA单链互补而成的siRNA分子；(3)SEQ ID NO：5所示的RNA单链和SEQ ID NO：6所示的RNA单链互补而成的siRNA分子。本发明siRNA分子可抑制ATF6α基因的表达，同时抑制Th17细胞分化基因的表达，从而能降低Th17细胞的比例，为治疗RA提供全新的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制ATF6α基因的siRNA分子及其应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性全身炎症性疾病，是最常见的系统性自身免疫性疾病。RA的发病机制十分复杂，与遗传、免疫等等多种因素都有关系，但目前尚未能阐明。RA的发生与体内炎性反应的持续存在密切相关，持续的炎性反应会激活ER应激，因此分泌炎性因子的Th17细胞以及ER应激相关蛋白的表达受到广泛的关注。同时在之前的研究中发现巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在自身免疫性疾病中发挥着重要作用的细胞因子，能促进炎性因子的分泌。
结合上述，研究它们在RA发展过程中起到的作用后，之前结果显示在RA患者的CD4+T细胞中ER应激被激活，Th17比例升高，MIF和IL-17A的表达上调且MIF与ATF6存在相互作用，Th17细胞分化的相关蛋白表达上调，表明MIF可通过增强被激活的ATF6通路诱导Th17细胞的分化。
因此，有必要开发一种抑制ATF6α基因的siRNA分子及其应用，从而有效抑制ATF6α基因的表达，同时降低Th17细胞分化基因的表达，下调Th17细胞的比例，为治疗RA提供一个全新的靶点。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抑制ATF6α基因的siRNA分子及其应用，从而有效抑制ATF6α基因的表达，同时降低Th17细胞分化基因的表达，下调Th17细胞的比例，为治疗RA提供一个全新的靶点。
本发明的第一方面提供一种抑制ATF6α基因的siRNA分子。
具体的，所述siRNA分子为如下(1)至(3)中的任意一种；
(1)SEQ ID NO：1所示的RNA单链和SEQ ID NO：2所示的RNA单链互补而成的siRNA分子；
(2)SEQ ID NO：3所示的RNA单链和SEQ ID NO：4所示的RNA单链互补而成的siRNA分子；
(3)SEQ ID NO：5所示的RNA单链和SEQ ID NO：6所示的RNA单链互补而成的siRNA分子。
本发明的第二方面提供一种能产生第一方面siRNA分子的DNA分子。
本发明的第三方面提供一种试剂盒。
具体的，所述试剂盒包含第一方面的siRNA分子或第二方面的DNA分子。
本发明的第四方面提供一种siRNA分子在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。
优选的，所述炎症包括关节炎症。
进一步优选的，所述关节炎症包括类风湿性关节炎。
本发明的第五方面提供一种siRNA分子在制备保护软骨和/或滑膜药物中的应用。
本发明的第六方面提供一种siRNA分子在制备抑制ATF6α基因表达药物中的应用。
本发明的第七方面提供一种siRNA分子在制备抑制Th17细胞分化基因表达药物中的应用。
本发明的第八方面提供一种siRNA分子在制备降低巨噬细胞迁移抑制因子诱导的Th17细胞比例药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明的siRNA分子可抑制ATF6α基因的表达，抑制了ATF6α通路，同时抑制了Th17细胞分化基因的表达，从而能降低Th17细胞的比例，抑制了RA患者的Th17细胞的分化，进而可在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎药物中应用，为治疗RA提供一个全新的靶点。
附图说明
图1为HC组和RA组MIF和ATF6α基因的表达结果图；
图2为HC组和RA组Th17细胞比例及血清IL-17A的表达结果图；
图3为HC组和RA组Th17细胞分化基因的表达结果图；
图4为RA组加入rhMIF刺激后MIF对ATF6α基因的表达结果图；
图5为实施例1siRNA分子对ATF6α基因和Th17细胞分化基因表达影响结果图；
