TWI558405B - Cicada active material, a preparation method thereof, a pharmaceutical composition comprising the same and a use thereof - Google Patents
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Description
本發明係關於蟬花活性物質之開發，特別是指蟬花活性物質於預防物理性傷害或化學性傷害所誘導之乾眼症相關病變之技術領域。
「乾眼症」是眼科門診相當常見的疾病之一(佔成人人口比例的10-15%)，主要是由於眼球表面缺乏淚液或淚液品質不佳所引起，常見之症狀包括眼睛乾澀、容易疲倦、想睡、會癢、有異物感、痛灼熱感、眼皮緊繃沉重、分泌物黏稠、怕風、畏光、對外界刺激敏感以及暫時性視力模糊等；有時眼睛太乾、基本淚液不足反而刺激反射性淚液分泌而造成常常流眼淚之症狀；較嚴重者眼睛會紅、腫、充血、角質化，角膜上皮破皮而有絲狀物黏附，長期之傷害則會造成角結膜病變，並會影響視力。而造成淚液分泌不正常的原因有許多可能，包含過度用眼、長時間配戴隱形眼鏡、眼表炎症、老化、荷爾蒙失衡、自體免疫疾病、糖尿病以及一些外來因素造成眼表的受損等。由於許多因素都會導致乾眼症狀，因此乾眼症又可稱為乾眼症候群(Dry eye syndrome)。
正常的眼睛表面有一層淚液層，經由眨眼的動作而均勻分布，覆蓋在眼角膜及結膜上，形成一個潤滑保護膜，最後經由鼻淚管排除
掉，具有滋潤及保護的功能；淚液層由外而內又可分為3層：
(1)油脂層：由眼瞼之皮脂腺所分泌，在最外層，主要功用是增加淚液膜之表面張力，延緩水層液的蒸發，潤滑眼瞼及眼球表面。
(2)水液層：由淚腺所分泌，在中間層，占淚液膜的絕大部分，含營養素維生素及抗菌物質；主要功用是提供眼睛潤滑清晰的表面、提供角膜氧氣、有殺菌作用、以及清除代謝產物之功用。
(3)黏液素層：由結膜之杯狀細胞所分泌，在最內層，主要作用是和角結膜上皮細胞接觸，使之變成親水性，而使得淚液水層能均勻分布在角結膜表面。
這3層淚液之組成如果有一層分泌不足或是分布不均勻，都會造成乾眼之症狀。
乾眼症屬於慢性疾病，根治並不容易。目前治療法可分為內科性療法及外科性療法：
1.人工淚液：人工淚液除了提供潤濕功能、加添水分等功能外，尚有稀釋發炎物質、降低淚液滲透壓等效用，因此為乾眼症病患最常使用的療法。如果對防腐劑過敏或使用頻率較高(1天超過4到6次眼劑，含非人工淚液的其他藥物)，建議改用不含防腐劑的潤滑用眼藥水。
2.自體血清：血清中具有類似淚液的成分，此外也富含生長因子，因此可用以治療嚴重的乾眼症病患。每次製備後的血清可以冷凍保存3-6個月，因此病患不必太過頻繁抽血。
3.化痰劑(黏液溶解劑)：用以治療呼吸道疾病的黏液溶
解劑局部使用時，可以減少眼表面絲狀綴生物、黏液、或黏液斑塊的形成。
4.植入型人工淚液：此為放置在下眼結膜深處的固體人工淚液，它可以慢慢地釋放出潤滑劑，在24小時內保持眼睛的濕潤。但缺點是放置不易(需眼科醫師示範)，且病患感覺眼表濃稠，視力稍微受到影響。
5.抗發炎療法：乾眼症不單單只是淚液分泌量不足，揮發太快，或是淚液成分失常而已；目前已知眼表的發炎反應也扮演重要的腳色。因此，局部使用類固醇，或Restasis(環孢靈表cyclosporine眼用藥水)也是治療的另一個方針。Restasis已在2002年經過美國藥品食品檢驗局(FDA)認證用以治療慢性乾眼症，它是目前市面上所有乾眼症藥物中唯一證實對淚液分泌量有增加效果的藥物。
6.抗生素：口服四環黴素或其相關藥物(doxyclcine)對於眼瞼板發炎，尤其有酒糟鼻體質的病患特別有效。然而這類的病患最好能夠同時注意眼瞼清潔和熱療法輔助。局部維他命A藥膏：可用於睡前使用，但其效果目前仍有爭議。
7.若伴有全身免疫系統疾病的病患，則需配合風濕免疫專科醫師共同治療。
以外科療法治療乾眼症一般用於重度、內科療法治療成效不彰的病患。常用的術式可以分為以下幾類：
1.淚小管填塞：以栓塞法將淚小管開口加以阻塞，其作用原理類似水槽的塞子，只讓少量的淚液流出，讓更多的淚液可以留在眼表
