CN118076634A - 抗TGFβ1、2、3抗体及其治疗用途 - Google Patents

Abstract

本公开涵盖新型抗TGFβ1、2、3抗体和编码其的多核苷酸。本公开进一步提供了本发明的新型抗体和/或核苷酸的用途，其用于治疗和/或预防TGFβ相关病症，特别是用于管理犬科动物和猫科动物的纤维化相关病症。

Description

抗TGFβ1、2、3抗体及其治疗用途

技术领域

本申请涉及单克隆抗体、其产生方法以及这些抗体的治疗用途。在某些实施例中，所述单克隆抗体针对转化生长因子β(TGFβ、TGFB、TGFb或TGFβ(TGFbeta))。在其它实施例中，所述抗体是嵌合抗体或物种形成的抗体。在其它实施例中，公开了包括本发明的抗体的治疗方法。

背景技术

转化生长因子β(TGFB、TGFβ(TGFβ或TGF beta)，如本文中可互换使用)是一种控制许多关键细胞功能，包含增殖、分化、存活、迁移和上皮间充质转化的细胞因子。其是包含TGFβ、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子、抑制素和激活素的38种细胞因子超家族的成员。TGFβ蛋白调控多种生物过程，如细胞外基质形成、伤口愈合、胚胎发育、骨发育、造血、免疫和炎性应答以及恶性转化。TGFβ的失调会导致病理病状，包含出生缺陷、癌症、慢性炎症、自身免疫和纤维化疾病。

TGFβ有三种已知的同种型TGFβ1、2和3。所有三种同种型最初都被翻译为前肽。这些同种型在内质网中合成为大的前体蛋白(前TGFβ)从而形成二聚体复合物，并且随后在羧基末端附近切割，以产生在三种TGFβ同种型中共享60-80％保守性的成熟的112个氨基酸多肽。成熟的TGFβ二聚体仍然作为一种无活性潜在复合物与前体的切割潜在肽部分相关。新合成的TGFβ与潜在相关肽(LAP)结合，从而形成小的潜在复合物(SLC)，其具有生物活性并且不能与其受体TGFβRII结合。通过形成二硫键，此复合物与潜在的TGFβ结合蛋白(LTBP)松散地结合，以形成大的潜在复合物(LLC)。TGFβ然后以潜在状态分泌并储存在细胞外基质(ECM)中。TGFβ的激活涉及暴露于多种不同因子后从潜在复合物中释放，所述多种不同因子包含整合素、蛋白酶、金属蛋白酶、活性氧(ROS)、纤溶酶和酸，这允许与其细胞表面受体结合以启动TGFβ信号传导。

TGFβ1、2和3的功能是多效性的，并且跨细胞和组织类型以不同的模式表达。其具有类似的体外活性，尽管共享与同一受体结合的能力，但在特定细胞类型中的个体敲除表明在体内的作用不相同，(Akhurst等人,《自然综述：药物发现(Nat Rev Drug Discov)》(2012)11(10):790-811)。在TGFβ与TGFβRII结合后，受体的组成性激酶活性磷酸化并激活TGFβRI，这进而使SMAD2/3磷酸化，从而与SMAD4缔合。这种复合物定位于细胞核，并作为TGFβ应答基因的转录因子。除了这种典型信号传导级联，非典型通路还通过其它因子，包含p38、MAPK、PI3K、AKT、JUN、JNK和NK-KB传递信号。最终结果是整合了细胞的状态和环境的所有这些信号传导通路的串扰。

许多严重疾病与TGFβ诱导的信号传导通路的功能障碍有关。本发明针对犬科动物和猫科动物两者的慢性肾病(CKD)的潜在治疗。CKD涉及由于一个长期的、渐进的过程而导致的功能性肾组织的丧失。尽管肾结构和功能变化只是松散相关的，但可以看到肾结构的显著变化。疾病通常在临床上显著之前会持续数月或数年，而且总是不可逆转的。尽管先天性疾病导致>3岁的动物的患病率短暂增加，但从5-6岁起，患病率随着年龄的增长而增加。在老年群体中，CKD影响多达10％的狗和40-80％的猫。在兽医领域，狗和猫两者都有治疗CKD的明显且未得到满足的需求，这被认为是一种受TGFβ蛋白过度产生影响的病状。

发明内容

本发明提供了与TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合的新型抗转化生长因子β(TGFB、TGFβ(TGFbeta)、TGFb或TGFβ，如本文所定义且可互换使用的)抗原结合蛋白(抗体、抗体片段、拮抗剂抗体，如本文所定义且可互换使用的)。本发明的抗原结合蛋白阻断TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的生物活性，从而阻止TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3与其受体的结合，并阻止与结合相关的通路的激活。另外，本发明提供了本发明的抗体的拮抗剂作用预防和/或治疗如本文所定义的TGFβ相关病症。本发明进一步提供编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸以及载体和宿主细胞的产生。本发明进一步提供了制备和使用所述抗体/抗原结合蛋白的方法，以及通过施用本发明的抗体来治疗犬科动物和猫科动物的TGFβ病症的方法。

一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与犬科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合，并且包括：重链互补决定区(CDR)，所述重链CDR包括SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:39；以及轻链互补决定区(CDR)，所述轻链CDR包括SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5，和其变体，其中所述抗体进一步包括犬科动物IgGB恒定区，所述犬科动物IgGB恒定区包括与SEQ ID NO:77具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与犬科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合，并且包括：重链可变区(VH)，所述VH与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性：SEQ ID NO:42-54；以及轻链可变区(VL)，所述VL与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性：SEQ ID NO:67-70。

在一个实施例中，所述抗体包括犬科化抗体。

一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与猫科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合，所述抗体包括：重链互补决定区(CDR)，所述重链CDR作为SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:39；以及轻链互补决定区(CDR)，所述轻链CDR作为SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5，和其变体，其中所述抗体包括猫科动物IgG1a恒定区，所述猫科动物IgG1a恒定区包括与SEQ ID NO:75具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与猫科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合，所述抗体包括

a.可变重(VH)链，所述VH链包括：

i.互补决定区1(CDR1)，所述CDR1包括与包括SEQ ID NO:22(G-Y-X1-X2-X3-S-N-V-X4-X5)的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列，其中：

·X1包括T或G；

·X2包括F或P；

·X3包括S或T；

·X4包括M或I；

·X5包括H或S；以及

ii.互补决定区2(CDR2)，所述CDR2包括与包括SEQ ID NO:32(X6-V-I-P-I-V-D-I-A-X7-Y-A-X8-X9-X10-X11-G-R)的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列，其中：

·X6包括G、Y或S；

·X7包括N、Y或T；

·X8包括Q或R；

·X9包括R或S；

·X10包括F或V；

·X11包括K或Q；以及

iii.互补决定区3(CDR3)，所述CDR3包括与包括SEQ ID NO:38(A-X12-T-L-G-L-V-L-D-A-M-D-Y)的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列，其中：

·X12包括R或S；以及

b.轻链可变区(VL)，所述VL包括：

i.互补决定区1(CDR1)，所述CDR1包括与包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；

ii.互补决定区2(CDR2)，所述CDR2包括与包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；

iii.互补决定区3(CDR3)，所述CDR3包括与包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；

和其任何变体，所述变体具有一个或多个保守氨基酸取代；其中所述抗体包括猫科动物IgG1a恒定区，所述猫科动物IgG1a恒定区包括与SEQ ID NO:75具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明提供了一种抗体，所述抗体包括：重链可变区(VH)，所述VH与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性：SEQ ID NO:87-94；以及轻链可变区(VL)，所述VL与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性：SEQ ID NO:6-13，和其任何变体，所述变体具有一个或多个保守氨基酸取代。

在一个实施例中，本发明提供一种抗体，所述抗体包括猫科化抗体。

在一个实施例中，本发明提供一种抗体，所述抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、单链抗体、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、单结构域抗体、dAb片段、小型模块化免疫药物(SMIP)纳米抗体和IgNAR分子。在一个实施例中，所述抗体包括单克隆抗体。

在一个或多个实施例中，本发明提供了一种用于治疗TGFβ相关病症的抗体。在一个实施例中，所述TGFβ相关病症选自由以下组成的组：纤维化病症、结缔组织病症、骨病症和细胞增殖病症。在一个实施例中，所述TGFβ相关病症包括纤维化病症。在一个实施例中，所述纤维化病症选自由以下组成的组：肾纤维化/慢性肾病；肺纤维化；肝硬化；胶质瘢痕；以及全身性硬化症/硬皮病。在一个实施例中，所述TGFβ相关病症是肾纤维化/慢性肾病。

一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载剂。

一方面，本发明提供了一种通过以下治疗受试者的TGFβ相关病症的方法：向所述受试者施用治疗量的本发明的药物组合物。在一个实施例中，所述受试者包括犬科动物。在一些实施例中，所述受试者包括猫科动物。在一个或多个实施例中，所述TGFβ相关病症选自由以下组成的组：纤维化病症、结缔组织病症、骨病症和细胞增殖病症。在一个实施例中，所述TGFβ相关病症包括纤维化病症。在一个实施例中，所述纤维化病症选自由以下组成的组：肾纤维化/慢性肾病；肺纤维化；肝硬化；胶质瘢痕；以及全身性硬化症/硬皮病。在一个实施例中，所述TGFβ病症是肾纤维化/慢性肾病。

一方面，本发明提供了一种通过以下抑制受试者的TGFβ1、2和3活性的方法：施用本发明的药物组合物。在一个实施例中，所述受试者包括犬科动物。在一些实施例中，所述受试者包括猫科动物。

一方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列与编码本发明的一种或多种抗体和其任何变体的核酸序列具有至少约95％序列同一性，所述抗体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

一方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码本发明的一种或多种抗体和其任何变体，其中所述序列包括编码与SEQ ID NO:55-66具有95％序列同一性的VH的核苷酸序列和编码与SEQ ID NO:71-74具有95％序列同一性的VL的核苷酸序列，所述变体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

一方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码本发明的一种或多种抗体和其任何变体，其中所述序列包括编码与SEQ ID NO:97-104具有95％序列同一性的VH的核苷酸序列和编码与SEQ ID NO:14-21具有95％序列同一性的VL的核苷酸序列，所述变体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

一方面，本发明提供了一种载体，所述载体包括本发明的核酸序列中的一种或多种。

一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明的核酸序列中的一种或多种。

一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明的载体。

一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞产生本发明的抗体。

一方面，本发明提供一种通过在使得产生所述抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或所述宿主细胞的培养基中分离所述抗体来产生本发明的抗体的方法。

附图说明

图1表示突出显示了抗原结合位点的天然小鼠免疫球蛋白G(IgG)的一般结构的实例。

图2是小鼠:犬科动物IgG的一个实施例的一般结构的示意图。

图3表示异源嵌合分子。

图4表示小鼠IgG的物种形成或犬科化。

序列简要说明

·SEQ ID NO:1猫科动物/人嵌合体抗TGFβ1、2、3VH氨基酸序列

·SEQ ID NO:2猫科动物/人嵌合体抗TGFβ1、2、3VH核酸序列

·SEQ ID NO:3抗TGFβ1、2、3VL CDR1氨基酸序列

·SEQ ID NO:4抗TGFβ1、2、3VL CDR1氨基酸序列

·SEQ ID NO:5抗TGFβ1、2、3VL CDR1氨基酸序列

·SEQ ID NO:6猫科化抗TGFβ1、2、3VL1氨基酸序列

·SEQ ID NO:7猫科化抗TGFβ1、2、3VL2氨基酸序列

·SEQ ID NO:8猫科化抗TGFβ1、2、3VL3氨基酸序列

·SEQ ID NO:9猫科化抗TGFβ1、2、3VL4氨基酸序列

·SEQ ID NO:10猫科化抗TGFβ1、2、3VL5氨基酸序列

·SEQ ID NO:11猫科化抗TGFβ1、2、3VL6氨基酸序列

·SEQ ID NO:12猫科化抗TGFβ1、2、3VL7氨基酸序列

·SEQ ID NO:13猫科化抗TGFβ1、2、3VL8氨基酸序列

·SEQ ID NO:14猫科化抗TGFβ1、2、3VL1核酸序列

·SEQ ID NO:15猫科化抗TGFβ1、2、3VL2核酸序列

·SEQ ID NO:16猫科化抗TGFβ1、2、3VL3核酸序列

·SEQ ID NO:17猫科化抗TGFβ1、2、3VL4核酸序列

·SEQ ID NO:18猫科化抗TGFβ1、2、3VL5核酸序列

·SEQ ID NO:19猫科化抗TGFβ1、2、3VL6核酸序列

·SEQ ID NO:20猫科化抗TGFβ1、2、3VL7核酸序列

·SEQ ID NO:21猫科化抗TGFβ1、2、3VL8核酸序列

·SEQ ID NO:22抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸化学式

·SEQ ID NO:23抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸序列

·SEQ ID NO:24猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH8、VH2.8、VH3.8

