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CN118079006A - 皮肤组合物 - Google Patents

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CN118079006A
CN118079006A CN202410273876.7A CN202410273876A CN118079006A CN 118079006 A CN118079006 A CN 118079006A CN 202410273876 A CN202410273876 A CN 202410273876A CN 118079006 A CN118079006 A CN 118079006A
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CN
China
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col17a1
cells
skin
substance
extract
Prior art date
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Pending
Application number
CN202410273876.7A
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English (en)
Inventor
西村栄美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Edem Ltd
Original Assignee
Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Medical and Dental University NUC filed Critical Tokyo Medical and Dental University NUC
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Abstract

本发明涉及提供促进皮肤伤口愈合的方法和用于促进皮肤伤口愈合的组合物，对预防或改善溃疡和褥疮有用的方法或组合物，抑制皮肤老化的方法和用于抑制皮肤老化的组合物，对预防或改善抗癌剂引起的皮肤损伤有用的方法或组合物，及增强表皮干细胞再生能力的方法和增强表皮干细胞再生能力的组合物。更具体地说，本发明涉及使用一种组合物，其特征包括选自,诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质、抑制细胞中COL17A1降解的物质、促进表皮干细胞竞争扩增能力的物质、抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质、以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成的群组的物质作为有效成分，以促进皮肤伤口愈合，防止抗癌药物，抑制皮肤老化，并增加表皮干细胞的再生能力。

Description

皮肤组合物
本申请为2020年3月26日递交的申请号为202080038284.7并且发明名称为《皮肤组合物》的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及对皮肤有有益影响的组合物。具体地，它涉及到对皮肤伤口愈合有加速效应，对皮肤老化有抑制作用和/或对表皮干细胞再生能力有增强作用的组合物。更具体地，本发明还特别涉及到药物组合物、化妆品组合物和美容保健品领域。
背景技术
动物器官/组织的老化是一个多阶段的过程，导致其结构和功能下降。虽然细胞衰老和/或干细胞耗损与细胞动态有关，但耗损/受压细胞的确切命运并不详细。一般来说，在衰老过程中，对构成组织/细胞器的细胞的体内动态知之甚少。以前对哺乳动物毛囊(皮肤小器官)的研究已经证明了干细胞衰老在毛囊衰老过程中的核心作用，以及存在一个“以干细胞为中心的器官老化程序”，导致与年龄有关的毛囊小型化，从而导致与年龄有关的头发稀疏和变白。(非专利文件1，专利文件2)。这提出了一个新的基本问题：是否存在一个独特的衰老程序来管理如皮肤的大型固体器官(器官)的细胞衰老动态。
细胞竞争的现象主要在果蝇中被报道，它可以消除在胚胎发育和癌症发展过程中出现在上皮组织中的不适当的突变细胞。已知干细胞在一些上皮组织中进行“中性干细胞竞争”，其特点是干细胞的概率性损失和替换，但这究竟是细胞命运的完全随机选择，还是细胞间差异驱动的随机细胞竞争的结果？直到现在，它的实质内容还不明确。在表皮中，表皮干细胞(角质细胞干细胞和表皮基底细胞)的对称细胞分裂(SCD)和不对称细胞分裂(ACD)是平衡的，以维持表皮的平衡状态。然而，细胞竞争在哺乳动物器官的生理平衡和老化以及分层上皮的细胞动态中的具体参与和作用一直不清楚。
随着年龄的增长，人类的皮肤会出现皮肤萎缩(变薄)、脆弱、干燥、异常的色素沉淀和延迟的伤口愈合和刺激。在这个过程中，皮肤失去了表皮和真皮的厚度、表皮突起、表皮角质细胞和功能性真皮成纤维细胞的储存。人类老化皮肤的脆弱性部分归因于真皮-表皮交界处的重塑，特别是血浆(HD)部分(连接上皮细胞和基底膜外基质的结构)。事实上，已经有报道称人类老化的皮肤中，如XVII型胶原蛋白(COL17A1/BP180/BPAG2/17型胶原蛋白)等HD成分的不稳定。此外，COL17A1基因的缺失导致良性全身性萎缩性表皮松解症(GABEB)，这是一种罕见的交界性表皮松解症(JEB)，其特点是相对温和的皮肤脆弱、萎缩、皮肤色素异常(多形性皮肤萎缩)和秃头。与该表型一致的是，以前的研究表明，小鼠Col17a1基因缺失会导致伴随毛囊细胞脱落的毛囊衰老(非专利文件2、专利文件1)。然而，COL17A1在表皮干细胞中的表达与健康皮肤中常见的年龄相关特征(皮肤萎缩、脆弱、屏障功能降低、色素异常、脱发等)之间的关系尚不清楚。在表皮干细胞中COL17A1的表达在维持皮肤年轻、老化和再生(伤口愈合)中的作用，COL17A1表达与干细胞竞争性自我复制能力之间的相关性，以及因COL17A11的干细胞竞争性在维持干细胞质量(年轻)中的作用尚未得到阐明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：2009-161509号专利公布
专利文献2：国际公开小册子WO2017122668
非专利文献
非专利文献1：Matsumura,H.et al.Hair follicle aging is driven bytransepidermal elimination of stem cells via COL17A1 proteolysis.Science 351,aad4395(2016).
非专利文献2：Tanimura et al.,Cell Stem Cell Vol.8,February 2011,pp.177-187.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的之一是提供预防和改善皮肤溃疡的方法和组合物，即促进皮肤伤口愈合。本发明的另一个目的是提供用于减少或预防与癌症治疗有关的皮肤损伤的方法和组合物。本发明的目的之一还在于提供抑制皮肤老化的方法和用于抑制皮肤老化的组合物，以及用于抑制毛囊老化(皮肤的一种附件)的组合物。本发明的另一个目的是提供增强表皮干细胞再生能力的方法，增强表皮干细胞(也可包括毛囊干细胞)再生能力的组合物，以及控制干细胞竞争的组合物和方法。
此外，本发明的目的之一是提供一种筛选能有效地减少或防止与癌症治疗有关的皮肤损伤，促进皮肤伤口愈合，抑制皮肤老化，控制细胞竞争和/或提高表皮干细胞的再生能力的物质的方法。
解决问题的方案
为了利用具有相同遗传和环境背景的小鼠来阐明哺乳动物器官老化的机制，本发明人使用了C57BL6近交系小鼠的尾部皮肤，这些小鼠表现出就像在人类皮肤老化中看到的那样，与年龄有关的皮肤萎缩、脆弱、色素异常和伤口愈合受损。本发明人发现，与COL17A1介导的表皮干细胞增殖有关的表皮细胞竞争动态能维持皮肤的平衡，从而调节皮肤器官的老化。本发明人还对衰老小鼠的表皮干细胞进行了体内细胞命运追踪分析，发现COL17A1high的克隆和COL17A1low的克隆在表皮中的异质性出现，通过COL17A1介导的SCD促进了它们之间的细胞竞争，导致COL17A1low的克隆被排除在外并促进COL17A1high的表皮干细胞克隆的增殖，这与COL17A1low的克隆的消除有关。此外，发明人还表明，表皮干细胞竞争动态介导表皮老化过程，皮肤再生能力下降，表皮黑色素细胞和真皮间质细胞减少，从而调节皮肤器官本身的老化。此外，通过强行维持COL17A1在表皮干细胞中的表达，并保持表皮干细胞的竞争性自我复制能力，本发明人能够防止皮肤老化并改善伤口愈合，证明了COL17A1通过表皮干细胞竞争和异源细胞维持来调节皮肤器官老化。
细胞竞争已被牵涉到不适当的细胞的淘汰，但它在哺乳动物器官老化中的作用在很大程度上是未知的。本发明人弄清表皮干细胞通过HD成分，即XVII型胶原蛋白(COL17A1)的稳定性感知其细胞相容性/压力，以促进皮肤平衡和老化的细胞竞争。体内细胞命运追踪分析，克隆分析法和体外三维模型显示，COL17A1high的表皮干细胞通过依赖COL17A1的对称细胞分裂进行克隆性增殖，从而从皮肤中消除COL17A1low/-耗竭的细胞以维持平衡。本研究结果表明，它们在竞争中的优势扩张最终使其自身的COL17A1水平降至最低，不仅降低了它们的自我复制能力，也降低了邻近表皮黑色素细胞和真皮成纤维细胞的自我复制能力，导致皮肤萎缩、色素异常和伤口愈合不良。此外，强制维持COL17A1在表皮的表达可以挽救皮肤老化的表型。这些发现为治疗性干预开辟了新的途径。本发明以这些发现为基础，具体涉及以下内容。
[1]一种用于促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡或褥疮的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[2]一种用于抑制皮肤老化的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[3]一种用于提高表皮干细胞再生能力的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[4]一种用于预防或改善抗癌药物引起的皮肤损伤的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[5]一种用于抗皱治疗的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[6]根据[5]所述的组合物，其中抗皱是由于以下组中的至少一种：皮肤弹性的改善，角质层功能的改善，皮肤保湿能力的改善，以及皮肤屏障功能的改善。
[7]一种用于抗斑的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[8]一种用于改善粗糙皮肤的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的组合物，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质进一步维持表皮干细胞的自我复制能力。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的组合物，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质选自以NADPH氧化酶抑制剂、COX抑制剂、iNOS抑制剂、ROCK抑制剂和雌激素类物质所组成的群组。
[11]根据[10]所述的组合物，其中所述NADPH氧化酶抑制剂选自以夹竹桃麻素、依布硒啉、二亞苯基碘(DPI)、GKT137831、AEBSF、GK-136901、ML171、辅酶Q10(CoQ10)、VAS2870和VAS3947所组成的群组。
[12]根据[10]所述的组合物，其中所述COX抑制剂选自以塞来昔布、地拉考昔、托芬那酸、尼氟酸、FR122047、LM-1685、SC-791、BTB02472、尼美舒利、SPB04674、姜黄素、双氯芬酸、4’-羟基双氯芬酸、DuP-697、依布硒啉、ETYA、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、美洛昔康、NPPB、NS-398、紫檀芪、白藜芦醇、SC-560、SKF-86002、TXA(氨甲环酸)、TXC(十六烷基氨甲环酸盐酸盐)、胡萝卜提取物和硫化舒林酸所组成的群组。
[13]根据[10]所述的组合物，其中所述iNOS抑制剂选自以1400W、L-NIL、氨基胍、BYK190123、S-乙基异硫脲、S-甲基异硫脲、S-氨基乙基异硫脲、2-亚氨基哌啶、丁胺、ONO-1714((1S,5S,6R,7R)-7-氯-3-亚氨基-5-甲基-2-氮杂双环[4.1.0]庚烷盐酸盐)、AMT盐酸盐(2-氨基-5，6-二氢-6盐酸盐)、AR-C102222、L-NG-硝基精氨酸、L-NG-单甲基精氨酸、L-硝基精氨酸甲酯、L-NIO、地塞米松、雌激素、虾青素和芹菜素所组成的群组。
[14]根据[10]所述的组合物，其中所述ROCK抑制剂选自以Y-27632、利帕舒地尔(K-115)、噻唑啉(Thiazovivin)、法舒地尔(HA-1077)、GSK429286A、RKI-1447、GSK269962、奈达舒地尔(AR-13324)、Y-39983、ZINC00881524、KD025、羟基法舒地尔(HA-1100)、GSK180736A和AT13148所组成的群组。
[15]根据[10]所述的组合物，其中所述雌激素类物质选自以雌激素、炔雌醇、生物链素A、大豆提取物、异黄酮、射干根提取物和葛根提取物所组成的群组。
[16]根据[1]至[9]中任一项所述的组合物，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质选自以夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物、山楂提取物和胡萝卜提取物所组成的群组。
[17]根据[1]至[9]中任一项所述的组合物，其中所述抑制细胞中COL17A1降解的物质选自以中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE)抑制剂和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂所组成的群组。
[18]根据[17]所述的组合物,其中所述ELANE抑制剂选自以西伯利亚特钠水合物(N-{2-[4-(2,2-二甲基丙酰氧基)-苯磺酰氨基]苯甲酰基}氨基乙酸单钠四水合物)，ONO-6818(2-(5-氨基-6-氧代-2-苯基嘧啶)-N-[2-(5-叔丁基-1,3,4-恶二唑-2-基)-1-(甲基乙基)-2-氧代乙基]乙酰胺、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、德贝斯特(Depelestat)、NEI-L1(三氟化钠异丙基氧丙基氨甲酰吡咯烷碳酰甲基丙基氨甲酰氨基乙酸酯)，抗ELANE的抗体、针对编码ELANE的基因的siRNA和针对编码ELANE的基因的反义寡核苷酸所组成的群组。
[19]根据[17]所述的组合物，其中所述MMP抑制剂选自以马利马斯塔特(Marimastat)、巴蒂玛斯塔特(Batimastat)、PD166793、Ro32-3555、WAY170523、UK370106、TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4所组成的群组。
[20]根据[1]至[9]中任一项所述的组合物，其中所述基因组应激是由于紫外线、辐射或抗癌药物引起的DNA损伤压力，或与细胞分裂有关的复制压力。
[21]根据[2]的组合物，其中所述皮肤老化是由以下(a)至(f)组成所组成的群组中的至少一个:
(a)表皮、真皮和/或脂肪组织变薄、变弱、萎缩或张力下降,
(b)表皮屏障功能降低或皮肤干燥,
(c)基底膜上的半球形体减少或不成熟,
(d)真皮层上部的成纤维细胞丧失，或因皮肤干燥而出现皱纹或细,
(e)由于真皮层的胶原蛋白流失而形成的皱纹和
(f)斑点、老年性色素沉着或脱色斑。
