CN118076633A - 人源化抗-人βig-h3蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

肿瘤基质进化在癌症期间发挥着关键作用，因为它可以充当限制免疫细胞进入肿瘤的物理屏障。因此，基质中βig‑h3(TGFβi)的过表达在胰腺导管腺癌和其他癌症中具有不良预后。一种称作18B3的针对βig‑h3蛋白的单克隆抗体显示出通过阻断抑制CD8+T细胞激活而发挥直接调节抗肿瘤免疫应答的作用。发明人从18B3开发出具有出乎意料地高的亲和力、慢的解离速率和强的热稳定性的人源化抗体，使它们成为治疗其中基质在体内表达βig‑h3的癌症的强效候选物。因此，本发明涉及这些人源化单克隆抗体和治疗此类癌症的方法。

Description

人源化抗-人βig-h3蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及抗体领域。特别是，提供对人βig-h3蛋白具有特异性的人源化抗体及其用途。还提供了医疗用途，特别是用于治疗其中在体内表达基质蛋白βig-h3的癌症，例如胰腺导管腺癌(PDAC)、肺癌、头颈癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤以及下文所提到的其他癌症。

背景技术

肿瘤基质进化在癌症期间发挥着关键作用，因为它可以充当限制免疫细胞进入肿瘤的物理屏障。因此，识别肿瘤基质中表达或过表达并参与免疫抑制的关键分子将带来新的治疗机会。在基质蛋白中，βig-h3(也称为TGFβi)已被表明，其在基质中的过表达在胰腺导管腺癌(PDAC)和其他癌症(例如肺癌、头颈癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤)中具有不良预后。

探索βig-h3基质蛋白在使用PDAC模型(小鼠和人类二者)中的潜在作用，已确定该蛋白降低T淋巴细胞的细胞毒性活性，并有助于硬化微环境，使肿瘤更难到达免疫系统。

在小鼠和人类中，βig-h3蛋白在健康个体的胰腺外分泌室中不表达，但非常早地出现在肿瘤基质中。

因此，有人提出通过用特定药物，靶向肿瘤基质的一些关键成分(例如βig-h3)来调节肿瘤基质，以帮助实体癌的治疗性治疗。有人提出特异性消耗(depletion)该蛋白可以恢复CD8+T细胞的活性并降低基质的刚性，从而恢复进入肿瘤的通道。

消耗蛋白质的一种标准方法是建立特异性定位关键表位的单克隆抗体(mAb)，从而阻断该蛋白质的功能活性，然后，使蛋白质/抗体复合物体内消除。

针对βig-h3蛋白的抗体显示，通过阻断CD8+T细胞活化，在直接调节抗肿瘤免疫应答中发挥作用(WO 2017/158043)。WO 2020/079164中描述了针对人βig-h3蛋白的鼠单克隆抗体，称为18B3。

发明内容

对新型的、优选改进的癌症治疗方法有持续需要。因此，本发明的一个目的是提供用于治疗癌症的改进的方法。特别地，这些改进的方法旨在特异性消耗βig-h3蛋白，恢复CD8+T细胞活性并降低基质的刚性，从而恢复或促进免疫系统对肿瘤的可及性，最终导致显著的肿瘤减少和存活率。本发明还旨在促进药物进入肿瘤。本发明的用于消耗βig-h3蛋白的方法是建立特异性定位关键表位的人源化单克隆抗体(mAb)，从而阻断该蛋白的功能活性。随后，获得蛋白质/抗体复合物的体内消除。