·SEQ ID NO:25猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH9

·SEQ ID NO:26猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH4

·SEQ ID NO:27猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH3

·SEQ ID NO:28猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH3.2

·SEQ ID NO:29猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH2.1

·SEQ ID NO:30猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH6.1

·SEQ ID NO:31猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR1氨基酸：VH2.2

·SEQ ID NO:32猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR2氨基酸：化学式

·SEQ ID NO:33抗TGFβ1、2、3VH CDR2氨基酸

·SEQ ID NO:34猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR2氨基酸：VH8、VH4.3、VH2.1、VH 6.1、VH2.8、VH3.8

·SEQ ID NO:35猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR2氨基酸：VH9

·SEQ ID NO:36猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR2氨基酸：VH3.2

·SEQ ID NO:37猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR2氨基酸：VH2.2

·SEQ ID NO:38猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR3氨基酸：化学式

·SEQ ID NO:39抗TGFβ1、2、3VH CDR3氨基酸

·SEQ ID NO:40针对VH8、VH9氨基酸序列的猫科化抗TGFβ1、2、3VH CDR3

·SEQ ID NO:41针对VH3、VH 3.2、VH 2.2氨基酸序列的猫科化抗TGFβ1、2、3VHCDR3

·SEQ ID NO:42犬科化抗TGFβ1、2、3VH2氨基酸序列

·SEQ ID NO:43犬科化抗TGFβ1、2、3VH6氨基酸序列

·SEQ ID NO:44犬科化抗TGFβ1、2、3VH3氨基酸序列

·SEQ ID NO:45犬科化抗TGFβ1、2、3VH4氨基酸序列

·SEQ ID NO:46犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.11氨基酸序列

·SEQ ID NO:47犬科化抗TGFβ1、2、3VH5.10氨基酸序列

·SEQ ID NO:48犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.5氨基酸序列

·SEQ ID NO:49犬科化抗TGFβ1、2、3VH3.1氨基酸序列

·SEQ ID NO:50犬科化抗TGFβ1、2、3VH3.5氨基酸序列

·SEQ ID NO:51犬科化抗TGFβ1、2、3VH3.6氨基酸序列

·SEQ ID NO:52犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.7氨基酸序列

·SEQ ID NO:53犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.11氨基酸序列

·SEQ ID NO:54犬科化抗TGFβ1、2、3VH5.6氨基酸序列

·SEQ ID NO:55犬科化抗TGFβ1、2、3VH2核酸序列

·SEQ ID NO:56犬科化抗TGFβ1、2、3VH6核酸序列

·SEQ ID NO:57犬科化抗TGFβ1、2、3VH3核酸序列

·SEQ ID NO:58犬科化抗TGFβ1、2、3VH4核酸序列

·SEQ ID NO:59犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.11核酸序列

·SEQ ID NO:60犬科化抗TGFβ1、2、3VH5.10核酸序列

·SEQ ID NO:61犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.5核酸序列

·SEQ ID NO:62犬科化抗TGFβ1、2、3VH3.1核酸序列

·SEQ ID NO:63犬科化抗TGFβ1、2、3VH3.5核酸序列

·SEQ ID NO:64犬科化抗TGFβ1、2、3VH3.6核酸序列

·SEQ ID NO:65犬科化抗TGFβ1、2、3VH4.7核酸序列

·SEQ ID NO:66犬科化抗TGFβ1、2、3VH5.6核酸序列

·SEQ ID NO:67犬科化抗TGFβ1、2、3VL1氨基酸序列

·SEQ ID NO:68犬科化抗TGFβ1、2、3VL2氨基酸序列

·SEQ ID NO:69犬科化抗TGFβ1、2、3VL3氨基酸序列

·SEQ ID NO:70犬科化抗TGFβ1、2、3VL4氨基酸序列

·SEQ ID NO:71犬科化抗TGFβ1、2、3VL1核酸序列

·SEQ ID NO:72犬科化抗TGFβ1、2、3VL 2核酸序列

·SEQ ID NO:73犬科化抗TGFβ1、2、3VL3核酸序列

·SEQ ID NO:74犬科化抗TGFβ1、2、3VL 4核酸序列

·SEQ ID NO:75猫科动物重链恒定区IgG1a氨基酸序列

·SEQ ID NO:76猫科动物重链恒定区IgG1a核酸序列

·SEQ ID NO:77犬科动物重链恒定区IgGB氨基酸序列

·SEQ ID NO:78犬科动物重链恒定区IgGB核酸序列

·SEQ ID NO:79GC1008 VH氨基酸序列

·SEQ ID NO:80GC1008 VL氨基酸序列

·SEQ ID NO:81犬科动物轻链恒定区氨基酸序列

·SEQ ID NO:82犬科动物轻链恒定区核酸序列

·SEQ ID NO:83猫科动物轻链恒定区氨基酸序列

·SEQ ID NO:84猫科动物轻链恒定区核酸序列

·SEQ ID NO:85猫科化抗TGFβ1、2、3VH3氨基酸序列

·SEQ ID NO:86猫科化抗TGFβ1、2、3VH4氨基酸序列

·SEQ ID NO:87猫科化抗TGFβ1、2、3VH8氨基酸序列

·SEQ ID NO:88猫科化抗TGFβ1、2、3VH9氨基酸序列

·SEQ ID NO:89猫科化抗TGFβ1、2、3VH3.2氨基酸序列

·SEQ ID NO:90猫科化抗TGFβ1、2、3VH2.1氨基酸序列

·SEQ ID NO:91猫科化抗TGFβ1、2、3VH6.1氨基酸序列

·SEQ ID NO:92猫科化抗TGFβ1、2、3VH2.2氨基酸序列

·SEQ ID NO:93猫科化抗TGFβ1、2、3VH2.8氨基酸序列

·SEQ ID NO:94猫科化抗TGFβ1、2、3VH3.8氨基酸序列

·SEQ ID NO:95猫科化抗TGFβ1、2、3VH3核酸序列

·SEQ ID NO:96猫科化抗TGFβ1、2、3VH4核酸序列

·SEQ ID NO:97猫科化抗TGFβ1、2、3VH8核酸序列

·SEQ ID NO:98猫科化抗TGFβ1、2、3VH9核酸序列

·SEQ ID NO:99猫科化抗TGFβ1、2、3VH3.2核酸序列

·SEQ ID NO:100猫科化抗TGFβ1、2、3VH2.1核酸序列

·SEQ ID NO:101猫科化抗TGFβ1、2、3VH6.1核酸序列

·SEQ ID NO:102猫科化抗TGFβ1、2、3VH2.2核酸序列

·SEQ ID NO:103猫科化抗TGFβ1、2、3VH2.8核酸序列

·SEQ ID NO:104猫科化抗TGFβ1、2、3VH3.8核酸序列

具体实施方式

本文所公开的本发明提供了以高亲和力和特异性与TGFβ1和TGFβ2以及TGFβ蛋白结合的抗TGFβ抗体/抗体片段(术语可互换使用)。本发明进一步提供抗体和多肽以及制备和使用所述抗体的方法，所述抗体和多肽还与本文所描述的作为所述抗体的变体的TGFβ1、2和3蛋白或多肽结合。在一些实施例中，本发明还提供了编码所述抗体和/或多肽的多核苷酸。本文所公开的本发明还提供了用于通过施用治疗有效量的本文所描述的本发明的抗TGFβ1、2和3抗体以及相应变体来预防和/或治疗TGFβ相关病症的方法，所述TGFβ相关病症选自由以下组成的组：纤维化病症、结缔组织病症、骨病症和细胞增殖病症。

一般技术和定义

应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文中所使用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，并且并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求限定。除非另外定义，否则结合本文所描述的本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。通常，与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的术语表和其技术是本领域众所周知和常用的术语表和技术，并且不限于单一描述。本领域中众所周知的是，可以用不同的技术来代替所描述的技术。

出于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类公开中描述的方法的目的，所有鉴定的专利和其它公开明确地通过引用并入本文。提供这些公开仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。

标准技术用于重组DNA、寡核苷酸和多核苷酸合成、组织培养、细胞转染和转化以及本领域技术人员熟知的许多其它常用技术。本领域技术人员熟知的一般技术是根据制造商的说明书或如本领域中通常实现的或如本文所描述来执行的。

在详细描述本发明之前，将定义在本发明的上下文中使用的若干个术语。除了这些术语之外，其它术语在本说明书的其它地方根据需要进行定义。如上文和整个公开中采用的，除非另有指示，以下术语和缩写应被理解为具有以下含义。除非本文另有明确定义，否则本说明书中使用的技术术语将具有其技术公认的含义。

如在说明书和权利要求中所使用的，单数形式的“一种/一个(a/an)”以及“所述(the)”包含复数对象，除非上下文中另外明确指明。例如，对“一种抗体”的提及包含多种此类抗体。

注意，在本公开中，如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“组成(consisting)”、“组成(consisted)”、“基本上由……组成(consisting essentially of)”、“包含(includes)”、“包含(included)”等术语是根据标准的美国和国际专利法实践定义的。

贯穿本申请，术语“约”在本文用于表示某个值包含用于测定所述值的装置或方法的标准误差偏差。术语“至少约”在本文中用于指示范围的下限。例如，当术语“具有至少约95％序列同一性”时，本领域技术人员应当清楚，这包含95％序列同一性至100％序列同一性。权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出其仅指代替代方案或替代方案相互排斥，但本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有但不限于相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来指代。如多肽结构等大分子结构可以根据不同的组织水平来描述。“初级结构”是指肽的氨基酸序列。“次级结构”是指多肽内局部有序的三维结构。这些结构通常被称为结构域，例如酶结构域、细胞胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域或细胞质尾部结构域。结构域是形成多肽的紧凑单元的多肽的各部分。示例性结构域包含具有酶活性的结构域。结构域可以由较小组织的区段，如β-折叠和α-螺旋的段组成。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立的三级单元非共价缔合形成的三维结构。

术语“保守氨基酸取代”指示给定氨基酸残基的任何氨基酸取代，其中取代残基在化学上与给定残基类似，以至于不会导致多肽功能(例如，酶活性)显著降低。保守氨基酸取代在本领域中通常是已知的，并且其实例描述于例如美国专利第6790639号、第6774107号、第6,194167号或第5350576号中。在优选实施例中，保守氨基酸取代将是以下六组之一中发生的任一种：

·小的脂肪族基本上非极性残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；

·大的脂肪族非极性残基：Ile、Leu和Val；Met；

·极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp和Glu；

·极性带负电残基的酰胺：Asn和Gln；His；

·极性带正电荷的残基：Arg和Lys；His；以及

·大的芳香族残基：Trp和Tyr；Phe。

在优选实施例中，保守氨基酸取代将是以下任何一种，其如以下天然残基(保守取代)对所列出：Ala(Ser)；精氨酸(Lys)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Gin(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)和Val(Ile；Leu)。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线性或支化的，其可以可能包括经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分缀合。此外，所述定义内还包含的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包含例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应当理解，因为本发明的多肽是基于抗体的，所以多肽可以以单链或相关链的形式出现。

如本文所使用的，“抗体”、“抗原结合蛋白”等是指包括由与抗原特异性地结合并识别所述抗原的免疫球蛋白基因或其抗体片段编码的区域的多肽。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元可以包括四聚体，其中每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每条链的N端限定了主要负责抗原识别的约100个到110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链和可变重链是指这些轻链和重链。抗体例如以完整的免疫球蛋白或以通过用各种肽酶消化产生的若干个充分表征片段形式存在。尽管就完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是本领域的技术人员将理解，可以化学或通过使用重组DNA方法重新合成此类片段。因此，如本文所使用的，术语“抗体”还包含通过修饰整个抗体产生的抗体片段或通过重组DNA方法从头合成的抗体片段或通过使用本领域中已知的其它方法鉴定的抗体片段

来自任何脊椎动物物种的如本文所使用的完整抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两种明显不同类型中的一种。所有轻链都含有一个可变结构域(V_L)和一个恒定结构域(C_L)。如本文所描述，存在几种不同类型的重链，其定义了抗体的类别或同种型。所有重链都含有一系列免疫球蛋白结构域，通常具有三个恒定结构域(C_H1、C_H2和C_H3)和一个对结合抗原很重要的可变结构域(V_H)。

术语“可变”区包括框架和CDR(也称为“高变区”)，并且是指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列上有很大差异，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性不会均匀地分布在抗体的可变结构域。其集中在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中的被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高保守性部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括：主要采用通过三个高变区连接的β-折叠构型的多个FR，所述三个高变区形成连接β-折叠结构的环并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密保持在一起并与来自另一条链的高变区一起促进抗体的抗原-结合位点形成(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991),第647-669页；以及Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987))。如本文所描述的，恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应功能。

