CN118121587A - 二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用，属于药学技术领域。本发明所述的二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用具体为二氢槲皮素在制备用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病的药物中的应用。本发明首次将二氢槲皮素应用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病。所述二氢槲皮素作为抗氧化剂对角膜上皮细胞(HCE)氧化损伤的相关疾病具有很好的保护作用。并且，在一定浓度范围内，所述二氢槲皮素可以促进HCE细胞的增殖提高细胞活力，也可以增加HCE细胞的泪液分泌量和泪膜稳定性使眼表疾病得到明显改善。

Description

二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用

技术领域

本发明涉及药学技术领域，尤其涉及二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用。

背景技术

氧化损伤在疾病中广泛存在，尤其是在衰老、炎症相关疾病中起到重要作用。氧化作用产生的自由基可直接作用于组织细胞膜，破坏细胞膜，并且自由基可通过细胞膜上的通道进入细胞内，对细胞内的蛋白、DNA产生损伤；氧自由基参与花生四烯酸的代谢为炎症反应中的重要过程，其产生的脂质过氧化物为趋化因子，会加剧炎症反应。另外，氧化产物还可以诱导不同于花生四烯酸的趋化因子产生，使蛋白水解酶抑制剂失活，使胶原酶等增加，从而破坏结缔组织。常见的因氧化损伤引起的眼部疾病有干眼症和角膜碱烧伤。

干眼症是眼科中常见的疾病，主要是指泪液不足或泪液过度蒸发所致的一种由泪液稳定性和眼表炎症性等多种因素引起的疾病。近年来国内外学者对干眼症发病机制做了深入研究，认为该病发生发展与机体免疫炎症反应、细胞凋亡以及性激素水平有关，其中T细胞介导的免疫炎症反应是干眼发病中最为关键的因素。另外，泪液分泌量减少或蒸发量增加导致泪液形成高渗透压，也是引起干眼症状恶性循环的关键因素，泪液的高渗透压会导致结膜上皮细胞凋亡、功能性杯状细胞数量减少等形态学上的改变并引发炎症级联反应，进一步引起角膜上皮细胞死亡，这些功能性细胞缺失后，会减少泪液中粘蛋白和脂质含量，进而加剧泪膜的不稳定性，推动这一恶性循环。该疾病导致不同程度的眼干涩、异物感、畏光感和疼痛感，严重的出现角膜损伤，患者视觉功能受到威胁，因此关于干眼症的临床治疗研究迫在眉睫。

角膜碱烧伤是临床上常见的眼外伤类型，致盲率极高。在碱烧伤早期，细胞凋亡及炎症反应激活是造成角膜损伤的重要因素；在碱烧伤后期，角膜新生血管会严重影响角膜透明度及视力水平。但是，眼底的脉络膜新生血管(CNV)的形成是一个复杂的病理过程，受到多种因素的调节，许多细胞因子形成的生长因子网络精确地调控着CNV的形成。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现最强的促血管形成因子，VEGF的过度表达与CNV的发生发展密切相关。目前，抑制新生血管发生机制的药物种类繁多，但很多药物的不良反应在治疗过程中被逐步证实，比如糖皮质激素常见的副作用有库欣综合征、感染、消化道反应、水肿、糖代谢紊乱、电解质失衡、神经系统兴奋异常等，抗VEGF药物常见的副作用有结膜充血、眼痛、异物感角膜擦伤、角膜水肿眼压升高、黑影飘动、眼内感染、视网膜脱离或玻璃体出血等。

因此，研究开发出新型的对眼部氧化损伤相关疾病有保护作用的抗氧化剂至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用。所述二氢槲皮素对H₂O₂诱导的角膜上皮细胞(HCE)的氧化应激损伤具有保护作用。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了二氢槲皮素在制备用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病的药物中的应用。

二氢槲皮素(dihydroquercetin，DHQ)，别名花旗松素(taxifolin)。它存在于多种植物中，在落叶松中含量较高，特别是花旗松。二氢槲皮素最早由日本学者Fukui从针叶植物Chamaecyparisobtusa叶中提取分离。近年来，在很多水果中也发现了二氢槲皮素的存在，如葡萄、橘子和西柚等。研究表明，二氢槲皮素含有较多的酚羟基，具有多种生物学活性，能够抑制或激活多种酶，从而产生不同的生理效应。二氢槲皮素的结构式如下：