[22]根据[2]所述的组合物，用于减少皱纹。
[23]根据[1]至[22]中的任一项所述的组合物，是一种药物组合物。
[24]根据[1]至[23]中任一项所述的组合物，含有一种药学上可接受的赋形剂。
[25]根据[1]至[24]中任一项所述的组合物，是一种应用剂。
[26]根据[1]至[22]中任一项所述的组合物，是一种化妆品组合物。
[27]根据[26]所述的化妆品组合物，其含有0.01至15％(重量)的有效成分。
[28]根据[26]或[27]所述的化妆品组合物，是一种用于皮肤护理的组合物。
[29]根据[26]至[28]中任一项所述的化妆品组合物，进一步包括以下至少一项：皮肤抗衰老剂、肤色调节剂、抗炎剂和防晒剂。
[30]一种筛选有效促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡、抑制皮肤老化、控制细胞竞争、提高表皮干细胞的再生能力、预防或改善抗癌药物引起的皮肤损伤、抗皱和/或改善皮肤粗糙的物质的方法，该方法包括:
(i)在体外使细胞与试验物质接触，
(ii)测量细胞中COL17A1的表达，和
(iii)确定试验物质是否能上调COL17A1的表达。
[31]一种以细胞中COL17A1的表达为指标的评估皮肤老化的方法。
[32]一种用于评估皮肤老化的方法的试剂盒，含有COL17A1抗体或编码COL17A1基因的探针或用于扩增该基因的引物。
[33]一种以细胞中COL17A1的表达为指标的评估表皮干细胞的方法。
[34]一种用于评估表皮干细胞的方法的试剂盒，含有针对COL17A1的抗体或针对编码COL17A1基因的探针或用于扩增该基因的引物。
[35]一种根据细胞中COL17A1的表达情况对表皮干细胞进行分类的方法。
[36]一种用于分选表皮干细胞的方法的试剂盒，含有COL17A1的抗体或编码COL17A1的基因的探针或扩增该基因的引物。
[37]一种扩增表皮干细胞和/或表皮细胞的方法，该方法包括使用针对COL17A1的抗体或针对编码COL17A1的基因的探针或扩增该基因的引物测量COL17A1的表达水平，并选择具有COL17A1高表达水平的表皮干细胞。
[38]用于扩增表皮干细胞和/或表皮细胞方法的试剂盒，含有COL17A1的抗体或编码COL17A1的基因的探针或扩增该基因的引物。
[39]功能性食品或美容补充剂，其特征在于，含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[40]根据[38]所述的功能性食品或美容补充剂，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质选自以NADPH氧化酶抑制剂、COX抑制剂、iNOS抑制剂、ROCK抑制剂和雌激素类物质所组成的群组。
[41]根据[39]或[40]所述的功能性食品或美容补充剂，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质选自以夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、虾青素、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物、山楂提取物和胡萝卜提取物所组成的群组。
[42]根据[39]至[41]中任一项所述的功能性食品或美容补充剂，用于口服。
[43]根据[39]至[42]中任一项所述的功能性食品或美容补充剂，其形式为片剂、粉末、半固体、果冻或液体。
[44]根据[39]至[43]中任一项所述的功能食品或美容补充剂，进一步包括以下至少一种：皮肤抗衰老剂、维生素、胶原蛋白和矿物质。
[45]一种含有表达COL17A1的分离细胞的细胞组合物。
[46]根据[45]所述的细胞组合物，其中所述细胞是表皮角质细胞或粘膜上皮角质细胞。
[47]根据[45]或[46]所述的细胞组合物，用于移植。
[48]根据[45]至[47]中任一项所述的细胞组合物，用于治疗皮肤的疾病或伤害。
[49]根据[45]至[48]中任一项所述的细胞组合物，含有至少1×103个细胞。
[50]根据[45]至[49]中任一项所述的细胞组合物，其中至少50％的细胞表达COL17A1。
[51]根据[45]至[50]中任一项所述的细胞组合物，其中所述细胞是干细胞衍生的细胞。
[52]根据[45]至[51]中任一项所述的细胞组合物，其中所述细胞被冷冻。
[53]根据[45]至[52]中任一项所述的细胞组合物，其中所述细胞被装在一个容器中。
[54]根据[45]至[53]中任一项所述的细胞组合物，其中所述细胞是用诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质处理过的细胞。
[55]根据[53]的细胞组合物，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质选自以NADPH氧化酶抑制剂、COX抑制剂、iNOS抑制剂、ROCK抑制剂和雌激素类物质所组成的群组。
[56]根据[54]或[55]所述的细胞组合物，其中所述诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质选自以夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、虾青素、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物和山楂提取物所组成的群组。
[57]含有[45]至[56]中任一项所述的细胞组合物的细胞片。
[58]一种用于控制细胞竞争的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
[59]通过对角质细胞进行三维培养来评估细胞竞争的方法。
[60]一种用于评估角质细胞竞争的方法的试剂盒，含有角质细胞和三维培养装置。
附图说明
图1显示了年轻(7-8周龄，n＝50)和年老(22-25月龄，n＝50)小鼠尾部的HD和基底膜成分、COL17A1、ITGA6、PLECTIN、ITGB4、COL7A1和ITGB1的荧光强度的量化图。COL17A1和PLECTIN的表达在老年皮肤中明显减少。
图2示出了量化年轻(8周龄，n＝3)和年老(22月龄，n＝3)小鼠尾部基底细胞中基底膜HD的数量的图表。生理上的老化明显减少了尾部基底细胞中HD的数量。
图3显示了量化老龄化期间尾部表皮整装片图像中单色克隆的面积(μm2)(左)和数量(右)的图表(4.5月龄，n＝5张图像；15月龄，n＝4张图像；24月龄，n＝7张图像)。
图4示出了年轻(11周龄)和年老(28个月龄)经塔莫西芬(TAM)处理的Epi-Confetti小鼠的尾部基底角质细胞中COL17A1的免疫染色图像。
图5显示了图4中多个区域的角质细胞COL17A1强度和克隆大小的分布量化图(11周龄，n＝13个克隆；28个月龄，n＝12个克隆)。
图6显示了对照组(Cont)小鼠(D2，n＝4；D28，n＝5)和Col17a1 cKO小鼠(D2，n＝3；D28，n＝5)在TAM给药后第2天(D2)和第28天(D28)的漂浮克隆进行量化的图表。
图7显示了年轻(7周龄，n＝3)和年老(25个月龄，n＝3)小鼠的尾部表皮角质细胞的菌落形成。菌落的数量和大小随着年龄的增长而明显减少。
图8显示了野生型(8周龄，n＝3)和hCOL17A1 tg(8周龄，n＝3)小鼠的尾部表皮角质细胞的菌落形成的分析图表。hCOL17A1 tg的表达明显增加了原生尾部表皮角质细胞的菌落数量和大小。
图9显示了随年龄增长的色素细胞变化的图表。与年龄有关的表皮色素细胞的损失导致皮肤的色素异常(混合沉积和损失)(左、中)，但强制维持COL17A1可维持色素细胞并抑制色素异常(右)。
图10显示了显示野生型和hCOL17A1tg中PDGFRa+细胞数量的图表。图中显示了随着年龄的增长，基底膜(BM)下面的PDGFRa+细胞的减少(左)以及通过强制维持COL17A1对其的抑制(右)。
图11显示了在第0天(D0)、第14天(D14)和第21天(D21)未修复的伤口面积的量化图表。生理老化(左)或Col17a1或Itga6的缺乏(右)显著减缓了伤口修复。
图12显示了在第0天(D0)、第14天(D14)和第21天(D21)未修复的伤口面积的量化图表。hCOL17A1的表达(左)和夹竹桃麻素或Y-27632的处理(右)明显加速了伤口修复。
图13显示菌落形成试验结果的图表。与对照组(Cont)相比，Y-27632处理(左)的菌落数量(n＝3孔)明显增加。Y-27632或夹竹桃麻素处理后，直径>2毫米的菌落数量(n＝3孔)也明显增加(右)。
图14显示菌落形成试验结果的图表。与对照组(Cont)相比，用Y-27632或夹竹桃麻素处理后，前五个菌落的平均大小(n＝3孔)明显增加。
图15显示COL17A1表达的HCS分析图(对应于COL17A1介导的竞争性自我复制增强剂的筛选步骤1)，显示与对照组相比，在HCS中用夹竹桃麻素或依布硒啉处理可显著提高COL17A1水平。
图16显示分析菌落形成试验结果的照片和图表(对应于筛选COL17A1表达介导的竞争性自我复制增强剂的步骤2)。与对照组相比，用夹竹桃麻素或依布硒啉处理导致每孔的菌落数量和面积显著增加。
图17显示抗癌药物和各种压力使COL17A1的表达减少。上图：连续服用羟基脲(HU)3个月后，COL17A1在C57BL/6小鼠皮肤中的表达的免疫染色图像。中左图：紫外线照射24小时后，在HaCaT细胞中COL17A1的量的西方蛋白印迹图像。中间图：照射72小时后，在HaCaT细胞中COL17A1的量的西方蛋白印迹图像。中右图：用过氧化氢处理24小时后，在HaCaT细胞中COL17A1的量的西方蛋白印迹图像。下图：用EGF受体抑制剂(PD168393)处理的HaCaT细胞中COL17A1的量的西方蛋白印迹图像。
图18显示通过COL17A1的过度表达改善抗癌药物引起的皮肤损伤。
图19显示通过表皮干细胞的竞争性扩增剤而改善由抗癌药物给药引起的皮肤损伤的图表。左图：显示用EGF受体抑制剂(厄洛替尼)连续治疗7周大的C57BL/6小鼠后第12天的TEWL。右图：显示用EGF受体抑制剂(厄洛替尼)连续治疗6个月大的C57BL/6小鼠后第7天的TEWL。
图20显示在老年小鼠上颈背皮肤诱发的皮肤病模型(干性湿疹和脱发)中，夹竹桃麻素的预防和治疗作用。
图21示出的柱状图显示了促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质对紫外线照射下的角质层水含量的保持(上)和TEWL增加的抑制(下)的影响。
图22示出的柱状图显示了表皮干细胞的竞争性扩增剤对紫外线照射表皮干细胞引起的TEWL增加的抑制作用(上)和对皮肤弹性损失的改善作用(下)。
图23显示长期连续应用表皮干细胞的竞争性扩增剂和比较剂后增进皮肤弹性的图(上)。柱状图显示长期连续应用表皮干细胞竞争性扩增剤和比较剂后表皮干细胞的TEWL的图(下)。被称为抗皱剂的视黄醇，长期应用会显著增加TEWL。另一方面，促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质的TEWL值与对照组没有明显差异，这表明它们在保持皮肤屏障功能的同时改善了皮肤的弹性。
图24示出表皮干细胞的竞争性扩增剂和比较剂对紫外线照射引起的皱纹的改进作用的高分辨率摄影图像，以及皱纹的染色图像(上)和显示皱纹总体积(mm3)和总皱纹平均深度(μm)的柱状图。
图25示出长期应用表皮干细胞的竞争性扩增剤后表皮干细胞的TEWL的柱状图。被称为抗皱剂的视黄醇，在长期应用后会显著增加TEWL。另一方面，促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质的TEWL值与对照组没有明显差异，这表明它们具有改善皱纹的能力，同时保留了皮肤的屏障功能。
图26示出的柱状图显示促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质和比较剂对改善紫外线照射引起的皮肤弹性的减少的作用。
图27示出的高分辨率摄影图像以及皮肤纹理的染色图像显示了表皮干细胞的竞争性扩增剤(夹竹桃麻素)对SDS诱发的皮肤粗糙度的改善作用。图中显示了Ra(算术平均粗糙度)和Rz(十点平均粗糙度)，它们是衡量皮肤表面粗糙度的指标。
图28显示一种促进表皮干细胞竞争能力的物质(夹竹桃麻素)对SDS诱发的TEWL增强的抑制作用的柱状图。
图29示出的高分辨率摄影图像以及皮肤纹理的染色图像显示了表皮干细胞的竞争性扩增剤(依布硒啉)对SDS诱发的皮肤粗糙度的改善作用。图中显示了Ra(算术平均粗糙度)和Rz(十点平均粗糙度)，它们是衡量皮肤表面粗糙度的指标。
图30显示促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质(依布硒啉)对SDS诱发的TEWL增强的抑制作用的柱状图。
图31显示表皮干细胞的竞争性扩增剤(夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布)对SDS诱发的原发性刺激性的皮肤损伤(皮肤粗糙)和色素沉着的影响的照片。SDS处理产生了强烈的发红和干燥，通过应用表皮干细胞的竞争性扩增剤，这种情况明显减少。在SDS治疗开始后的第16天，使用夹竹桃麻素的区域已经愈合，而对照组则出现了色素沉着。
图32示出的高分辨率摄影图像以及皮肤纹理的染色图像显示了表皮干细胞的竞争性扩增剤(夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布)对SDS诱发的人类皮肤粗糙的改善作用。图中显示的“ΔRz”和“ΔRy”是减去测量日对照组的Ry(最大高度)和Rz(十点平均粗糙度)的值，它们是衡量皮肤表面粗糙度的指标。
图33显示表皮干细胞的竞争性扩增剤(夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布)对SDS诱发的人类皮肤粗糙有关的TEWL增强的抑制作用的图表。图中的误差条表示S.D.(标准偏差)。
具体实施方式
如以上描述的，本发明人发现COL17A1(十七型胶原蛋白)参与皮肤老化和再生，并确定了一种对促进皮肤伤口愈合、抑制皮肤老化、控制细胞竞争和提高表皮干细胞再生能力有用的成分。下面将对本发明进行详细描述。
皮肤伤口愈合
皮肤伤口的发生有多种原因，包括外伤、割伤、烧伤、血液循环不良、褥疮引起的溃疡和糖尿病，这些原因会暂时损害皮肤的正常功能和结构。如果身体无法愈合这些伤口，它们就会变成慢性的，并最终被感染。皮肤伤口可分为急性皮肤伤口和慢性皮肤伤口。急性皮肤伤口是指那些伤口愈合过程正常的伤口，如新鲜的创伤和手术伤口，而慢性皮肤伤口是指那些正常的伤口愈合过程由于某种原因而不能发挥作用的伤口。导致慢性皮肤伤口愈合时间延长的原因主要有两个：如基础疾病的系统性因素和局部因素。1％的患者会出现慢性皮肤伤口，其中一半的伤口不能完全愈合。
皮肤是人体中最大的器官，作为与外界的天然屏障，保护里面所组成的群组织免受磨损和感染。皮肤一般分为三层：表皮层、真皮层和皮下组织。表皮是最外层，包含角质细胞(角质形成细胞)以及黑素细胞(色素细胞)。角质细胞形成表皮，表皮是多层次的，覆盖在身体的外表面。黑色素细胞分布在表皮的基底层，为周围的角质细胞提供黑色素色素。色素细胞的分布、黑色素色素的数量和黑色素的类型决定了皮肤的颜色。
表皮从最深又分为四层：基底层(基底细胞层)、棘层(棘状细胞层)、颗粒层(颗粒细胞层)和角质层(角质细胞层)。基底层是含有角质细胞的干细胞，由一层基底细胞组成的。基底层有桥粒、间隙连接(缝隙连接)和半桥粒作为结构，与邻近的细胞和基底细胞下的基底膜连接。棘层由五至十层组成。在这一层中，细胞似乎是通过棘刺相互连接的，因此被称为刺状细胞。颗粒层由两层或三层组成。它之所以被称为棘层，是因为它含有嗜碱性的、富含聚丝蛋白原的角质蛋白颗粒。角质层也被称为角质层，由大约10层组成。去核、死亡的角质形成细胞变成膜状并分层，就好像它们被落叶覆盖一样。掌心和足底的灵芝层极为厚实，正下方有一层透明层(stratum lucidum)。角质细胞的细胞质充满聚集的角蛋白纤维。此外，毛囊和汗腺持续存在于表皮中，它们作为皮肤的附件生长毛发并排出汗液。
存在于表皮基底层的表皮干细胞成为表皮再生的驱动力，相对于基底膜进行水平分裂的均匀分裂或因垂直分裂而均衡分裂的不均匀分裂。然后，它通过自我复制向皮肤表面提供分化的表皮角质细胞来维持表皮的构建。角质细胞构成了表皮中大多数的细胞。在皮肤表面的角质层中发现的细胞几乎都是死细胞，当这些死细胞脱落时，它们会被来自下层的新角质细胞所取代。这个过程不断重复，整个皮肤表面在15至30天内得到更新。