四种人IgG亚类的特性已经得到很好的证实；每个都具有不同的特性，并且参与免疫系统的方式截然不同。人IgG亚类通过其对免疫效应蛋白的结合亲和力而分化，所述免疫效应蛋白包含新生儿Fc受体(FcRn)、Fcγ受体(FcγR)和补体蛋白C1q。这些受体蛋白分别在血清半衰期、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)中发挥作用。对这些受体的亲和力经常用于表征抗体的功能特性(Bruggemann等人,1987)。对FcγR1和FcγRIII的更高亲和力表明抗体具有ADCC活性，而与抑制性受体FcγRIIb的结合导致ADCC活性降低(Daeron,1997；Armour等人,1999；Clynes等人,2000)。类似地，与补体级联反应中的第一蛋白C1q结合表明补体活性有助于激活吞噬细胞并摧毁病原体(Schifferli等人,1986；Garred等人,1989；Moore等人,2010)。FcRn结合与抗体循环相关，并与体内半衰期相关(Ghetie等人,1996；Israel等人,1996；Praetor和Hunziker,2002；Jefferis,2007)。IgG亚类的独特功能有助于抗体治疗的设计。

1967年，Johnson和Vaughan报道了六种犬科动物免疫球蛋白的存在(Johnson和Vaughan,1967；Johnson等人,1967)。随后的工作将重点缩小到IgG，针对此，Mazza等人(1993)从富含IgG的犬科动物血清中分离出四种级分，并通过凝胶过滤、蛋白A/G结合和电泳迁移率将其分离。这些级分用于获得对犬科动物IgG具有特异性的抗体试剂(Mazza等人,1994)。虽然这项工作启动了一系列研究，调查各种疾病状态下的犬科动物IgG，但犬科动物免疫球蛋白的功能以及其如何与免疫效应蛋白相互作用仍不清楚。2001年，Tang等人(2001)提供了开始回答这些问题所必需的犬科动物IgG序列。与人IgG一样，犬科动物IgG由四个亚类组成。按照登录号[AF354264、AF354265、AF354266和AF354267]的顺序，Bergeron等人(《兽医免疫学和免疫病理学(Veterinary Immunology and Immunopathology)》157(2014)31-41)将这些犬科动物IgG亚类分别称为A、B、C和D。与犬科动物IgG序列相关的字母命名法是基于体内的患病率。Bergeron等人提供了每个子类的功能分析。

直至2014年，当Strietzel等人(《兽医免疫学和免疫病理学》158(2014)214-223)公开了与先前已经从猫科动物脾cDNA文库中分离的两个已知序列相关的功能特性时，人们对猫科动物IgG知之甚少。这两个IgG序列IgG1a和IgG1b已经被分离但未被表征(Kanai,T.H.等人,2000《兽医免疫学和免疫病理学》73(1),53-62)。Strietzel等人报道了第三猫科动物IgG序列，称为IgG2，并描述了与已鉴定的猫科动物FcγRI、FcγRIII、FcRn和C1q的三种猫科动物IgG相互作用。另外分离猫科动物κ和λ轻链区。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种效应功能。示例性“效应功能”包含C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；新生儿受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，等等。此类效应功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的各种测定来评估，以评价此类抗体效应功能。

“天然序列Fc区”包括与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然Fc区序列的序列的非限制性实例包括与SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:72具有介于约80-99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的抗体包括包含SEQ ID No:70的天然Fc区。在一个实施例中，本发明的抗体包括包含SEQ ID NO:72的天然Fc区。本文的天然Fc区优选地与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％序列同一性，并且最优选地与其具有至少约90％序列同一性，更优选地与其具有至少约95％序列同一性。与天然Fc区序列相比，“变体Fc区”或“突变”或“突变体”Fc区包括与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述氨基酸序列由于至少一种氨基酸修饰而不同，并且可以保留或不保留天然序列Fc区的至少一种效应功能序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本肽的Fc区中约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％序列同一性，并且最优选地与其具有至少约90％序列同一性，更优选地与其具有至少约95％序列同一性。变体或突变的Fc区也可以基本上消除抗体的Fc区的功能。变体或突变的Fc区也可以增加或增强抗体的Fc区的功能。例如，Fc区突变可以消除抗体的效应功能。在另一实例中，突变的Fc区可以增强抗体的效应功能。在又另一个实例中，突变的Fc区可以改变半衰期或影响细胞中其它可以确定抗体的特性的因素的结合。在一个实施例中，本发明的抗体包括突变的Fc区。在一个实施例中，本发明的抗体包括影响效应功能的变体或突变的Fc区，其包括与SEQ ID NO:70具有介于约80-99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的抗体包括影响效应功能的变体或突变的Fc区，其包括与SEQ ID NO:72具有介于约80-99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的抗体包括影响效应功能的变体或突变的Fc区，其包括包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的抗体包括影响效应功能的变体或突变的Fc区，其包括包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。

如本文所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且随后使靶细胞裂解。所关注分子的ADCC活性可以使用体外ADCC测定来评估，如在美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中描述的。用于此类测定的有用的效应细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。可替代地或另外地，可以例如在如Clynes等人,1998,《PNAS》(USA),95:652-656中公开的动物模型等动物模型中体内评估所关注分子的ADCC活性。

“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在存在补体的情况下靶标的裂解。补体激活通路是通过补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合而启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,202:163(1996)中所描述。

为了制备抗体，例如重组抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用本领域已知的许多技术。编码所关注的抗体的重链和轻链的基因可以从细胞中克隆，并且用于产生重组单克隆抗体。也可以使用编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大抗体池。在本领域中发现了产生单链抗体或重组抗体的技术，并且所述技术可以适于产生针对根据本发明的多肽的抗体。噬菌体展示技术还可以用于鉴定与所选抗原特异性地结合的抗体和异聚体片段。抗体也可以制备成双特异性的，即能够识别两种不同的抗原或异源缀合物，例如两种共价连接的抗体或免疫毒素。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数量不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链的一端有一个可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。每条轻链的一端有一个可变结构域(VL)，并且另一端是恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信具体的氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。图1是突出显示了抗原结合位点的天然小鼠免疫球蛋白G(IgG)的一般结构的实例。

如本文所使用的，本文可以可互换使用的术语“抗原结合蛋白”、“抗体”、“拮抗剂抗体”、“抗原结合片段”等是指包括抗原结合位点的多肽或其片段。因此，分离的抗体或片段可以是多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、异源嵌合抗体、犬科化抗体、猫科化抗体、完全犬科动物抗体或完全猫科动物抗体。

在一些实施例中，术语“抗原结合蛋白”、“抗体”、“拮抗剂抗体”等优选地指单克隆抗体和其片段，以及可以与TGFβ蛋白和其片段结合的其免疫结合等效物。示例性抗体片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、双抗体、其抗原识别片段、小型模块化免疫药物(SMIP)纳米抗体、IgNAR分子和本领域技术人员公认为抗体或抗体片段的等效物，以及上述片段和其化学或遗传操作对应物中的任一者，以及其它抗体片段和其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及包括抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。抗体和抗原结合蛋白可以例如但不限于通过传统杂交瘤技术(Kohler等人,《自然》256:495-499(1975))、重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)或使用抗体文库的噬菌体展示技术(Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1991))或本领域技术人员所采用和熟知的其它技术。

如本文所定义的“单克隆抗体”是单一纯均质类型的抗体。所产生的所有单克隆抗体是相同的，并且具有相同的抗原特异性。单克隆抗体是均匀抗体群体，其中单克隆抗体包括抗原的选择性结合中涉及的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)。单克隆抗体群体是高度特异性的，针对单个抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，还涵盖其片段(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、双抗体、其抗原识别片段、小型模块化免疫药物(SMIP)纳米抗体、IgNAR分子等)、其变体、包括抗体部分的融合蛋白以及免疫球蛋白分子的包括具有所需特异性的抗原识别位点并且能够与抗原结合的任何其它经修饰构型。不旨在限制抗体的来源或其形成的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段，即各自具有单个抗原结合位点的所说的“Fab”片段和其名称反映了其易于结晶的能力的残留“Fc”片段。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')₂片段。

“Fv”是含有完整抗原识别和抗原-结合位点的最小抗体片段。这个区由紧密地非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在此构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以限定V_H-V_L二聚体的表面上的抗原结合位点。共同地，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或包括对抗原具有特异性的仅三个高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但是以比完整结合位点更低的亲和力进行。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端加入几个残基。Fab'-SH在本文中是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab'的名称。F(ab')₂抗体片段最初是作为成对的Fab'片段产生的，其之间具有铰链半胱氨酸。还已知抗体片段的其它化学偶联。

本文所描述的单克隆抗体具体地包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要其表现出所期望的生物活性即可。通常，嵌合抗体是轻链和重链基因通常通过基因工程化已经从属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体(或包含猫科动物的任何其它物种抗体)的基因的可变区段可以连接到犬科动物恒定区段，例如本文中由SEQ IDNO:72表示的具有和不具有效应功能突变的IgGB犬科动物重链恒定区的氨基酸序列，或本文中由SEQ ID NO:70表示的具有和不具有效应功能突变的IgG1a猫科动物重链恒定区的氨基酸序列。另外，以相同方式产生嵌合猫科动物抗体，不同之处在于包括猫科动物重链恒定区SEQ ID NO:75的氨基酸序列与另一种物种抗体(小鼠、犬科动物、猫科动物等)的可变区段连接。图2是小鼠:犬科动物IgG的一个实施例的一般结构的示意图。在此实施例中，抗原结合位点来源于小鼠，而Fc部分是犬科动物。此图示并不将所要求保护的本发明仅限于小鼠/犬科动物嵌合体，而是也可以应用于任何物种抗体的组合：如本文所描述的，犬科动物、猫科动物、鼠类和人。

如本文所定义的，术语“异源嵌合”是指其中抗体链中的一条(重链或轻链)是物种形成的(即犬科化或猫科化)而另一条嵌合的抗体。在此实施例中，犬科化可变重链(其中所有CDR是小鼠，并且所有FR是犬科动物)与嵌合可变轻链(其中所有CDR是小鼠并且所有FR是小鼠)配对。在此实施例中，可变重链和可变轻链两者与犬科动物恒定区融合。与嵌合抗体一样，对抗体的物种和部分的组合没有限制。

如本文所使用的，术语“犬科动物抗体”、“猫科动物抗体”、“人抗体”等是指针对靶标产生的抗体和从靶物种内的淋巴细胞中分离的抗体。如本文所描述的，这些抗体已在体外进行重组修饰，以包含靶物种的特定恒定区，或以其它方式进行重组修饰。

短语“重组犬科动物抗体”、“重组猫科动物抗体”和“重组人抗体”等都包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的物种形成的抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组组合犬科动物(或猫科动物、人等)抗体文库中分离的抗体、从转基因犬科动物、猫科动物或其它物种免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等人(1992)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20:6287-6295)，或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，所述方式涉及将犬科动物(或猫科动物、人等)免疫球蛋白基因序列重组到其它DNA序列上。

为了简单起见，以下描述了“犬科化”抗体，但同样可以应用于猫科化、人源化或任何其它物种形成的抗体。作为实例，“犬科化”被定义为用于将非犬科动物抗原结合区从供体抗体转移至免疫原性较低的犬科动物抗体受体以产生在狗中可用作治疗剂的治疗的方法。犬科化抗体是犬科动物抗体序列，其中接受者的高变区残基被非犬科动物物种(如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、鸡、牛、马、无峰驼、骆驼、单峰驼、鲨鱼、非人灵长类动物、人类)的高变区残基(供体抗体)、人源化重组序列或具有所需特性、特异性、亲和力和容量的工程化序列替代。此外，犬科化抗体可以包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。如本文所描述的，对高变区和/或框架区的修饰是基于本领域技术人员已知的实验为每个单独工程化的物种化(犬科化)抗体确定的，但不能在所述实验之前预测。犬科化抗体任选地可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的全部或至少一部分，通常是犬科动物免疫球蛋白恒定区的全部或至少一部分。图4是显示小鼠IgG的物种形成或犬科化的一个实施例的图示。在此实施例中，小鼠CDR被移植到犬科动物框架上。在一些情况下，维持在高变区的外部的小鼠框架或其中的残基。抗体的犬科化和犬科化抗体的犬科化的所有描述在概念上都可以应用于任何“物种形成的”抗体，无论是犬科化、猫科化、人源化等。

如本文所描述的，“亲本”抗体是通过用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，在犬科化或犬科动物抗体的情况下，亲本抗体具有犬科动物框架区，并且如果存在的话，具有犬科动物抗体恒定区。例如，亲本抗体可以是犬科化抗体或犬科动物抗体。猫科化的、人源化的、马科化的、牛科化的抗体也是如此。

术语“反突变”是指其中犬科动物抗体的部分或全部体细胞突变氨基酸被来自同源种系抗体序列的对应种系残基替代的过程。将本发明的犬科动物抗体的重链序列和轻链序列与种系序列分开比对，以鉴定具有最高同源性的序列。本发明的犬科动物抗体中的差异通过使编码此类不同氨基酸的限定核苷酸位置突变而返回种系序列。因此应研究被鉴定为反突变候选的每种氨基酸的作用在抗原结合中的直接或间接作用，并且在突变后发现的影响犬科动物抗体的任何期望特征的任何氨基酸都不应包含在最终犬科动物抗体中；作为实例，通过选择性诱变方法鉴定的活性增强氨基酸将不会经历反突变。为了使经历反突变的氨基酸的数量最小化，那些被发现与最接近的种系序列不同但与第二种系序列中的对应氨基酸相同的氨基酸位置可以保留，条件是第二种系序列与本发明的犬科动物抗体的序列相同并且共线。可能需要将所选靶标框架残基反突变为对应的供体残基，以恢复和/或提高亲和力。