本发明首次将二氢槲皮素应用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病。

优选的，所述眼表疾病为由角膜上皮细胞损伤和/或凋亡引发的眼表疾病。

优选的，所述角膜上皮损伤为氧化损伤。

优选的，所述氧化损伤为由过氧化氢导致的损伤。

本发明所述的二氢槲皮素对H₂O₂诱导的角膜上皮细胞(HCE)的氧化应激损伤具有保护作用。

上述保护作用具体为：在一定浓度范围内，二氢槲皮素对HCE细胞具有增殖作用，能提高氧化损伤后的HCE细胞的相对细胞活力。

本发明通过建立H₂O₂诱导角膜上皮细胞(HCE)损伤的模型，确定了H₂O₂造模浓度，然后在该浓度下进行造模引起HCE细胞的氧化损伤，最后将不同浓度的二氢槲皮素分别作用于HCE细胞，发现一定浓度的二氢槲皮素对HCE细胞具有增殖作用，而浓度过高则会对HCE细胞产生一定毒性。

上述造模浓度具体为300μM。在本发明的一些具体实施例中，对HCE细胞具有增殖作用的二氢槲皮素的浓度为25-200μM，对HCE细胞能产生一定毒性的二氢槲皮素的浓度为600μM。

本发明优选的，所述眼表疾病为干眼症或角膜新生血管相关疾病。

试验结果表明，通过二氢槲皮素治疗后，HCE细胞的泪液分泌量和泪膜稳定性会有一定的增加，干眼症会得到明显改善。

本发明还提供了一种二氢槲皮素眼用制剂，包括二氢槲皮素和溶剂。

优选的，所述二氢槲皮素的质量浓度为0.01％～0.5％；更优选的，所述二氢槲皮素的质量浓度为0.03％～0.3％；进一步优选的，所述二氢槲皮素的质量浓度为0.03％或0.3％。

本发明优选的，所述制剂的剂型为滴眼液、眼膏、眼周及眼内注射液、眼用凝胶或脂质体。

与现有技术相比，本发明提供了二氢槲皮素在制备用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病的药物中的应用。本发明首次将二氢槲皮素应用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病。所述二氢槲皮素作为抗氧化剂对角膜上皮细胞(HCE)氧化损伤的相关疾病具有很好的保护作用。并且，在一定浓度范围内，所述二氢槲皮素可以促进HCE细胞的增殖提高细胞活力，也可以增加HCE细胞的泪液分泌量和泪膜稳定性使眼表疾病得到明显改善。

附图说明

图1是采用MTS法分别检测不同浓度二氢槲皮素(A)、不同浓度H₂O₂(B)以及300μM过氧化氢与不同浓度二氢槲皮素组合(C)作用于角膜上皮细胞24小时后的结果图，其中，P代表显著水平，**代表P<0.01，***代表P<0.001，##代表P<0.01，###代表P<0.001；

图2是动物实验活体小鼠泪液分泌量检测结果图；

图3是动物实验活体小鼠泪膜破裂时间检测结果图；

图4是各实验组小鼠经角膜荧光素钠染色后的角膜形态图；

图5是角膜荧光素钠染色检查小鼠角膜上皮损伤的评分结果图；

图6是角膜裂隙灯检测各实验组新西兰兔角膜上新生血管的形态图；

图7是各实验组新西兰兔角膜新生血管面积检测结果图，其中****代表P<0.0001。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的二氢槲皮素在治疗眼表疾病中的应用进行详细描述。

人角膜上皮细胞购自美国ATCC细胞库，细胞培养基采用高糖DMEM培养基辅以10％(V/V)胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL庆大霉素。于含5％二氧化碳，37℃培养箱中培养。细胞铺于96孔板中，用对数生长期细胞，以1.5×10⁵个/mL的密度，每孔100μL铺板，每组6个副孔。细胞分组均为正常细胞组、过氧化氢模型组、各浓度二氢槲皮素干预组。检测方法为MTS试剂盒法(代表Promega)，490nm处酶标仪检测吸光度。