表皮层下面是基底膜，它将表皮层与下面的真皮层分开。真皮层由成纤维细胞、血管、免疫细胞、皮肤附件(毛囊、汗腺)和支持这些细胞的细胞外基质组成。血管滋养皮肤，免疫细胞保护皮肤，成纤维细胞产生胶原蛋白使其具有强度，弹性蛋白使其具有弹性。
在皮肤的最深处是皮下组织。皮下组织是真皮层下的一层脂肪，作为底层肌肉和骨骼的另一道屏障，吸收冲击并保护它们免受感染。
当皮肤的表皮层被创伤、感染、抗癌药物、与年龄有关的皮肤萎缩、屏障功能的破坏或其他皮肤疾病破坏时，就会形成伤口，而且伤口的严重程度会随着皮肤底层的受损而增加。伤口的正常愈合包括炎症、增殖和重塑的三个步骤。炎症持续约四天。在此期间发生的主要事情是纤维蛋白基质的形成和血凝块的形成以覆盖和保护伤口。在增殖期，炎症信号吸引了许多类型的细胞到伤口。这些被吸引的细胞包括成纤维细胞和血管内皮细胞。成纤维细胞产生胶原蛋白，也可以转变为肌成纤维细胞，可以关闭伤口。血管内皮细胞在伤口周围创建新的血管。这些细胞活动导致在血凝块下方形成一种称为“肉芽组织”所组成的群组织。肉芽组织是作为对组织损伤的修复和炎症反应而产生的新组织，由新血管、结缔组织、成纤维细胞和炎症细胞组成。然后，表皮再生从缺损周围的表皮和皮肤附件开始，角质形成细胞从伤口边缘移动到伤口，也从毛囊底部移动。在没有残留附件的深层皮肤缺损中，表皮在创面被肉芽组织替代后从周围延伸。角质形成细胞在肉芽组织上分裂并将表皮聚集在一起。在重塑阶段，这个过程不断发生，随着表皮角化细胞从伤口周围或从剩余附件迁移，表皮恢复，角质细胞和成纤维细胞是新形成的基底膜基质蛋白产生，与表皮和真皮再生。
如果损伤从深层真皮延伸到脂肪组织，例如严重的深层烧伤或割伤，毛囊和汗腺也会被破坏，从而减少可用于修复表皮的角质形成细胞的数量。因此，全层伤口需要更长的时间才能愈合，并且可能需要进行皮肤移植(植皮)、用培养的皮肤(例如表皮片)进行治疗或喷洒表皮角质形成细胞。
用于促进皮肤伤口愈合或用于预防或改善皮肤溃疡或褥疮的组合物
本发明的实施方案之一是促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡或褥疮的组合物，该组合物的特征在于，它含有诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞(表皮干细胞)内DNA损伤(DNA损伤反应或DNA自身损伤)的物质作为有效成分。
诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质
如上其中所述，本发明人通过强行维持COL17A1在表皮干细胞中的表达，成功地防止了皮肤老化，改善或加速了伤口愈合，或防止或改善了皮肤溃疡或褥疮，并表明COL17A1能调节皮肤器官通过表皮干细胞的竞争和异源细胞的维持来实现衰老。本发明人还表明，基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂的马利马斯塔特(Marimastat)能稳定COL17A1，并阻断紫外线诱发的COL17A1的下行抑制。本发明人还发现一种ROCK抑制剂(Y27632)和一种NADPH氧化酶抑制剂(夹竹桃麻素)是在体外维持或诱导COL17A1在角质细胞中表达并促进维持培养的角质细胞自我复制能力的化学品。
此外，本发明人在体外和体内都表明，Y27632(ROCK抑制剂)和夹竹桃麻素(NADPH氧化酶抑制剂)都能显著加速转基因小鼠以及过表达人类COL17A1的转基因小鼠的伤口修复过程。因此，本领域技术人员理解，诱导或维持细胞中COL17A1的表达或抑制细胞中COL17A1的降解的物质可用于促进或改善皮肤伤口愈合，或预防或改善皮肤溃疡或褥疮。此外，可以理解的是，本发明可以利用保持表皮干细胞自我复制能力的物质、抑制细胞中基因组或氧化应激的物质以及抑制细胞中DNA损伤的物质，促进或改善皮肤伤口愈合，或预防或改善皮肤溃疡或褥疮。
COL17A1(十七型胶原蛋白/BP180/BPAG2)是一种跨膜蛋白型的细胞粘附分子，是上皮组织的细胞连接点之一的半桥粒(hemidesmosome)的蛋白质。诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质包括但不限于ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和COX抑制剂。诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质还包括编码COL17A1的DNA或RNA，可使用合适的载体将其引入细胞。
ROCK抑制剂包括但不限于，例如Y27632、噻唑啉(Thiazovivin)、法舒地尔(HA-1077)、GSK429286A、RKI-1447、GSK269962、奈达舒地尔(AR-13324)、Y-39983、ZINC00881524、KD025、利帕舒地尔(K-115)、羟基法舒地尔(HA-1100)、GSK180736A和AT13148。NADPH氧化酶抑制剂包括但不限于，例如夹竹桃麻素、依布硒啉、二亞苯基碘(DPI)、GKT137831、AEBSF、GK-136901、ML171、辅酶Q10(CoQ10)、VAS2870和VAS3947。还包括植物提取物，如含有夹竹桃麻素的罗布麻提取物。
在本发明的植物提取物中罗布麻提取物(商品名：Venetron)、桑葚提取物(商品名：Morus Alba leaf extract powder)、金鸡菊提取物(商品名：Gymnema Sylvestreextract powder)、茶提取物(商品名：Tiacalon 90)、枇杷叶提取物(商品名：EriobotryaJaponica leaf powder)、水飞蓟提取物(商品名：Silybum Marianum extract powder)和黑姜黄提取物(商品名：SIRTMAX)可从Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.获得。圣约翰草种子提取物(商品名：Absorage)、咖啡种子提取物(商品名：Caffenoage)、梧桐叶提取物(商品名：Sakura extract B)、楝树叶提取物(商品名：Neem leaf liquid B)、柑橘皮提取物(商品名：MandarinClear)、薰衣草花提取物(商品名：ecofarm Lavender B)、克拉拉根提取物(商品名：Pharcolex clara B)、米仁提取物(商品名：Pharcolex rice nuka BK)、大麻玫瑰果提取物(商品名：Pharcolex Novara B)、金缕梅叶提取物(商品名：Pharcolex HamamerisB)、桉树叶提取物(商品名：Pharcolex Eucalyptus B)、山楂提取物(商品名：PharcolexHawthorn B)在一丸自然美健有限公司的产品指南中列出。
作为iNOS抑制剂，可以使用选择性iNOS抑制剂，也可以使用非选择性iNOS抑制剂，例如从副作用的观点考虑，优选选择性iNOS抑制剂。
iNOS抑制剂包括但不限于，例如1400W、L-NIL、氨基胍、BYK190123、S-乙基异硫脲、S-甲基异硫脲、S-氨基乙基异硫脲、2-亚氨基哌啶、丁胺、ONO-1714((1S,5S,6R,7R)-7-氯-3-亚氨基-5-甲基-2-氮杂双环[4.1.0]庚烷盐酸盐)、AMT盐酸盐(2-氨基-5，6-二氢-6盐酸盐)、AR-C102222、L-NG-硝基精氨酸、L-NG-单甲基精氨酸、L-硝基精氨酸甲酯、L-NIO、地塞米松、雌激素和虾青素,以及抑制iNOS表达的芹菜素。
COX抑制剂包括但不限于，例如塞来昔布、地拉考昔、托芬那酸、尼氟酸、FR122047、LM-1685、SC-791、BTB02472、尼美舒利、SPB04674、姜黄素、双氯芬酸、4’-羟基双氯芬酸、DuP-697、依布硒啉、ETYA、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、美洛昔康、NPPB、NS-398、紫檀芪、白藜芦醇、SC-560、SKF-86002、TXA(氨甲环酸)、TXC(十六烷基氨甲环酸盐酸盐)、胡萝卜提取物和硫化舒林酸。作为COX抑制剂，可以使用选择性COX抑制剂或非选择性COX抑制剂，但从副作用的观点来看，优选选择性COX-2抑制剂。
类似雌激素的物质包括但不限于雌激素、炔雌醇、生物链素A、大豆提取物、异黄酮、射干根提取物和葛根提取物。
抑制细胞中COL17A1降解的物质
抑制细胞中COL17A1降解的物质包括，例如，中性粒细胞弹性酶(ELANE)抑制剂和MMP抑制剂。
ELANE抑制剂包括但不限于西伯利亚特钠水合物(N-{2-[4-(2,2-二甲基丙酰氧基)-苯磺酰氨基]苯甲酰基}氨基乙酸单钠四水合物；也称为Elaspol)，ONO-6818(2-(5-氨基-6-氧代-2-苯基嘧啶)-N-[2-(5-叔丁基-1,3,4-恶二唑-2-基)-1-(甲基乙基)-2-氧代乙基]乙酰胺、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、德贝斯特(Depelestat；也称为EPI-hNE4或DX-890)、NEI-L1(三氟化钠异丙基氧丙基氨甲酰吡咯烷碳酰甲基丙基氨甲酰氨基乙酸酯)、发酵紫苏叶(JP 2006-61091)、发酵香菜(JP 2006-75085)、发酵甜椒(JP 2006-76926)。发酵欧芹(JP2006-75085)和发酵青椒(JP 2006-76926)等的弹性蛋白酶活性抑制剂。
ELANE抑制剂可以是ELANE的抗体，针对编码ELANE的基因的siRNA，针对编码ELANE的基因的反义寡核苷酸等。MMP抑制剂包括但不限于马利马斯塔特(Marimastat)、巴蒂玛斯塔特(Batimastat)、PD166793、Ro32-3555、WAY170523、UK370106、TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4等。
维持表皮干细胞自我复制能力的物质
本发明人发现，表皮干细胞的维持是通过COL17A1的表达和维持来实现的，并且是基于表皮干细胞的自我复制能力。因此，本发明中维持表皮干细胞自我复制能力的物质可以包括ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和COX抑制剂，以及生长因子和植物提取物，例如夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、虾青素、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物、山楂提取物和胡萝卜提取物等。
这些物质维持或促进表皮干细胞的自我复制能力。在体内或三维表皮培养物中，表达足够数量COL17A1的表皮干细胞竞争性地占据表皮和扩增，与周围COL17A1表达量较低的表皮干细胞竞争。因此，基于COL17A1表达的自我复制能力被称为“竞争性自我复制能力”。例如，表皮干细胞的自我复制能力是指表皮干细胞的竞争性自我复制能力，上述物质可以被称为“表皮干细胞的竞争性扩增剂”。
抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质
本发明人还发现，COL17A1的表达会因各种压力而减少。
本发明中要抑制的压力是基因组应激(基因毒性压力)和氧化应激。基因组应激包括基因毒性压力，如紫外线、辐射压力或抗癌药物引起的DNA损伤，或与细胞分裂有关的复制压力。细胞功能受到DNA破坏性压力和分子靶向药物阻断自我复制信号的双重影响而受损。因此，本领域技术人员理解，抑制细胞中基因组或氧化应激或细胞中DNA损伤的物质可用于促进和改善皮肤伤口愈合。
抑制细胞中DNA损伤的物质
作为抑制DNA损伤的物质，可以使用例如无花果(Sarcandra glabra)取物、中国无忧花(Saraca dives)取物、柘木Cudrania pubescens)取物、落叶松(Taxodium distichum)提取物、墨西哥樱草柳(Ludwigia octovalis)提取物、东京桐(Deutzianthustonkinensis)提取物、紫穗槐(Alchornea trewioides)提取物、多叶草(Berchemiapolyphylla)提取物、算盘子(Glochidion puberum)提取物、檫木(Sassafras tzumu)提取物(参考JP 2008-247854)、奎宁提取物、紫草提取物、咖啡树提取物、决明子提取物、牛蒡提取物、水仙提取物、克拉拉提取物、小球藻提取物、薰衣草提取物、黄芪提取物、玫瑰提取物、羊栖菜提取物、黄柏提取物、夹竹桃提取物、胡萝卜提取物、椴树提取物、黄麻提取物、荷花提取物、茶提取物或秋葵提取物(参考WO2013/031003)。
抑制DNA损伤物质的DNA损伤抑制能力可以用本领域技术人员已知的任何方法进行评估，如COMET试验或检测DNA损伤反应诱发的DNA损伤焦点的试验。作为DNA损伤抑制物质，可以使用促进DNA损伤修复的物质，例如，紫草(Gigartina tenella)提取物(参考JP2006-273761)或奎宁提取物(参考WO2013/031003)。促进DNA损伤修复药剂的DNA损伤修复能力可以用本领域技术人员已知的任何方法进行评估，如宿主细胞重新激活试验(Host-cell reactivation assay)。抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质包括但不限于抗氧化剂、紫外线吸收剂、紫外线散射剂、辐射保护剂和DNA损伤修复促进剂。
用于预防皮肤老化的组合物
本发明的一个实施方案涉及一种用于抑制皮肤老化的组合物，其特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的一个实施方案是特别用于抑制表皮老化的组合物。本发明的一些实施方案是特别用于抑制包含毛囊的皮肤老化的组合物。本发明的一些实施方案也可以是特别用于抑制不包含毛囊的皮肤老化的组合物。
用于抑制皮肤老化的组合物包括上述“用于促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡或褥疮的组合物”一节中描述的活性成分。在本说明书中，在下文中的组合物的活性成分可以以与上述相同的方式施用。
皮肤在隔离个人与外界的作用以及其再生能力随着年龄的增长而下降。皮肤的功能是由表皮基底层的表皮干细胞及其正常分化来维持的。表皮干细胞的正常角质化，其后代垂直于皮肤表面排列，并形成具有一定厚度的层，保持了皮肤的再生能力和作为外界屏障的抗侵蚀和溃疡能力。然而，随着皮肤的老化或经受各种压力，它变得无法履行这些作用，这些变化显示出共同的特点，统称为皮肤老化。
随着年龄的增长，皮肤变得不那么精细，外观也不均匀，出现了细纹和皱纹。表皮的屏障功能弱化和变得干燥，表皮、真皮和/或脂肪组织变得更薄和更脆弱，导致发红、湿疹、溃疡、侵蚀和溃疡。皮肤的色素沉着也变得更加明显。除了因真皮层胶原蛋白流失而产生的皱纹外，表皮、真皮和脂肪组织的变薄(萎缩)、张力下降和脆弱、斑点、老年性色素沉着和脱色是皮肤老化的常见特征。本发明人发现，小鼠和人类皮肤老化的共同特征是组织学上的表皮萎缩，色素细胞减少，基底膜的半桥粒成分减少或不成熟，特别是COL17A1的降低和半桥粒的减少，以及真皮上部的成纤维细胞的损失，由于皮肤干燥而出现的细纹和皱纹，和真皮上部的PDGFRα+间质细胞的数量的减少。
尽管已知COL17A1的丧失导致皮肤脆弱，上述发现可解释老年皮肤容易产生皱纹、糜烂和溃疡。因此，本领域技术人员可以理解的是诱导或维持细胞中COL17A1的表达、抑制细胞中COL17A1的降解、抑制细胞中的基因组应激或氧化应激和/或抑制细胞中的DNA损伤的物质可用于抑制皮肤老化。
本发明的一个实施方案是一种用于对抗下列皮肤老化状况的组合物
(a)表皮、真皮和/或脂肪组织变薄、变弱、萎缩或张力下降
(b)表皮屏障功能降低或皮肤干燥
(c)基底膜上的半球形体减少或不成熟
(d)真皮层上部的成纤维细胞丧失，或因皮肤干燥而出现皱纹或细纹
(e)由于真皮层的胶原蛋白流失而形成的皱纹
(f)斑点、老年性色素沉着或脱色斑
本发明的一个实施方案是一种特别用于抑制皱纹的成分。