因此，本发明涉及对βig-h3蛋白具有特异性的人源化(Hz)抗体及其用途。这些Hz抗体是βig-h3拮抗剂。具体地，本发明由权利要求书限定。这些抗体是18B3抗体的人源化形式。这些人源化抗体具有特别的吸引力和意想不到的特性(例如亲和力、解离速率、热稳定性、细胞培养物中的生产力)并且是用于治疗用途的有前途的抗体，特别是在恢复CD8+T细胞活性和降低基质刚性方面，从而恢复或促进免疫系统和/或药物对肿瘤的可及性。因此，这些人源化mAb在体外和体内功能生物测定中被证明是成功的。

mAb靶向βig-h3蛋白的区域，该区域已知参与整合素(参与T细胞激活途径)和胶原蛋白(参与调节肿瘤微环境或基质)的结合。该区域是avb3(αVβ3)整合素相互作用基序，存在于对应于氨基酸(AA)548-614的片段内。表位作图研究表明，该抗体靶向βig-h3-蛋白(AA残基549-558)的βig-h3蛋白的FAS1第4个结构域(线性表位ALPPRERSRL，SEQ ID NO：16，甚至可以减少至8个中心氨基酸，SEQ ID NO：30)。本文所述的几种亲和力和功能生物测定允许确认本文公开的人源化(Hz)单克隆抗体的特异性结合。

在一个方面，本发明涉及包含可变区VH和可变区VL的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，例如所述抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白的表位特异性结合，所述表位如序列SEQ ID NO：16或30所示，所述抗体或其抗原结合片段具有K_D为1nM以下的高亲和力，优选0.7nM以下，更优选0.6nM或0.58nM以下，和慢解离速率K_d为4E-04s^-1～10E-04s^-1，优选为5E-04s^-1～8E-04s^-1，更优选为5.5E-04s^-1～7.5E-04s^-1，如使用表面等离子体共振(SPR)测量的。SPR可以使用生物传感器系统例如系统来测量。

本文公开的亲和力和解离速率如测量方法部分中所述的测量。

在实施方式中，本发明涉及包含可变区VH和可变区VL的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，例如所述抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白的表位特异性结合。所述表位如序列SEQ ID NO：16或30所示。VH区具有如SEQ ID NO：4或28所示的序列。SEQ IDNO：28是SEQ ID NO：4的突变形式，即H-CDR3中的第102位半胱氨酸被丝氨酸替换。VL是具有SEQ ID NO：18所示序列的鼠18B3 VL区的人源化变体。VH和VL的此种组合为人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段提供了高的和意想不到的热阻，即DSC，其等于或高于80℃，特别是80℃至83℃、83.2℃、83.5℃或84℃，优选为81℃至约83℃或83.2℃。DSC使用测量方法部分中描述的方法来测量。在一个方面，该人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段与所述表位以K_D为1nM以下，优选为0.7nM以下，更优选为0.6nM或0.58nM以下的高亲和力，和/或K_d为4E-04s^-1～10E-04s^-1，优选为5E-04s^-1～8E-04s^-1，更优选为5.5E-04s^-1～7.5E-04s^-1的慢解离速率进一步结合，如使用表面等离子体共振(SPR)测量的。SPR可以使用生物传感器系统例如系统来测量。

本发明的人源化抗体可以允许消耗βig-h3蛋白。

本发明的人源化抗体可以恢复CD8+T细胞活性和/或降低基质的刚性，从而恢复进入肿瘤的通道。因此，由于抗βig-h3抗体对基质的作用，这些抗体可以与另一种可以更容易地到达肿瘤的抗肿瘤剂组合使用。

本发明还涉及药物组合物，包含至少一种人源化单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

本发明还涉及药物组合物、药物组合或组分的试剂盒，包含：至少一种人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，以及另一种抗肿瘤药物，例如抗体，特别是单克隆抗体或其片段。

本发明还涉及这样的抗体、药物组合物、药物组合或组分的试剂盒，用于预防或治疗癌症、消耗βig-h3蛋白、恢复或激活CD8+T细胞活性和/或降低基质的刚性，并有利于其他抗肿瘤药物(例如抗体、单克隆抗体)到达肿瘤的用途。

本发明还涉及预防或治疗癌症的方法，包括向有需要的患者给药有效量的此类抗体、药物组合物、药物组合或组分的试剂盒。本发明还涉及消耗βig-h3蛋白、恢复或激活CD8+T细胞活性和/或降低基质的刚性，并有利于其他抗肿瘤药物(例如抗体、单克隆抗体)到达肿瘤。

