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CN118086166B - 一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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CN118086166B CN202410465797.6A CN202410465797A CN118086166B CN 118086166 B CN118086166 B CN 118086166B CN 202410465797 A CN202410465797 A CN 202410465797A CN 118086166 B CN118086166 B CN 118086166B
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Abstract

本发明提供了一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株以E.coli W3110为底盘微生物，经代谢工程方法改造后，所述菌株缺失了deoD、xapA、gsk、purR基因；过表达了guaB、guaA、surE、prsA *基因，其中prsA *基因双拷贝；异源表达了来源于B.subtilis168的purF * 、pur (EKBCSQLFMNHD)基因，其中purF * 基因双拷贝；所述菌株具有良好的鸟苷合成能力，性能稳定，经5L发酵罐发酵48h，最终鸟苷的产量可达到35g/L，在目前已报道的利用大肠杆菌生产鸟苷中属于最高水平，具有很好的工业应用价值。

Description

一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
鸟嘌呤核苷，又名 9-β-D-呋喃核糖基鸟嘌呤，简称鸟苷（GR），英文名Guanosine。鸟苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂──5'-鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠以及核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造无环鸟苷（Acyclovir）、三氮唑核苷（ATC）、三磷酸鸟苷钠（GTP）等药物的主要原料。
近年来，鸟苷在工业上的主要生产方法为微生物发酵法，其所使用的生产菌株主要为芽孢杆菌，但利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷存在一些问题，例如生产周期过长，容易染菌，导致发酵过程不稳定，并且生产成本较高，因此，如何缩短发酵周期，降低生产成本是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种鸟苷生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述鸟苷生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述鸟苷生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种鸟苷生产菌株，为Gus12鸟苷生产菌株，以E.coliW3110作为出发菌株，经改造后，缺失了deoD、xapA、gsk、purR基因；过表达了guaB、guaA、surE、prsA *基因；异源表达了来源于B.subtilis168的purF * 、pur(EKBCSQLFMNHD)基因；最终得到Gus12鸟苷生产菌株。
优选的，上述鸟苷生产菌株，以E.coliW3110作为出发菌株，敲除了菌株基因组上的deoD、xapA、gsk、purR基因；利用T7启动子分别强化guaB、guaA、surE基因转录强度，并分别整合到基因组mbhA、yeeL、ycgH基因位点；利用Trc启动子强化prsA *基因转录强度，并分别整合到基因组yeeP、yjgX基因位点进行双拷贝；利用Trc启动子强化来源于B.subtilis168的purF * ,并分别整合到基因组gapC、ycdN基因位点进行双拷贝；利用Trc启动子强化来源于B.subtilis168的pur(EKBCSQLFMNHD)基因转录强度，并整合到基因组yjiV基因位点。
优选的，上述鸟苷生产菌株，所述出发菌株为E.coliW3110 ATCC 27325。
优选的，上述鸟苷生产菌株，所述deoD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，xapA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，gsk基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.3所示，purR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，guaB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，guaA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，surE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，prsA *基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，purF * 基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，pur(EKBCSQLFMNHD)基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，Trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。
优选的，上述prsA *基因：prsA基因的第385位碱基A替换为C，其对应的第128位氨基酸由天冬氨酸替换为丙氨酸。
优选的，上述purF * 基因：purF基因的第878位碱基A替换为T，其对应的第293位氨基酸由天冬氨酸替换为缬氨酸；第946位碱基A替换为C，其对应的第316位氨基酸由赖氨酸替换为谷氨酰胺；第1199位碱基由C替换为G，第1200为碱基由C替换为G，其对应的第400位氨基酸由丝氨酸替换为色氨酸；该基因来源于B.subtilis168。
上述鸟苷生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
（1）底盘菌改造：