本发明的一个实施方案涉及一种用于维持表皮干细胞的再生或竞争性自我复制能力的组合物，其特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。在本说明书的范围内，皮肤老化伴随着表皮变薄，屏障功能降低，干燥，基底膜区减弱，由于真皮中胶原蛋白流失而形成皱纹，表皮、真皮和/或脂质组织变薄、萎缩、张力下降、变弱，斑点或老年性色素沉着的一项或多项。表皮干细胞存在于表皮基底层，提供新的表皮角质细胞，在皮肤代谢中发挥着重要作用，并维持皮肤表面的健康状态。当表皮干细胞因衰老、各种基因组应激、氧化压力或分子靶标快速阻断自我复制信号而变得衰老时，其自我复制的自然能力就会降低，通过最终分化而丧失。
如上其中所述，本发明人表明，与COL17A1介导的表皮干细胞增殖有关的表皮细胞竞争动态维持着皮肤的平衡，从而调节皮肤器官的老化。COL17A1高表达的表皮干细胞具有较高的再生能力。因此，本领域技术人员了解到，通过使用诱导或维持细胞中COL17A1表达、抑制细胞中COL17A1降解、抑制细胞中基因组或氧化应激和/或抑制细胞中DNA损伤的物质，可以增强表皮干细胞的再生能力。通过增强表皮干细胞的再生能力，维持或改善新的表皮角质细胞的供应，可以减少皮肤老化，维持或改善皮肤的表面状况。
抗皱用组合物
本发明的一个实施方案是一种用于抗皱治疗的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。抗皱是选自以改善皮肤弹性、改善角质层功能、改善皮肤保湿能力和改善皮肤屏障功能所组成的群组中的至少一种。
改善皮肤弹性
在本发明中，皮肤弹性指的是机械性能，如灵活性(柔软度)和弹性(被拉伸的皮肤在一定时间内像弹簧一样恢复到原始状态的程度)。皮肤弹性被认为是皮肤年龄的指标之一：湿润、有弹性的皮肤被认为是“柔软”和“结实”。紫外线辐射会影响皮肤弹性的下降，而弹性的下降在暴露紫外线辐射下的部位更为明显，如面部。皮肤弹性也被称为粘弹性，可以用Cutometer MPA580(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)进行定量测量，测量皮肤在受力变形后恢复到原来位置的过程。Cutometer的原理是通过使用一个直径为2毫米的探针对皮肤施加负压，然后释放负压来测量皮肤的回弹，从而测量皮肤的粘弹性。在分析中使用了以下数值，一般来说，数值越大，弹性越好，随着年龄的增长，弹性会下降。
Ur/Uf值(R7)：用最大伸长值(Uf或R0)和松弛时的弹性伸长高度(Ur)表示的弹性指数，它表示皮肤瞬间恢复到最大伸长的速度。
Ur/Ue(R5)：用放松时的弹性伸长高度(Ur)和被探头吸收时的弹性伸长高度(Ue)来表示弹性的量度，它表示皮肤瞬间恢复到最大伸长率，被视为净弹性。
Ua/Uf(R2)：用最大伸长值(Uf)和Ua表示的弹性量度，Ua表示皮肤瞬间恢复到最大伸长值的速度，也称为总弹性；Ua是Uf和R1(第一个测量周期后的残余应变高度)之间的差。
改善角质层功能
角质层功能的改善是指涂抹改善角质层功能的药剂在皮肤上时能表现出增加角质层水分或保留保湿能力，以及抑制外界异物侵入的屏障功能的提高的任何一个效果。
改善皮肤保持水分的能力
在本发明中，“保湿能力”是指对角质含水量的保持，角质含水量越高，保湿能力越强。能够提高皮肤保持水分能力的药剂就是能够保持这些水平的角质水分。
改善皮肤屏障功能
“屏障功能”是指抑制经皮水分的流失，经皮水分蒸发量(TEWL)越小，屏障功能越好。
皮肤屏障功能可以防止体内水分的蒸发和外来物质从外部进入。一般来说，角质层的含水量、TEWL和表皮的厚度被作为皮肤屏障功能和紫外线辐射造成的皮肤损伤程度的指标。改善皮肤屏障功能的药剂是指能够有效地防止水分蒸发或防止外来物质进入体内。
改善皮肤粗糙
健康的皮肤是光滑和滋润的，而粗糙的皮肤则通常被定义为皮肤表面失去光滑度，导致干燥和问题的一种状态。它可以引起表面问题，如粗糙、发红、不平整和瘙痒。众所周知，皮肤粗糙与皮肤屏障功能不佳是密切相关的。出于这个原因，衡量皮肤屏障功能的TEWL被用来定量分析和评估皮肤粗糙的症状。此外，由于角质层表面的粗糙度(不平整度)与皮肤粗糙度一起发生，皮肤粗糙度可以通过ISO标准的皮肤表面粗糙度参数进行定量分析，如算术平均粗糙度(Ra)、最大高度(Ry)和十点平均粗糙度(Rz)。可以用PRIMOS-CR三维高分辨率成像系统对皮肤表面进行拍照，用专用软件(Primos OMC3_22)进行表面分析。使用皮肤粗糙度模型(该模型是化学药物诱发的人类皮肤损伤的标准)，本发明人发现，保持表皮干细胞自我复制能力的物质可以通过抑制与人工诱发的皮肤粗糙度相关的TEWL的增加，以及通过改善皮肤表面的粗糙度来改善皮肤粗糙度。
因此，本发明的一个实施方案提供了一种用于改善粗糙皮肤的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
粗糙的皮肤是指皮肤失去光滑、湿润、外观和质地不均匀的状态，常常伴随着干燥、瘙痒、发红和糜烂，而本发明的组合物可以改善上述症状或状况。
抗斑用组合物
斑点一词指的是皮肤中产生的一种色素、黑色素的沉积。最常见的类型是“色斑”(老年性色素沉着)，它是由持续暴露在紫外线下引起的，但它也可以指其他广泛的色素均匀性被破坏的情况，如雀斑、炎症后色素沉着和黄褐斑。因此，“抗斑”一词意味着要保持色素的均匀性。
本发明提供了一种用于抗斑的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
预防和改善由抗癌药物引起的皮肤疾病的药剂
本发明的一个实施方案涉及一种预防或改善与抗癌药物治疗有关的皮肤病的方法和组合物。
皮肤病(皮肤毒性)是抗癌治疗中经常出现的副作用。除了皮肤干燥外，已知还会出现手足综合症(手掌/脚底发红过敏综合症)、色素沉着、指甲变化和类似老化的皮肤疾病。常规使用的抗代谢剂、烷基化剂和铂金制剂与皮肤干燥、萎缩、脆弱、屏障功能失调、色素异常和脱发有关。近年来，根据癌细胞和正常细胞的差异，选择性地攻击癌细胞中特异性表达的分子的分子靶向药物已经被开发出来，并被用于各种癌症，如乳腺癌和肺癌，取代了传统的抗癌药物。
除了通常与抗癌药物相关的皮肤病(干燥、萎缩、手足综合症、色素沉着、脱发等)外，与分子靶向药物(各种多酪氨酸激酶抑制剂、EGF受体抑制剂等)相关的皮肤毒性已频繁地导致红斑性丘疹、酒渣鼻样皮炎、脂溢性皮炎、头发和指甲色素沉着、甲癣、皮肤干燥、裂纹、脱发、瘙痒和强烈的烧灼感。新的免疫治疗剂(免疫检查点抑制剂)也与皮肤病的发展有关。由这些分子靶向药物引起的皮肤病变不易被视为有害，而是作为对表达癌细胞共同分子的皮肤细胞的药理作用的标志，或作为抗癌药物疗效的指标，在抗癌治疗中继续使用润肤剂等对症治疗。然而，这可能会给病人带来大量的心理困扰和负担，他们往往会放弃治疗。在许多情况下，严重的皮损导致抗癌药物(化疗和分子靶向药物)的停用，但没有适当的预防或局部治疗的方法。
到目前为止，COL17A1在表皮干细胞中的表达被一些不同的抗癌药物所改变，而COL17A1的表达与抗癌药物之间的关系还没有确定。然而，目前还没有开发出有效的方法来预防或改善与癌症治疗相关的皮肤疾病。
在这项研究中，本发明人发现不仅羟基脲等抗癌药物，而且EGF受体抑制剂等分子靶向药物也会降低COL17A1的表达和干细胞竞争性自我复制的能力。
因此，本发明提供了一种用于预防或改善抗癌药物引起的皮肤损伤的组合物，其特征在于，该组合物含有选自以诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，以及抑制细胞中DNA损伤的物质所组成群组中的物质作为有效成分。
在其中一个实施方案中，本发明的预防和改善皮肤病的药剂的特征在于，它含有作为活性成分的物质，可以维持COL17A1的表达和细胞中的自我复制能力。更具体地说，本发明预防和改善皮肤病的药剂可包括ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和/或COX抑制剂，作为诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质。更具体地说，本发明的预防和改善皮肤病的药剂可以包括，作为维持细胞中COL17A1的表达和自我复制能力的物质，夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、虾青素、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物、山楂提取物和胡萝卜提取物等。
植物提取物
在本发明中，各种植物提取物可用于上述用途(见下文)。
·促进皮肤伤口愈合，或预防或改善皮肤溃疡
·抑制皮肤老化
·增加表皮干细胞的再生能力
·预防或改善由抗癌药物引起的皮肤疾病
·抗皱(改善皮肤弹性，改善角质层功能，改善皮肤保湿能力，改善皮肤屏障功能)
·抗斑
此外，在本发明中，植物提取物还可作为COL17A1促进剂、脱发和白发抑制剂使用。
本发明使用的植物提取物的原料是罗布麻(Apocynum venetum)、桑树(Morusalba)、金鸡菊(Gymnema sylvestre)、茶(Camellia sinensis)、水飞蓟(Silybummarianum)、枇杷叶(Eriobotrya japonica)、黑姜黄(Kaempferia parviflora)、胡萝卜(Panax ginseng)和印度人参(Indian ginseng)。只要能获得上述效果，这些植物的使用部位不受限制。
每种植物提取物的提取方法不受限制，可以按照本领域技术人员已知的方法进行。作为提取溶剂，可以使用水、酒精溶剂和有机溶剂，例如丙酮、酯、多元醇和醚。因此，例如，可以制备上述植物材料的乙醇提取物、热水提取物和1,3-丁二醇提取物。这些溶剂可以单独使用或结合使用。提取溶剂的量、提取温度、提取时间和提取方法不受限制，只要可以获得表现出上述效果的本发明组合物即可。
提取物可以是通过过滤所得的提取物得到的滤液本身，通过浓缩滤液得到的浓缩液，通过干燥浓缩液得到的干燥产品，以及这些产品的粗制或纯化产品。浓缩法和干燥法可以通过任何方法进行。如果有必要，可以添加赋形剂如糊精。纯化可按照本领域技术人员已知的方法进行，如合成吸附树脂、活性炭、离子交换树脂、柱层析和重结晶等。
该组合物也可以采取食品组合物、药物组合物或化妆品组合物的形式，特别是在食品组合物的情况下，它可以采取功能性食品或健康食品的形式。
药物组合物
本发明的组合物可以是药物组合物。本发明的一个实施方案是用于促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡或褥疮的药物组合物，其特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的药物组合物可用于治疗急性皮肤创伤或预防或治疗慢性皮肤创伤。换言之，本发明的实施方案之一涉及在促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡或褥疮的药物制造中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，维持表皮干细胞自我复制能力的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或抑制细胞中DNA损伤的物质的使用。
本发明的实施方案之一是一种用于抑制皮肤老化的药物组合物，其特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的药物组合物可用于预防或治疗与皮肤老化进展有关的疾病的皮肤症状。换句话说，本发明的实施方案之一可用于制造预防皮肤老化药物组合物，其含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的实施方案之一是一种用于增强表皮干细胞再生能力的药物组合物，其特征在于，它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的药物组合物可用于预防或治疗与表皮干细胞再生能力降低有关的疾病的皮肤症状。换句话说，本发明的一个实施方案是使用一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质于制造一种用于提高表皮干细胞的再生能力(自我复制能力)的药物或生产再生医学产品(加工细胞、加工细胞片等)。
此外，本发明的一个实施方案涉及一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有一种抵抗损害表皮干细胞再生能力(自我复制和维持)的分子靶向药物的物质，一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞的自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的一个实施方案还涉及一种用于预防或改善抗癌药物引起的皮肤损伤的药物组合物，其特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的药物组合物可用于预防或改善由抗癌药物引起的皮肤疾病。换句话说，本发明的一个实施方案涉及用于预防或改善抗癌药物引起的皮肤病的药物的制造，其中使用一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质。
本发明的一个实施方案是一种用于抗皱治疗的药物组合物，其特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。
本发明的药物组合物可用于抗皱。换句话说，本发明的一个实施方案涉及用于抗皱药物的制造，其中使用一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质。
本发明的一个实施方案是一种用于改善粗糙皮肤的药物组合物，其特征在于，它含有作为活性成分的诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质、抑制细胞中COL17A1降解的物质、维持表皮干细胞自我复制能力的物质、抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或抑制细胞中DNA损伤的物质。
本发明的药物组合物可用于改善皮肤粗糙度。另外，本发明的一个实施方案涉及用于改善粗糙皮肤的药物的制造，其中使用一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质。
本发明的药物组合物可用于抗斑。换句话说，本发明的一个实施方案涉及用于抗斑药物的制造，其中使用一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，一种抑制细胞中COL17A1降解的物质，一种维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质和/或一种抑制细胞中DNA损伤的物质。
在本发明的药物组合物中，作为活性成分的物质包括，例如本文其他部分其中所述的ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂、COX抑制剂和ELANE抑制剂，更具体地说，Y27632、夹竹桃麻素和西维莱斯特等，但不限于此。
本发明的药物组合物可以采取任何形式，如片剂、粉末、液体和半固体。本发明的药物组合物也可以是外用药，如通过皮肤或直接施用于皮肤病变的局部治疗的涂层，或者可以通过将基质与各种主剂混合制备。除上述活性成分外，本发明的药物组合物还可含有药学上可接受的赋形剂、添加剂、缓冲剂、用于等渗调节的盐类、抗氧化剂、防腐剂、药物稳定剂等。赋形剂包括但不限于水、纯净水、酒精、甘油、乳糖、淀粉、糊精、白糖、沉淀的二氧化硅、蜂蜜、大米淀粉和曲克芦丁。本发明的药物组合物还可以含有其他活性成分。每种成分的数量可在制药用途可接受的范围内酌情确定。组合物的剂量可根据所用药物的类型和要施用的目标酌情决定。例如，活性成分可以是0.01-15％(重量)，例如0.1-5％(重量)。
给药途径也可以根据所使用的药物类型和要给药的对象来决定。本发明的药物组合物可含有在伤口敷料中的敷料。敷料是能够保持湿润环境的医疗材料，为伤口愈合提供最佳环境。
本发明的一个实施方案涉及一种促进哺乳动物皮肤伤口愈合的方法，一种预防或改善皮肤溃疡或褥疮的方法，一种抑制皮肤老化的方法，一种增强表皮干细胞再生能力的方法，一种预防或改善由抗癌药物引起的皮肤损伤的方法，一种抗皱方法，抗斑方法，和/或改善粗糙皮肤的方法。