面，幫助維持眼球上的淚膜穩定。一般而言，眼科醫師會先使用暫時性、可溶解的栓塞以測試治療效果；如果暫時性的栓塞法能改善乾眼症的症狀，醫師才會放置永久性的栓塞。接受淚小管填塞的病患須注意術前是否有嚴重發炎現象，以避免手術後因發炎物質長期留置眼表而造成眼表傷害。
2.眼瞼縫合術：極嚴重的乾眼患者、合併其他角膜病變或眼瞼癒合不全之患者，可施行「眼瞼縫合術」，以避免進一步之惡化。
眼科醫師可由臨床症狀和一些檢查來診斷乾眼症；包括淚液分泌試驗、角膜結膜染色試驗、淚液層瓦解時間、以及其他淚腺之檢查、結膜功能之檢查等等；此外一些免疫疾病相關之檢查也可以幫助找出病因。
蟬花型態與分布
蟬花又名土蟬花、蟲花、蟬草、胡蟬、蟬菌、蟬蛹草、金蟬花、蟬茸或蠶茸等，為子囊菌亞門(Ascomycotina)，麥角菌目(Claricipiyales)，麥角菌科(clavicipitaceae)，蟲草屬(Cordyceps)真菌，由感染蟬蛹或蟬科山蟬(Cicada flammate)、螻蛄(Platypleura kaempferi)、黑蚱(Crytotympana pustulata)及竹蟬(Platylomia pieli)等幼蟲身上使其死亡，後於蟬蛹前端或蟲體頭部形成花蕾狀子座而成，故名蟬花。為一種菌蟲複合體。蟬花可依不同的寄主及感染菌種分類為大蟬花或金蟬草(C.cicadae)、小蟬花(C.sobolifera)及蟬草或蟬生蟲草(C.cicadicola)三種。蟬花多產於長江以南熱帶和亞熱帶地區，在中國為福建、浙江、四川、雲南及江蘇等地。在台灣部分山區亦有野生蟬花子實體蹤跡。
蟬擬青黴的有性階段，被認為是大蟬草(Cordyceps cicadae)，大蟬草俗名獨角龍，子座棒狀或角狀，從寄主頭部發出，單生或叢生，褐色。在自然界廣為分布的是蟬擬青黴(蟬花)，大蟬草稀少。
蟬花功效
蟬花為名貴傳統中藥材，性寒、味甘、無毒，曬乾後可入藥，有散風熱、鎮驚、明目、退翳障、透疹之功效。主治小兒天吊、驚癇、心悸、夜啼《本草綱目》。
蟬花入藥已有一千多年歷史，且野生蟬花之歷史記載比冬蟲夏草早了800年。蟬花之名最早見於南北朝劉宋時代之《雷公炮製論》，其中記載：凡使蟬花要白花全者。收得後於屋下懸乾，去甲土後用漿水煮一日，至夜焙乾，研細用之。
根據宋朝蘇頌的傳統醫書《圖經草本》記載「山蜀中，其蟬上有一角，如花冠狀，謂之蟬花。」；北宋唐慎微所著《証類草本》記載「蟬花味甘、性寒、無毒，具疏散風熱、定驚解痙之效，主治小兒夜啼、心悸等症狀。」；《本草綱目》亦記載「蟬花功同蟬蛻，又止瘧疾。」；亦有中醫藥書記載主治翳膜遮睛，如：《景岳全書》「蟬花散：治肝經風熱，毒瓦斯上攻，眼目赤痛，及一切內外翳障。」但目前仍無相關科學論證或發表。
其他傳統常用方劑如「萬應蟬花散」、「蟬花明目方」及「蟬花清熱方」等皆可見於《中華藥物大全》及《中華藥海》記載。
而現今亦有文獻報導「蟬花五味散」及「萬應蟬花散」應用於眼部相關疾病之研究。河南醫科大學第一附屬醫院眼科的彭廣華等曾以中藥生液散和「蟬花五味散」配合西藥治療外傷性低眼壓。外傷性低眼壓
是眼外傷的一種常見併發症，嚴重影響視功能。結果顯示中西藥治療組14人達正常眼壓(>1.33kPa)，有效率占46.67%，平均提高眼壓0.76kPa，西藥治療組30人中8人達正常眼壓，有效率占26.67%，平均提高眼壓0.41kPa；中國新鄉市中醫院徐大梅等觀察「萬應蟬花散」加減內服外洗治療春季結膜炎100例臨床觀察，並與西藥治療做對比觀察。結果治療組治癒率為78%，對照組為26%。一年後，治療組復發率為22%，對照組為88%。以上二例皆為添加蟬花子實體之複方應用，分別於眼壓及春季結膜炎之臨床觀察，並無明確表示單方蟬花或蟬花液態發酵菌絲體活性物質製備方法及其對角膜損傷或乾眼症狀之預防用途和效果。
蟬花與冬蟲夏草同屬蟲生真菌複合體，蟬花之功能性與應用性不亞於冬蟲夏草和蛹蟲草，具相近醫療保健功效，且含有相近的化學成分，所以常作為冬蟲夏草的代用品。而天然冬蟲夏草產量日趨減少，且天然蟬花子實體亦不多，限制了大量的使用，可以人工培養作為天然蟬花之替代品，人工培養物的主要生物活性成分、藥理學作用均和天然蟬花相似或超出天然蟬花。天然蟬花的產生需依賴於寄主，而寄主又受自然環境的制約，特別是受氣候因子或人為因素的影響。以人工培養品來替代日益枯竭的自然資源，為一條理想的途徑，因此蟬花液態發酵菌絲體具高度經濟應用價值。