存活率＝各组存活率/正常细胞组存活率×100％

实验例1

(一)MTS检测方法

人角膜上皮细胞购自美国ATCC细胞库，细胞培养基采用高糖DMEM培养基辅以10％(V/V)胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL庆大霉素。于含5％二氧化碳，37℃培养箱中培养。细胞铺于96孔板中，用对数生长期细胞，以1.5×10⁵个/mL的密度，每孔100μL铺板，每组6个副孔。24h后根据实验目的对细胞进行H₂O₂建模或二氢槲皮素给药处理。呈色：每孔加MTS溶液20μL，继续孵育2～4h。比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

(二)H₂O₂诱导人角膜上皮细胞(HCE)损伤模型的建立

HCE细胞传代培养，按照1.5×10⁵cell/mL滴板，100μL/孔。将不同浓度的H₂O₂(100μM，200μM，300Μm，400μM，500μM，600μM，700μM，800μM，900μM)分别作用HCE细胞24h，每组6复孔以保证实验数据的稳定性和准确性，观察H₂O₂对细胞的损伤程度。呈色：每孔加MTS溶液20μL，继续孵育2-4h。比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以不同浓度H₂O₂为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。MTT法检测细胞存活率在50％左右时的H₂O₂浓度做为氧化损伤模型的造模浓度。存活率＝各组存活率/正常细胞组存活率×100％

图1是采用MTT法分别检测不同浓度二氢槲皮素(A)、不同浓度H₂O₂(B)以及300μM过氧化氢与不同浓度二氢槲皮素组合(C)作用于角膜上皮细胞24小时后的结果图，其中，P代表显著水平，**代表P<0.01，***代表P<0.001，##代表P<0.01，###代表P<0.001。如图1中的B图所示，当H₂O₂浓度在300μM时细胞存活率为49％，所以300μM的H₂O₂确定为后续实验的氧化损伤模型的造模浓度。

(三)二氢槲皮素对HCE细胞的增殖及毒性作用

不同浓度的二氢槲皮素(0.01-600μM)分别作用于HCE细胞，每组6复孔以保证实验数据的稳定性和准确性，观察药物对细胞的增殖作用。

如图1中的A图所示，不同浓度的二氢槲皮素处理HCE细胞24h后，浓度为50μM、100μM、200μM实验组HCE细胞的细胞存活率(cell viability)与对照组相比有显著性差异，明显高于对照组，这说明50-200μM浓度的二氢槲皮素对HCE细胞有促增值作用。当二氢槲皮素浓度升高到600μM时，HCE细胞存活率(cell viability)与对照组相比细胞存活率显著降低，这说明600μM浓度的二氢槲皮素对HCE细胞有毒性。

(四)二氢槲皮素对HCE细胞的抗氧化损伤作用

实验分8组：正常对照组，H₂O₂模型组，不同浓度二氢槲皮素(0.1-200μM)+H₂O₂干预组。利用300μM的H₂O₂对HCE细胞进行造模，造模后安全范围内不同浓度药物作用于HCE细胞，通过MTS方法检测各组间细胞存活率，检测二氢槲皮素对HCE细胞的抗氧化损伤保护作用情况。

如图1中的C图所示，各实验组的细胞存活率中H₂O₂建模组低于对照组(P＜0.001)，25-200μM的二氢槲皮素组高于H₂O₂建模组(P＜0.01)，这说明H₂O₂能够诱导HCE细胞氧化应激损伤，而二氢槲皮素对H₂O₂诱导HCE细胞氧化应激损伤的具有保护作用。

1.1干眼

1.1.1分组

50只8周龄C57/BL6的健康雌性小鼠中筛选出30只，随机划分5只小鼠为一组，共划分6组，记录为空白对照组(N)、模型组(M)、阳性药组(CsA)、中药复方低浓度组(SL)、中药复方中浓度组(SM)、中药复方高浓度组(SH)。分组时在小鼠尾部及笼卡进行标识，标识信息包括：实验名称、实验编号、组别、给药剂量、给药时间等。

1.1.2饲养

实验动物饲养于沈阳何氏医学院动物中心S代表PF级实验室中。实验期间每笼(长40cm×宽20cm×高20cm)饲育5只小鼠，共6笼。垫料为玉米芯垫料。本实验采用灭菌全价营养饲料。(采购自辽宁长生生物有限公司)。饮水为纯净水，由动物中心HT-RO1000型净水系统自行制备。每年专人检测水质。实验期间小鼠自由摄取食水，小鼠解剖取材前夜禁食，不禁饮水。动物实验室温度湿度由空调机组自动控制在温度20℃-25℃，湿度40％-70％，每日记录温湿度变化情况。光照系统自动控制动物实验室内光照周期变化，24小时明暗平均分配。动物实验室噪音控制，不高于60分贝。本实验经机构动物管理委员会(IACUC)批准并接受其监督，严格遵守国家动物福利法规《关于善待动物的指导性意见》。