此类方法可包括诱导或维持细胞中COL17A1的表达，抑制细胞中COL17A1的降解，抑制细胞中的基因组或氧化应激，和/或抑制细胞中的DNA损伤的步骤。本发明的一个实施方案可更具体地包括在哺乳动物上施用，例如，ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和/或COX抑制剂。
哺乳动物包括，例如，人类、猴子、小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、绵羊、山羊、羊驼、马、牛、猪、水貂、狐狸、貂、浣熊、龙猫、水獭、海狸和海豹。剂量可根据所用药物的类型和给药对象来决定(如上)。给药途径也可以根据所用药物的类型和给药目标来决定。优选的给药途径包括，例如，将液体、乳液或乳膏涂抹或喷洒在皮肤上，或皮下注射液体，或口服固体或液体制剂。也可以制备含有本公开内容的组合物的贴片，并应用于皮肤。
抗色素沉着剂
本发明的一个实施方案涉及预防或改善老化皮肤的色素异常的方法和组合物。此类方法可包括诱导或维持细胞中COL17A1的表达，抑制细胞中COL17A1的降解，抑制细胞中的基因组或氧化应激，和/或抑制细胞中的DNA损伤等步骤。此类组合物可包括诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，和/或抑制细胞中DNA损伤的物质。
本发明的一个实施方案涉及预防或改善因皮肤的年龄变化而产生的皱纹、细纹、干燥和疮疤的方法和组合物。此类方法可包括诱导或维持细胞中COL17A1的表达，抑制细胞中COL17A1的降解，抑制细胞中的基因组或氧化应激，和/或抑制细胞中的DNA损伤等步骤。此类组合物可包括诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，和/或抑制细胞中DNA损伤的物质。
干细胞竞争调节剂
本发明的一个实施方案涉及用于控制表皮干细胞的细胞竞争的方法和组合物。本发明人发现，COL17A1是参与细胞竞争的一个重要因素。因此，本发明的方法可包括诱导或维持细胞中COL17A1的表达，抑制细胞中COL17A1的降解，抑制细胞中的基因组或氧化应激，和/或抑制细胞中的DNA损伤等步骤。本发明的组合物还可包括诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质，抑制细胞中COL17A1降解的物质，抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，和/或抑制细胞中DNA损伤的物质。本领域技术人员理解可以通过抑制COL17A1对细胞竞争进行负面调节。
美容保健品或功能食品
本发明的一个实施方案涉及一种美容保健品或功能性食品，其中含有一种能维持细胞中COL17A1的表达和基于它的竞争性自我复制能力的物质，一种能抑制细胞中COL17A1的降解的物质，一种能维持表皮干细胞自我复制能力的物质，一种能抑制细胞中基因组应激或氧化应激的物质，和/或或抑制细胞中的DNA损伤。在其一个实施方案中，本发明的美容保健品或功能性食品的特征在于它含有一种诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质作为活性成分。更具体地说，美容保健品或功能性食品可包括ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和/或COX抑制剂，作为诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质。更具体地说，本发明的美容保健品或功能性食品可以包括夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、虾青素、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物、山楂提取物和胡萝卜提取物等作为维持细胞中COL17A1的表达和维持自我复制能力的物质。
本发明的美容保健品或功能食品可以采取任何形式，如片剂、粉末、半固体、果冻或液体。本发明的美容保健品可进一步含有皮肤抗衰老剂、维生素、胶原蛋白和矿物质中的至少一种。本发明的美容保健品或功能食品可以制备作为例如，每天口服1至3次，在饭前、饭中或饭后服用。
化妆品组合物
本发明的一个实施方案涉及一种化妆品组合物，其特征在于，它含有一种能够维持细胞中COL17A1的表达和基于细胞中COL17A1的表达的竞争性自我复制能力的物质一种能够抑制细胞中COL17A1的降解的物质，一种能够维持表皮干细胞的自我复制能力的物质，一种能够抑制细胞中的基因组应激或氧化应激的物质，和/或一种能够抑制细胞中DNA损伤的物质作为活性成分。如本文其他地方其中所述，诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质包括但不限于ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和COX抑制剂。诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质包括但不限于，例如夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、虾青素、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻提取物、桑葚提取物、武靴藤提取物、茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、黑姜黄提取物、圣约翰草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、克拉拉根提取物、米仁提取物、大麻玫瑰果提取物、金缕梅叶提取物、桉树叶提取物、山楂提取物等。
在一个实施方案中，根据本公开的化妆品组合物是一种用于皮肤护理的组合物。在一个实施方案中，根据本公开的化妆品组合物涉及一种用于应用于皮肤表面的组合物。该组合物可包括但不限于溶液、悬浮液、洗剂、乳霜、凝胶、乳液、棒状物、笔状物、喷雾剂、气雾剂、软膏、清洁洗涤剂溶液和清洁棒固体、洗发水和护发素、糊状物、泡沫、粉状物、摩丝、剃须剂等。膏药、湿巾、药条、药贴、电贴、伤口敷料和粘性绷带、水凝胶、成膜产品、面部和皮肤面膜(含有和不含有不溶性片)，化妆产品，如粉底、眼线笔和眼影。
根据本公开的化妆品组合物可含有0.01至15％(重量)，例如0.1至5％(重量)的诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质(Y27632，夹竹桃麻素等)。
根据本公开的化妆品组合物可进一步包括皮肤抗衰老剂、肤色调节剂、抗炎剂和防晒剂中的至少一种。皮肤抗衰老剂包括但不限于具有抗衰老特性的肽(WO2014157485A1)。合适的肤色调节剂包括但不限于糖胺、熊果苷、脱氧熊果苷、己基间苯二酚、曲酸、己脒化合物、水杨酸，以及包括丙酸视黄醇和丙酸视黄醇在内的维甲酸。
合适的抗炎药包括非甾体抗炎药(NSAIDS，如布洛芬和萘普生)、甘草酸(也称为甘草次酸糖苷)和甘草酸二钾等盐类、甘草次酸(甘草次酸)、甘草提取物、没药醇(例如α没药醇)、曼珠沙华(从黄连属植物中提取，特别是Rubia cordifolia)和Guggal(从Commiphora属植物中提取，特别是Commiphora mukul))、可乐树提取物、洋甘菊、紫苜蓿提取物和鞭毛珊瑚提取物(来自山羊科植物的提取物)，上述任何一种的衍生物，以及它们的混合物，但不限于此。
合适的防晒剂包括2-乙基己基对甲氧基肉桂酸酯、4,4'-t-丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、2羟基-4-甲氧基二苯甲酮，辛基二甲基对氨基苯甲酸，三油酸二缩水甘油酯，2,2二羟基-4-甲氧基二苯甲酮,乙基-4-(双羟丙基)氨基苯甲酸酯,2-乙基己基2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯,2-乙基己基水杨酸酯,甘油-P氨基苯甲酸酯、3,3,5-三甲基环己基水杨酸酯、氨基苯甲酸甲酯、对二甲氨基苯甲酸酯或氨基苯甲酸，2-乙基己基对二甲氨基苯甲酸，2-苯基苯咪唑-5-磺酸硫酸、2-(对二甲氨基苯基)-5-磺酸苯并恶唑酸、辛烯、氧化锌、亚苄基樟脑及其衍生物、二氧化钛，和和它们的混合物。
本公开的化妆品组合物可包含至少一种在化妆品领域常规使用的、不影响本公开组合物特性的添加剂，如增稠剂、香料、珠光剂、防腐剂、防晒剂、阴离子或非离子或阳离子或两性聚合物、蛋白质、蛋白质水解物，如18-甲基二十烷酸、维生素、泛醇、硅酮、脂肪酸如植物油、动物油、矿物油或合成油、胶凝剂、抗氧化剂、溶剂、过滤器等。蛋白质、蛋白质水解物，如18-甲基二十烷酸、维生素、泛醇、有机硅、脂肪酸，如植物油、动物油、矿物油或合成油、胶凝剂、抗氧化剂、溶剂、过滤器、筛选剂、气味吸收剂、着色剂、磨料、吸收剂、芳香剂化妆品成分、染料、颜料/着色剂、精油、抗结块剂、消泡剂、抗菌剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填料、螯合剂、化学添加剂、化妆品收敛剂、化妆品杀菌剂、变性剂、药物收敛剂、皮肤软化剂、局部镇痛剂、成膜剂或材料、乳化剂、pH调节剂也可以包括防腐剂、喷雾剂、还原剂、清除剂、皮肤冷却剂、皮肤保护剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素和这些所组成的群组合。这些添加剂在本公开的组合物中的比例，就组合物的总重量而言，最好或有利地落在0至50％(重量)、5至40％(重量)或30至50％(重量)的范围内。
本公开的化妆品组合物可以是，特别是用于皮肤局部应用的水溶液或油性溶液、乳液或血清类型的分散液、通过将脂肪相分散在水相(O/W)或反之(W/O)而获得的具有液体或半液体稠度的牛奶类型的乳液、具有水或无水凝胶或软稠度的悬浮液或乳液，其他的可能有微胶囊或微粒子、离子和/或非离子囊状分散体或泡沫状。这些组合物是按照常规方法制备的。该组合物的水相应在5-99.5％之间。
本公开的化妆品组合物的pH值不受限制，一般在2至12之间，最好在3至9之间。可通过向组合物中加入氨、氢氧化钠、氢氧化钾或一级、二级或三级(聚)胺基(有机或无机)，如单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺或1，3-丙二胺，或与碱性或多胺基酸，如赖氨酸或精氨酸。另外，可以通过添加无机或有机酸，最好是羧酸，例如柠檬酸，来制备到pH的目标值。
本公开的化妆品组合物特别适合用于清洗、保护、治疗或护理面部、手部、脚部、身体主要结构上的褶皱或身体的面霜(例如，日霜、晚霜、抗衰老霜、保湿霜、卸妆霜、粉底霜或防晒霜)、液体粉底、卸妆乳、保护性或护理性身体乳、防晒乳、乳液、用于护理皮肤的凝胶或泡沫，例如清洁乳液、防晒乳液、人造日光浴乳液、沐浴用组合物，含有消毒剂的除臭剂组合物，须后凝胶或乳液，脱毛膏，处理昆虫叮咬的组合物。
在整个治疗期间，本公开的化妆品组合物可以每天至少施用一次、两次或更频繁地施。在每天施用两次的情况下，例如第一次和第二次施用之间应该有至少1至12小时的时间间隔。通常情况下，该组合物可以在早晨和/或晚上睡觉前使用。
筛选方法
该方法涉及一种筛选的方法，这些物质能有效地促进皮肤伤口愈合或预防或改善皮肤溃疡，抑制皮肤老化，控制细胞竞争，改善(增强、增效)表皮干细胞的再生能力，预防或改善抗癌药物引起的皮肤损伤，抗皱、抗斑和/或改善皮肤粗糙度。这里，对皮肤老化的抑制可能是对毛囊老化的抑制，毛囊是皮肤的附件。这种筛选方法可包括以下i-iii的步骤:
(i)在体外使细胞与试验物质接触，
(ii)测量细胞中COL17A1的表达，和
(iii)确定该试验物质是否能上调COL17A1的表达。
在此，COL17A1的表达的测量可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。通过上述筛选方法确定的物质可在本发明中用作促进皮肤伤口愈合、抑制皮肤老化、控制细胞竞争、增强表皮干细胞的再生能力、预防或改善抗癌剂造成的皮肤损伤的成分。它可作为预防或改善由抗癌药物引起的皮肤损伤的成分、抗皱成分、抗斑成分和/或改善粗糙皮肤的成分。另外，根据本发明，在促进哺乳动物皮肤伤口愈合、抑制皮肤老化、增强表皮干细胞的再生能力、防止或改善抗癌剂引起的皮肤损伤、抗皱方法、抗斑方法和/或改善皮肤粗糙度的方法中它也可以作为给哺乳动物注射的物质。
通过将评估COL17A1的表达与菌落形成试验相结合，可以筛选出通过保持COL17A1的连续表达来维持自我复制能力的药剂。通过将COL17A1-表达的评估与菌落形成试验相结合，可以筛选出促进“通过干细胞竞争实现干细胞扩增”的药剂。也就是说，在其中一个实施方案中，该筛选方法可包括以下i-iv的步骤:
(i)在体外使细胞与试验物质接触，
(ii)测量细胞中COL17A1的表达，
(iii)确定该试验物质是否能上调COL17A1的表达，和
(iv)确定试验物质是否促进菌落形成。
皮肤老化评估方法和评估试剂盒
本发明的一个实施方案涉及一种使用细胞中COL17A1的表达作为指标评估皮肤老化的方法。本发明人发现，COL17A1的表达在衰老的表皮细胞中减少。因此，通过测量COL17A1在表皮细胞中的表达，COL17A1可被用作评估皮肤老化的标志物。COL17A1在表皮细胞中的表达可以通过技术人员已知的任何方法来测量，如西方蛋白印迹或使用针对COL17A1的抗体(抗COL17A1抗体)进行抗体染色，或通过RT-PCR测量编码COL17A1基因的mRNA。测量的结果可以与对照组进行比较，或随着时间的推移评估皮肤老化。例如，如果比较的结果显示COL17A1的表达水平降低，则判断皮肤老化在进行。
本发明的一个实施方案还涉及一种用于评估皮肤老化的方法的试剂盒，使用细胞中COL17A1的表达作为指标。该试剂盒包括，例如，特异性识别COL17A1的抗体。这样的抗体可以直接被标记或被标记的第二抗体识别。例如，标记可以基于酶的活性或化学发光的着色。该试剂盒还可包含，例如，用于检测COL17A1转录物的寡核苷酸(探针、引物)。此类寡核苷酸可用于通过与转录物杂交进行检测和用于扩增反应如PCR。因此，本发明的一个实施方案涉及一种用于评估皮肤老化的方法的试剂盒，包括检测COL17A1的抗体(抗COL17A1抗体)和编码COL17A1的基因的探针或引物。此外，该试剂盒可能包含用于测量其他标记蛋白，如p16Ink4a，表达水平的成分(抗体、探针、引物等)。
用于评估表皮干细胞的方法和试剂盒
本发明的一个实施方案涉及一种以细胞中COL17A1的表达为指标来评价表皮干细胞的方法。本发明人发现，表皮干细胞的增殖潜力与COL17A1的表达水平之间存在着关联。因此，COL17A1可以作为评价表皮干细胞的标志物，通过测定COL17A1在表皮干细胞中的表达，可以评价表皮干细胞。表达高水平COL17A1的表皮干细胞具有高增殖潜力，因此适合培养。COL17A1在表皮干细胞中的表达可以通过技术人员已知的任何方法来测量，如使用抗COL17A1抗体进行西方蛋白印迹，抗体染色，ELISA，FACS等。本发明人还发现，COL17A1的表达在衰老的表皮干细胞中减少。因此，通过测量COL17A1在表皮干细胞中的表达水平，可以评估表皮干细胞的老化。表皮干细胞的衰老是指表皮干细胞本身的自我复制能力因老化、各种基因组应激和氧化压力而降低，并容易通过最终分化而丧失的现象。例如，如果COL17A1的表达与设定的标准相比被认为是高的，那么该细胞被认为适合用于培养和再生医学产品。
本发明的一个实施方案还涉及一种用于评估表皮干细胞的方法的试剂盒，使用细胞中COL17A1的表达作为指标。该试剂盒可以包括，例如，特异性识别COL17A1的抗体，编码COL17A1的基因的探针或用于扩增编码COL17A1的基因的引物。因此，本发明的一个实施方案涉及一种用于评估表皮干细胞的方法的试剂盒，包括用于检测COL17A1的抗体、探针或引物。
表皮干细胞分选方法和试剂盒
本发明的一个实施方案涉及一种以细胞中COL17A1的表达为指标来分选表皮干细胞的方法。本发明人发现，表皮干细胞的增殖潜力与COL17A1的表达水平之间存在关联。COL17A1表达水平高的表皮干细胞增殖能力强，因此更适合用于培养。因此，COL17A1可作为评估表皮干细胞增殖潜力的标志物，测量COL17A1在表皮干细胞中的表达，并选择COL17A1高表达的表皮干细胞，可能对后续培养和移植有帮助。COL17A1高表达的细胞的选择可以通过技术人员已知的任何方法进行，例如使用FACS。