本發明之目的為提供一種蟬花活性物質及該活性物質的製備方法，以及其用於預防或治療物理性傷害或化學性傷害所誘導之角膜傷害或乾眼症及其所導致之病變之用途。相較一般西藥治療或眼藥水，本發
明之製備方法更為安全、簡便，其活性物質更天然、安全，並達到預防或治療眼睛病變之效果。
根據本發明之實施例，提供一種用於預防及/或治療乾眼症之蟬花活性物質的製備方法。所述製備方法包括下列步驟：(a)取一蟬花菌絲體於平板培養基上，於15-35℃培養5-14天；(b)將步驟(a)培養後之蟬花菌絲體接種至燒瓶內，於15-35℃、pH 2-8的條件培養數天；(c)將步驟(b)培養後之蟬花菌絲體接種至一發酵槽內，於15-35℃、pH 2-8、槽壓0.5-1.0kg/cm2且通氣速率0.01-1.5VVM的條件培養3-5天，形成一蟬花菌絲體發酵液；(d)將所述蟬化菌絲體發酵液冷凍乾燥後磨粉，形成一蟬花菌絲體凍乾粉；(e)將所述蟬花菌絲體凍乾粉以至少一種溶劑萃取，形成蟬花菌絲體萃取液；及(f)將蟬花菌絲體萃取液乾燥後，獲得所述蟬花活性物質。
一實施例中，上述步驟(b)的燒瓶培養係採震盪培養，且震盪速率為10-250rpm。
一實施例中，上述步驟(c)內通入發酵槽的氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合。
一實施例中，上述步驟(a)、(b)及(c)的培養溫度為25℃，且pH值為4-7。
一實施例中，上述步驟(b)及(c)的培養pH值為4.5。
一實施例中，上述步驟(b)及步驟(c)係使用相同的培養基，且此培養基包括穀類、豆類、無機鹽類、醣類、酵母抽出物、麥芽抽出物或其組合。
一實施例中，上述步驟(e)內所述溶劑的數量為兩種，包括水及一醇類。
一實施例中，上述步驟(e)之醇類為甲醇或乙醇。
一實施例中，上述步驟(f)內以水作為溶劑的蟬花菌絲體萃取液乾燥後形成一水萃物，以醇類作為溶劑的蟬花菌絲體萃取液乾燥後形成一醇萃物，所述蟬花活性物質係將水萃物及醇萃物混合而成。
一實施例中，蟬花活性物質係由等重的蟬花菌絲體水萃物及蟬花菌絲體醇萃物混合而成。
根據本發明另一實施例，提供一種用於治療及/或預防乾眼症的蟬花活性物質，係以前述之製備方法製成。
根據本發明又一實施例，所述蟬花活性物質之用途係用於製備治療及/或預防乾眼症之藥物。
根據本發明再一實施例，提供一種用於治療及/或預防乾眼症之醫藥組合物。此醫藥組合物包括所述蟬花活性物質，以及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
根據本發明再一實施例，所述醫藥組合物之用途係用於製備治療及/或預防乾眼症之藥物。
為使本發明上述實施例之特徵及優點能更加清楚，以下配合
圖式說明本發明之實施方式。
第1A圖至第1D圖繪示小鼠淚液測試的結果(分別對應表3-1至表3-4)。第1A圖繪示UVB小鼠組淚液改變分泌量；第1B圖繪示BAC小鼠組淚液改變分泌量；第1C圖繪示UVB小鼠組淚液分泌量；第1D圖繪示BAC小鼠組淚液分泌量。
第2A圖及第2B圖繪示小鼠角膜平滑度分析的結果(分別對應表4-1及表4-2)。第2A圖繪示UVB小鼠角膜平滑度的平均分級；第2B圖繪示BAC小鼠角膜平滑度的平均分級。
第3A圖及第3B圖繪示小鼠角膜平滑度分析的結果(分別對應表5-1及表5-2)。第3A圖繪示UVB小鼠角膜清澈度的平均分級；第3B圖繪示BAC小鼠角膜清澈度的平均分級。
第4A圖及第4B圖繪示小鼠角膜地圖分析的結果(分別對應表6-1及表6-2)。第4A圖繪示UVB小鼠角膜地圖的平均分級；第4B圖繪示BAC小鼠角膜地圖的平均分級。
第5A圖及第5B圖繪示小鼠角膜損傷染色分析的結果(分別對應表7-1及表7-2)。第5A圖繪示UVB小鼠角膜損傷染色的平均分級；第5B圖繪示BAC小鼠角膜損傷染色的平均分級。
第6A圖及第6B圖繪示小鼠HE染色分析的結果。第6A圖為UVB小鼠HE染色；第6B圖為BAC小鼠角膜HE染色。
第7A圖至第7D圖繪示小鼠淚膜破裂時間試驗的結果(分別對應表8-1至表8-4)。第7A圖為UVB小鼠的角膜破裂時間；第7B圖為BAC小
鼠的角膜破裂時間；第7C圖為UVB小鼠的角膜破裂相對時間；第7D圖為BAC小鼠的角膜破裂相對時間。