1.2造模方法

本实验采用智能干燥环境控制系统结合东莨菪碱注射诱导建立小鼠干眼模型。造模过程中应用两阶梯除湿法控制模型环境湿度，首先采用可调温工业除湿机将房间湿度降低，将湿度调节到40％±5％，再使用智能干燥箱(除湿范围RH10％-80％)将小鼠饲养环境湿度进一步降低至15％±3％。同时在智能干燥箱内放置无噪音、可调速(风速范围0-5m/s)风扇，放置风扇距离鼠笼20cm，且设置风扇与小鼠同一垂直高度。通过以上措施，可以将各实验环境参数有效控制在实验所需要的环境条件范围内。将模型对照组(M)、阳性药组(CsA)、二氢槲皮素低浓度组(E1)、二氢槲皮素高浓度组(E2)、溶剂对照组小鼠放置于该干燥环境内(湿度15％±3％；风速2.1±0.2m/s；温度21-23℃)饲养，空白对照组小鼠于正常环境中(湿度60％-80％；温度21-23℃)饲养。除空白对照组外，其余各组小鼠每天皮下注射0.5mg/0.2mL东莨菪碱溶液3次(上午9:00；中午12:00；下午3:00)，模型建立时间持续2周。给药采用经眼给药，给药剂量为每只眼结膜囊内滴入5μL每天给药两次(上午9:00；下午3:00)，各给药组均在造模前一天开始给药，连续给药15天。

1.3给药方法与剂量

给药方式为经眼给药，全部实验小鼠均在造模前一天开始给药。空白对照组、模型对照组不给药；阳性药组采用质量浓度为0.05％的环孢素A滴眼5μL/次，滴入结膜囊内；低浓度给药组采用质量浓度为0.03％二氢槲皮素滴眼5μL/次，高浓度给药组采用质量浓度为0.3％二氢槲皮素滴眼5μL/次，各组小鼠给药均2次/日(上午9：00，下午3：00)。

1.4模型评估

在造模第14天，完成日常造模和给药操作后，检测空白对照组小鼠及模型对照组小鼠角膜上皮损伤情况、泪液分泌情况。统计分析两组指标具有显著性差异时，表示造模成功。

1.5实验检查指标

1.5.1一般情况观察

在适应期(分组前)对所有小鼠进行一次眼科检查(包括视力缺陷情况、眼球异常情况、角膜损伤情况)，确保实验用小鼠无异常。适应期及实验过程中每周称量1次体重，给药期每天在给药前后观察实验小鼠，记录健康状况，是否出现异常体征。小鼠情况观察包括：外观(眼、耳、口、鼻、外阴、皮毛、排泄物、四肢活动以及精神状态)、是否呕吐、活动情况、饮食、步态、濒死、死亡等。

1.5.2泪液分泌量检测

将小鼠在非麻醉的状态下进行固定，将小鼠的下眼睑使用软头镊夹起，然后将酚红棉线折叠一端置入下结膜囊内，放松小鼠下眼睑使之自然闭合，将酚红棉线固定好后，计时1min后取出酚红棉线，将酚红棉线放在标尺纸上，计算变红色部分的长度，记录。对数据使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。

图2是动物实验活体小鼠泪液分泌量检测结果图。如图2所示，N为空白对照组；M为模型对照组；R为溶剂对照组；Y为阳性药组(质量浓度为0.05％环孢素A)；E1为二氢槲皮素低浓度组；E2为二氢槲皮素高浓度组。另外，P代表显著性差异，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

统计酚红棉线长短(mm)，酚红棉线越长说明泪液分泌量越多，反之泪液分泌量越少。造模前各组动物泪液分泌量均正常，组间无显著性差异(P＞0.05)如图2所示，造模14d后阳性药组(CsA)、二氢槲皮素低浓度组(E1)、二氢槲皮素高浓度组(E2)相对模型对照组(M)泪液分泌量显著增加，差异均具有统计学意义(P＜0.001)，溶剂对照组与模型对照组相比泪液分泌量无显著性变化。上述结果表明经二氢槲皮素治疗后，干眼模型小鼠泪液分泌量有一定增加。