本发明的一个实施方案还涉及一种用于分选表皮干细胞的方法的试剂盒，使用细胞中COL17A1的表达作为指标。该试剂盒可以包括，例如，上述特异性识别COL17A1的抗体、探针或引物。因此，本发明的一个实施方案涉及一种用于分选表皮干细胞的方法的试剂盒，包括用于检测COL17A1的抗体、探针或引物。
扩增表皮干细胞和/或表皮细胞的方法和评估试剂盒
本发明的一个实施方案还涉及一种扩增表皮干细胞和/或表皮细胞的方法，包括选择具有高表达COL17A1的表皮干细胞的步骤。由于COL17A1高表达水平的表皮干细胞具有高增殖能力，因此通过选择这些细胞可以有效地扩增表皮干细胞和/或表皮细胞。COL17A1高表达的表皮干细胞意味着其表达水平在数量上高于衰老细胞。例如，可以通过使用FACS的方法或使用珠的方法进行分离。可以使用这种扩增方法离体制备细胞片。
此外，本发明的一个实施方案涉及一种用于扩增表皮干细胞和/或表皮细胞的方法的试剂盒，其包括分选具有高COL17A1表达水平的表皮干细胞的步骤。该试剂盒可以包括，例如，如上所述特异性识别COL17A1的抗体、探针或引物。
用于评估细胞竞争的方法和试剂盒
本发明的一个实施方案涉及一种评估参与细胞竞争的分子、促进或减少细胞竞争的物质、或改变竞争效率或速度的物质的方法，其方法是改变一些细胞中参与细胞竞争的分子(如COL17A1)的表达水平。本发明涉及到本发明人发现，COL17A1的表达与表皮干细胞的细胞竞争有关。COL17A1高表达的表皮干细胞在细胞竞争中具有优势。细胞竞争的评估可以使用形成分层鳞状上皮的上皮细胞的三维培养物进行，如角质细胞(包括培养的角质细胞、角质细胞系HaCaT细胞和Pam212细胞)。COL17A1高表达的细胞比COL17A1低表达的细胞增殖得更多，被评价为具有高细胞竞争能力。
在本发明中，还可以评估角质细胞三维培养中的细胞竞争，并寻找控制这种竞争的化合物、提取物和核酸。因此，本发明的一个实施方案还涉及一种评估角质细胞竞争的方法，特别是涉及一种筛选控制细胞竞争的物质的方法，使用角质细胞(系)三维培养中的细胞竞争作为指标。
本发明的一个实施方案还涉及一种用于评估角质细胞(keratinocytes)的细胞竞争的方法的试剂盒。该试剂盒包括，例如，改变细胞竞争相关分子如COL17A1或癌症相关基因表达的核酸，如用于RNA干扰的核酸(针对编码COL17A1的基因的siRNA、shRNA等)，基因转移试剂，慢病毒或逆转录病毒，用于免疫染色的抗体，如特异性识别COL17A1的抗体，以及3D培养的设备。因此，本发明的一个实施方案涉及一种用于评估角质细胞竞争的方法的试剂盒，包含一种细胞系、一种病毒、一种抗体和一种装置。该试剂盒还可包含用于进行三维培养的角质细胞系(如HaCaT细胞)。
细胞组成
本发明的一个实施方案涉及一种细胞组合物(细胞群)，包括分离的、表达COL17A1的细胞，其中分离表达COL17A1的细胞可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行，例如FACS或基于珠子的技术。本发明的细胞组合物还可以包括上皮片、器官和其他三维结构。
细胞组合中的细胞最好是能表达高水平的COL17A1。表达高水平COL17A1的细胞(COL17A1high细胞)可以使用例如FACS被分离出来。这里，表达水平的术语“high”或“hi”在本领域是众所周知的，“COL17A1high”是指相对于被分析的细胞群而言，COL17A1的表达水平高。在本公开的背景下，“high”或“hi”可被视为目标细胞群中前50％以内的表达水平，例如，3％、5％、10％、15％、20％、30％或40％以内。细胞组合中的细胞可以是，例如，表皮角质细胞或粘膜上皮角质细胞，但也可以包含其他细胞。该细胞组合物中的细胞可以是，例如，至少有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％表达COL17A1的细胞。细胞组合物可以包含至少1×103、1×104、1×105、1×106、1×107或1×108个细胞。
该细胞组合物可以是一种用于移植的细胞组合物。该细胞组合物可以是一种用于治疗皮肤疾病或损伤的细胞组合物。细胞组合中的细胞可以是干细胞衍生的细胞。细胞组合物中的细胞可以是利用诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质来诱导或维持COL17A1表达的细胞。诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质可以是ROCK抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂、iNOS抑制剂和COX抑制剂中的至少一种。诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质可能是Y27632或夹竹桃麻素。
本发明的细胞组合中的细胞可被冷冻。本发明的细胞组合物可以装在一个容器中。
细胞片
本发明的一个实施方案涉及到含有表达COL17A1的细胞的细胞片。这样的细胞片可以通过分离和培养表达COL17A1的细胞而制备。这种细胞片可以移植到患者体内，用于治疗患者的疾病或损伤。细胞片可用于自体或同种异体移植。
实施例
将通过以下实施例具体描述本发明，但是，本发明不应解释为限于此。
实施例1：随着年龄的增长，COL17A1蛋白在皮肤中的表达量减少
小鼠尾部的皮肤与背部的皮肤不同，其分层表皮细胞层，正如在人类表皮黑色素细胞所组成的群组织学分析中观察到的那样，老年小鼠尾部皮肤的特点也是伴随鳞片状表皮的刺细胞层数量减少而萎缩。年轻小鼠的基底层细胞相对于基底膜有一个长方形的纵向形状，而老化的基底层细胞则有一个更圆的或扁平的形态。老年皮肤中基底层细胞和MCM2+非休眠基底层细胞的总数明显减少，表明干细胞及其在表皮中的分裂随着年龄增长而减少。使用透射电子显微镜(TEM)对表皮基底层细胞和表皮-真皮交界处进行的超结构分析显示，将基底细胞层固定在基底板上的电子致密区(hemidesmosomes；HD)的数量与年龄有关，明显减少。此外，在老年尾部皮肤的透明区(lamina lucida；LL)经常观察到基底层细胞的脱落，这与年龄相关的基底细胞层的HD下降有关。
因此，发明人假设HD成分直接参与了皮肤老化过程。为了验证这一点，本发明人分析了年轻和年老(周岁)小鼠尾部表皮中各种HD成分和主要细胞粘附分子整合素β1(ITGB1)的表达。结果显示，随着年龄的增长，COL17A1的免疫染色水平明显降低(图1)。与此相一致的是，免疫电镜分析显示，老年皮肤中真皮-表皮交界处的COL17A1的信号明显减少。全身免疫染色也显示出COL17A1和ITGA6在老年皮肤中的异质性分布。特别是，在老化的尾部表皮中，除了发现表达ITGA6的COL17A1阴性细胞区外，还发现了双阴性细胞区。这表明COL17A1蛋白的表达是最不稳定的，因此，随着年龄的增长，COL17A1不足最终会破坏其他HD成分的稳定性。
为了研究COL17A1在HD成分的稳定性中的作用，本发明人分析了年轻和年老小鼠皮肤中HD的数量(图2)。此外，COL17A1的蛋白分解也被持续的DNA损伤反应所诱发，如小鼠的X射线照射和TTD早衰症小鼠的基因组不稳定。同样，紫外线(UV)照射也被证明可以在体外和体内的几个基底层角质细胞中下调COL17A1的表达。因此，皮肤的紫外线照射导致HD不稳定。这些数据共同表明，COL17A1的功能是“干细胞检查点分子”，是一个压力/兼容性传感器，监测DNA损伤反应并决定干细胞是否能自我复制或分化。这种压力感应机制可能导致老化表皮基底层中COL17A1表达水平不同的表皮干细胞克隆自我复制能力的差异。
实施例2：皮肤老化过程中COL17A1+表皮干细胞的克隆扩增
为了可视化随着年龄增长而出现的表皮干细胞克隆的动态，并跟踪COL17A1缺陷克隆的命运，本发明人在K14-CreERT2；R26R Brainbow 2.1小鼠身上生成了一个具有药物诱发的多色标记的基底层角质细胞系追踪系统。该系统允许通过Cre-LoxP介导的重组对基干/祖细胞进行随机的多色标记。在塔莫西芬(TAM)治疗后，在年轻(4.5个月大)的尾部皮肤中概率地发现了GFP-、RFP-、YFP-或CFP表达的细胞。相反，单一的彩色角质细胞克隆区域随着年龄的增长而明显增加，同时伴随着克隆总数的减少(图3)，表明在生理老化过程中，一些干细胞在牺牲许多其他细胞的情况下进行克隆扩张。
接下来，为了测试基底细胞异质性在不同的COL17A1表达水平可能在衰老过程中诱发基底层的干细胞竞争的可能性，本发明人观察了年轻(11个月大)和年老(28个月大)小鼠尾部毛囊间的表皮(IFE)中多色标记的干细胞克隆的COL17A1表达。如图4所示，代表干细胞克隆的单色基底层细胞的COL17A1表达在老年皮肤中普遍下降，而年轻小鼠基底层细胞的COL17A1表达在每个克隆中表现出不同的COL17A1表达水平，并随着年龄的增长普遍下降。COL17A1在年轻小鼠基底层细胞中的表达水平在每个克隆中都是不同的，一般来说随着年龄的增长而减少。对基底层角质细胞克隆大小与COL17A1表达水平的详细比较显示，基底层细胞克隆大小与老年小鼠皮肤的COL17A1表达水平呈正相关(图5)。这表明，在生理老化过程中，保持较高水平的COL17A1表达的干细胞克隆表现出较高的克隆性，并在表皮基底层成为主导。此外，在老年皮肤的基底层细胞中，没有明显诱发细胞凋亡或所谓的“衰老”细胞。这些数据表明，COL17A1high的表皮干细胞与COL17A1low的细胞竞争，以抵御表皮衰老。
实施例3：COL17A1的差异性表达导致对表皮干细胞的竞争
为了研究COL17A1low/-克隆的出现是否直接导致与邻近的周围COL17A1high的克隆在体内的竞争，本发明人将一种对基底层角质细胞特异的多色标记系统与产生了药物诱发的Col17a1基因敲除(cKO)小鼠。使用低剂量TAM罕见地诱发Col17a1缺失，导致在基因敲除诱发后第2天在尾部表皮出现单色标记的Col17a1缺失的角质细胞克隆。在对照组小鼠中，这些克隆在第14天时体积增大，随后在第28天形成单色柱(基底克隆)。相反，许多Col17a1缺陷的基底层角质细胞克隆，被COL17A1高水平表达的未标记的基底层角质细胞克隆所包围，在第14天左右脱离，到第28天成为失败者细胞克隆(漂浮克隆)(图6)。与此相一致的是，对小鼠尾巴的整装片分析显示，Col17a1缺陷的细胞克隆被明显地从皮肤中排除。这些数据表明，表达COL17A1的表皮干细胞与COL17A1缺陷的表皮干细胞在生态位中竞争，并且COL17A1通过表皮的细胞竞争机制介导皮肤的平衡和老化过程。
为了进一步研究COL17A1的不同表达是否直接介导了表皮的细胞竞争，本发明人通过在三维培养的HaCaT人类角质细胞中表达短发夹(sh)RNA建立了一个新的体外细胞竞争检测系统。生成表达shCOL17A1的EmGFP+COL17A1稳定的HaCaT细胞和表达shScramble的EmGFP+COL17A1+对照的HaCaT细胞，并在3D培养系统中培养。表达shScramble和表达shCOL17A1的HaCaT细胞都在3D表皮中培养。在三维培养的表皮的结构、分层、增殖或凋亡细胞的数量方面都没有显示出明显的差异。相反，COL17A1-EmGFP+细胞与野生型(COL17A1+)细胞以1:10的比例共同培养，明显排除了shCOL17A1表达的细胞。然而，在1:3的比例下，没有检测到表达COL17A1的细胞被明显的排除。这些数据表明，Col17a1缺陷的基底层细胞作为失败者细胞被周围足够数量的野生型细胞从基底层淘汰。总之，这些数据表明，COL17A1介导的细胞竞争发生在人类表皮的生理老化过程中，而表皮干细胞表达的COL17A1赋予了与邻近表皮干细胞群竞争性的自我复制能力。
实施例4：通过COL17A1介导的SCD维持表皮的稳态
为了了解COL17A1介导的细胞竞争机制，发明人假设COL17A1促进SCD，理论上可以维持COL17A1+表皮干细胞的克隆增殖。为了验证这一假设，本发明人在体内分析了基底层细胞的有丝分裂轴。正常的基底层细胞显示细胞分裂大多与基底膜平行，而Col17a1缺陷的基底层角质细胞异常地诱发垂直细胞分裂，产生基底层细胞和位于基底层以上的子层。这表明COL17A1介导了SCD，并表明COL17A1介导的SCD推动Col17a1缺陷的基底层细胞失去或减少HD而与基底膜分离。事实上，Col17a1缺陷的角质细胞最终会从基底层的IFE中分离出来。
因此，这些数据表明，依赖COL17A1的SCD促进了COL17A1+赢家细胞的克隆增殖，在老化过程中引起了细胞竞争。重要的是，老化表皮的基底层细胞的垂直细胞分裂率增加，并且往往COL17A1的表达水平降低。这最终导致了表皮萎缩(变薄)，原因是细胞分裂受损，同时伴随着COL17A1在老年皮肤区域的表达消失。与此形成鲜明对比的是，来自COL17A1转基因(tg)小鼠的表皮基底层细胞，其中基底层细胞保持COL17A1表达，相对于基底膜保持水平细胞分裂。这些数据表明，COL17A1介导的SCD产生了细胞竞争的机械驱动力，并通过竞争性的自我复制现象抵御了表皮的衰老，这种现象是由成人表皮的水平细胞扩散和占据基底膜区域造成的。
此外，众所周知，某些干细胞克隆的造血干细胞主要扩增，而其他干细胞则消失，导致干细胞的竞争性自我复制(竞争性自我复制)。参与这一过程的分子现在正在被确认。然而，在表皮的生理条件下，竞争性自我复制的实际性质尚不清楚，而且负责这一过程的分子也没有被确定。
为了测试COL17A1介导的SCD是否能维持表皮干细胞克隆的增殖，本发明人使用了集落形成试验，这是一种体外试验，是评估上皮干细胞(包括尾部表皮的细胞)自我复制潜力的金标准。表达低水平COL17A1的老化表皮角质细胞与年轻尾巴的角质细胞相比，其集落形成能力下降，产生的集落也较小(图7)。相反，在小鼠基底层角质细胞中强制表达hCOL17A1促进了表皮干细胞的克隆形成潜力，其菌落大小和数量明显高于对照小鼠(图8)。
这些数据表明，COL17A1通过其增殖表皮干细胞的能力来介导克隆增殖。与此相一致的是，COL17A1在tg小鼠中的表达明显地挽救了与年龄有关的表皮变薄和与年龄有关的脱落。总之，COL17A1依赖性的表皮干细胞在集落试验中进行持续的对称细胞分裂(SCD)的增殖能力，解释了COL17A1high的干细胞克隆更适合于表皮稳态和衰老期间的细胞竞争，以及它们竞争性的自我复制能力。
实施例5：通过表达COL17A1的表皮干细胞维持异型细胞谱系
皮肤老化的特点是不仅有表皮的衰老，而且还有与黑色素细胞有关的色素异常和真皮的变化。为了研究表皮干细胞衰老在皮肤老化中的功能意义，本发明人评估了生理性老化是否会诱发尾部表皮的色素异常。据观察，生理性老化逐渐诱发了皮肤色素异常(皮肤色素异质化，有低色素区和高色素区)，最后诱发了尾部皮肤的色素减退。对尾巴全样的详细显微镜检查显示，随着年龄的增长，色素沉着模式变得更加不均匀。为了直观地看到表皮中黑色素细胞的分布，发明人分析了多巴克罗姆绷带酶(Dct)启动子调控的活塞-H2B GFP(Dct-H2BGFP)tg小鼠的尾部皮肤。切片和整装片分析显示，在年轻小鼠的尾部观察到H2BGFP+表皮黑色素细胞/黑色素细胞，但这些细胞在老年尾部的表皮以依赖年龄的方式消失了。与此相一致的是，对年轻和衰老的整个表皮细胞的微阵列分析将黑色素细胞基因列为衰老过程中最主要的变化。重要的是，在12个月大的尾巴的基底层区域观察到高度色素沉着的黑素细胞，这表明这些细胞偶尔存在于基底层上部区域，它们从基底层分离出来，被排除在皮肤之外。
接下来，为了研究表皮角质细胞的干细胞衰老是否会诱发表皮黑色素细胞的变化，本发明人研究了表皮基底层细胞中Col17a1和/或Itga6缺失导致的HD成分损失是否会诱发早期皮肤色素异常。纵向分析显示，Col17a1缺失通过诱发HD不稳定而诱发相对温和的色素异常，Col17a1和Itga6基因协同诱发明显的色素异常。事实上，当Col17a1或Itga6基因被删除时，被标记为Dct-H2B GFP的表皮黑素细胞从皮肤中耗尽了。
慢性UVB照射诱发小鼠和人类表皮的异常皮肤色素沉着和HD损伤。本发明人接下来研究了慢性UVB照射是否会诱发尾部表皮的皮肤色素沉着和HD损伤及其相关表型(图9)。在反复UVB照射诱发的皮肤色素沉着之后，在最后一次UVB照射后一个月内，Col17a1或ITGA6的表皮色素异常使用TEM和免疫TEM进行的超微结构分析显示，UVB照射抑制了成熟HD的形成，并减少了COL17A1的信号，与Col17a1 cKO类似。
这些数据共同表明，慢性UVB介导的HD损伤通过损害表达COL17A1的表皮角质细胞而诱发表皮色素异常。此外，在小鼠基底层角质细胞中过量表达COL17A1，可以显著挽救宏观和微观的色素沉着表型以及与年龄相关的KIT+表皮黑色素细胞的减少(图9)。总之，这些数据表明，在衰老和光老化过程中，表皮中的黑色素细胞是由表皮中邻近的表达COL17A1的表皮干细胞维持的。