第8A圖及第8B圖繪示小鼠角膜敏感性分析的結果(分別對應表9-1及表9-2)。第8A圖繪示UVB小鼠角膜敏感性分析的結果；第8B圖繪示BAC小鼠角膜敏感性分析的結果。
角膜是人體內神經最密集，感覺最靈敏的組織之一，是眼睛最前端部分，直接和空氣接觸，無血管組織，並透過淚液及房水獲取養份及氧氣，易損傷並造成疾病。因此本發明中之部分實施例即透過物理性或化學性誘導角膜損傷並評估蟬花活性物質用於預防或治療其所導致之乾眼症及其他眼部疾病之效果及用途。
紫外線(UV：Ultraviolet)在地球上無所不在，依其波長區段不同可分為UVA(315-380nm)、UVB(280-315nm)及UVC(100-280nm)。紫外線的過度照射會造成光化學傷害，尤以UVB對眼球的傷害最明顯。會引發自由基的形成，使眼角膜上的抗氧化酵素失去活性。UVB會被角膜所吸收，主要會導致眼表(Ocular surface)與眼角膜的光損傷，造成結膜的結締組織增生，眼瞼皮膚也會因為曝曬造成角質增生，使眼角膜結膜及眼瞼組織傷害及加速老化。長期照射會使眼睛有異物感及刺痛感，亦會產生角膜發炎、上皮脫落以及眼角膜的退化性傷害等症狀。一般民眾除了配戴太陽眼鏡之外較少做到眼睛防護，因此在不知不覺中忽略UVB對眼表的傷害而導致慢性發炎甚至乾眼症的發生。
氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride；BAC、BAK)是一種陽離子介面活性劑，屬非氧化性之廣效殺菌劑，可用於殺菌、消毒、防腐、乳化、去垢、增溶等功能。早期常被添加於眼藥水中作為防腐用途，但近來研究顯示該化合物會導致淚膜不穩定性、杯狀細胞的流失、結膜鱗狀上皮化生(Metaplasia)和凋亡(Apoptosis)、角膜上皮屏障的破壞及更深層眼睛組織的損傷，輕度症狀會導致眼睛發炎與亁眼症，嚴重者甚至會造成眼表的永久傷害而影響視力。BAC造成上述影響的機制尚未釐清，但目前的研究已證實其會造成前趨炎症細胞激素(Proinflammatory cytokine)的釋放、細胞凋亡以及氧化應激(Oxidative stress)而導致免疫炎症反應發生，此外也會與淚膜及細胞膜上的脂質成分有直接的交互作用(Interaction)。
因此本發明根據上述原理，設計兩種小鼠動物模式(UVB及BAC模式)來觀察蟬花活性物質對於物理性或化學性誘導眼表損傷而導致之乾眼症的預防效果及其應用於眼睛保健之相關用途。
蟬花菌絲體來源
本發明之實施例所用之蟬花(Cordyceps cicadae)菌絲體係由採集而得之台灣野生蟬花子實體，經分離而得其菌絲，並繼代保存於平板培養基上，經台灣食品工業發展研究所做鑑定證實其基因序列為蟬花(Cordyceps cicadae)，此菌株現已公開寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源
研究中心(BCRC)，寄存編號為MU30106。但本發明所述之蟬花活性物質不限於由此菌種所得。
液體培養
蟬花液態發酵菌絲體活性物質之製備及蟬花菌絲體液體培養，係將菌絲體接種於平板培養基上，於適當溫度15-35℃(較佳為25℃)下培養5天至2周後，刮取菌絲接種於燒瓶內。在15-35℃(較佳為25℃)，pH 2-8，較佳為pH 4-7，更佳者約pH 4.5，震盪速率10-250rpm之下培養約3天，培養時間可依培養條件及菌絲生長情形進行調整；然後將燒瓶培養物接種於發酵槽培養基(參下表1)，(同燒瓶培養基)內，在15-35℃(較佳為25℃)，槽壓0.5-1.0kg/cm2，pH 2-8下，10-150rpm攪拌速度或不攪拌(air lift)情況，以0.01-1.5VVM通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣、二氧化碳與氮氣的混合物，較佳者為空氣，培養時間為3-5天內，即得蟬花菌絲體液體培養發酵液，包括菌絲體與澄清液。此發酵液內即含本發明之蟬花活性物質。蟬花菌絲體液體培養發酵液可進一步藉由乾燥步驟製備為發酵液凍乾粉。
培養基配方如下表1：