异源表达了来源于B.subtilis168的嘌呤操纵子pur(EKBCSQLFMNHD)基因，并由Trc启动子控制；敲除了鸟苷激酶gsk基因；敲除了嘌呤核苷酸合成抑制因子purR基因；
（2）弱化鸟苷分解的基因转录强度：
敲除嘌呤核苷磷酸化酶deoD、xapA基因，保留了其功能相同的yfiH、yaiE基因；
（3）调整嘌呤核苷酸合成途径以及鸟苷合成途径的基因转录强度：
利用Trc启动子强化嘌呤核苷酸合成途径中的关键酶合成基因prsA *、purF * 基因，可以较好的增强嘌呤核苷酸合成途径的基因转录强度；利用T7启动子强化鸟苷合成关键酶合成基因guaB、guaA、surE基因转录强度，能有力增强嘌呤核苷酸代谢途径重要中间产物肌苷酸流向鸟苷的基因转录强度。
优选的，上述鸟苷生产菌株的构建方法，所述yfiH基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.11所示，yaiE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示。
上述鸟苷生产菌株在发酵生产鸟苷方面的应用。
优选的，上述鸟苷生产菌株的应用，在培养基中发酵培养得到鸟苷。
优选的，上述鸟苷生产菌株的应用，具体步骤如下：
①菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13 h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：34-35℃；
②种子培养：培养温度为33-35℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30-50%，当OD600nm为15-20时达到接种要求；
③发酵培养：接种量为种子培养基的15-20%，培养温度为33-35℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养，pH控制在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30-50%，通过流加80%（质量体积分数）葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期≤48h。
优选的，上述鸟苷生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为葡萄糖25-35g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨0.8-1.2g/L，MgSO4.7H2O 0.5-1g/L，KH2PO42-3g/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，FeSO4.7H2O 10-20mg/L，VB1、VB3、VB5各0.8-1.5mg/L，VH0.5-1mg/L，其余为水。
优选的，上述鸟苷生产菌株的应用，所述步骤③采用的发酵培养基为：酵母粉3-5g/L，蛋白胨1.5-2.5g/L，柠檬酸1.5-2.5mg/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，KH2PO42-5g/L，MgSO4.7H2O 1.5-2.5g/L，DPF（大豆水解液）0.8-1.5g/L，FeSO4.7H2O 20-30mg/L，MnSO410-15mg/L，VB1、VB3、VB5各2-3mg/L，VH0.5-0.5mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述鸟苷生产菌株，缺失了deoD、xapA、gsk、purR基因；过表达了guaB、guaA、surE、prsA *，其中prsA *基因双拷贝；异源表达了来源于B.subtilis168的purF * 、pur (EKBCSQLFMNHD)基因，其中purF * 基因双拷贝；所述菌株具有良好的鸟苷合成能力，性能稳定，经5L发酵罐发酵48h，最终鸟苷的产量可达到35g/L，在目前已报道的利用大肠杆菌生产鸟苷中属于最高水平，具有较好的工业应用价值。具体来说：
（1）完全敲除核苷类物质分解为嘌呤类物质的嘌呤核苷磷酸化酶deoD、xapA、yfiH、yaiE基因，引起菌体严重的嘌呤类物质缺陷，影响菌体生长，生产上也会增加成本负担，而敲除deoD、xapA基因，保留了其功能相同的yfiH、yaiE基因，使核苷类物质分解成的嘌呤类物质能够支撑菌体自身的生长而不至于造成菌体严重的嘌呤缺陷；
（2）利用Trc启动子强化嘌呤核苷酸合成途径中的关键酶合成基因prsA *、purF * 基因，可以较好的增强嘌呤核苷酸合成途径的基因转录强度，而不过度影响菌体自身的代谢，减少菌体自身代谢负担，增强鸟苷前体物的供应；利用T7启动子强化鸟苷合成关键酶合成基因guaB、guaA、surE基因转录强度，能有力增强嘌呤核苷酸代谢途径重要中间产物肌苷酸流向鸟苷的基因转录强度，提高鸟苷的积累效率。
附图说明
图1为鸟苷生产菌株Gus12的构建方法图解。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株为E.coliW3110 ATCC 27325（市售）；涉及的菌株B.subtilis168为B.subtilis168 ATCC 23857（市售）；相应启动子和基因等见序列表。涉及到的菌株构建过程中用到的引物见表1。
如图1所示，通过下述方法构建鸟苷生产菌株：
(1)底盘菌改造：
异源表达了来源于B.subtilis168的嘌呤操纵子pur(EKBCSQLFMNHD)基因，并由Trc启动子控制；
敲除了鸟苷激酶gsk基因；
敲除了嘌呤核苷酸合成抑制因子purR基因；
（2）弱化鸟苷分解的基因转录强度：
敲除嘌呤核苷磷酸化酶deoD、xapA基因，保留了其功能相同的yfiH、yaiE基因；
（3）调整嘌呤核苷酸合成途径以及鸟苷合成途径的基因转录强度：
利用Trc启动子强化嘌呤核苷酸合成途径中的关键酶合成基因prsA *、purF * 基因，可以较好的增强嘌呤核苷酸合成途径的基因转录强度；利用T7启动子强化鸟苷合成关键酶合成基因guaB、guaA、surE基因转录强度，能有力增强嘌呤核苷酸代谢途径重要中间产物肌苷酸流向鸟苷的基因转录强度。
关于启动子强度具体可参考文献（Tegel, Hanna, Jenny Ottosson, and SophiaHober. "Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with astrong promoter."The FEBS journal278.5 (2011): 729-739.）。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.），本发明涉及到的专业名词，若无特别备注，均可在该文章中得到解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