皮肤的再生能力随着年龄的增长而下降。本发明人测试了与年龄有关的表皮干细胞变化与皮肤伤口愈合的关系，伤口愈合是通过克隆表皮干细胞进行的，并影响到真皮中的成纤维细胞(图10)。对PDGFRα阳性间质细胞的分析表明，年龄增长明显减少了位于表皮下的群体，并且而强制表达hCOL17A1可以挽救与年龄有关的PDGFRα阳性细胞的损失。这些数据表明，COL17A1介导的表皮干细胞的维护加强了表皮-真皮交界处的稳定性，并抵御其破坏引起的皮肤器官衰老，包括皮肤萎缩、皱纹和皮肤老化。
实施例6：HD是皮肤器官再生的关键
为了验证上述假设，本发明人用老年野生型小鼠的尾部皮肤进行了全层伤口愈合实验。对伤口面积的测量表明，生理性老化明显延迟了伤口愈合过程。发明人随后分析了Col17a1或ITGA6缺陷的皮肤，发现两者都显示出明显的伤口修复延迟(图11)，表明HD不稳定导致生理性老化中的伤口愈合不良。小鼠基底层角质细胞强制表达hCOL17A1也能促进伤口愈合(图12)。这些数据表明，COL17A1介导的表皮干细胞克隆增殖不仅对于皮肤稳态中的干细胞竞争至关重要，而且对于全层皮肤伤口愈合的再生也是必不可少的。
由于COL17A1的过度表达促进了皮肤伤口的愈合，发明人在体外寻找能诱发COL17A1在角质细胞中表达的新型化合物。如表1和图15所示，本发明人确定了两种化学品，Y27632和夹竹桃麻素，它们在培养的角质细胞中诱发COL17A1的表达。为了在体外证实这些化合物的作用是通过增加表现出SCD的表皮干细胞的竞争性自我复制能力来介导的，本发明人使用人类表皮角质细胞进行了集落形成试验。与此相一致的是，Y-27632使菌落数量明显增加，两种药剂都使菌落的大小明显增加(表1，图13和图14)。
为了证实体内的有益作用，将这些药物施用于啮齿动物尾巴皮肤上的全厚伤口。这两种药物都明显加速了伤口修复过程，过度表达人类COL17A1的tg小鼠也是如此(图12)。这些结果表明，COL17A1诱导型的药物通过表皮干细胞的增殖促进伤口边缘的再上皮化，从而促进皮肤伤口愈合，这些发现为促进皮肤再生的新药物开辟了新途径。
实施例7：寻找促进维持表皮干细胞竞争性自我复制能力的物质
对诱导或维持COL17A1表达的物质进行了进一步搜索。将人类表皮角质细胞播种到384孔板中，用试剂培养48小时，用抗COL17A1的抗体和荧光标记的二抗进行免疫染色，然后用高含量成像系统(HCS：高含量筛选)检测每个细胞的荧光强度。除了用DAPI进行细胞计数外，还对COL17A1的表达进行了量化。
本发明人确定了一组通过COL17A1表达维持表皮干细胞自我复制能力的物质，但无法区分那些暂时增加COL17A1表达但长期减少自我复制能力的物质，如类固醇和其他细胞毒性物质，不能通过测量COL17A1的表达来排除。因此，结合菌落形成试验，本发明人成功地选择了长期促进COL17A1介导的竞争性自我复制的物质。结果显示在图15，表1和表2中。
[表1]
在表1中，COL17A1表达水平(对照比例)中的两个双圈(◎◎)代表表达量增加2.0倍以上，一个双圈(◎)代表增加1.2倍以上，一个圈(0)代表维持1.0-1.2倍。菌落数或菌落面积对照比例中的两个双圈(◎◎)表示增加1.2倍以上，一个双圈(◎)表示维持1.0-1.2倍，X表示小于1.0(同下)。nd(未完成)表示未分析。
在诱导或维持表皮干细胞COL17A1表达的物质中，本发明人发现许多物质能增加集落形成能力，即表皮干细胞自我复制的能力(图16，表1和表2)。另一方面，有一些物质很难与应激反应性COL17A1表达的变化区分开来，还有一些物质稳定地降低了菌落形成的能力。因此，通过结合COL17A1表达的分析和菌落形成能力，可以选择在体内具有“竞争性自我复制能力”的物质。
[表2]
[表3]
表3总结了已被证明可降低COL17A1表达的抗癌剂和分子靶向药物。COL17A1的表达被常规化疗药物如抗代谢药和烷化剂所改变。特别是，COL17A1的表达被针对癌细胞的分子靶向药物明显降低(表3)。
实施例8：抗癌药物和各种压力对COL17A1的减少
用抗癌药物羟基脲治疗7周大的C57BL6小鼠，每月三次，三个月后收集组织并用COL17A1的抗体进行免疫染色。因此，羟基脲处理的小鼠在基底层的COL17A1的表达明显减少(图17)。此外，用辐射(20Gy、30Gy)和紫外线(20mJ、30mJ)照射人类表皮角质细胞HaCaT细胞，分别在24小时和72小时后收集细胞，并使用针对COL17A1的抗体进行西方蛋白印迹分析。结果显示，在辐射和紫外线照射下，COL17A1蛋白的数量都有显著下降。此外，当HaCaT细胞被过氧化氢处理而诱发氧化应激，COL17A1的表达也明显减少(图17)。
这些结果表明，如抗癌药物、紫外线、辐射和氧化压力的各种压力会降低COL17A1的表达。
实施例9：研究COL17A1过量表达对抗癌药物引起的皮肤病的改善试验
过度表达人类COL17A1的转基因小鼠(COL17A1-Tg)和对照组小鼠(大约18个月大)适应了实验环境，然后在麻醉状态下拔掉它们的背毛。
·无EGF受体抑制剂的对照小鼠(n＝3)
·无EGF受体抑制剂的COL17A1-Tg小鼠(n＝3)
·用EGF受体抑制剂(厄洛替尼)治疗的对照小鼠组(n＝4)
·用EGF受体抑制剂(厄洛替尼)治疗的COL17A1-Tg小鼠(n＝4)
·用EGF受体抑制剂(吉非替尼)治疗的对照小鼠组(n＝3)
·用EGF受体抑制剂(吉非替尼)治疗的COL17A1-Tg小鼠(n＝3)
厄洛替尼或吉非替尼是一种针对EGF受体的抗癌药物，溶解在0.5％的甲基纤维素溶液中，浓度为5毫克/毫升，从研究开始每天以50毫克/公斤的剂量腹腔注射给药。未处理的对照组以同样方式接受0.5％的甲基纤维素溶剂溶液。在厄洛替尼或吉非替尼治疗开始后的第7天，对每组小鼠的经表皮水分蒸发率(TEWL)进行测量。使用Tewameter TN300(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)在小鼠背部的特定部位(从脊柱中心对称的两个部位)测量TEWL。
图18显示了该研究的结果。图18显示，用厄洛替尼或吉非替尼治疗的对照组小鼠的TEWL明显增加，但相比之下，过度表达COL17A1的Tg小鼠即使在厄洛替尼或吉非替尼治疗下，TEWL值也明显降低，这表明皮肤损伤减少。这表明抗癌药物诱发的皮肤损伤通过过量表达COL17A1得到明显改善，而COL17A1能促进表皮干细胞的自我复制能力。
实施例10：通过促进表皮干细胞的自我复制能力的物质对抗癌药物造成的皮肤损伤的改善试验
雌性C57BL6N小鼠(7周大或6个月大)适应了实验环境，在麻醉状态下从其背部取下毛发，并将其分为以下6组(n＝4)，以保持体重值基本一致。
·7周/无EGF受体抑制剂(厄洛替尼)组
·7周岁/EGF受体抑制剂(厄洛替尼)+对照溶剂应用组
·7周/EGF受体抑制剂(厄洛替尼)+200μM夹竹桃麻素应用组
·6个月大/无EGF受体抑制剂(厄洛替尼)组
·6个月大/EGF受体抑制剂(厄洛替尼)+对照溶剂应用组
·6个月大/EGF受体抑制剂(厄洛替尼)+夹竹桃麻素200μM应用组
厄洛替尼被溶解在0.5％的甲基纤维素溶液中，浓度为5毫克/毫升，从研究开始，每天以50毫克/公斤的剂量腹腔注射给药。对照的非处理组接受同样的0.5％甲基纤维素溶液的溶剂。对照溶剂组和夹竹桃麻素200μM组接受每种制剂的水溶液，每天一次，每周五次，在背部。7周大的小鼠在厄洛替尼治疗开始后的第7天，6个月大的小鼠在第12天，对每组小鼠的TEWL进行测量。使用Tewameter TN300(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)在小鼠背部的特定部位(从脊柱中心对称的两个部位)测量TEWL。
图19显示了研究的结果。图19的结果显示，用厄洛替尼治疗的小鼠的TEWL明显增加，但用夹竹桃麻素治疗所组成的群组，即使在厄洛替尼的治疗下，TEWL也明显减少，皮肤损伤也减少。这表明分子靶向药物诱发的皮肤病变可以通过促进表皮干细胞的细胞竞争潜力的物质得到明显改善。
实施例11：通过促进表皮干细胞的自我复制能力的物质对老年小鼠的皮肤病的改善试验
在老年小鼠颈部上部皮肤上诱发的刺激性皮肤损伤模型(干燥湿疹和脱发)，用一种促进表皮干细胞竞争能力的物质(夹竹桃麻素)持续处理高浓度乙醇(100％)。结果如图20所示，皮肤损伤明显减少，获得了显著的预防和治疗效果。
实施例12：皮肤屏障改善试验
皮肤屏障功能是皮肤的主要功能，它可以防止体内水分的蒸发和外来物质从体外进入。然而，随着表皮因紫外线照射而反应性地增厚，屏障功能也会恶化。一般来说，角质层含水量和TEWL用于评估皮肤屏障功能，与反应性表皮厚度一起，被认为是反映紫外线辐射和抗癌药物对皮肤损伤程度的指标。
无毛小鼠HOS：HR-1雌性(7周大)适应了实验环境，然后分成以下6组，以保持体重值基本一致。
·非紫外线照射组(n＝2)
·紫外线照射+溶剂应用组(n＝4)
·紫外线(UVB)照射+夹竹桃麻素200nM应用组(n＝4)
·紫外线(UVB)照射+夹竹桃麻素200μM应用组n＝4)
·紫外线(UVB)照射+Y-27632 2μM应用组(n＝4)
·紫外线(UVB)照射+Y-27632 20μM应用组(n＝4)
在上述溶液应用组中，从紫外线照射的前一天开始，将每种制剂的水溶液涂在无毛小鼠的背部，每天一次，持续5天。使用Yayoi紫外线照射系统(Y-UV-Lab-K-D5灯型)进行紫外线照射，每天一次，强度为150mJ/cm2。使用Cutometer CM825和TEWL TN300(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)测量各组小鼠在紫外线照射开始后第四天的角质层水含量和TEWL。测量是在小鼠背部的特定部位进行的(从脊柱中间对称的两个部位)。
图21显示了促进表皮干细胞自我复制能力的物质在应对紫外线照射时对角质层水含量保持的影响。紫外线照射后角质层的含水量明显低于没有紫外线照射的对照组，但夹竹桃麻素200μM组、Y-27632 2μM组和20μM组的角质层含水量明显升高。这表明促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质具有维持角质层水含量以应对紫外线照射的效果。
此外，本发明人分析了促进表皮干细胞自我复制能力的物质对抗紫外线照射的TEWL抑制作用。如图21所示，紫外线照射后的TEWL明显高于没有紫外线照射的对照组，但夹竹桃麻素200μM和Y-27632 20μM组的TEWL则明显降低。这表明促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质对紫外线照射引起的TEWL增加有抑制作用。
实施例13：评估皮肤弹性(紧实度)的改善
由于紫外线辐射和老化导致的真皮层状况的变化会使皮肤失去弹性(即紧实度)，导致皱纹和下垂。皮肤的弹性是通过皮肤被拉动时的拉伸和释放时的恢复弹性来衡量的。皮肤弹性的增加可能会导致皮肤的皱纹、下垂或紧实度的改善。
无毛小鼠HOS：HR-1雌性(7周大)适应了实验环境，并被分组为以下三组(n＝4)，以保持体重值基本一致。
·非紫外线照射组
·紫外线(UVA+UVB)照射+溶剂应用组
·紫外线(UVA+UVB)照射+200μM夹竹桃麻素应用组
在这项研究中，从紫外线照射的前一天开始，每天将每种制剂的水溶液涂在背部，每周三次，持续五周。使用Yayoi紫外线照射器(Y-UV-Lab-K-D5灯型)进行UVB照射，强度为2J/cm2 UVA和150mJ/cm2 UVB，每周三次，共五周。
紫外线照射开始后5周，在每组的背部(相对于脊柱中间的两个对称位置)进行皮肤弹性测量。使用Cutometer MPA580(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)测量皮肤弹性(参数设置：300mba，开启时间2秒，关闭时间2秒)，使用三次测量的平均值进行分析。对小鼠背部的皮肤进行2秒的抽吸，然后在2秒后释放抽吸，测量抽吸后、释放抽吸前和释放抽吸后各时间点的皮肤拉伸长度，并计算出以下数值：抽吸开始时的快速拉伸(Ue：单位mm)，释放抽吸前的最大皮肤拉伸(Uf：单位mm)，快速回收(Ur：单位mm)。R5＝Ur/Ue被用作净弹性的指数，R7＝Ur/Uf被用作弹性的指数。
如图22所示，紫外线照射明显降低了皮肤弹性值，但与对比组相比，应用了促进表皮干细胞自我复制能力的物质的试验组，皮肤弹性明显改善。皮肤弹性的增加可能会导致皱纹、下垂或皮肤紧致度的改善。这表明，应用促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质可以改善皮肤的皱纹、松弛或紧实。
实施例14：评估长期使用后皮肤弹性(皮肤紧实度)的改善试验
为了研究促进表皮干细胞的细胞竞争能力的物质对皮肤弹性的影响，雌性无毛小鼠(HOS：HR-1)(7周龄)适应了实验环境，然后分为以下三组(n＝2)，使其体重值基本相等。适应后，将动物分为以下三组(n＝2)，以使体重值基本一致：
·对照组(溶剂)
·夹竹桃麻素200μM应用组
·视黄醇0.1％应用组
将每种制剂的水溶液涂在背部，每天一次，每周三次，持续七周。在开始使用后7周(第53天)，在每组小鼠的背部(与脊柱中间对称的两个部位)进行TEWL和皮肤弹性测量。TEWL的测量是在小鼠背部的特定部位进行的(从脊柱中间对称地位于左右两侧的两个部位)。用Cutometer MPA580(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)测量皮肤的弹性(参数设置：300mba，开启时间2秒，关闭时间2秒)，并使用三次测量的平均值进行分析。将小鼠背部的皮肤抽吸2秒，然后在2秒后释放抽吸。在每个时间点测量抽吸后、释放抽吸前和释放抽吸后立即拉伸的皮肤长度。释放抽吸时皮肤的回位(Ua：单位mm)，抽吸开始时的快速延伸(Ue：单位mm)释放抽吸前立即的最大皮肤延长(Uf：单位毫米)，以及在释放吸力后立即迅速恢复(Ur：单位毫米)。R5＝Ur/Ue被设定为净弹性的指数，R7＝Ur/Uf为弹性的指数。R2＝Ua/Uf被设定为总弹性的指数。
如图23所示，与对比者视黄醇相比，长期持续应用促进表皮干细胞自我复制的物质的试验组在所有三个指标上都明显改善了皮肤弹性。此外，视黄醇明显增加了皮肤的TEWL，并在连续应用时抑制了皮肤的屏障功能，而促进表皮干细胞自我复制能力的物质则保持了正常的屏障功能。持续应用促进表皮干细胞自我复制的物质可以增加皮肤的弹性，防止皮肤出现皱纹、松弛和紧实，同时保持皮肤的正常屏障功能。
实施例15：皱纹改善试验
在长期暴露于紫外线(UVA)而诱发形成皱纹的小鼠模型中，一种促进表皮干细胞自我复制能力的物质被证明能够改善皱纹。
无毛小鼠HOS：HR-1雌性(7周大)适应了实验环境，然后分为以下三组，以保持体重值基本一致。
·非紫外线照射组(n＝2)
·紫外线(UVA+UVB)照射+溶剂应用组(n＝4)
·紫外线(UVA+UVB)照射+夹竹桃麻素200μM应用组(n＝4)
·紫外线(UVA+UVB)照射+0.1％视黄醇应用组(n＝2)
在上述溶液应用组中，从紫外线照射的前一天开始，每天一次将每种制剂的水溶液涂抹在无毛小鼠的背部，每周三次，持续五周。在“紫外线+溶剂应用组”中，以同样的方式应用夹竹桃麻素的溶剂(50％乙醇/PBS)。已被证明能有效改善皱纹的视黄醇以同样的方式涂抹，浓度为0.1％，作为对照组。使用Yayoi紫外线照射系统(Y-UV-Lab-K-D5灯型)进行UVB照射，强度为20J/cm2的UVA和100mJ/cm2的UVB，每周三次，为期四周。
对于每组小鼠，从紫外线照射开始后的第一周到第四周，用高分辨率的三维图像分析系统PRIMOS-CR(Canfield Scientific，Integral公司，美国)对背部进行了拍照。根据获得的图像，用Primos OMC3_22软件测量总皱纹体积(mm3)和平均总皱纹深度(μm)。使用Cutometer MPA580(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)测量皮肤弹性，并将R0的值作为皮肤弹性；R0的值反映了角质的状态，是皮肤弹性的一个指标。使用Tewameter TN300(Courage+Khazaka，Integral公司，德国)在每组的背部(脊柱中部的两个对称点)测量TEWL。