“抗原”是指能够与抗体结合的分子或分子的一部分。通常，表位由例如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成并且具有特异性三维结构特性以及特异性电荷特性。表位是免疫系统识别的蛋白质上的抗原决定簇。免疫系统识别表位的组分是抗体、T细胞和B细胞。T细胞表位显示在抗原呈递细胞(APC)的表面上，并且长度通常为8-11个(MHC I类)或15个以上(MHC II类)氨基酸。T细胞对所显示的MHC肽复合物的识别对其激活至关重要。这些机制允许适当识别“自身”蛋白与“非自身”蛋白，如细菌和病毒。不一定连续的独立氨基酸残基有助于与APC结合裂缝的相互作用以及随后被T细胞受体识别(Janeway,Travers,Walport,《免疫生物学：健康与疾病中的免疫系统(Immunobiology:The ImmuneSystemin Health and Disease.)》第5版,纽约：加兰德科学出版社(Garland Science)；2001)。被可溶性抗体和细胞表面相关B细胞受体识别的表位在长度和连续性程度上变化很大(Sivalingam和Shepherd,《免疫学(Immunol.)》2012；51(3-4):304-309)。同样，即使是在连续延伸的蛋白质序列中发现的甚至线性表位或表位，也经常具有不连续的氨基酸，所述氨基酸代表与抗体互补位或B细胞受体的关键接触点。抗体和B细胞识别的表位可以与在三维空间中包括与蛋白质共同接触区域的氨基酸构象，并且依赖于蛋白质的三级和四级结构特征。这些残基通常在初级氨基酸序列的空间上不同的区域中发现。

如本文所使用的，术语“TGFβ(TGFbeta/TGFβ)”和“TGFB”如本文中可互换使用，指转化生长因子β蛋白1(TGFβ1)、转化生长因子β蛋白2(TGFβ2)和转化生长因子β蛋白3(TGFβ3)。TGFβ蛋白是相关生长因子超家族的一部分，通过调节细胞增殖和迁移、细胞分化、细胞凋亡、ECM(细胞外基质)产生和免疫调节，对伤口愈合发挥多效性作用。如本文所使用的，通过使用本发明的抗体抑制TGFβ蛋白用于治疗TGFβ相关病症，如纤维化病症、骨病症和细胞增殖病症。

如本文所使用的，“抗TGFβ抗体”可以互换地称为“抗TGFβ抗原结合蛋白”和“抗TGFβ拮抗剂抗体”、“抗TGFβ抗原结合片段”、“抗TGFβ抗原结合部分”等，描述任何抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白与其特异性抗体结合的结合的功能分子，因此抑制与其相关的TGFβ信号传导通路的生物功能。在优选实施例中，抗TGFβ抗体与TGFβ1、2和3蛋白结合。本发明的抗TGFβ抗体涵盖结合蛋白和抗体，其阻断、拮抗、抑制或降低(包含显著降低)TGFβ生物活性，包含由TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3信号传导介导的下游通路，和/或抑制TGFβ蛋白与TGFR2受体结合，如受体结合和/或引发对TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白的细胞应答。出于本发明的目的，将明确理解，术语“抗TGFβ抗体”或“抗TGFβ拮抗剂抗体”或“TGFβB抗原结合蛋白”涵盖所有先前鉴定的术语、标题和功能状态和特性，其中TGFβ自身的生物活性或生物活性的后果基本上被抵消、降低或中和到任何有意义的程度，所述生物活性包含但不限于其介导任何方面的TGFβ相关病症，如纤维化病症、骨病症和/或细胞增殖病症的发展或治疗的能力。本文提供了抗TGFβ抗体的实例。

“变体”抗TGFβ抗体在本文中是指这样一种分子：通过亲本抗体序列中的一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代而在氨基酸序列中与“亲本”抗TGFβ抗体氨基酸序列不同，并保留亲本抗TGFβ抗体的至少一种期望的活性。期望的活性可以包含与抗原特异性地结合的能力，减少、抑制或中和动物的TGFβ活性的能力，以及在基于细胞的测定中抑制TGFβ介导的SMAD信号传导的能力。在一个实施例中，变体在亲本抗体的一个或多个高变区和/或框架区中包括一个或多个氨基酸取代。例如，变体可以在亲本抗体的一个或多个高变和/或框架区中包括至少一个或约一个至约十个或约两个至约五个取代。通常，变体将具有与亲本抗体重链或轻链可变结构域序列具有至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或与亲本抗体具有至少约65％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。关于此序列的同一性或同源性在本文中被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，在候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列的N端、C端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响整体序列同一性或同源性。变体保留与TGFβ变体结合的能力可能具有更强的结合亲和力，增强降低、抑制或中和动物中的TGFβ活性的能力，和/或增强在基于细胞的测定中抑制TGFβ介导的SMAD信号传导的能力。

“TGFβ受体”是指被TGFβ蛋白结合或激活的多肽。TGFβ受体是属于TGFβ受体家族的单程丝氨酸/苏氨酸激酶受体。其以几种不同的同种型存在，可以是同源或异源二聚体。三种对TGFβ蛋白具有特异性的TGFβ受体可以通过其结构和功能特性来区分。TGFβR1(ALK5)和TGFβR2具有类似的配体结合亲和力。TGFβR1和TGFβR2两者对TGFβ1具有高亲和力，并且对TGFβ2具有低亲和力。TGFβR3(β-聚糖)对同源二聚体TGFβ1和TGFβ2两者以及另外的异源二聚体TGFβ1、2具有高亲和力。TGFβ受体也与TGFβ3结合。从机制上讲，TGFβ蛋白最初与TGFβR2受体结合，后者募集并磷酸化TGFβR1。然后TGFβR1磷酸化受体调控的SMAD(R-SMAD)，后者可以与共SMAD SMAD4结合。R-SMAD/共SMAD复合物在细胞核中积聚，在细胞核中，其充当转录因子并参与靶基因表达的调控

如本文关于本发明的单克隆抗体的活性所使用的术语“中和”意指基本上拮抗、禁止、阻止、抑制、减慢、破坏、消除、停止、减少或逆转被抑制的疾病或病状的进展或严重程度的能力，包含但不限于生物活性或特性。抑制或中和优选地至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。如果抗体与抗原结合导致部分或完全抑制或降低抗原的生物功能，则称所述抗体“中和”其抗原。通过测量TGFβ活性的一种或多种体外或体内指标的部分或完全抑制或减少，如TGFβ受体结合和信号传导通路的差异来评估TGFβ蛋白的生物活性的中和作用。如本文所描述的，通过测量Smad2磷酸化的抑制来评估中和TGFβ活性的能力，如本文所描述的体外测定中所描述的。体内TGFβ的中和可能导致疾病病状下TGFβ引起的细胞表型转换、细胞增殖和细胞存活的抑制。

如本文所使用的，抗体的“免疫特异性”结合是指在抗体的抗原结合位点与所述抗体识别的特异性抗原之间发生的抗原特异性地结合相互作用(即，抗体在ELISA或其它免疫测定中与蛋白质反应，并且没有可检测地与不相关蛋白质反应，另外还意味着本发明的抗体还将在体内表位处与靶抗原结合)。与抗体或多肽“特异性地结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)的表位是本领域中众所周知的术语，并且用于确定这种特异性或优先结合的方法也是本领域中众所周知的。如果分子与包括所述抗原的特定细胞或物质比其与替代性细胞或物质更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应或缔合，则所述分子被称为展现出“特异性地结合”或“优先结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶标“特异性地结合”或“优先地结合”。例如，与TGFβ表位特异性地或优先地结合的抗体是比其结合其它表位或非TGFB表位亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合此表位的蛋白。

在抗体结合的上下文中，术语“特异性地”是指抗体与特定抗原(即多肽或表位)的高亲和力和/或高亲和性结合。与抗原特异性地结合的抗体比相同抗体与其它抗原的结合更强。与多肽特异性地结合的抗体可以能够以微弱但可检测的水平与其它多肽结合(例如，显示出与所关注的多肽的结合为10％或更少)。这种弱结合或背景结合很容易从与受试者多肽结合的特异性抗体中辨别出来，例如通过使用适当的对照。通常，特异性抗体以K_D为10.⁷M或更低、10^-8M或更低、10^-9M或更低、10.¹⁰M或更低、10.¹¹M或更低、10.¹²M或更低或10.¹³M或更低等的结合亲和力与抗原结合。

如本文所使用的，术语“亲和力”是指单个抗原结合位点与抗原决定簇的结合的强度。亲和力取决于抗体与抗原决定簇之间的立体化学配合的紧密程度、取决于其之间接触面积的大小、取决于带电基团和疏水基团的分布等。抗体亲和力可以通过平衡分析或通过表面等离子体共振“SPR”方法(例如BIACORE^TM)测量。SPR方法依赖于表面等离子体共振(SPR)现象，当表面等离子体波在金属/液体界面激发时会发生这种现象。光被引导到表面的不与样品接触的一侧并从其反射，并且SPR引起在角度和波长的特定组合下反射光强度的降低。双分子结合事件使表面层的折射率变化，这些变化被检测为SPR信号的变化。

如本文所使用的，术语“K_D”旨在指抗体-抗原相互作用的解离常数。解离常数K_D和缔合常数K_a是亲和力的定量量度。处于均衡状态时，游离抗原(Ag)和游离抗体(Ab)与抗原-抗体复合物(Ag-Ab)平衡，并且速率常数k_a和k_d定量单个反应的速率。处于均衡状态时，ka[Ab][Ag]＝kd[Ag-Ab]。解离常数K_d由以下给出：K_D＝kd/ka＝[Ag][Ab]/[Ag-Ab]。K_D具有浓度单位，最典型的是M、mM、μM、nM、pM等。当比较以K_D表示的抗体亲和力时，对TGFβ具有更大的亲和力由较低的值表示。缔合常数K_a由以下给出：Ka＝ka/kd＝[Ag-Ab]/[Ag][Ab]。K_a具有浓度单位，最典型的是M^-1、mM^-1、μ.M^-1、nM^-1、pM^-1等。如本文所使用的，术语“亲合力”是指在形成可逆复合物后抗原-抗体结合的强度。抗TGFβ抗体可以根据其与TGFβ蛋白结合的K_D来表征，即“在约(K_D下限值)至约(K_D上限值)的范围内的解离常数(K_D)”结合。

术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”等可以在本文中可互换地使用，并且指代DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也被称为“核苷酸”)。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。术语“核酸”包含，例如，单链和双链分子。核酸可以是例如基因或基因片段、外显子、内含子、DNA分子(例如cDNA)、RNA分子(例如mRNA)、重组核酸、质粒和其它载体、引物和探针。包含5'至3'(有义)和3'至5'(反义)多核苷酸。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物中的任何取代物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)和其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后如通过与标记组分结合来进一步修饰。其它类型的修饰包含例如“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如，用不带电键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和用带电键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些核苷酸间修饰、含有侧基部分例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些核苷酸间修饰、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些核苷酸间修饰、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些核苷酸间修饰、含有烷化剂的那些核苷酸间修饰、使用经修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些核苷酸间修饰以及多核苷酸的未经修饰的形式。进一步地，通常存在于糖中的任何羟基均可以例如通过膦酸酯基团、磷酸酯基团来替代，通过标准保护基团来保护，或者被激活以制备与另外的核苷酸的另外的键，或者可以与固相载体缀合。5'和3'端OH可以经具有1个至20个碳原子的胺或有机封端部分磷酸化或取代。也可以将其它羟基衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包含例如2'-0-甲基-、2'-0-烯丙基、2'-氟基-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、哌喃醣、呋喃糖、景天庚糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。可以用替代性连接基团替代一个或多个磷酸二酯键。这些替代性连接基团包含但不限于磷酸盐被P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR2(“酰胺化物”、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛化物”)取代的实施例，其中每个R或R'独立地为H或任选地含有醚(-0-)键的经取代或未经取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有键都需要是相同的。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包含RNA和DNA。

如本文所使用的，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一个或多个所关注的基因或序列的构建体。载体的实例包含但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，如生产细胞。如本文所描述的，载体具有表达控制序列，意指指导核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与要转录的核酸序列“可操作地连接”。当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。

正如多肽可以含有保守氨基酸取代一样，其多核苷酸也可以含有保守密码子取代。如果密码子取代在表达时产生如上文所描述的保守氨基酸取代，则所述密码子取代被认为是保守的。未导致氨基酸取代的变性密码子取代也可以用于本发明的多核苷酸。因此，例如，编码可用于本发明的一实施例中的所选多肽的多核苷酸可以通过简并密码子取代而突变，以便近似由要用其转化的表达宿主细胞所表现出的密码子使用频率，或以其它方式改进其表达。