引物名称 序列号 引物序列（5’-3’）
pGRB-yjiV-S SEQ ID NO.15 AGTCCTAGGTATAATACTAGTATCCCGCATTTCTTAAAGTCGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-yjiV-A SEQ ID NO.16 TTCTAGCTCTAAAACGACTTTAAGAAATGCGGGATACTAGTATTATACCTAGGACT
yjiV-U-S SEQ ID NO.17 GTGCTGGAGGGATGATTGTTGG
yjiV-U-EKB-A SEQ ID NO.18 GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACGCAGTACTTCCTGCTGGCT
EKB-S SEQ ID NO.19 GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCAGCCGCTAGTAGGAATCATCA
EKB-A SEQ ID NO.20 GGTATAGTGAACGCCGGTAATTCGCCTAGAAGAAATCAACCAGCGCACTATGCTAAACCTAAACGTTCAAAGATCAG
yjiV-D-EKB-S SEQ ID NO.21 CTGATCTTTGAACGTTTAGGTTTAGCATAGTGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGCGAATTACCGGCGTTCACTATACC
yjiV-D-A SEQ ID NO.22 TCACCTCCACCAGCACATCC
pGRB-1-S SEQ ID NO.23 CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGC
pGRB-1-A SEQ ID NO.24 GCCCCAAGGGGTTATGCTAGCCTACAAATTGAGTTATGTTCATTTAAATATGATGTTGTTCAG
EKB-U-S SEQ ID NO.25 GGTTCATCTGCAATGCCGC
EKB-U-A SEQ ID NO.26 GAAGAAGCCGCTAAAAGCTTCTTCTATGCTAAACCTAAACGTTCAAAGATC
CSQ-S SEQ ID NO.27 GATCTTTGAACGTTTAGGTTTAGCATAGAAGAAGCTTTTAGCGGCTTCTTC
CSQ-A SEQ ID NO.28 CCTACAAATTGAGTTATGTTCATTCAAGCAGTAGTGACATGAGTTTCC
yjiV-D-CSQ-S SEQ ID NO.29 ATGAACATAACTCAATTTGTAGGCGAATTACCGGCGTTCACTATA
pGRB-4-S SEQ ID NO.30 ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACT
pGRB-4-A SEQ ID NO.31 AGTTGCTGGATTACTATGACCCTAGAAGAAATCAACCAGCGCATCAGAAAGTCTCCTGTGCAT
CSQ-U-S SEQ ID NO.32 GAGGATTTTCTTACGGCGATTACT
CSQ-U-A SEQ ID NO.33 TCAAGCAGTAGTGACATGAACAATTTAAGACCGTCGGC
L-S SEQ ID NO.34 GCCGACGGTCTTAAATTGTTCATGTCACTACTGCTTGA
L-A SEQ ID NO.35 CCATAATTATTGCGGATATTCCTTTAAGCCTTTGATTTCAGCAAGCAT
yjiV-D-L-S SEQ ID NO.36 AGGAATATCCGCAATAATTATGGCGAATTACCGGCGTTCACTATA
pGRB-5-S SEQ ID NO.37 ATGCACAGGAGACTTTCTGAAGGAATATCCGCAATAATTATGGGTCATAGTAATCCAGCAACT
pGRB-5-A SEQ ID NO.38 AGTTGCTGGATTACTATGACCCATAATTATTGCGGATATTCCTTCAGAAAGTCTCCTGTGCAT
L-U-S SEQ ID NO.39 AGATACAGCGCACATTACAACACAG
L-U-A SEQ ID NO.40 TTAAGCCTTTGATTTCAGCAAGCAT
FMN-S SEQ ID NO.41 ATGCTTGCTGAAATCAAAGGCTTAA
FMN-A SEQ ID NO.42 CCTAGAAGAAATCAACCAGCGCATCATGCCTTTTCACCTCTGTTATT
yjiV-D-FMN-S SEQ ID NO.43 TGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGCGAATTACCGGCGTTCACTATA
FMN-U-S SEQ ID NO.44 GAAGGAGGAGAACTGGGATGC
FMN-U-A SEQ ID NO.45 GCACGTTTAATGGTCATTCATGCCTTTTCACCT
HD-S SEQ ID NO.46 AGGTGAAAAGGCATGAATGACCATTAAACGTGC
HD-A SEQ ID NO.47 CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTATTTTTGGGCAGCC
yjiV-D-HD-S SEQ ID NO.48 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGAATTACCGGCGTTCACTATA
pGRB-mbhA-S SEQ ID NO.49 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGTGATGTGAATGAGAAAAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-mbhA-A SEQ ID NO.50 TTCTAGCTCTAAAACTTTTCTCATTCACATCACGCACTAGTATTATACCTAGGACT
mbhA-U-S SEQ ID NO.51 GCCAGCACGAACATAATCCC
mbhA-U-A SEQ ID NO.52 TCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGACCCTATAGTGAGTCGTATTACACGGTGGCAGGTTTTGG