上述培養基配方中，綜合性碳氮源可為穀類(如：麥粉類)或豆類(如：黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等)；無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鐵等；醣類可為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等。特別說明的是，上述培養基配方僅為一範例，使用時成份可依需求調整，或搭配市售培養基使用，並無特別限制。
乾燥
包含但不限於：噴霧乾燥、熱風乾燥、滾筒乾燥、冷凍乾燥、減壓濃縮或其他適合的乾燥方法，將發酵液製備成發酵液凍乾粉。
萃取
1.水萃取
發酵液經乾燥法製備而得之發酵液凍乾粉加入蒸餾水回溶，以90℃-121℃溫度加熱數分鐘，待冷卻後經減壓濃縮法或上述之任一乾燥法進行乾燥，即得蟬花菌絲體水萃物。
2.醇萃取
蟬花菌絲體液體培養發酵液經乾燥法製備而得之發酵液凍乾粉加入醇類溶劑(1%-100%重量或體積百分濃度之甲醇或乙醇)回溶，萃取數分鐘(包含但不限於浸泡、攪拌、震盪或超音波萃取法)，之後經減壓濃縮法或上述之任一乾燥法進行乾燥，即得蟬花菌絲體醇萃物。
3.萃取物混合物(任何比例)
由上述之水萃物與醇萃物混合之混合物，可包含任何混合之比例，不受特別之限制。
菌絲體菌株：
平板培養：將蟬花菌絲體接種於平板培養基上，培養基為馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)，於25℃下培養約5天。
燒瓶培養：
刮取平板上之菌絲接種於燒瓶內，用下表2之培養基，在約25℃，pH 4.5下，於震盪機上以轉速120rpm震盪培養3天；
發酵槽培養：
培養基同表2，將燒瓶培養物接種於發酵槽培養基內，在25℃，槽壓0.5-1.0kg/cm2，pH 4.5下，10-150rpm攪拌速度或不攪拌(air lift)情況，以0.5-1.0VVM通氣速率通入空氣，培養3天，得菌絲體與澄清液，稱為蟬花菌絲體發酵液。發酵液內含本發明之蟬花活性物質。將蟬花菌絲體發酵液經冷凍乾燥可得發酵液凍乾粉。
萃取物製備：
水萃取
取蟬花菌絲體發酵液凍乾粉加入20倍體積蒸餾水溶解，以溫度100℃加
熱三十分鐘，待冷卻後經冷凍乾燥法進行乾燥，得蟬花菌絲體水萃物。
醇萃取
取蟬花菌絲體發酵液凍乾粉加入20倍體積乙醇回溶，利用超音波震盪萃取1小時，萃取懸浮液離心後取上清液經減壓濃縮，得蟬花菌絲體醇萃物。
萃取物混合物
取上述等重之水萃物與醇萃物均勻混合並以冷凍乾燥法使其完全乾燥，得水/醇萃取混合物。
結果：
20公噸發酵槽培養完畢之蟬花菌絲體液體培養發酵液經冷凍乾燥後，可得約110公斤發酵液凍乾粉。經由萃取步驟可取得較高濃度之用以預防或治療物理性傷害或化學性傷害所誘導之乾眼症及其所導致之病變的蟬花活性物質。蟬花活性物質的態樣包含蟬花菌絲體發酵液(菌絲體與澄清液)、發酵液凍乾粉、水/醇萃取液混合物或其他劑型。以下實施例二中，係以水/醇萃取液混合物作為蟬花活性物質態樣。
1.乾眼症小鼠動物模式之建立
實驗動物：
品系ICR雌性小鼠購自樂斯科公司(台灣)，年齡7~10周，體重25~33克，飼養於中山醫學大學實驗動物中心，提供正常潔淨飼料及飲水，飼養環境為12小時照光及12小時黑暗之循環光照，溫度控制在20±2℃，濕度控制在50±5%。
(1)紫外燈UVB誘導乾眼症
紫外燈購自Vilber lourmat公司，燈管型號為VL-6MC，波長設定為280nm~320nm範圍，主要波峰在312nm。
試驗進行前將小鼠隨機分為4組，每組6隻，分別為對照組(餵食生理食鹽水，未餵食蟬花活性物質、無UVB處理)、UVB處理組(經UVB處理)、低劑量試驗組(餵食10mg/kg‧bw蟬花活性物質，經UVB處理)及高劑量試驗組(餵食100mg/kg‧bw蟬花活性物質，經UVB處理)。
本試驗共進行10天，試驗組每日皆管餵試驗設計劑量之蟬花活性物質(水/醇萃取液混合物)，UVB處理組及試驗組由第4天開始，每日將小鼠以2.5% Avertin麻醉後置於暗箱中，眼球朝上照射0.72J/cm2強度之UVB 90秒，使小鼠眼表受到損傷。所有組別進行小鼠淚液測試(第4、7及10天)，淚膜破裂時間及角膜敏感性測試(第4、7及10天)，角膜外觀評估及犧牲後之眼球組織染色分析(第10天)以評估蟬花活性物質是否能改善由UVB造成之眼表損傷及乾眼症狀。數據表明(詳述如後)，蟬花活性物質對紫外燈UVB物理性傷害誘導眼表損傷造成之乾眼症具保護效果。