“变体”核酸在本文中是指在序列上与“亲本”核酸不同的分子。多核苷酸序列差异可以由突变变化引起，如一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加。这些变化中的每个变化都可以单独发生或组合发生，以给定的顺序发生一次或多次。

术语“分离的”意指从其自然环境的组分中分离和/或回收材料(例如，如本文所描述的抗体或核酸)。其自然环境中的污染物组分是会干扰材料诊断或治疗用途的材料，并且可以包含酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。关于核酸，分离的核酸可以包含从染色体中通常与其相关的5'至3'序列中分离的核酸。在优选实施例中，材料将被纯化至大于材料的95重量％并且最优选地大于99重量％。分离的材料包含在重组细胞内的原位材料，因为材料的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个本文所使用的纯化步骤来制备分离的材料。

术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用。这些术语也包含其子代，即所有的后代。应理解的是，由于有意或无意的突变，所有子代可能不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指位于体外或体内的原核或真核细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。宿主细胞可以用作载体的受体，并且可以包含能够复制载体和/或表达由载体编码的异源核酸的任何可转化生物体。

本文中使用的“标记”一词是指直接或间接与抗体或核酸缀合的可检测化合物或组合物。标记本身可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。

“受试者”或“患者”是指可以受到本发明的分子的影响的需要治疗的动物。可以根据本发明治疗的动物包含脊椎动物，具体地哺乳动物，如犬科动物或猫科动物是尤其优选的实例。

“组合物”是指活性剂的组合，无论是化学组合物、生物组合物或生物治疗剂(特别是如本文所描述的抗体)，以及另一种可以是惰性的(例如标记)或活性的化合物或组合物，如佐剂。

如本文所定义的，适用于本发明的药学上可接受的载剂是本领域的技术人员众所周知的。此类载剂包含但不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水性溶液、乳液或悬浮液。可以根据常规技术添加其它常规采用的稀释剂、佐剂和赋形剂。此类载剂可以包含乙醇、多元醇和其合适的混合物、植物油和可注射的有机酯。还可以采用缓冲液和pH调节剂。缓冲液包含但不限于由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲液包含但不限于有机酸盐，如柠檬酸、柠檬酸盐、抗坏血酸、葡糖酸、组氨酸-Hel、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐、Tris、氨丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲液。肠胃外载剂可以包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载剂可以包含流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些等。在药物载剂中也可以提供防腐剂和其它添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂(例如，EDTA)、惰性气体等。本发明不受载剂的选择的限制。由上述组分制备具有适当pH等渗性、稳定性和其它常规特性的这些药学上可接受的组合物在本领域技术范围内。参见例如，文本，如《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)出版,2000；以及《药物赋形剂手册(TheHandbook of Pharmaceutical Excipients)》,补充第4版,编辑R.C.Rowe等人,APhA公开,2003。

“治疗有效量”(或“有效量”)是指当施用于受试者或患者时足以产生有益的或期望的结果的活性成分，例如，本发明的药剂的量。可以以一次或多次施用、施加或剂量来施用有效量。根据本发明的组合物的治疗有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定。在本发明的上下文中，“治疗有效量”是指在与TGFB相关病状相关的一个或多个参数中产生客观测量的变化，所述变化足以产生有益或期望的结果，包含临床结果，如疼痛感的缓和或减轻。可以以一种或多种施用来施用有效量。出于本发明的目的，有效量的组合物是足以预防、治疗、减少或消除在本文中定义为纤维化病症、骨病症或细胞增殖病症的TGFβ相关病症的量。治疗有效量将根据所治疗的特定受试者和病状、受试者的体重和年龄、病状的严重程度、所选择的特定组合物、所遵循的给药方案、施用时间、施用方式等而变化，所有这些都可以由本领域的普通技术人员容易地确定。

如本文所使用的，术语“治疗(therapeutic)”涵盖对疾病、病状或病症的全方位治疗。本发明的“治疗”剂可以以防治性或预防性的方式发挥作用，包含那些结合了旨在靶向可以被鉴定为有风险的受试者的程序的药剂；或者以本质上是改善性或治愈性的方式；或者可以起到减缓正在治疗的疾病或病症的至少一种症状的进展速度或程度的作用。

在另外的方面，本发明的特征在于兽用组合物，其中提供本发明的抗体用于治疗或防治用途。本发明的特征在于用于治疗具有特定抗原，例如与疾病或病状相关的抗原的犬科动物或猫科动物受试者的方法。所述方法包含用如本文所描述的本发明的抗体施用治疗有效量的对一种或多种TGFβ蛋白具有特异性的抗体。

本发明的抗体可以并入到适于施用于受试者的药物组合物中。本发明的化合物可以单独或与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂组合以单剂量或多剂量施用。用于施用的组合物被设计成适于所选择的施用模式，并且视情况而定，使用药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂，如相容的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。

可以使用标准施用技术将包括本发明的抗体的组合物施用于表现出如本文所描述的病理或病症的受试者，所述标准施用技术包含静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。本发明的抗体的施用途径可以是肠胃外施用。输液通常通过静脉内途径进行。优选地，本发明的抗体可以并入到适于肠胃外施用的药物组合物中。如本文所使用的，术语肠胃外包含静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。通过静脉内或腹膜内或皮下注射进行外周全身递送是优选的。进一步地，本发明的方法的受试者也被称为患者，并且在本文中被描述为犬科动物或猫科动物。

如本文所使用的，TGFβ相关病症是这样一种病症，其中一种或多种TGFβ蛋白的调控或总体水平导致结缔组织病症、纤维化/纤维化病症、骨病症或细胞增殖病症。TGFβ调控多种细胞功能，包含增殖、凋亡、分化和炎症，并且如此这些蛋白质的失调可能导致几种所述病症。

如本文所使用的，结缔组织病症是指一组涉及支持器官和身体的其它部位的富含蛋白质的组织的疾病。结缔组织的实例是脂肪、骨和软骨。这些病症通常涉及关节、肌肉和皮肤，但也可能涉及其它器官和器官系统，包含眼睛、心脏、肺、肾、胃肠道和血管。

如本文所描述的，纤维化相关病症涉及病理过程，包含瘢痕形成和结缔组织过度产生细胞外基质作为对组织损伤的应答。分子过程与正常器官中结缔组织和细胞外基质的正常形成没有什么不同。从生理学上讲，纤维化起到沉积结缔组织的作用，这可以干扰或完全抑制下层器官或组织的正常架构和功能。纤维化可以用于描述纤维组织过度沉积的病理状态，以及愈合过程中结缔组织沉积的过程。由细胞外基质(ECM)蛋白的病理学积聚所定义，纤维化导致受影响组织的瘢痕形成和增厚，其本质上是一种夸大的伤口愈合应答，这会干扰正常的器官功能。纤维化形成包含许多细胞类型与细胞因子之间的相互作用，并且当平衡变得促纤维化时，发生纤维化形成。纤维化与瘢痕的过程类似，因为两者都涉及位于结缔组织下方的受刺激的成纤维细胞，包含胶原和糖胺聚糖。当免疫细胞，如巨噬细胞释放刺激成纤维细胞的可溶性因子时，所述过程开始。最具特征的促纤维化介质是TGFβ，其由巨噬细胞以及称为间质的表面之间的任何损伤的组织释放。如本文所定义的，纤维化病状选自由以下组成的组：肺纤维化，其包含囊性和特发性肺纤维化两者；肝硬化；脑中的神经胶质瘢痕、膝盖、肩膀和其它关节的关节纤维化、腹膜后纤维化、全身性硬化症(硬皮病)，并且具体地导致慢性肾病(CKD)的肾纤维化。纤维化是一种血管、皮肤、肺、肾、心脏和GI道的进行性退行性病症，并且迄今为止被视为是不可逆转的过程，并且通常通过抗炎和免疫抑制剂进行治疗，这在很多时候会造成伤害。

如本文所描述的，慢性肾病(CKD)涉及由于一个长期的、渐进的纤维化过程而导致的功能性肾组织的丧失。尽管肾结构和功能变化只是松散相关的，但可以看到肾结构的显著变化。疾病通常在临床上显著之前会持续数月或数年，而且总是不可逆转的。CKD的许多病因与进行性间质纤维化相关。间质纤维化的严重程度与GFR下降的程度呈正相关，并且与预后呈负相关。在患有全身性CKD的动物中发现的肾小球、肾小管间质和血管病变通常是类似的，无论起始病因如何。TGFβ已经被描述为负责肌成纤维细胞激活的最重要的促纤维化介质。其驱动了集成了许多其它纤维化因素影响的会聚通路。TGFβ1是最丰富的同种型，并且由所有类型的肾细胞合成。

TGFβ，以及如所讨论的作为促纤维化细胞因子的功能，也是一种丰富的骨基质蛋白，其影响形成，成骨细胞和破骨细胞的功能和细胞-细胞相互作用，以控制骨重塑并维持足够的骨量，并且已经表明TGFβ抑制是在CKD引起的继发性肾甲状旁腺功能亢进(SRHP)期间减少骨脱矿的潜在机制。

治疗“(treatment)”或治疗“(treating)”等是指治疗性治疗和防治性或预防性措施两者。需要治疗的动物包含已经患有所述病症的患者以及需要预防所述病症开始或进展的患者。治疗还可以被描述为延迟症状或病状的发作或延迟其严重程度。术语疾病或病症的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包含预防或防止疾病或病症(即，使得临床症状不发展)；抑制疾病或病症(即，阻止或抑制临床症状的发展)；和/或缓解疾病或病症(即，引起临床症状的消退)。如可以理解的是，并不总是能够区分“预防”与“抑制”疾病或病症，因为最终的诱导事件可能是未知的或潜在的。因此，术语“防治”一词将被理解为构成一种类型的“治疗”，涵盖“预防”和“抑制”两者。因此，术语“治疗”包含“防治”。

在描述本发明的方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意图为限制性的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等效于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本文所提到的所有公开通过引用整体并入本文。

本文所公开的本发明涉及抗体(如本文所描述的，可与术语“抗原结合蛋白”、“拮抗剂抗体”、“抗体片段”等互换使用)，其与TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白特异性地结合，并且具体地抗体，无论是犬科动物还是猫科动物抗体，通过重组方法、杂交瘤技术或噬菌体展示技术产生的犬科化或猫科化抗体，或与犬科动物或猫科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合的完全物种形成的单克隆抗体，从而阻止所有抗体与TGFβRII受体结合，从而起到拮抗剂的作用，因为信号传导通路被阻止被TGFβ蛋白之一激活。在优选实施例中，本发明提供了与TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合的抗体。

虽然抗体的特性使其成为非常有吸引力的治疗剂，但也有一些局限性。如先前所述，绝大多数单克隆抗体(mAb)是啮齿动物来源的。当在不同物种中施用此类抗体时，患者/受试者可以对此类异种抗体产生自己的抗体应答。这种应答可能引起抗体的最终中和以及消除。如上文所描述的，小鼠被广泛用于单克隆抗体的产生，尽管抗体的产生并不局限于小鼠。可以用抗原使如犬科动物等物种免疫，并回收和表征抗体。使用由特定物种产生的抗体(例如，如果通常最初在小鼠中产生)的一个问题是，用所述抗体治疗的非鼠类受试者对小鼠抗体的反应就好像它们是外来物质一样，因此产生新的一组针对小鼠抗体的抗体。小鼠抗体被非鼠类“看到”，例如，犬科动物(或任何其它非鼠类物种)，免疫系统会将异种抗体“看作”为外来抗体，并且然后可能针对分子产生免疫应答。本领域技术人员将认识到需要能够用抗原特异性抗体治疗受试者但具有所述抗体种类的特异性用途。跨物种抗体施用产生的部分反应，例如向犬科动物注射小鼠单克隆抗体，可以是轻微的形式，如皮疹，也可以是更极端和危及生命的应答，如肾衰竭。这种免疫应答也可能降低治疗的有效性，或者如果受试者随后接受含有小鼠抗体的治疗，则会产生未来的反应。因此，如本发明所阐述，旨在通过本发明抗体的“犬科化”或“猫科化”来克服这一缺点。具体地，此过程侧重于免疫球蛋白可变结构域的框架区，但也可能包含可变结构域的互补决定区(CDR)。在本公开中描述了此过程的使能步骤和实践的减少，并且围绕CDR序列的亲和力成熟过程在本领域中是众所周知的。