guaB-S SEQ ID NO.53 ATAGGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCTACGTATCGCTAAAGAAGCTC
guaB-A SEQ ID NO.54 AGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTCAGGAGCCCAGACGGTAGTT
mbhA-D-S SEQ ID NO.55 ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGGACCAAAAGTGCGTCCGATAC
mbhA-D-A SEQ ID NO.56 CGGCGTAATCACAAACTGGC
pGRB-yeeL-S SEQ ID NO.57 AGTCCTAGGTATAATACTAGTAACACAGCAATACGGTACGCGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-yeeL-A SEQ ID NO.58 TTCTAGCTCTAAAACGCGTACCGTATTGCTGTGTTACTAGTATTATACCTAGGACT
yeeL-U-S SEQ ID NO.59 TTCATCGGGACGAGTGGAGATG
yeeL-U-A SEQ ID NO.60 CAAAATTATTTCTAGACCCTATAGTGAGTCGTATTACCATAGCATCGCCAATCTGATCG
guaA-S SEQ ID NO.61 GGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACGGAAAACATTCATAAGCATCGC
guaA-A SEQ ID NO.62 CCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTCATTCCCACTCAATGGTAGCTGG
yeeL-D-S SEQ ID NO.63 CTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGACCCAAAGGTGAAGATAAAGCCAG
yeeL-D-A SEQ ID NO.64 CATTCCCTCTACAGAACTAGCCCTTC
pGRB-ycgH-S SEQ ID NO.65 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATGCGTCTGAACGACCGTGGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-ycgH-A SEQ ID NO.66 TTCTAGCTCTAAAACCACGGTCGTTCAGACGCATAACTAGTATTATACCTAGGACT
ycgH-U-S SEQ ID NO.67 TAAACTCGTCAGCGGCACAAC
ycgH-U-A SEQ ID NO.68 CAAAATTATTTCTAGACCCTATAGTGAGTCGTATTAGGTAGGCGTTTCTGTTGATTCTGAA
surE-S SEQ ID NO.69 AGGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGCATATTGCTGAGTAATGATGAC
surE-A SEQ ID NO.70 CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTACCATTGCGTGCCAACTCC
ycgH-D-S SEQ ID NO.71 CTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGGCGTGTCGGATTATCGTTCGAAAG
ycgH-D-A SEQ ID NO.72 GATTCAGGTTGCCATTTACGCCAAG
pGRB-deoD-S SEQ ID NO.73 AGTCCTAGGTATAATACTAGTCGTGAAGTGAACAACGTTCGGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-deoD-A SEQ ID NO.74 TTCTAGCTCTAAAACCGAACGTTGTTCACTTCACGACTAGTATTATACCTAGGACT
deoD-U-S SEQ ID NO.75 TGACGCCACCATCAAAGAGA
deoD-U-A SEQ ID NO.76 CCATTTCCACGCCGAGAAGGTCGCCTGGCATCAAAA
deoD-D-S SEQ ID NO.77 TTTTGATGCCAGGCGACCTTCTCGGCGTGGAAATGG
deoD-D-A SEQ ID NO.78 TGGCAACAAGGCGTGAGAAC
pGRB-xapA-S SEQ ID NO.79 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCTACTGTTCTGCACCAATGGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-xapA-A SEQ ID NO.80 TTCTAGCTCTAAAACCATTGGTGCAGAACAGTAGCACTAGTATTATACCTAGGACT
xapA-U-S SEQ ID NO.81 ATAGCATAATTCCCTATGCCGATCG
xapA-U-A SEQ ID NO.82 AGGCACCACAGACATACCAACATGCGACAGCGTTCTCAATCTG
xapA-D-S SEQ ID NO.83 CAGATTGAGAACGCTGTCGCATGTTGGTATGTCTGTGGTGCCT
xapA-D-A SEQ ID NO.84 CCGCACACACCAGGTGAC
pGRB-gsk-S SEQ ID NO.85 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCATTGCCGAGAATCCGCAGGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-gsk-A SEQ ID NO.86 TTCTAGCTCTAAAACCTGCGGATTCTCGGCAATGAACTAGTATTATACCTAGGACT
gsk-U-S SEQ ID NO.87 TCCAAACATTACTTCCCCGTAAACG
gsk-U-A SEQ ID NO.88 CAGCACCAGATCTACCCAGTCGATAGCAAAGGTACGTTCCCCG