1.5.3泪膜破裂时间检测

将小鼠在非麻醉的状态下进行固定，并使用荧光素钠溶液滴入小鼠结膜囊内，然后被动闭合小鼠眼睑数次后，打开眼睑，在裂隙灯钴蓝光下，记录观察到第一个泪膜破裂黑斑的时间，即为泪膜破裂时间。对数据使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。

图3是动物实验活体小鼠泪膜破裂时间检测结果图。如图3所示，其中N为空白对照组；M为模型对照组；R为溶剂对照组；Y为阳性药组(质量浓度为0.05％环孢素A)；E1为二氢槲皮素低浓度组；E2为二氢槲皮素高浓度组。另外，P代表显著性差异，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。小鼠造模前检测BUT数值均在正常范围，差异无统计学意义(P>0.05)；经智能干燥环境系统结合药物诱导造模后，空白对照组造模前后检测BUT值差异无统计学意义(P>0.05)；在造模第14天(day 14)后对各组小鼠进行BUT检测。

结果如图3所示：与空白对照组比较，其余5组小鼠泪膜破裂时间均有不同程度变短，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，二氢槲皮素给药组泪膜破裂时间明显增长，差异有统计学意义(P<0.05)，说明经二氢槲皮素治疗后，小鼠泪膜稳定性得到改善。

1.5.4角膜荧光素钠染色检查角膜上皮损伤

分别在开始造模前及造模后14天观察各组实验小鼠角膜形态，并使用荧光素钠溶液染色双眼角膜，并使用裂隙灯进行观察拍照。固定好小鼠后，将5μL的2％荧光素钠生理盐水溶液滴入小鼠结膜囊内，1min后用2mL生理盐水轻轻淋洗眼睛，用棉棒吸去多余溶液，用钴蓝光照射荧光素钠染色的小鼠角膜，用裂隙灯进行观察、拍照并记录。如角膜表面有绿色荧光残留，代表该处角膜上皮有损伤。对角膜表面荧光素钠残留进行评分，记录。对数据使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析

图4是各实验组小鼠经角膜荧光素钠染色后的角膜形态图。如图4所示，空白对照组小鼠角膜均完整光滑，无荧光素钠附着，说明空白对照组小鼠角膜上皮完好无损伤。除空白对照组外，模型组与各给药组均有不同程度的荧光素钠附着，说明模型对照组与各给药组小鼠角膜上皮均有不同程度的损伤。在造模第14天，与模型对照组相比，阳性药组和二氢槲皮素给药组也出现了密集的点状荧光附着，但与模型组相比有显著性减少。

角膜荧光素钠染色检查各实验组小鼠角膜上皮损伤评分结果如图5所示，其中，N为空白对照组；M为模型对照组；R为溶剂对照组；Y为阳性药组(质量浓度为0.05％环孢素A)；E1为二氢槲皮素低浓度组；E2为二氢槲皮素高浓度组。另外，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。由图可知，除空白对照组外，模型组与各给药组小鼠角膜上皮均有不同程度的损伤。在造模第14天，与模型对照组相比，阳性药组和二氢槲皮素给药组也出现了角膜上皮细胞损伤，但与模型组相比有显著性减少(P<0.001)。说明阳性药组与各浓度二氢槲皮素给药组减轻了小鼠角膜上皮的损伤程度，对角膜有一定的保护作用。

2.1角膜碱烧伤建立角膜新生血管疾病模型

2.1.1分组

50只3月龄的健康新西兰兔，雌雄各半，随机划分6只小鼠为一组，共划分6组，记录为空白对照组(N)、模型对照组(M)、阳性药组(LEV)、二氢槲皮素低浓度组(E1)、二氢槲皮素高浓度组(E2)和溶剂对照组(R)。分组时在兔耳部及笼卡进行标识，标识信息包括：实验名称、实验编号、组别、给药剂量、给药时间等。

2.1.2饲养

饲养条件：实验动物饲养于沈阳何氏医学院动物中心普通级兔实验室中。实验期间每笼饲育1只兔，共6笼。采用不锈钢悬挂笼单笼饲养，动物自由摄食饮水，同一房间内未饲养其他种属的动物。