修饰来自动物的单克隆抗体(如本文所描述的，抗体、拮抗剂抗体等，以及可互换使用的术语)以使其对不同物种的治疗性施用具有较低的免疫原性的过程已经得到了积极的研究，并且已经在许多公开中进行了描述(例如，《抗体工程化：实践指南(AntibodyEngineering:A practical Guide)》.Carl A.K.Borrebaeck编辑W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman and Company),1992)。然而，直到最近，此过程才常规地应用于非人的治疗或诊断的开发。事实上，很少有关于犬科动物、猫科动物或其它物种特异性可变结构域的研究公开。Wasserman和Capra,《生物化学(Biochem.)》6,3160(1977)测定了犬科动物重链的可变区的氨基酸序列。Wasserman和Capra,《免疫化学(Immunochem.)》15,303(1978)测定了来自犬科动物IgA的κ轻链的氨基酸序列。McCumber和Capra,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》16,565(1979)公开了犬科动物mu链的完整氨基酸序列。Tang等人,《兽医免疫学和免疫病理学》80,259(2001)公开了犬科动物IgG-A y链cDNA和四个犬科动物IgG-A y链蛋白序列。Bergeron等人描述了四种犬科动物重链的功能特性。在这一点上，缺乏关于犬科动物抗体的可用信息阻碍了其作为治疗犬科动物疾病的治疗剂的发展。

这些注意到的局限性促使了被称为“物种形成”的工化技术的发展，这在治疗性抗体的“人源化”方面为本领域的技术人员所熟知。抗体的“犬科化”、“猫科化”和“人源化”是“物种形成”技术的几个实例，这些分子是以抗体或片段的形式产生的，其含有源自非靶免疫球蛋白的最小序列。作为实例，犬科化抗体(“靶物种抗体”)，其中来自受体/靶标的互补决定区(CDR)的残基被具有如特异性、亲和力和效力等期望特性的来自非靶标物种(即“供体抗体”或“源物种抗体”)(如小鼠)的CDR的残基替代。这种策略基于鉴定最合适的靶标动物(用于CDR移植的种系抗体序列)。在对可变重链和轻链两者的所有可用种系序列进行广泛分析后，基于其与小鼠/供体mAb的同源性来选择种系候选者，并且使用来自小鼠/供体祖细胞mAb的CDR来替代天然犬科动物CDR。如果用作治疗剂，目标始终是保持高亲和力和最终的体内功效。当施用于狗时，使用犬科动物抗体框架通常将最大限度地降低体内免疫原性的潜力。然而，在一些情况下，当观察到亲和力或功能降低时，犬科动物免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非犬科动物残基替代。如所述的，可能需要将所选靶标框架残基反突变为对应的供体残基，以恢复和/或提高亲和力。还可以利用基于结构的方法进行犬科化和亲和力成熟，如US 7,261,890所描述的。上述描述使用犬科动物作为靶标物种并且使用小鼠作为供体物种。物种形成的抗体并不局限于这些靶标和供体。猫科动物等可以用作靶标物种。

开发靶向蛋白质的治疗性抗体的另一个挑战是，不同物种中的同源蛋白质上的表位往往不同，并且与其它蛋白质的交叉反应性潜力也不同。因此，必须针对要治疗的特定物种中的特定靶标制备、测试和开发抗体。不同物种中的同源靶标之间的抗体结合是不可预测的，并且需要测试和评估功效。

抗体通过与抗体分子的可变区相互作用与抗原上的特定表位结合来靶向抗原。此外，抗体具有介导、抑制(如在本发明的拮抗性抗TGFβ抗体的情况下)和/或启动各种生物活性的能力。治疗性抗体具有广泛的功能，例如，抗体可以作为激动剂或拮抗剂调节受体-配体相互作用。抗体结合可以启动细胞内信号传导以刺激细胞生长、细胞因子产生或细胞凋亡。抗体可以将与Fc区结合的试剂递送至特定位点。抗体还通过抗体的Fc区与细胞中引发ADCC、CDC等的相应分子的结合引发抗体介导的细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)和吞噬作用。在ADCC、CDC、C1q结合和吞噬功能被消除的地方，也有抗体已经被改变。在一个实施例中，本发明提供了包括抗体的改变所述抗体的效应功能的Fc区中的改变的抗体。本发明进一步提供了表达本发明的抗体的细胞和细胞系。代表性宿主细胞包含细菌、酵母、哺乳动物和人细胞，如CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞和COS细胞。用于将异源构建体转化为宿主细胞后产生稳定细胞系的方法是本领域熟知的。代表性非哺乳动物宿主细胞包含昆虫细胞(Potter等人(1993)《国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)》10(2-3):103-112)。抗体也可以在转基因动物(Houdebine(2002)《生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.)》13(6):625-629)和转基因植物(Schillberg等人(2003)《细胞与分子生命科学(Cell Mol.Life Sci.)》60(3):433-45)。

如上所讨论，通过例如缺失、添加或取代抗体的其它部分(例如恒定区)修饰的单克隆抗体、嵌合抗体和具有特异性的物种的抗体和物种形成的抗体也在本发明的范围内。例如，抗体可以如下修饰：(i)通过使恒定区缺失；(ii)通过用另一个恒定区，例如，旨在增加抗体的半衰期、稳定性或亲和力的恒定区或来自另一物种或抗体类别的恒定区替代所述恒定区；或者(iii)通过修饰恒定区中的一个或多个氨基酸来改变，例如，糖基化位点的数量、效应细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定等。在本发明的一个实施例中，本发明的抗体包括改变抗体的效应功能的改变的Fc区。在本发明的一些实施例中，本发明抗体的Fc区已被替代、修饰或去除。

用于改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。通过用不同的残基替代抗体的恒定部分中的至少一个氨基酸残基，可以产生具有改变的功能，例如，对效应配体(如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和力改变的抗体(参见例如，EP388151A1、美国专利第5,624,821号和美国专利第5,648,260号，所述文献的全部的内容通过引用并入)。

例如，可以改变抗体的Fc区对FcR(例如FcγR1)或C1q结合的亲和力，方法是用在其侧链上具有适当功能的残基替代指定的残基，或者通过引入带电荷的官能团，如谷氨酸或天冬氨酸，或者可能引入芳香族非极性残基，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸(参见例如，美国专利第5,624,821号)。抗体或其结合片段可以与细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子缀合。在一个实施例中，缀合的蛋白质是抗体或其片段。细胞毒素或细胞毒性剂包含任何对细胞有害的药剂。非限制性实例包含卡奇霉素(calicheamicin)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙素(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂包含但不限于抗代谢药(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶脱卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑(melphalan)、卡莫斯汀(BSNU)和洛莫斯汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星)、抗生素(例如，放线菌素、博来霉素(bleomycin)、光神霉素和氨茴霉素(anthramycin))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。用于将此类部分与蛋白质偶联的技术是本领域熟知的。

组合物、衍生组合物和制备所述组合物的方法

本发明涵盖组合物，包含药物组合物，所述药物组合物包括抗体(如本文中可互换使用的“抗原结合蛋白”、“抗体片段”、“拮抗剂抗体”等)、多肽和包括编码本发明的抗体或多肽的序列的多核苷酸。

如本文所使用的，组合物包括与TGFβ蛋白中的一种或多种结合的一种或多种抗体或抗原结合多肽，和/或包括编码与TGFβ蛋白中的一种或多种结合的一种或多种抗体或多肽的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可以进一步包括合适的赋形剂，如药学/兽医学可接受的赋形剂，包含本领域熟知的缓冲液。本发明还涵盖分离的抗体、多肽和多核苷酸实施例。本发明还涵盖基本上纯的抗体、多肽和多核苷酸实施例。

在一个或多个实施例中，本发明提供了与TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白结合的分离的和重组的抗体和其任何变体，其中可变重链包括与本文所描述的本发明的抗体的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中可变轻链包括与包括本文所描述的本发明的抗体的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，所述变体在所述抗体的可变轻链或可变重链中的任一者内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一者中具有一个或多个保守氨基酸取代。

本发明提供了重组抗体，在本文所描述的一些实施例中，单克隆抗体和抗体片段以及其在临床施用和科学程序(包含诊断程序)中的用途。随着分子生物学方法和重组技术的使用，有可能通过重组方式产生抗体和抗体样分子，并且由此产生编码抗体的多肽结构中发现的特定氨基酸序列的基因序列。此类抗体可以通过克隆编码所述抗体的多肽链的基因序列或通过所述多肽链的直接合成来产生，其中合成的链组装以形成对特异性表位和抗原决定簇具有亲和力的活性四聚体(H2L2)结构。这允许随时从不同物种和来源产生具有中和抗体的序列特性的抗体。

无论抗体的来源如何，其如何构建，或者其如何在体外或体内合成，使用转基因动物、实验室或商业规模的大细胞培养物、使用转基因植物或者通过在过程的任何阶段不采用活生物体的直接化学合成，所有抗体都具有类似的整体3维结构。此结构通常以H2L2给出，并且是指抗体通常包括两条轻(L)氨基酸链和2条重(H)氨基酸链的事实。两条链都具有能够与结构上互补的抗原靶标相互作用的区。与靶标相互作用的区被称为“可变”或“V”区，并且其特征在于，在来自不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列方面存在差异。H或L链的可变区含有能够与抗原靶标特异性地结合的氨基酸序列。

如本文所使用的，术语“抗原结合区”是指抗体分子的含有与抗原相互作用并赋予抗体对所述抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包含维持抗原结合残基的正确构象所必需的“框架”氨基酸残基。在提供抗原结合区的H或L链的可变区内，是被称为“高变”的较小序列，因为其在不同特异性的抗体之间具有极端的可变性。此类高变区也称为“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区说明了抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。

CDR表示可变区内氨基酸的非连续段，但无论物种如何，已发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置在可变链的氨基酸序列内具有类似位置。所有抗体的可变重链和轻链各具有三个CDR区，每个都与其它区不连续。在所有哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定区(即，高度保守的)和可变区，并且在后者内，存在CDR和由重链或轻链的可变区内但在CDR外的氨基酸序列构成的所谓“框架区”。

本发明进一步提供了一种载体，所述载体包含上述核酸中的至少一种核酸。由于遗传密码的简并性，可以使用超过一个密码子来编码特定氨基酸。使用遗传密码，可以鉴定一个或多个不同的核苷酸序列，其中每一个都能够编码氨基酸。通过考虑异常碱基配对关系和在表达抗TGFβ抗体或部分的真核细胞或原核细胞中实际使用特定密码子(编码特定氨基酸)的频率，可以估计特定寡核苷酸实际上构成实际编码序列的概率。此类“密码子使用规则”由Lathe等人,183《分子生物学杂志》1-12(1985)公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，可以鉴定出单个核苷酸序列或者含有能够编码抗TGFB序列的理论上“最可能”的核苷酸序列的一组核苷酸序列。预期本发明中使用的抗体编码区也可以通过使用实现本文所描述的抗体和肽的变体(激动剂)的标准分子生物学技术改变现有抗体基因来提供。此类变体包含但不限于抗TGFB抗体或肽的氨基酸序列中的缺失、添加和取代。

抗体衍生物

抗体衍生物包含在本发明的范围内。抗体的“衍生物”含有另外的化学部分，通常不是蛋白质的一部分。蛋白的共价修饰包含在本发明的范围内。此类修饰可以通过抗体的靶向氨基酸残基与能够与选择的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而引入到分子中。例如，用本领域众所周知的双功能剂衍生化可用于使抗体或片段与不溶于水的载体基质或其它大分子载剂交联。

衍生物还包含被标记的放射性地标记的单克隆抗体。例如，使用放射性碘(251,1311)、碳(4C)、硫(35S)、铟、氚(H³)等；单克隆抗体与生物素或亲和素的缀合物，与酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖淀粉酶、羧酸脱水酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶的缀合物；以及单克隆抗体与生物发光剂(例如荧光素酶)、化学发光剂(如吖啶酯)或荧光剂(如藻胆蛋白)的缀合物。

本发明的另一种衍生物双功能抗体是双特异性抗体，其通过结合识别两个不同抗原群的两种单独抗体的部分而产生。这可以通过交联或重组技术来实现。另外地，可以将部分添加到抗体或其一部分中以增加体内半衰期(例如，通过延长从血流中清除的时间)。此类技术包含，例如，添加PEG部分(也被称为聚乙二醇化)，并且在本领域中是众所周知的。参见美国专利申请公开第20030031671号。

抗体的重组表达

在一些实施例中，编码本发明的抗体的核酸被直接引入到宿主细胞中，并且所述细胞在足以诱导经编码的抗体的表达的条件下温育。将受试者核酸引入到细胞中后，通常在37℃下，有时在选择条件下，将细胞温育约1-24小时，以允许抗体的表达。在一个实施例中，抗体被分泌到细胞生长的培养基的上清液中。传统上，单克隆抗体是作为鼠类杂交瘤系中的天然分子产生的。除了这个技术之外，本发明还提供了单克隆抗体的重组DNA表达。这允许在所选择的宿主物种中产生所述抗体以及一系列抗体衍生物和融合蛋白。

如果核酸分子，如DNA，含有包含转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且此类序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则所述核酸分子被称为“能够表达”所述多肽。可操作的连接是这样的连接，其中调控性DNA序列和寻求表达的DNA序列以允许基因以可回收的量表达为抗TGFβ抗体或抗体片段的方式连接。基因表达所需的调控区的精确性质可能因生物体而异，如类似领域中众所周知的。