gsk-D-S SEQ ID NO.89 GACTGGGTAGATCTGGTGCTGTG
gsk-D-A SEQ ID NO.90 TTAACGATCCCAGTAAGACTCTTCCAG
pGRB-purR-S SEQ ID NO.91 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCCCAATGGTGGTCATGGACGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-purR-S SEQ ID NO.92 TTCTAGCTCTAAAACGTCCATGACCACCATTGGGAACTAGTATTATACCTAGGACT
purR-U-S SEQ ID NO.93 ACGCTTACACTATTTGCGTACTGG
purR-U-A SEQ ID NO.94 TTCAGGTTCAAAGTCACCCTGCTCGACGCGTTTTTGCGC
purR-D-S SEQ ID NO.95 GCGCAAAAACGCGTCGAGCAGGGTGACTTTGAACCTGAA
purR-D-A SEQ ID NO.96 TCGGCATGTTGTCTGACATGG
pGRB-yeeP-S SEQ ID NO.97 AGTCCTAGGTATAATACTAGTACTGCAGGACGAGCTGCGCAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-yeeP-A SEQ ID NO.98 TTCTAGCTCTAAAACTGCGCAGCTCGTCCTGCAGTACTAGTATTATACCTAGGACT
yeeP-U-S SEQ ID NO.99 AGATGAGTCTGCGCTGGAG
yeeP-U-A SEQ ID NO.100 TTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTTG
prs-1-S SEQ ID NO.101 GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCGTGCCTGATATGAAGCTTTTTGCTG
prs-1-A SEQ ID NO.102 CGTGCAGAGCCACTGTCAG
prs-2-S SEQ ID NO.103 CTGACAGTGGCTCTGCACG
prs-2-A SEQ ID NO.104 CAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGTGTTCGAACATGGCAGAGATC
yeeP-D-S SEQ ID NO.105 CTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGTC
yeeP-D-A SEQ ID NO.106 CCTGTAGCAGGTATTCAGATGTCG
pGRB-gapC-S SEQ ID NO.107 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTACCTCCGCCGAGAAATCGCGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-gapC-A SEQ ID NO.108 TTCTAGCTCTAAAACGCGATTTCTCGGCGGAGGTAACTAGTATTATACCTAGGACT
gapC-U-S SEQ ID NO.109 TGGGAAGAAACCACGAAACTCCA
gapC-U-A SEQ ID NO.110 TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATGTTTCAGCAGGTAGGCGAGAA
purF-1-S SEQ ID NO.111 GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCTTGCTGAAATCAAAGGCTT
purF-1-A SEQ ID NO.112 GCCTGTTGCCTCTGCATAGCCGATCGCCGCTGAAATACTGGAAACCGG
purF-2-S SEQ ID NO.113 CGGCTATGCAGAGGCAACAGGCATTCCGTATGAGCTTGGCTTAATCCAAAACCGTTATGTTGG
purF-2-A SEQ ID NO.114 GTGTCCAAGTGTCAATGCCG
purF-3-S SEQ ID NO.115 CGGCATTGACACTTGGACACAT
purF-3-A SEQ ID NO.116 GATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTATTTGGTTAATACTGCTTCTTTTACGTGAGG
gapC-D-S SEQ ID NO.117 GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATAAAACGGTCGCCTGGTACG
gapC-D-A SEQ ID NO.118 TTATCCGCCGACATTGCTGC
pGRB-yjgX-S SEQ ID NO.119 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGGCCATTGCGGATGGTTAAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-yjgX-A SEQ ID NO.120 TTCTAGCTCTAAAACTTAACCATCCGCAATGGCCAACTAGTATTATACCTAGGACT
yjgX-U-S SEQ ID NO.121 GGAAGTCAACGGGTTATGCGG
yjgX-U-A SEQ ID NO.122 TTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAAAATCACCACGAATACCAGAATCGC
yjgX-D-S SEQ ID NO.123 CTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACAGTGTCTTCCCTGAGCC
yjgX-D-A SEQ ID NO.124 CAGCTTGATGGTATCCTTCGCC
pGRB-ycdN-S SEQ ID NO.125 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGGCATTTCAACAAGATGTGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-ycdN-A SEQ ID NO.126 TTCTAGCTCTAAAACACATCTTGTTGAAATGCCGCACTAGTATTATACCTAGGACT