环境条件：动物房的温湿度自动控制，控制温度20℃-25℃，控制湿度40％-70％。人工光照，光周期自动控制，12小时明，12小时暗，噪音在60dB以下。

动物福利：动物使用遵守国家动物福利法规《关于善待动物的指导性意见》(2006年，科技部)。动物使用方案经机构动物管理委员会(IACUC)批准，试验过程接受其监督。试验过程中，可能需要人道处死动物，以减轻动物的痛苦或疼痛。人道原因处死的动物处理方式同试验中死亡的动物。试验结束存活的动物进行安乐死。动物尸体委托专业机构进行处置。

2.2造模方法

本实验采用化学损伤法建立兔角膜新生血管模型，使用1％戊巴比妥钠耳缘静脉注射进行全身麻醉，丙美卡因滴眼液进行眼表麻醉，取6mm直径的滤纸片浸泡在1mol/L的NaOH溶液中浸泡1分钟，然后将浸泡后的滤纸片贴敷在角膜中心，30秒后取下滤纸片，然后用生理盐水冲洗眼表及结膜囊1分钟，造模完成后将造模眼滴加左氧氟沙星预防术后感染。

2.3给药方法与剂量

给药方式为经眼给药，全部给药组动物均在造模前一天开始给药。空白对照组、模型对照组不给药；阳性药组采用左氧氟沙星滴眼50μL/次，滴入结膜囊内；低浓度给药组采用质量浓度为0.03％二氢槲皮素滴眼50μL/次，高浓度给药组采用质量浓度为0.3％二氢槲皮素滴眼50μL/次，各组新西兰兔给药均2次/日(上午9：00，下午3：00)。

2.4角膜新生血管面积检测

各实验组动物在给药后14天进行眼表炎症及新生血管面积检测，拍照记录并计算新生血管面积，对数据使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。

图6为角膜裂隙灯检测各实验组新西兰兔给药后14天角膜上新生血管的形态图，黑色圆圈区域即为角膜新生血管面积，空白对照组角膜透明无新生血管；模型组和溶剂对照组角膜出现大量树枝状新生血管沿着角膜缘向着角膜中心区域扩张，与空白对照组相比有显著性差异；阳性药对照组及高低浓度二氢槲皮素给药组角膜上仅出现少量的新生血管，与模型组相对比有显著性改善。各实验组的新西兰兔的角膜新生血管面积的检测结果如图7所示，其中，N为空白对照组；M为模型对照组；R为溶剂对照组；Y为阳性药组(左氧氟沙星)；E1为二氢槲皮素低浓度组；E2为二氢槲皮素高浓度组。另外，**代表P<0.01，****代表P<0.0001。模型组和溶剂对照组角膜的新生血管面积与空白对照组相比有显著性差异(P<0.0001)；阳性药对照组及高低浓度二氢槲皮素给药组角膜的新生血管面积较小，与模型组相对比有显著性改善(P<0.01)，说明二氢槲皮素能抑制新生血管的出现，减轻角膜碱烧伤程度。

综上可知，二氢槲皮素应用于治疗眼表疾病中作用突出，50-200μM浓度的二氢槲皮素对HCE细胞有促增值作用、25-200μM的二氢槲皮素对H₂O₂诱导HCE细胞氧化应激损伤的具有保护作用。经二氢槲皮素治疗后，干眼小鼠泪液分泌量有一定增加，小鼠泪膜稳定性得到改善。并且二氢槲皮素能够减轻小鼠角膜上皮的损伤程度，对角膜有一定的保护作用，同时可以抑制新生血管的出现，减轻角膜碱烧伤程度。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.二氢槲皮素在制备用于预防、减轻和/或治疗眼表疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述眼表疾病为由角膜上皮细胞损伤和/或凋亡引发的眼表疾病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述角膜上皮损伤为氧化损伤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氧化损伤为由过氧化氢导致的损伤。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述眼表疾病为干眼症或角膜新生血管相关疾病。

6.一种二氢槲皮素眼用制剂，其特征在于，包括二氢槲皮素和溶剂。

7.根据权利要求6所述的二氢槲皮素眼用制剂，其特征在于，所述二氢槲皮素的质量浓度为0.01％～0.5％。

8.根据权利要求6所述的二氢槲皮素眼用制剂，其特征在于，所述制剂的剂型为滴眼液、眼膏、眼周及眼内注射液、眼用凝胶或脂质体。