图6为实施例1siRNA分子对Th17细胞分化影响结果图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种抑制ATF6α基因的siRNA分子。
表1siRNA分子的单链序列
| 序列名称 | 序列(5’to3’) |
| SEQ ID NO：1 | GUGAGCUACAAGUGUAUUATT |
| SEQ ID NO：2 | UAAUACACUUGUAGCUCACTT |
实施例2
一种抑制ATF6α基因的siRNA分子。
表2siRNA分子的单链序列
| 序列名称 | 序列(5’to3’) |
| SEQ ID NO：3 | GCACCAUCCCUGAGUCAUUTT |
| SEQ ID NO：4 | AAUGACUCAGGGAUGGUGCTT |
实施例3
一种抑制ATF6α基因的siRNA分子。
表3siRNA分子的单链序列
| 序列名称 | 序列(5’to3’) |
| SEQ ID NO：5 | GGAGACAGCAACGUAUGAUTT |
| SEQ ID NO：6 | AUCAUACGUUGCUGUCUCCTT |
实施例4
收集RA组和HC组的CD4+T细胞。
实验分组：
RA组：
类风湿性关节炎纳入标准：
1)患者临床资料完整且类风湿因子阳性和抗环状胍氨酸多肽抗体阳性；
2)患者病况符合美国风湿病学会的分类标准。
排除标准：
患有其他自身免疫性疾病者；近期有感染，其他疾病者(如肿瘤、传染病)。
HC组：
健康对照组纳入标准：
1)无自身抗体阴性且无类风湿性关节炎临床症状者；
2)无感染、肿瘤及其他自身免疫性疾病；
2年来无重大疾病史。
实验步骤：
一、提取外周血单个核细胞PBMC
1.分别取RA组和HC组3mL Ficoll淋巴细胞分离液置于15mL无菌无酶离心管中，缓慢沿管壁滴加入5mL的肝素抗凝全血至分离液液面上，置于低速离心机中，室温下以450×g的速度，离心20min；
2.再取15mL离心管，加入3mL PBS缓冲液，在吸取完血浆后，小心吸取PBMC层(在血浆层与Ficoll淋巴分离液层中间，呈云雾状悬浮液，最下层则为红细胞层)至PBS缓冲液中，450×g离心10min；
3.弃去上清液，加入2mL红细胞裂解液，重悬，室温裂解10min，450×g离心10min；
4.弃去上清液，使用PBS缓冲液再洗涤两遍，450×g离心5min；
5.离心结束后，弃去上清液，收集的PBMC可以直接使用或冻存于-80℃。
二、磁珠分选CD4+T细胞
1.将RA组和HC组PBMC细胞分别收集于流式管中，用含有3％FBS的PBS(下称简述为PBS)洗涤两次，450×g离心5min，并计算细胞数量；
2.用250μL PBS重悬细胞，按照说明书比例加入适量的细胞抗体，涡旋混匀，室温孵育5min；
3.涡旋混匀磁珠，按1:1的抗体磁珠比例加入磁珠，再用PBS加至2.5mL，混匀，置于磁铁中，室温孵育3min；
4.倾倒流式管中液体，分别收集RA组和HC组的CD4+T细胞。
实施例5
检测MIF和ATF6α基因的表达情况。
分别提取实施例4RA组和HC组CD4+T细胞的RNA和蛋白，并分别使用RT-PCR和Western blot检测。
由图1可知，相较于HC组，RA组的MIF和ATF6α在mRNA水平及蛋白水平均表达增加。
实施例6
检测Th17细胞比例及血清IL-17A的表达情况。
使用密度梯度离心分离实施例4RA组和HC组的PBMC，再使用细胞刺激混合剂刺激各组PBMC 6h，进行流式实验，观察Th17细胞的变化情况；ELISA试剂盒测定血清IL-17A的表达。
由图2可知，相较于HC组，RA组的Th17细胞的比例升高；RA组的血清中IL-17A的表达升高。
实施例7
检测Th17细胞分化基因的表达情况。
分别提取实施例4RA组和HC组CD4+T细胞的RNA和蛋白，并分别使用RT-PCR和Western blot检测Th17细胞的分化基因表达情况。
由图3可知，相较于HC组，RA组Th17细胞的相关分化基因STAT3和RORC的表达增加。
实施例8
检测MIF对ATF6α基因表达的影响情况。
采集实施例4RA组CD4+T细胞，一组加入rhMIF刺激6h，另一组不加入rhMIF刺激，分别提取各组蛋白检测。