ycdN-U-S SEQ ID NO.127 GATTTTGACGCCACCAACACC
ycdN-U-A SEQ ID NO.128 GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCAATCCACATCACACAATCCATCG
ycdN-D-S SEQ ID NO.129 GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAAGGGATTTTTGGCTATCAGGAAGC
ycdN-D-A SEQ ID NO.130 CATATCGTATTCGCCAGGCTGT
实施例1
本实施例旨在说明菌株Gus12的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
1.1嘌呤核苷操纵子pur(EKBCSQLFMNHD)基因的整合:
由于在B.subtilis168菌株基因组中嘌呤核苷操纵子pur(EKBCSQLFMNHD)基因全长12804bp，通过分段整合的方法（具体方法参照CN114774341A说明书[0096]段）将其依次整合在基因组yjiV位点，这五段分别为purEKB、purCSQ、purL、purFMN、purHD。
1.1.1基因purEKB的整合：
以B.subtilis168基因组为模板，分别以yjiV-U-S、yjiV-U-EKB-A和yjiV-D-EKB-S、yjiV-D-A，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，以基因组B.subtilis 168为模板，以EKB-S、EKB-A为引物，通过pcr扩增得到目的基因片段；接着，以上游和下游同源臂、目的基因片段为模板，以yjiV-U-S、yjiV-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段，由于引物设计时已将Trc启动子连接到了引物的5’端，因此重叠片段带有Trc启动子，即该重叠片段由“上游同源臂-Trc启动子-目的基因-下游同源臂”组成；以pGRB-yjiVA-s、pGRB-yjiV-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到yjiV-pGRB；制备E.coliW3110电转化感受态细胞，将重叠片段与yjiV-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株Gus01-EKB。
1.1.2基因purCSQ的整合:
具有1.1.1中相同操作方法，不同之处在于，引物设计时不将Trc启动子连接到引物的5’端，所用引物为EKB-U-S、EKB-U-A、CSQ-S、CSQ-A、yjiV-D-CSQ-S、yjiV-D-A、pGRB-1-S、pGRB-1-A。感受态细胞为Gus01-EKB，获得菌株Gus01-CSQ。
1.1.3基因purL的整合:
具有1.1.1中相同操作方法，不同之处在于，引物设计时不将Trc启动子连接到引物的5’端，所用引物为CSQ-U-S、CSQ-U-A、L-S、L-A、yjiV-D-L-S、yjiV-D-A、pGRB-4-S、pGRB-4-A。感受态细胞为Gus01-CSQ，获得菌株Gus01-L。
1.1.4基因purFMN的整合:
具有1.1.1中相同操作方法，不同之处在于，引物设计时不将Trc启动子连接到引物的5’端，所用引物为L-U-S、L-U-A、FMN-S、FMN-A、yjiV-D-FMN-S、yjiV-D-A、pGRB-5-S、pGRB-5-A。感受态细胞为Gus01-L，获得菌株Gus01-FMN。
1.1.5基因purHD的整合:
具有1.1.1中相同操作方法，不同之处在于，引物设计时不将Trc启动子连接到引物的5’端，所用引物为FMN-U-S、FMN-U-A、HD-S、HD-A、yjiV-D-HD-S、yjiV-D-A、pGRB-4-S、pGRB-4-A。感受态细胞为Gus01-FMN，获得菌株Gus01。
2.1过表达guaB基因：
以E.coli W3110基因组为模板，分别以mbhA-U-S、mbhA-U-A;mbhA-D-S、mbhA-D-A;guaB-S、guaB-A为引物，通过PCR扩增得到上、下游同源臂与目的基因片段，再以上游同源臂、下游同源臂与目的基因片段为模板，以mbhA-U-S、mbhA-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段，由于引物设计时已将T7启动子连接到了引物的5’端，因此重叠片段带有T7启动子，即该重叠片段由“上游同源臂-T7启动子-目的基因-下游同源臂”组成；以pGRB-mbhA-s、pGRB-mbhA-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到mbhA-pGRB；制备Gus01电转化感受态细胞，将重叠片段与mbhA-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株Gus02。
3.1过表达guaA基因：
具有2.1中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为yeeL-U-S、yeeL-U-A、guaA-S、guaA-A、yeeL-D-S、yeeL-D-A、pGRB-yeeL-S、pGRB-yeeL-A。感受态细胞为Gus02，获得菌株Gus03。
3.2过表达surE基因：
具有2.1中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为ycgH-U-S、ycgH-U-A、surE-S、surE-A、ycgH-D-S、ycgH-D-A、pGRB-ycgH-S、pGRB-ycgH-A。感受态细胞为Gus03，获得菌株Gus04。
3.3敲除deoD基因：
以E.coli W3110基因组为模板，不同之处在于，分别以deoD-U-S、deoD-U-A和deoD-D-S、deoD-D-A，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以deoD-U-S、deoD-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段，即该重叠片段由“上游同源臂-下游同源臂”组成；以pGRB-deoD-S、pGRB-deoD-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到deoD-pGRB；制备Gus04电转化感受态细胞，将重叠片段与deoD-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株Gus05。