(2)BAC誘導乾眼症
試驗進行前將小鼠隨機分為4組，每組6隻，分別為對照組(餵食生理食鹽水，未餵食蟬花活性物質、無BAC處理)、BAC處理組(經BAC處理)、低劑量試驗組(餵食10mg/kg‧bw蟬花活性物質，經BAC處理)及高劑量試驗組(餵食100mg/kg‧bw蟬花活性物質，經BAC處理)。
本試驗共進行14天，試驗組由第1天至第13天每日皆管餵試驗設計劑量之蟬花活性物質，第4天起至第13天為止，BAC處理組及試驗組
之小鼠，每日取體積5μL 0.2% BAC點於眼球，使小鼠眼表受到損傷。所有組別進行小鼠淚液測試(第4、7、10及13天)，淚膜破裂時間及角膜敏感性測試(第4、7、10及13天)，角膜外觀評估及犧牲後之眼球組織染色分析(第14天)以評估蟬花活性物質是否能改善由BAC造成之眼表損傷及乾眼症狀。數據結果顯示(詳述如後)，蟬花活性物質對化學物質BAC化學性傷害誘導眼表損傷造成之乾眼症具保護效果。
2.眼表損傷程度檢測項目及乾眼症評估相關指標分析
本試驗採用兩種小鼠動物模式(UVB與BAC傷害模式)來觀察蟬花活性物質對於眼表的保護效果。根據試驗設計，分別在試驗中途及試驗結束後取樣進行眼表損傷程度及乾眼症評估。
相關指標分析採用與臨床乾眼症評估診斷相似之項目，包含淚液測試、角膜外觀分析、HE染色組織學分析、淚膜破裂時間及角膜敏感性；其中角膜外觀分析共進行角膜平滑度、角膜清澈度、角膜地圖及角膜損傷染色4項評估。
(1)淚液測試(Tear production)
淚液測試可反映淚液之基礎分泌量。使用石蕊試紙測試小鼠淚液之分泌量。將其置入已麻醉小鼠靠耳側的眼窩中吸取淚液，數秒後取出試紙並測量試紙濕潤長度，以評估小鼠是否有淚液分泌量改變的情形。
(2)角膜外觀分析
分為角膜平滑度(Corneal smoothness)、角膜清澈度(Corneal opacity)、角膜地圖(Corneal topography)及角膜損傷染色(Corneal staining)4項進行測試，評級分數越高表示角膜受損程度越高。
(2.1)角膜平滑度分析：以環形光源照射眼球表面，根據角膜反射光源環形影像的完整度做分級，分為0級到5級；0級影像為完整無扭曲環形，1-3級依序為1/4、1/2、3/4部分的環形出現扭曲，4級為整個環形皆出現扭曲，最嚴重的5級則為極度扭曲到無法辨識環形線條。
(2.2)角膜清澈度分析：以光源照射眼球，觀察角膜的清澈度，依不透明程度分為0級到4級；0級為正常的角膜透明度，1-3級分別為輕度、中度、中度(虹膜不清楚)的不透明變性，而4級則為重度不透明變性，可觀察到明顯白色混濁並伴隨著角膜潰瘍。
(2.3)角膜地圖分析：角膜地圖分析是以5重環形圖形投射眼表，可觀察較大範圍的角膜平滑程度。評估方法為將眼表以十字等分成4區，每區皆有5重環形之5條圓弧線，每當1條圓弧線扭曲或無法判讀時計數1分，全眼共20分；分數越高表示角膜不平滑程度越高，依程度分為0-5級，得分0分定為0級，1-4分為1級、5-9分為2級、10-14分為3級、15-19分為4級，最嚴重之20分定為5級。
(2.4)角膜損傷染色分析：因受損的角膜會被染劑上色，故可藉由染色面積來評估角膜受損的程度。依面積大小將分析結果定為0-5級，未被染色者為0級、25%以下為1級、25-50%為2級、50-75%為3級、75%-99%為4級，全角膜皆被染色則定為5級。
(3)HE染色(Hematoxylin and eosin stain、H&E stain)
此為組織學最常用的染色方法之一，染料蘇木紫(Hematoxylin)可將嗜鹼性結構染成藍紫色，如核內染色質與胞內核糖體等，而伊紅(Eosin)為酸性染料，可使細胞質及胞外基質呈現紅色，以利組織學判讀。在本試
驗之最後一天結束後，將小鼠犧牲，取出其眼球組織經3%福馬林浸泡及正丁醇脫水後進行石蠟包埋、切片及HE染色，觀察中央角膜的細胞層數、型態與厚薄度，評估給予蟬花活性物質之效果。
(4)淚膜破裂時間(Tear break-up time，TBUT)
淚膜品質亦是影響乾眼症是否發生之原因之一。淚膜破裂時間可評估淚液品質，可反映淚膜的穩定性。將1μL之0.1%液體螢光劑鈉滴入結膜囊，經三次眨眼後以秒為單位記錄淚膜破裂時間。90秒後，角膜上皮損傷程度分級由裂隙燈顯微鏡經鈷藍色濾光片評估。將角膜分成四象限，分別計分，四組分數相加取得總分(滿分為16分)。未染色得0分；輕微點狀染色並小於30點得1分；點狀染色超過30點並無擴散現象得2分；嚴重點狀染色並擴散，但無明顯斑塊得3分；有明顯螢光斑塊得4分。