因此，本发明涵盖抗TGFβ抗体或在原核或真核细胞中的表达。合适的宿主包含细菌或真核宿主，包含体内或原位的细菌、酵母、昆虫、真菌、鸟类和哺乳动物细胞，或哺乳动物、昆虫、鸟类或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以源自人、灵长类、仓鼠、兔子、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫，但是可以使用但不限于任何其它哺乳动物细胞。

可以通过各种合适的方法中的任一种将携带本发明的嵌合的物种形成的抗体构建体或抗TGFβ抗体的表达载体引入到合适的宿主细胞中，所述方法包含如转化、转染、缀合、原生质体融合、磷酸钙共沉淀法以及与聚阳离子(如二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖)一起使用的生物化学方法，以及如电穿孔、直接显微注射和微粒轰击等机械方法。Johnston等人,240《科学》1538(1988)或其它技术是本领域但不限于本领域的技术人员已知的。

为了长期、高产率地产生重组抗体，可以使用稳定表达。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。可以用免疫球蛋白表达盒和可选标志物转化宿主细胞，而不是使用含有复制来源的表达载体。引入外来DNA后，可以使经工程化的细胞在富集的培养基中生长，并且然后切换成选择性培养基。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的抗性，并且允许细胞稳定地将质粒整合到染色体中并且生长以形成病灶，所述病灶进而可以被克隆并且扩展成细胞系。此类经工程化的细胞系可以特别用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物/组分。

一旦产生了本发明的抗体，就可以通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将所述抗体分子纯化，例如但不限于通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是蛋白A后对特异性抗原的亲和力)和分级柱色谱法)、离心、差别溶解或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。在许多实施例中，抗体从细胞分泌到培养基中并且从培养基中采集。

药物和兽医应用

如本文所描述的本发明的抗TGFβ抗体或抗体片段可以用于例如治疗犬科动物和猫科动物的TGFβ相关病症。更具体地，本发明进一步提供了一种药物组合物，其包括药学上可接受的载剂或稀释剂以及作为活性成分的本发明的抗体或抗体片段。抗体可以是嵌合的、异源的、犬科化的或猫科化的抗体，以适应不同的非人物种。也可以设想完整的免疫球蛋白或其结合片段。本发明的抗体和其药物组合物可用于胃肠外施用，例如，皮下、肌肉内或静脉内。

在一些期望的实施例中，本发明的抗体通过肠胃外注射施用。对于肠胃外施用，抗TGFβ抗体或片段可以被调配成与药学上可接受的肠胃外媒剂缔合的溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。例如，媒剂可以是溶解于可接受的载剂，如但不限于水性载剂中的抗体或其混合物的溶液，此类媒剂是水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、海藻糖或蔗糖溶液、或血清白蛋白、甘氨酸等。也可以使用脂质体和如固定油等非水性媒剂。这些溶液是无菌的并且通常不含颗粒物质。这些组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。抗体在这些调配物中的浓度可以有很大的变化，例如从小于约0.5重量％，通常为或至少约1％到多达15重量％或20重量％，并且将主要基于流体体积、粘度等根据所选择的特定施用方式进行选择。媒剂或冻干粉末可以含有保持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲液和防腐剂)的添加剂。调配物通过通常使用的技术灭菌。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法将是本领域的技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述于例如《雷明顿药物科学》(第15版,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版有限公司(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.),1980)中。

本发明的抗体可以冻干以用于储存，并且在使用前在适合的载剂中重构。此技术已经显示出对常规免疫球蛋白有效。可以采用任何合适的冻干和重组技术。本领域的技术人员将理解，冻干和重组可以导致不同程度的抗体活性损失，并且可能必须调节使用水平以进行补偿。可以施用本发明的可以提供其混合物的抗体组合物以预防现有疾病的复发和/或治疗性治疗。合适的药物载剂描述于最新版的《雷明顿药物科学》中，这是此技术领域的其它参考文献中的本领域技术人员熟知的标准参考文本。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分地遏制或减轻疾病或病状和其并发症的量向已患有疾病或病状的受试者施用组合物。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”或“治疗有效量”。

施用剂量当然将取决于已知因素，如特定药剂的药效学特征，以及其施用方式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗的频率以及期望的效果而变化。

作为非限制性实例，狗和猫的TGFβ相关病理的治疗可以在剂量范围内按需提供。根据本发明，用于犬科动物或猫科动物治疗用途的示例抗体是高亲和力抗体以及其具有有效体内抗TGFB活性的片段、区和衍生物。可以通过治疗兽医选择剂量水平和模式来进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，药物调配物应提供足以有效地治疗受试者的本发明抗体的量。

诊断应用

本发明还提供了上述抗TGFβ抗体，用于检测已知或疑似患有TGFβ相关病症的物种，特别是犬科动物和猫科动物的TGFβ的诊断方法。本发明的抗TGFβ抗体可用于检测或定量样品中的一种或多种TGFβ或抗TGFβ抗体的免疫测定。TGFβ的免疫测定通常包括在存在本发明的能够选择性地与TGFβ结合的可检测标记的高亲和力(或高亲合力)的抗TGFβ抗体的情况下温育临床或生物样品并且检测结合在样品中的标记肽或抗体。各种临床测定程序是本领域众所周知的。此类样品包含组织活检、血液、血清和粪便样品，或从动物受试者中收集并进行如本领域技术人员已知的ELISA分析的液体。

“固相载体”或“载剂”是指能够与肽、抗原或抗体结合的任何载体。众所周知的载体或载剂包含玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载剂的性质可以在一定程度上是可溶的或不可溶的。载体材料实际上可以具有任何可能的结构配置，只要偶联的分子能够与一种或多种TGFβ蛋白或抗TGFβ抗体结合。因此，载体配置可以是球形的，如呈珠粒，或圆柱形的，如试管的内表面或棒的外表面。可替代地，表面可以是平坦的，如片材、培养皿、测试条等。例如，载体可以包含聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员将了解用于结合抗体、肽或抗原的许多其它合适的载剂，或者可以通过常规实验确定相同的载剂。众所周知的方法步骤可以确定给定批次的抗TGFB肽和/或抗体的结合活性。本领域技术人员可以通过常规实验来确定操作和最佳测定条件。

可检测地标记TGFβ特异性肽和/或抗体可以通过与用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶连接来实现。连接的酶与暴露的底物反应产生可以通过例如但不限于分光光度法、荧光法或视觉手段检测的化学部分。可以用于可检测地标记本发明的TGFβ特异性抗体的酶包含但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。通过放射性标记TGFβ特异性抗体，可以通过施用放射免疫测定(RIA)检测TGFβ。放射性同位素可以通过γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影等方式进行检测。对于本发明的目的特别有用的同位素包含：³H、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S和¹⁴C。

还可以用荧光化合物标记TGFβ特异性抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，它的存在可以由于荧光而被检测到。最常用的荧光标记化合物为本领域技术人员已知的异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。TGFβ特异性抗体也可以使用荧光发射金属(如¹²⁵Eu)或镧系元素的其它金属可检测地标记。这些金属可以使用如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团与TGFβ特异性抗体连接。

TGFβ特异性抗体也可以通过与化学发光化合物偶联而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程期间出现的发光的存在来确定化学发光标记抗体的存在。有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)、三甲基吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

同样，生物发光化合物可以用于标记本发明的TGFβ特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物。生物发光是在生物系统中发现的化学发光类型，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在是通过检测发光的存在来确定的。用于标记的重要生物发光化合物是荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

TGFβ特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物的检测可以通过闪烁计数器完成，例如，如果可检测标记是放射性γ发射体，或者通过荧光计完成，例如，如果标记是荧光材料。在酶标记的情况下，检测可以通过采用酶底物的比色方法来完成。检测也可以通过与类似制备的标准品比较底物的酶促反应程度的视觉比较来完成。

出于本发明的目的，通过上述测定检测到的TGFβ可以存在于生物样品中。可以使用含有TGFβ的任何样品。例如，样品是生物流体，例如血液、血清、淋巴、尿液、粪便、炎性渗出物、脑脊液、羊水、组织提取物或匀浆等以及任何活检相关材料。本发明不限于仅使用这些样品的测定，然而，根据本说明书，本领域普通技术人员可以确定允许使用其它样品的合适条件。

原位检测可以通过从动物受试者中取出组织学样本并将本发明的标记抗体的组合提供给此类样本来完成。抗体(或其部分)可以通过将标记抗体(或部分)施加或覆盖到生物样品上来提供。通过使用此类程序，不仅可以确定TGFβ的存在，还可以确定被检查组织中TGFβ的分布。使用本发明，本领域技术人员将容易地认识到，可以修改各种组织学方法(如染色程序)中的任一种，以实现这种原位检测。

本发明的抗体、片段或衍生物可以适用于免疫测定，也称为“双位点”或“夹心”测定。在典型的免疫测定中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)与不溶于要测试的流体的固相载体结合，并且添加一定量的可检测标记的可溶性抗体，以允许检测和/或定量固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。

抗体可以用于定量或定性检测样品中的一种或多种TGFβ蛋白，或检测表达TGFβ蛋白中的一种或多种的细胞的存在。这可以通过采用荧光标记抗体(参见下文)的免疫荧光技术与荧光显微术、流式细胞术或荧光检测相结合来实现。出于诊断目的，抗体可以是经标记的或未经标记的。未经标记的抗体可以与其它与抗体反应的标记抗体(第二抗体)组合使用，如犬科动物免疫球蛋白恒定区特异性抗体。可替代地，抗体可以被双特异性标记。可以采用多种标记，如放射性核素、萤石(fluor)、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。多种类型的免疫测定，如先前讨论的免疫测定是可用的，并且是本领域技术人员熟知的。重要的是，本发明的抗体可以有助于诊断犬科动物和猫科动物的TGFβ相关病症。更具体地，抗体/本发明的抗体可以鉴定伴侣动物中TGFβ的过度表达。因此，本发明的抗体可以提供重要的免疫组织化学工具。本发明的抗体可以用于抗体阵列上，其高度适于测量基因表达谱和本领域技术人员熟知的其它诊断工具。

试剂盒

本发明的范围内还包含用于实践本主题方法的试剂盒。试剂盒至少包含本发明的抗体中的一种或多种、编码所述抗体的核酸或含有所述抗体的细胞。本发明的抗体可以通常以冻干形式在容器中提供。可以与标记或毒素缀合或未缀合的抗体通常包含在试剂盒中，所述试剂盒含有缓冲液，如Tris、磷酸盐、碳酸盐等、稳定剂、灭微生物剂、惰性蛋白，例如血清白蛋白等。通常，基于活性抗体的量，这些材料将以小于5％wt.的量存在，并且再次基于抗体浓度，通常以至少约0.001％wt.的总量存在。通常，期望包含惰性填充剂或赋形剂来稀释活性成分，其中赋形剂可以占总组合物的1％至99％wt.。在测定中采用能够与第一抗体结合的第二抗体的情况下，其通常存在于单独的小瓶中。第二抗体通常与标记缀合，并且以与上述抗体调配物类似的方式调配。试剂盒通常还将包含一套使用说明书

在描述本发明的方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化，但对于本领域技术人员来说是众所周知的。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意图为限制性的。现在将通过下面的非限制性实例进一步描述本发明。

实例

通过以下实例进一步说明和支持本发明。然而，这些实例决不应被视为进一步限制本发明的范围。相反，本领域的普通技术人员将容易理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，还存在本发明的其它实施例、修改和等效物。

实例1：

抗TGFβ1、2、3抗体

抗TGFβ1、2、3GC1008抗体(VH：SEQ ID NO:74和VH：SEQ ID NO:75)使用如本文所描述的犬科化和猫科化技术两者进行物种形成。

GC1008单克隆抗体的六个CDR如下：

表1

SEQ ID NO:	描述	氨基酸序列
			23	重链CDR#1(CDR-H1)	GYTPSSNVIS
33	重链CDR#2(CDR-H2)	GVIPIVDIANYAQRPKGR
			39	重链CDR#3(CDR-H3)	ASTLGLVLDAMDY
3	轻链CDR#1(CDR-K1)	RASQSL
			4	轻链CDR#2(CDR-K2)	GASSRA
5	轻链CDR#3(CDR-K3)	QQYADSPIT

重组人：猫科动物嵌合体的构建

抗体可变结构域负责抗原结合，并且因此将GC1008抗体的全可变结构域移植到不同的恒定区，例如来自不同物种的恒定区上，这应对抗体与猫科动物TGFβ蛋白结合的能力几乎没有或没有影响。如此，表达载体被设计成在哺乳动物表达系统中产生重组嵌合抗体。本文所描述的嵌合抗体由来自宿主物种抗体的可变序列(CDR和框架两者)组成，所述可变序列移植到来自不同物种的IgG分子的相应重恒定区和轻恒定区上。例如，来自人源化抗体的可变区，例如SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80，以及来自猫科动物物种的重链恒定区(氨基酸SEQ ID NO:75)，其在本文中称为人:猫科动物嵌合体。为了产生期望的嵌合抗体，为所选抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)序列构建合成DNA序列，所述合成DNA序列含有独特的限制性核酸内切酶位点、Kozak共有序列和N端分泌前导，以促进重组抗体表达并从哺乳动物细胞系中分泌。