3.4敲除xapA基因：
具有3.3中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为xapA-U-S、xapA-U-A、xapA-D-S、xapA-D-A、pGRB-xapA-S、pGRB-xapA-A。感受态细胞为Gus05，获得菌株Gus06。
3.5敲除gsk基因：
具有3.3中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为gsk-U-S、gsk-U-A、gskA-D-S、gsk-D-A、pGRB-gsk-S、pGRB-gsk-A。感受态细胞为Gus06，获得菌株Gus07。
3.6敲除purR基因：
具有3.3中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为purR-U-S、purR-U-A、purR-D-S、purR-D-A、pGRB-purR-S、pGRB-purR-A。感受态细胞为Gus07，获得菌株Gus08。
3.7过表达prsA * 基因：
以E.coli W3110基因组为模板，分别以yeeP-U-S、yeeP-U-A；yeeP-D-S、yeeP-D-A为引物，通过PCR扩增得到上游同源臂、下游同源臂；以prs-1-S、prs-1-A;prs-2-S、prs-2-A为引物，通过PCR扩增分别得到prs-1、prsA-2片段；再以prs-1、prs-2片段为模板，以prs-1-S、prs-2-A为引物，通过重叠PCR扩增得到目的基因片段；最后以上游同源臂、下游同源臂、目的基因片段为模板，以yeeP-U-S、yeeP-D-A为引物，通过重叠PCR扩增得到重叠片段，由于引物设计时已将Trc启动子连接到了引物的5’端，因此重叠片段带有Trc启动子，即该重叠片段由“上游同源臂-Trc启动子-目的基因-下游同源臂”组成；以pGRB-yeeP-S、pGRB-yeeP-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到yeeP-pGRB；制备Gus08电转化感受态细胞，将重叠片段与yeeP-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株Gus09。
3.8异源表达purF * 基因：
以E.coli W3110基因组为模板，分别以gapC-U-S、gapC-U-A；gapC-D-S、gapC-D-A为引物，通过PCR扩增得到上游同源臂、下游同源臂；以B. subtilis168基因组为模板，再分别以purF-1-S、purF-1-A；purF-2-S、purF-2-A;purF-3-S、purF-3-A为引物，通过PCR扩增分别得到purF-1、purF-2、purF-3片段；再以purF-1、purF-2、purF-3片段为模板，以purF-1-S、purF-3-A为引物，通过重叠PCR扩增得到目的基因片段；最后以上游同源臂、下游同源臂、目的基因片段为模板，以gapC-U-S、gapC-D-A为引物，通过重叠PCR扩增得到重叠片段，由于引物设计时已将Trc启动子连接到了引物的5’端，因此重叠片段带有Trc启动子，即该重叠片段由“上游同源臂-Trc启动子-目的基因-下游同源臂”组成；以pGRB-gapC-S、pGRB-gapC-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到gapC-pGRB；制备Gus09电转化感受态细胞，将重叠片段与gapC-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株Gus10。
3.9二次过表达prsA * 基因：
具有3.7中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为yjgX-U-S、yjgX-U-A、prs-1-S、prs-1-A、prs-2-S、prs-2-A、yjgX-D-S、yjgX-D-A、pGRB-yjgX-S、pGRB-yjgX-A。感受态细胞为Gus10，获得菌株Gus11。
3.10二次异源表达purF * 基因：
具有3.8中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为ycdN-U-S、ycdN-U-A、purF-1-S、purF-1-A、purF-2-S、purF-2-A、purF-3-S、purF-3-A、ycdN-D-S、ycdN-D-A、pGRB-ycdN-S、pGRB-ycdN-A。感受态细胞为Gus11，获得菌株Gus12。
实施例2
本实施例旨在说明鸟苷生产菌株Gus12的5L发酵罐发酵应用，具体步骤为：
①菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养12h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养12h，培养温度：35℃；
②种子培养：培养温度为35℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为35%，当OD600nm为20时达到接种要求；种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母粉4.5g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KH2PO42g/L，(NH4)2SO42.5g/L，FeSO4.7H2O 10mg/L，VB1、VB3、VB5各1mg/L，VH0.5mg/L，其余为水；
③发酵培养：接种量为20%，培养温度为34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养，pH控制在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为35%，通过流加80%（质量体积分数）葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期≤48h。采用的发酵培养基为：酵母粉4.5g/L，蛋白胨1.5g/L，柠檬酸2mg/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO43g/L，MgSO4.7H2O 2g/L，DPF（大豆水解液）1g/L，FeSO4.7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，VB1、VB3、VB5各2mg/L，VH0.3mg/L，其余为水。