(5)角膜敏感性(Corneal sensitivity，CS)
利用柯-博二氏感覺測量器(Cochet and Bonnet aesthesiometer)評估角膜敏感性，測量角膜中央知覺及敏感度。經物理性或化學性傷害後未麻醉的小鼠在不同時間點由頸背抓住固定並利用可調整長度之單絲纖維垂直觸碰角膜表面，直至使線變彎曲到可觀察到的彎度(大約偏斜5°)。如小鼠無出現眨眼反應，再依序縮短單絲纖維之長度，直到小鼠有眨眼反應。單絲纖維單位間隔0.5公分，依序使用長度6.0-0.5公分之單絲纖維觸碰角膜表面測試，單絲纖維愈長，愈容易彎曲，角膜表面所承受之頂端壓力愈小。眨眼反應以單絲纖維不相差大於5mm為正常。每支不同長度之單絲纖維以垂直角膜表面方向觸碰，至少4次才可記為無眨眼反應。在0.5公分單絲纖維觸碰之眨眼數計分為0。每次操作測量必須為同一操作者。
上述實驗結果皆以第18版SPSS軟體進行無母數檢定Mann-Whitney U統計分析。在以下的測試結果中，星號(*)表示p<0.05，即兩者間具有顯著差異。
本試驗使用裁切成1mm寬之石蕊試紙(Toyo Roshi Kaisha,Ltd)，將其置入已麻醉小鼠靠耳側的眼窩中吸取淚液，待20秒後取出試紙並測量試紙濕潤長度(mm)，測試小鼠淚液之分泌量，以評估小鼠是否有淚液分泌量改變的情形。試驗結果列於下表3-1至表3-4(分別對應第1A圖至第1D圖)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，蟬花活性物質可減少淚液分泌量改變情形並增加淚液分泌量，有助於預防乾眼症之症狀產生。
(1)角膜平滑度分析：以環形光源照射眼球表面，根據角膜反射光源環形影像的完整度無扭曲至嚴重扭曲依序分為0級到5級。試驗結果列於下表4-1及表4-2(分別對應第2A圖及第2B圖)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經餵食蟬花活性物質之組別其反射光源環形影像之扭曲程度平均等級皆低於對照組，有效減少角膜平滑度傷害，有助
於預防乾眼症之症狀產生。
(2)角膜清澈度分析：以光源照射眼球，觀察角膜的清澈度，依不透明程度分為0級到4級。試驗結果列於下表5-1及表5-2(分別對應第3A圖及第3B圖)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經餵食蟬花活性物質之組別其混濁變性程度平均等級皆低於對照組，有效減少角膜混濁變性傷害，有助於預防乾眼症之症狀產生。
(3)角膜地圖分析：以五重環形圖形投射眼表，觀察較大範圍的角膜平滑程度。評估方法為將眼表以十字等分成4區，每區皆有五重環形之5條圓弧線，每當1條圓弧線扭曲或無法判讀時計數1分，全眼共20分，依角膜不平滑程度分為0-5級。試驗結果列於下表6-1及表6-2(分別對應第4A圖及第4B圖)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經餵食蟬花活性物質之組別其環形圓弧線扭曲程度平均等級皆低於對照組，有
效減少角膜不平滑程度，有助於預防乾眼症之症狀產生。
(4)角膜損傷染色分析：因受損的角膜會被染劑上色，故可藉由染色面積來評估角膜受損的程度。依被染色之面積大小程度輕微至嚴重結果定為0-5級。試驗結果列於下表7-1及表7-2(分別對應第5A圖及第5B圖)。此結果顯示，試驗結果表明，不論是物理性或化學性誘導傷害，經餵食蟬花活性物質之組別其被染色面積大小平均等級皆低於對照組，有效
減少角膜受損程度，有助於預防乾眼症之症狀產生。
利用HE染色法，觀察角膜的細胞層數、型態與厚薄度。試驗結果如第6A圖及第6B圖，其顯示不論是物理性UVB或化學性BAC誘導傷害，餵食蟬花活性物質之組別經HE染色後可看出角膜的細胞層數、型態與厚薄度皆大於受誘導損傷之組別，有效減少角膜受損程度，有助於預防乾
眼症之症狀產生。