对于人:猫科动物GC1008嵌合体，本文称为felchimGC1008，将人可变区(SEQ IDNO:79和80)克隆到含有猫科动物IgG重链恒定区(SEQ ID NO:75)或轻链恒定区(SEQ IDNO:83)的哺乳动物表达质粒中。在CMV启动子的控制下，使用标准方法将编码每个重链和轻链的质粒共转染到HEK 293细胞中(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。在表达六天后，根据蛋白质纯化的标准方法，使用MabSelect Sure蛋白A树脂(瑞典乌普萨拉的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Uppsala,Sweden))从50ml的瞬时转染的HEK293FS细胞上清液中纯化嵌合mAb。中和洗脱的级分，使用10,000标称MW截止Amicon Ultra离心装置(马萨诸塞州伯灵顿的密理博西格玛公司(Millipore Sigma,Burlington,MA))浓缩至约0.5-1.0mL，在4℃的20mM乙酸钠(pH 5.0)、85g/L蔗糖、+/-0.05g/L EDTA中透析过夜，并在4℃下储存以供进一步使用。

抗体GC1008的猫科化

抗药物抗体(ADA)的产生与包含单克隆抗体在内的任何生物治疗蛋白的功效丧失相关。单克隆抗体的物种形成可以降低mAb的免疫原性倾向，尽管可以找到免疫原性完全人mAb和非免疫原性嵌合mAb的实例。为了帮助缓解与本文所提供的GC1008单克隆抗体的ADA形成相关的风险，采用了犬科化策略。这种犬科化策略基于鉴定用于CDR移植的最合适的犬科动物种系抗体序列。

在对可变重链和轻链两者的可用犬科动物种系序列进行广泛分析后，基于其与GC1008抗体可变区的框架区的同源性来选择种系候选者，并且使用CDR(VH SEQ ID NO:23、33和39，以及VL SEQ ID NO:3、4、5)来替代天然犬科动物CDR。目的是使用犬科动物抗体框架保持高亲和力和基于细胞的活性，以最小化体内免疫原性的潜力。

制备了表示犬科化GC1008抗体的犬科化可变重链和轻链的合成核苷酸构建体。最初集中在表示四个犬科动物可变重链(VH2、3、4和6)和四个犬科动物κ轻链(VL1-4)的合成核苷酸构建体上的用GC1008抗体的犬科化工作被选择用于最初的犬科化。在将每个可变链亚克隆到含有相应犬科动物重恒定区(SEQ ID NO:77)或κ(SEQ ID NO:81)恒定区中后，将质粒共转染以在HEK 293细胞中以所有可能的组合表达抗体，以制备大量犬科化抗体构建体。除了两个以外的所有犬科化构建体在瞬时HEK293表达系统中表达。在表达后，评估与所有三种TGFβ同种型的结合。参见下文。令人惊讶的是，没有观察到体外结合或功能活性。CDR和框架区中的氨基酸被突变、插入或缺失，以微调mAb与靶标同种型的结合界面。移植到犬科动物框架上的预先确定的标准人互补决定区显著降低了对靶标同种型的亲和力，因此，需要另外的工程化来恢复对全物种模板mAb的靶标的相当的亲和力。重新工程化的VH和VL在下表2中用^*表示。

表2

GC1008的猫科化

与GC1008抗体的犬科化一样，通过获得用于犬科化的相同CDR区序列并用猫科动物可变框架序列并入其来产生猫科化抗体。在猫科动物数据库中搜索与嵌合和/或犬科化抗体类似的框架，以鉴定要研究的猫科动物种系。最初，选择了两个重链框架和四个轻链框架，产生了以下猫科化可变区：

在将每个可变链亚克隆到含有相应猫科动物重恒定区(SEQ ID NO:75)或κ(SEQID NO:83)恒定区中后，将质粒共转染以在HEK 293细胞中表达抗体。进行共转染以得到重链和轻链的组合。对犬科化和猫科化版本的原始VH和VL进行结合和功能测定(如下文所描述的)。令人惊讶的是，没有观察到体外结合或功能活性。CDR和框架区中的氨基酸被突变、插入或缺失，以微调mAb与靶标同种型的结合界面。移植到猫科动物框架上的预先确定的标准人互补决定区显著降低了对靶标同种型的亲和力，因此，需要另外的工程化来恢复对全物种模板mAb的靶标的相当的亲和力。重新工程化的VH和VL在下表3中用^*表示。

表3

体外结合和功能测定

使用表面等离子体共振(SPR)评估felchimGC1008和所有犬科化和猫科化抗体04H09和chi04H09的亲和力和基于细胞的效力。为了表征候选单克隆抗体(mAb)与TGFβ1、2和3结合的亲和力，使用Biacore T200系统(瑞典乌普萨拉的Biocore生命科学公司(通用电气医疗集团))评估表面等离子体共振(SPR)。为了避免在将抗体固定到表面时可能发生的与不同表面制备相关的亲和力差异，将TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3(R&D系统公司)直接与单个表面缀合。使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学，通过胺偶联5μg/mL获得固定化。将芯片用乙醇胺猝灭，并评估所有候选mAb与固定化的TGFβ结合的亲和力。所有曲线均拟合为1:1模型。亲和力<10-11为低于仪器检测的定量下限。

表4：犬科化mAb VH/VL组合体外结合

表5：猫科化mAb VH/VL组合体外结合

样品名称	TGFb1 KD(M)	TGFb2 KD(M)	TGFb3 KD(M)
				felchimGC1008	2.58E-09	1.88E-09	2.35E-09
VH8-VL2	无	无	无
				VH9-VL3	无	无	无
VH4-VL4	无	无	无
				VH3-VL5	无	无	无
VH2.1-VL3	2.89E-09	1.91E-09	2.6E-09
				VH6.1-VL3	3.54E-09	2.99E-09	3.57E-09
VH2.2-VL3	3.31E-09	2.39E-09	3.49E-09
				VH3.2-VL3	6.6E-10	7.51E-10	1.44E-10
VH2.8-VL6	2.95E-09	1.72E-09	2.41E-09
				VH2.2-VL7	4.95E-09	2.16E-09	3.52E-09
VH3.2-VL7	8.57E-10	5.89E-10	4.34E-10
				VH3.8-VL7	3.07E-09	1.94E-09	6.35E-10
VH2.1-VL8	3.31E-09	3.41E-09	1.06E-09
				VH3.2-VL8	9.71E-10	2.13E-09	4.66E-11
VH3.2-VL1	3.33E-10	1.84E-09	5.1E-12

为了测定效力，一种基于原代细胞的测定测量犬科动物二尖瓣间质细胞(CMVIC)中的TGFβ1诱导的SMAD3磷酸化的抑制作用。对于此测定，将TGFβ1、2或3添加到具有或不具有抗体的细胞中，并通过AlphaLISA检测试剂盒测定SMAD3信号传导。所有mAb对TGFβ1、2和3表面的亲和力以及每种抗体的效力如表6和表7(下文)所示(分别为KD数据和CMVIC数据)。

表6：犬科化mAb VH/VL组合功能抑制测定

表7：猫科化mAb VH/VL组合体外功能抑制测定

样品名称	TGFb1_IC50 ug/mL	TGFb2_IC50 ug/mL	TGFb3_IC50 ug/mL
				felchimGC1008VH	0.1762	0.1668	0.05296
VH8-VL2	-	-	-
				VH9-VL3	-	-	-
VH4-VL4	-	-	-
				VH3-VL5	-	-	-
VH2.1-VL3	0.597	0.277	0.132
				VH6.1-VL3	0.425	0.223	0.014
VH2.2-VL3	0.240	1.197	0.000
				VH3.2-VL3	0.132	0.140	0.023
VH2.8-VL6	0.969	0.547	0.000
				VH2.2-VL7	4.587	20.600	2.203
VH3.2-VL7	0.139	0.048	0.018
				VH3.8-VL7	1.357	2.667	0.204
VH2.1-VL8	0.266	0.031	0.124
				VH3.2-VL8	0.072	0.037	0.008
VH3.2-VL1	0.797	0.190	0.053

实例2：

ZTS-122和ZTS-207的药代动力学

进行了一项确定犬科化ZTS-122(VH3.1和VL2[分别为SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:68])和ZTS-207(VH4.5-VL2[分别为SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:68])的皮下药代动力学的研究。在第0天和第28天，以1mg/kg的皮下施用量向4只狗给药每个分子。在给药前第1天、第3天、第7天、第10天、第14天、第21天、第28天、第29天、第31天、第35天、第38天、第43天、第49天和第56天采集动物的血浆样品。使用配体结合方法评估每种单克隆抗体在血浆中的暴露。在第1期(第0天剂量)和第2期(第28天剂量)使用非隔室分析评估其药代动力学特性。请参见表8(下文)。

表8

Claims (28)

1.一种犬科化抗体，其与犬科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合，所述犬科化抗体包括：重链互补决定区(CDR)，所述重链CDR包括SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:39；以及轻链互补决定区(CDR)，所述轻链CDR包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5，和其变体。

2.根据权利要求1所述的犬科化抗体，其进一步包括犬科动物IgGB恒定区，所述犬科动物IgGB恒定区包括与SEQ ID NO:77具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。

3.一种犬科化抗体，其与犬科动物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3特异性地结合，所述犬科化抗体包括：重链可变区(VH)，所述VH与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性：SEQ ID NO:42-54；以及轻链可变区(VL)，所述VL与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性：SEQ ID NO:67-70。

4.根据权利要求3所述的犬科化抗体，其包括重链可变区(VH)，所述VH与包括SEQ IDNO:49的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性；并且包括轻链可变区(VL)，所述VL与包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性。

5.根据权利要求3所述的犬科化抗体，其包括重链可变区(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:49；并且包括轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:68。

6.根据权利要求3所述的犬科化抗体，其包括重链可变区(VH)，所述VH与包括SEQ IDNO:48的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性；并且包括轻链可变区(VL)，所述VL与包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性。

7.根据权利要求3所述的犬科化抗体，其包括重链可变区(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:49；并且包括轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:68。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其用于治疗TGFβ相关病症。

9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述TGFβ相关病症选自由以下组成的组：纤维化病症、结缔组织病症、骨病症和细胞增殖病症。

10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述TGFβ相关病症包括纤维化病症。

11.根据权利要求10所述的抗体，其中所述纤维化病症选自由以下组成的组：肾纤维化/慢性肾病；肺纤维化；肝硬化；胶质瘢痕；以及全身性硬化症/硬皮病。

12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述TGFβ相关病症是肾纤维化/慢性肾病。

13.一种药物组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载剂。

14.一种通过以下治疗犬科动物的TGFβ相关病症的方法：向所述犬科动物施用治疗量的根据权利要求8所述的药物组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述TGFβ相关病症选自由以下组成的组：纤维化病症、结缔组织病症、骨病症和细胞增殖病症。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述TGFβ相关病症包括纤维化病症。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述纤维化病症选自由以下组成的组：肾纤维化/慢性肾病；肺纤维化；肝硬化；胶质瘢痕；以及全身性硬化症/硬皮病。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述TGFβ病症是肾纤维化/慢性肾病。

19.一种通过以下抑制犬科动物的TGFβ1、2和3活性的方法：施用根据权利要求8所述的药物组合物。

20.一种分离的核酸序列，其与编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体和其任何变体的核酸序列具有至少约95％序列同一性，所述变体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

21.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体和其任何变体，其中所述序列包括编码与SEQ ID NO:55-66具有95％序列同一性的VH的核苷酸序列和编码与SEQ ID NO:71-74具有95％序列同一性的VL的核苷酸序列，所述变体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

22.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求21所述的抗体和其任何变体，其中所述序列包括编码与SEQ ID NO:62具有95％序列同一性的VH的核苷酸序列和编码与SEQ IDNO:72具有95％序列同一性的VL的核苷酸序列，所述变体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

23.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求21所述的抗体和其任何变体，其中所述序列包括编码与SEQ ID NO:61具有95％序列同一性的VH的核苷酸序列和编码与SEQ IDNO:72具有95％序列同一性的VL的核苷酸序列，所述变体具有一个或多个引起保守氨基酸取代的核酸取代。

24.一种载体，其包括根据权利要求20至23中任一项所述的核酸序列。

25.一种宿主细胞，其包括根据权利要求20至23中任一项所述的核酸序列。

26.一种宿主细胞，其包括根据权利要求24所述的载体。

27.一种宿主细胞，其产生根据权利要求1至12中任一项所述的抗体。

28.一种产生根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在使得产生所述抗体的条件下培养根据权利要求25至27中任一项所述的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或所述宿主细胞的培养基中分离所述抗体。