以野生型E.coliW3110为对照组，经过48h发酵验证，野生型E.coliW3110未能积累鸟苷，实施例1所述菌株Gus12积累了35g/L鸟苷，证明了该菌株的有效性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种鸟苷生产菌株，其特征在于：以E.coliW3110 ATCC 27325作为出发菌株，经改造后，缺失了deoD、xapA、gsk、purR基因；过表达了guaB、guaA、surE、prsA *基因；异源表达了来源于B.subtilis168的purF * 、pur(EKBCSQLFMNHD)基因，具体来说，敲除了菌株基因组上的deoD、xapA、gsk、purR基因；利用T7启动子分别强化guaB、guaA、surE基因转录强度，并分别整合到基因组mbhA、yeeL、ycgH基因位点；利用Trc启动子强化prsA *基因转录强度，并分别整合到基因组yeeP、yjgX基因位点进行双拷贝；利用Trc启动子强化来源于B.subtilis168的purF * ,并分别整合到基因组gapC、ycdN基因位点进行双拷贝；利用Trc启动子强化来源于B.subtilis168的pur(EKBCSQLFMNHD)基因转录强度，并整合到基因组yjiV基因位点；其中，所述deoD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，xapA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，gsk基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，purR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，guaB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，guaA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，surE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，prsA *基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，purF * 基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，pur(EKBCSQLFMNHD)基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，Trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQID NO.14所示。
2.权利要求1所述鸟苷生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体方法如下：
（1）底盘菌改造：
异源表达了来源于B.subtilis168的嘌呤操纵子pur(EKBCSQLFMNHD)基因，并由Trc启动子控制；敲除了鸟苷激酶gsk基因；敲除了嘌呤核苷酸合成抑制因子purR基因；
（2）弱化鸟苷分解的基因转录强度：
敲除嘌呤核苷磷酸化酶deoD、xapA基因，保留了其功能相同的yfiH、yaiE基因；
（3）调整嘌呤核苷酸合成途径以及鸟苷合成途径的基因转录强度：
利用Trc启动子强化嘌呤核苷酸合成途径中的关键酶合成基因prsA *、purF * 基因，增强嘌呤核苷酸合成途径的基因转录强度；利用T7启动子强化鸟苷合成关键酶合成基因guaB、guaA、surE基因转录强度，增强嘌呤核苷酸代谢途径重要中间产物肌苷酸流向鸟苷的基因转录强度。
3.根据权利要求2所述的鸟苷生产菌株的构建方法，其特征在于：所述yfiH基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，yaiE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示。
4.权利要求1所述鸟苷生产菌株在发酵生产鸟苷方面的应用。
5.根据权利要求4所述的鸟苷生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13 h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：34-35℃；
②种子培养：培养温度为33-35℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30-50%，当OD600nm为15-20时达到接种要求；
③发酵培养：接种量为种子培养基的15-20%，培养温度为33-35℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养，pH控制在6.7±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30-50%，通过流加80%（质量体积分数）葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期≤48h。
6.根据权利要求5所述的鸟苷生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为葡萄糖25-35g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨0.8-1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，KH2PO42-3g/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，FeSO4·7H2O 10-20mg/L，VB1、VB3、VB5各0.8-1.5mg/L，VH 0.5-1mg/L，其余为水。
7.根据权利要求5所述的鸟苷生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤③采用的发酵培养基为：酵母粉3-5g/L，蛋白胨1.5-2.5g/L，柠檬酸1.5-2.5mg/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，KH2PO42-5g/L，MgSO4·7H2O 1.5-2.5g/L，大豆水解液0.8-1.5g/L，FeSO4·7H2O 20-30mg/L，MnSO4 10-15mg/L，VB1、VB3、VB5各2-3mg/L，VH 0.5-0.5mg/L，其余为水。
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