由图4可知，WesternBlot结果显示MIF能增加ATF6α的表达，即MIF增强RA患者的ER应激反应，ATFα表达增加。
实施例9
检测实施例1siRNA分子对ATF6α基因和Th17细胞分化基因的表达影响情况。
采集实施例4RA组CD4+T细胞，其中一组用实施例1siRNA分子转染CD4+T细胞，同时加入rhMIF刺激6h，提取蛋白裂解物。另一组不使用实施例1siRNA分子转染CD4+T细胞，只加入rhMIF刺激6h，提取蛋白裂解物。
siRNA转染CD4+T细胞的具体步骤：
1.细胞转染当天，将细胞收集于离心管，用含血清培养基重悬细胞，计算细胞数量。按24孔板计算，每孔400μL培养基中细胞数量为1×106个。
2.转染：
在100uL的中加入55pmoles的实施例1siRNA，缓慢涡旋10s；向混合物中加入/>试剂，缓慢涡旋1s，室温静置10min；再将混合液均匀的加到24孔板中，温箱培养48h。
3.48h观察荧光后收样，完成转染。
由图5可知，从WesternBlot结果可以看出实施例1siRNA分子有效抑制ATF6α基因的表达，同时能抑制Th17细胞分化基因的表达。
实施例10
检测实施例1siRNA分子对Th17细胞分化的影响情况。
采集实施例4RA组PBMC后，其中一组用实施例1siRNA分子转染PBMC，同时加入rhMIF刺激3d，进行流式实验。另一组不使用实施例1siRNA分子转染PBMC，只加入rhMIF刺激3d，进行流式实验。siRNA分子转染PBMC的步骤同实施例9。
由图6可知，从流式结果及统计可知，实施例1siRNA分子能降低MIF诱导的Th17细胞比例，即本发明siRNA分子可抑制RA患者的Th17细胞的分化。
综上所述，本发明结果显示，本发明制得的siRNA分子可抑制ATF6α基因的表达，抑制了ATF6α通路，同时抑制了Th17细胞分化基因的表达，从而能降低Th17细胞的比例，抑制了RA患者的Th17细胞的分化，进而可在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎药物中应用。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验所作的任何修改、等同替换、改进等得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抑制ATF6α基因的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子为如下(1)至(3)中的任意一种；
(1)SEQ ID NO：1所示的RNA单链和SEQ ID NO：2所示的RNA单链互补而成的siRNA分子；
(2)SEQ ID NO：3所示的RNA单链和SEQ ID NO：4所示的RNA单链互补而成的siRNA分子；
(3)SEQ ID NO：5所示的RNA单链和SEQ ID NO：6所示的RNA单链互补而成的siRNA分子。
2.一种能产生权利要求1所述的siRNA分子的DNA分子。
3.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的siRNA分子或权利要求2所述的DNA分子。
4.权利要求1所述的siRNA分子在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的炎症包括关节炎症。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述关节炎症包括类风湿性关节炎。
7.权利要求1所述的siRNA分子在制备保护软骨和/或滑膜药物中的应用。
8.权利要求1所述的siRNA分子在制备抑制ATF6α基因表达药物中的应用。
9.权利要求1所述的siRNA分子在制备抑制Th17细胞分化基因表达药物中的应用。
10.权利要求1所述的siRNA分子在制备降低巨噬细胞迁移抑制因子诱导的Th17细胞比例药物中的应用。
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2024
- 2024-02-06 CN CN202410167890.9A patent/CN118127010A/zh active Pending
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