利用螢光劑滴入結膜囊，並用裂隙燈觀察淚膜破裂時間評估淚膜品質。試驗結果列於下表8-1至表8-4(分別對應第7A圖至第7D圖)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經餵食蟬花活性物質之組別其淚膜破裂時間及淚膜破裂相對時間皆高於誘導傷害組，有效延長淚膜破裂時間及降低角膜受損程度，有助於預防乾眼症之症狀產生。
表8-3、UVB小鼠淚膜破裂相對時間(秒)(對應第7C圖)
利用柯-博二氏測量器評估角膜敏感性。試驗結果列於下表9-1及表9-2(分別對應第8A圖及第8B圖)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經餵食蟬花活性物質之組別其角膜敏感度皆低於誘導傷害組，有效減少角膜損傷程度即減少角膜敏感性，有助於預防乾眼症之症狀產生。
上述實施例三之試驗證明，以實施例一製備方法製成的蟬花活性物質，對於物理性UVB及化學性BAC誘導的角膜損傷具有治療效果，可改善其受損情形。故蟬花活性物質可應用於眼睛保健、乾眼症治療及預防之領域。
上述實施方式係針對本發明之數個可行實施例的具體說明，惟此些實施例並非用以限制本發明。本領域之通常知識者在不脫離本發明技藝精神的範疇內，當可對此些實施例進行等效實施或變更，故本發明的保護範圍應以其後所附之申請專利範圍為準。
Claims (13)
- 一種用於預防及/或治療乾眼症之蟬花活性物質的製備方法，包括下列步驟：(a)取一蟬花菌絲體於平板培養基上，於15-35℃培養5-14天；(b)將步驟(a)培養後之蟬花菌絲體接種至燒瓶內，於15-35℃、pH 2-8的條件培養3天；(c)將步驟(b)培養後之蟬花菌絲體接種至一發酵槽內，於15-35℃、pH 2-8的條件培養3-5天，形成一蟬花菌絲體發酵液；(d)將該蟬花菌絲體發酵液冷凍乾燥後磨粉，形成一蟬花菌絲體凍乾粉；(e)將該蟬花菌絲體凍乾粉分別以水及一醇類作為溶劑萃取，形成兩種蟬花菌絲體萃取液；以及(f)將以水作為溶劑的該蟬花菌絲體萃取液乾燥後形成一水萃物，以醇類作為溶劑的該蟬花菌絲體萃取液乾燥後形成一醇萃物，將該水萃物及該醇萃物混合獲得該蟬花活性物質。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中步驟(b)的燒瓶培養係採震盪培養，且震盪速率為10-250rpm。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中步驟(c)中通入該發酵槽的氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中步驟(c)之該發酵槽的槽壓為0.5-1.0kg/cm2且通氣速率為0.01-1.5VVM。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中步驟(b)及步驟(c)中使 用相同的培養基，且此培養基包括穀類、豆類、無機鹽類、醣類、酵母抽出物、麥芽抽出物或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中該醇類為甲醇或乙醇。
- 如申請專利範圍第1項所述之製備方法，其中該蟬花活性物質係由等重的該水萃物及該醇萃物混合而成。
- 一種用於治療及/或預防乾眼症的蟬花活性物質，係以如申請專利範圍第1-7項中任一項的方法製備而成。
- 一種如申請專利範圍第8項所述之蟬花活性物質之用途，其係用於製備治療及/或預防乾眼症之藥物。
- 如申請專利範圍第9項所述之蟬花活性物質之用途，其中該治療及/或預防乾眼症之藥物係以口服方式服用。
- 一種用於治療及/或預防乾眼症之醫藥組合物，係包括如申請專利範圍第8項之蟬花活性物質，以及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
- 一種如申請專利範圍第11項之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療及/或預防乾眼症之藥物。
- 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組合物之用途，其中該治療及/或預防乾眼症之藥物係以口服方式服用。
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