如图24所示，紫外线照射会显著增加皮肤皱纹，但应用了促进表皮干细胞的细胞竞争力的物质的试验组，比对照组的皱纹形成要少，而且这种程度比视黄醇更明显。测量了皱纹的总体积(mm3)和皱纹的平均深度(μm)，如图24所示，紫外线照射明显增加了皮肤的皱纹数量，但在用促进表皮干细胞竞争能力的物质处理的试验组中，皱纹明显改善。这表明，应用促进表皮干细胞自我复制能力的物质可以改善皮肤皱纹。
测量每组小鼠的经表皮水分蒸发率(TEWL)，与其他组相比，观察到涂抹视黄醇组的TEWL显著增加(图25)。另一方面，用促进表皮干细胞自我复制能力的物质处理所组成的群组别中，其TEWL值与对照组没有差异，这表明这些物质在减少皱纹的同时保持了正常的屏障功能。
由于视黄醇中的TEWL明显增强，因此对每组小鼠的皮肤弹性(R0)进行了测量，这应该是反映角质层的状态。结果显示，尽管紫外线照射显著降低了皮肤弹性值，但与比较者视黄醇相比，应用了促进表皮干细胞自我复制能力的物质的试验组明显改善了皮肤弹性(图26)。这表明促进表皮干细胞竞争能力的物质在改善皱纹的同时保持良好的角质层状态方面比视黄醇有更好的效果。
实施例16：皮肤粗糙度改善试验(夹竹桃麻素)
用10％月桂醇硫酸钠(SDS)溶液诱发的皮肤刺激模型(该试验作为化学品诱发的皮肤损伤的标准)来评估一种促进表皮干细胞竞争性自我复制能力的物质(夹竹桃麻素)对皮肤刺激预防或改善剂中皮肤刺激的影响。
无毛小鼠(HOS：HR-1)(7周大)适应了实验环境，并被分为以下三组，以保持体重基本一致。
·SDS无处理组(n＝2)
·SDS处理+溶剂应用组(n＝4)
·SDS处理+夹竹桃麻素200μM应用组(n＝4)
在第1、2、3和4天，将浸泡在500μL 10％ SDS溶液(溶于70％乙醇)中的棉签涂在无毛小鼠的背部，持续30分钟。从研究的前一天开始，每天在背部涂抹夹竹桃麻素，直到第4天。在研究开始后的第三天，以与上述相同的方式，在背部的特定部位(从脊柱中间开始对称地位于脊柱左右两侧的两个部位)测量每组小鼠的TEWL。第八天，用一个高分辨率的三维图像分析系统PRIMOS-CR(Canfield Scientific，Integral公司，美国)拍摄图像。PrimosOMC3_22软件用于测量皮肤粗糙程度，以Ra(算术平均粗糙度)和Rz(十点平均粗糙度)表示，这是高度方向的参数，代表皮肤的表面粗糙度。
从图27和28所示的测试结果来看，SDS处理的对照组显示TEWL明显增加，皮肤粗糙度的指标Ra和Rz值增加，并明显诱发皮肤粗糙度。另一方面，在用一种促进表皮干细胞自我复制能力的物质(夹竹桃麻素)处理的小鼠中，与溶剂处理的对照组相比，背部的TEWL明显降低，背部表面的Ra和Rz值也明显减少。
这些结果表明，促进表皮干细胞自我复制能力的物质(夹竹桃麻素)对粗糙皮肤有明显的预防或改善作用。
实施例17：皮肤粗糙度改善试验(依布硒啉)。
用10％月桂醇硫酸钠(SDS)溶液诱发的皮肤刺激模型涂抹一种促进表皮干细胞自我复制能力的物质(依布硒啉)来评估皮肤刺激预防或改善剂改善皮肤刺激的作用。
在无毛小鼠的背部，在第1、2、3和4天，用500微升的10％SDS溶液(溶于70％的乙醇)浸润的棉球，持续30分钟。从研究的前一天开始，每天在背部涂抹依布硒啉，直到第4天。在研究开始后的第八天，对每组小鼠在背部的特定部位(从脊柱中间开始左右对称的两个部位)测量TEWL，如上其中所述。同时，用一个高分辨率的三维图像分析系统PRIMOS-CR(Canfield Scientific，Integral公司，美国)拍摄图像。Primos OMC3_22软件用于测量皮肤粗糙程度，以Ra(算术平均粗糙度)和Rz(十点平均粗糙度)为标准，这些参数在高度方向上代表表面粗糙度。
从图29和30所示的测试结果来看，SDS处理的对照组显示TEWL明显增加，皮肤粗糙度的指标Ra和Rz值增加，并明显诱发皮肤粗糙度。另一方面，与溶剂处理的对照组相比，用一种促进表皮干细胞自我复制能力的物质(依布硒啉)处理的小鼠，背部的TEWL明显降低，背部表面的Ra和Rz值明显降低。
这些结果表明，促进表皮干细胞自我复制能力的物质(依布硒啉)对皮肤粗糙有明显的预防或改善作用。
实施例18：人体皮肤粗糙度改善试验
用促进表皮干细胞自我复制能力的物质(夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布)治疗两名受试者，采用10％月桂醇硫酸钠(SDS)溶液诱发的皮肤刺激试验(该试验是化学品诱发的人类皮肤损伤的标准)来防止或改善皮肤刺激性评估了这些药剂对改善皮肤粗糙度的效果。
在每个受试者的前臂内侧放置六个1.5厘米的方块，并对每个方块进行以下处理
·SDS无处理组(70％乙醇处理)
·SDS处理+溶剂(50％乙醇/PBS)应用组
·SDS处理+夹竹桃麻素(200μM)溶液应用组
·SDS处理+依布硒啉(0.25％)溶液应用组
·SDS处理+塞来昔布(2％)溶液应用组
在第0天和第1天，用500μL的10％ SDS溶液(溶于70％的乙醇)渗透的棉球涂抹在测试区域，持续30分钟。在第0天的SDS处理前后施用夹竹桃麻素，然后每天在试验区施用一次，直到第9天。在SDS处理之前和之后，以及从第1天到第7天每天测量每个测试区域的TEWL。对于每个区域，从测量日的TEWL值中减去SDS处理前的TEWL值，并将此值作为评估的"ΔTEWL"。此外，用数码相机和高分辨率三维图像分析仪PRIMOS-CR(Canfield Scientific，Integral公司，美国)对试验区进行了拍照。对于PRIMOS图像，本发明人使用Primos OMC3_22软件，以"Ry"(最大高度)和"Rz"(平均表面粗糙度)测量粗糙程度。对于每个区域，用测量日的Rz或Ry值减去SDS未处理对照的Rz或Ry值得到的值被指定为"ΔRz"和"ΔRy"，这些值被用于评估。
图31-33显示了测试的结果。如图31所示，在SDS处理后，对照组和受各溶液影响的区域明显可见发红和粗糙，但在第7天，虽然受对照组溶液影响的区域继续发红和粗糙，但在受夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布影响的区域却明显减少。此外，在第16天，受夹竹桃麻素影响的区域没有色素沉着，而受对照组影响的区域有色素沉着。此外，如图32所示，应用夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布可显著降低ΔTEWL值，而SDS引起的皮肤刺激则显著增加ΔTEWL值。此外，从图33的结果中可以看出，当根据皮肤表面的高分辨率照片分析皮肤纹理时，可以看到SDS处理的对照组明显诱发皮肤粗糙，而应用夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布后，皮肤粗糙度明显降低。此外，表示皮肤表面粗糙度的ΔRz和ΔRy值在SDS处理的对照组中明显增加，而在施用夹竹桃麻素、依布硒啉和塞来昔布后，这些值在受影响的部位明显减少。这表明，通过促进表皮干细胞竞争性自我复制的物质，SDS溶液诱发的皮肤粗糙和色素沉着得到了明显改善。
图31-33的结果显示，促进表皮干细胞竞争性自我复制的物质对预防或改善人类的皮肤刺激有明显的作用，对预防和治疗由化学物质引起的皮肤病有效果。
制造实例1
(1)生产罗布麻的提取物
该提取物由Tokiwa Phytochemical Co.Ltd将罗布麻(Apocynum venetum)的干燥叶子压碎，在压碎的材料中加入60％的乙醇，加热并循环，然后过滤，得到提取物。合并第一和第二提取液，减压浓缩，调整pH值至3，并搅拌过夜。将第一和第二种提取物合并，减压浓缩，调整pH值至3，并搅拌过夜。将滤液通过合成吸附树脂，用水洗涤，收集用70％乙醇解吸的部分，减压浓缩，喷雾干燥，得到拉呋玛提取物。
(2)桑树(Morus alba)提取物
桑葚提取物是由Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.生产的。在桑树(Morus alba)的叶子中加入50％的乙醇，在加热和回流后，过滤提取物。提取物在减压下浓缩后，加入赋形剂，并将提取物干燥，得到桑葚提取物。
(3)生产金鸡菊(Gymnema sylvestre)提取物
武靴藤提取物来自于Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.。将碾碎的金鸡菊(Gymnemasylvestre)叶子用70％的乙醇在回流中提取，并过滤得到提取物。提取物在减压下浓缩，然后减压干燥，得到武靴藤提取物。
(4)茶叶(Camellia sinensis)提取物
茶叶提取物是由Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.生产的。用热水提取茶叶(Camellia sinensis)，并过滤以获得提取物。提取物经吸附树脂提纯，减压浓缩并干燥，得到茶叶提取物。
(5)水飞蓟(Silybum marianum)提取物
水飞蓟的提取物来自于Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.。用90-95％的乙醇回流提取水飞蓟(Silybum marianum)，并过滤以获得提取物。提取物在减压下浓缩，用乙醇提纯，然后在减压下浓缩，在温暖的空气中干燥，得到水飞蓟提取物。
(6)枇杷(Eriobotrya japonica)叶提取物
琵琶叶提取物由Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.生产。将粉碎的枇杷(Eriobotrya japonica)叶子用80％的乙醇进行热回流提取，过滤后得到提取物。在提取物中加入活性炭进行脱色，然后将脱色的液体减压浓缩并减压干燥，得到枇杷叶提取物。
(7)生产黑姜黄(Kaempferia parviflora)提取物
黑姜黄提取物是由Tokiwa Phytochemical Co.Ltd.生产的。将黑姜黄(Kaempferia parviflora)根茎的干燥碎片用搅拌机粉碎，向粉碎的材料中加入80％的乙醇，加热至回流，然后过滤，得到提取物。将第一和第二种提取物合并，减压浓缩，加入辅料，减压干燥，得到黑姜黄提取物。
生产实例2
表4中所示的植物提取物是使用规定的提取溶剂从各种植物的相应部位提取的。
[表4]
尽管这里显示了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员来说，显然提供这样的实施方案仅仅是为了说明问题，而且本领域的技术人员能够在不偏离本发明的情况下做出各种变化、改变和替换。应该理解的是，在实施本发明的过程中，可以使用本文描述的本发明的各种替代实施方案。还应解释为，这里提到的所有出版物，包括专利和专利申请文件的内容，都是通过参考而纳入本文规定的内容。本申请要求获得第2019-59616号特别申请(申请日期：2019年3月27日)的优先权，该申请的全部内容通过引用纳入本文。
工业实用性
如上其中所述，本发明人发现COL17A1(十七型胶原蛋白)参与皮肤老化和再生，以及抗癌药物和辐射造成的皮肤损伤，并确定了对促进皮肤伤口愈合、抑制皮肤老化、控制细胞竞争和提高表皮干细胞再生能力有用的成分。研究的结果由于抗癌药物引起的皮肤损伤而继续治疗是一个重大挑战，也是一个预后问题。在接受癌症治疗期间继续工作的癌症患者人数每年都在增加，对外观护理的需求非常高。本申请中公开的组合物、细胞和方法可有效地用于继续抗癌药物治疗、外科治疗、再生医学和美学等领域。

Claims (19)

1.诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质在制备用于抑制皮肤老化的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持COL17A1表达的所述物质选自由以下组成的组：NADPH氧化酶抑制剂、COX抑制剂、iNOS抑制剂、ROCK抑制剂和雌激素类物质。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述NADPH氧化酶抑制剂是一种化合物，其选自由以下组成的组：夹竹桃麻素、依布硒啉、二亞苯基碘(DPI)、GKT137831、AEBSF、GK-136901、ML171、辅酶Q10(CoQ10)、VAS2870和VAS3947。
4.根据权利要求2所述的用途，其中，所述COX抑制剂选自由以下组成的组：塞来昔布、地拉考昔、托芬那酸、尼氟酸、FR122047、LM-1685、SC-791、BTB02472、尼美舒利、SPB04674、姜黄素、双氯芬酸、4’-羟基双氯芬酸、DuP-697、依布硒啉、ETYA、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、美洛昔康、NPPB、NS-398、紫檀芪、白藜芦醇、SC-560、SKF-86002、TXA(氨甲环酸)、TXC(十六烷基氨甲环酸盐酸盐)、胡萝卜提取物和硫化舒林酸。
5.根据权利要求2所述的用途，其中，所述iNOS抑制剂选自由以下组成的组：1400W、L-NIL、氨基胍、BYK190123、S-乙基异硫脲、S-甲基异硫脲、S-氨基乙基异硫脲、2-亚氨基哌啶、丁胺、ONO-1714((1S,5S,6R,7R)-7-氯-3-亚氨基-5-甲基-2-氮杂双环[4.1.0]庚烷盐酸盐)、AMT盐酸盐(2-氨基-5，6-二氢-6盐酸盐)、AR-C102222、L-NG-硝基精氨酸、L-NG-单甲基精氨酸、L-硝基精氨酸甲酯、L-NIO、地塞米松、雌激素、虾青素和芹菜素。
6.根据权利要求2所述的用途，其中，所述ROCK抑制剂选自由以下组成的组：Y-27632、利帕舒地尔(K-115)、噻唑啉(Thiazovivin)、法舒地尔(HA-1077)、GSK429286A、RKI-1447、GSK269962、奈达舒地尔(AR-13324)、Y-39983、ZINC00881524、KD025、羟基法舒地尔(HA-1100)、GSK180736A和AT13148。
7.根据权利要求2所述的用途，其中，所述雌激素类物质选自由以下组成的组：雌激素、炔雌醇、生物链素A、大豆提取物、异黄酮、射干根提取物和葛根提取物。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质选自由以下组成的组：夹竹桃麻素、依布硒啉、塞来昔布、芹菜素、Y-27632、利帕斯地尔、1400W、炔雌醇、生物链素A、坏死抑制素1、罗布麻叶/茎提取物、桑叶提取物、武靴藤叶提取物、绿茶提取物、枇杷叶提取物、水飞蓟提取物、小花山柰提取物、车前草种子提取物、咖啡种子提取物、梧桐叶提取物、楝树叶提取物、柑橘皮提取物、薰衣草花提取物、狭叶苦参根提取物、水稻提取物、犬蔷薇果提取物、金缕梅叶提取物、蓝桉叶提取物、山楂提取物和人参根提取物。
9.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质是夹竹桃麻素。
10.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质是依布硒啉。
11.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质是塞来昔布。
12.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质是芹菜素。
13.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质是氨基胍。
14.根据权利要求1所述的用途，其中，诱导或维持细胞中COL17A1表达的所述物质是小花山柰提取物。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的用途，其中，所述组合物是药物组合物、化妆品组合物、食品组合物、保健食品、功能性食品或补充剂、或搽剂、片剂、粉末、半固体、胶冻或液体。
16.诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质在制备用于提高表皮干细胞再生能力的药物中的用途。
17.诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质在制备用于抗皱治疗的药物中的用途。
18.诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质在制备用于抗斑治疗的药物中的用途。
19.诱导或维持细胞中COL17A1表达的物质在制备用于改善粗糙皮肤的药物中的用途。
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