发明详述

人源化抗体

在一个方面，本发明涉及包含可变区VH和可变区VL的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，例如所述抗体或其抗原结合片段与与βig-h3蛋白的表位特异性结合。表位优选如序列SEQ ID NO：16或30所示。当然，不能排除本发明的抗体或其片段能够与大于SEQ ID NO：16或30并且包含该序列的βig-h3蛋白片段结合。抗体或其片段的结合可以以出人意料的高亲和力水平发生，特别是以K_D为1nM以下，优选0.7nM以下，更优选0.6nM或0.58nM以下的高亲和力水平发生，如使用表面等离子体共振(SPR)测量的。显著且出乎意料的是，以慢解离速率K_d结合后Hz抗体或其片段出现。该慢解离速率可以为4E-04s^-1～10E-04s^-1，优选为5E-04s^-1～8E-04s^-1，更优选为5.5E-04s^-1～7.5E-04s^-1，如使用SPR测量的。SPR可以使用生物传感器系统例如系统来测量。

本申请中关注的序列如下表1所示：

图例：在VL和VH中，根据Kabat的CDR以粗体显示，其他氨基酸在FR中，与鼠科动物不同的特定氨基酸以下划线示出。

产生了两个人源化VH区(H-330和H-311)和两个人源化VL区(L-41和L-228)，并且它们的VH/VL组合在单克隆抗体或其片段中，每个区都是本发明的目的。人源化VH区H-169和人源化VL区L-315也是本发明的目标，以及它们与本发明的VL或VH区在单克隆抗体或其片段中的组合也是本发明的目的。

H-330的突变形式也已建立，具有第102位半胱氨酸突变为丝氨酸。该突变形式被称为H330 V1.2(而原始H330为V1)或H330C102S，并且具有如SEQ ID NO：28所示的序列。该突变发生在H-CDR-3中，并且突变的H-CDR3具有序列如SEQ ID NO：27所示。

这些VH区，包括突变的VH区，可以组合以设计抗体结合区H-330/L-41、H-330/L-228、H-330V1.2/L-41、H-330V1.2/L-228、H-311/L-41和H-311/L-228，每一种都是本发明的目的。人源化VH区H-330、H-33 0V1.2和H-311，尤其是VH区H-330和H-330V1.2，还可以与衍生自m18B3单克隆抗体的任何人源化VL区组合。具体地，人源化VL区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或分别如SEQ ID NO：11、12、9所示序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。这些组合被认为与βig-h3蛋白特异性结合，并且更具体地与βig-h3蛋白的βig-h3蛋白的FAS1第四结构域(如SEQ ID NO：16或30所示的表位)(AA残基549-558)结合。如上所述的具有良好亲和力或具有非常高亲和力的结合可以使用本文描述的方法验证，尤其是SPR方法，例如使用生物传感器系统例如系统来验证，以便鉴定包含结构域H-330、H-330V1.2或H-311以及源自m18B3的人源化结构域的候选物。可以用相同的方法测试解离率来鉴定那些候选物。

对通过ELISA测量的亲和力而言，人源化变体与嵌合18B3相比没有统计学显著差异，表明人源化处理没有改变通过ELISA测量的亲和力。使用系统，所有这些人源化mAb都具有亚纳摩尔范围内的亲和力(KD)，并且令人惊讶的是解离速率较慢，比小鼠18B3和嵌合18B3更慢。人源化变体H-330/L-228在人源化mAb中显示出最佳亲和力。

因此，在一些方面，本发明涉及人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，包含H-330/L-41、H-330/L-228、H-330V1.2/L-41、H-330V1.2/L-228、H-311/L-41或H-311/L-228。这些抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白的表位特异性结合，所述表位如序列SEQ IDNO：16或30(或如上所述的更长序列)所示。此结合以高亲和力K_D发生，所述K_D特别为1nM以下，优选0.7nM以下，更优选0.6nM或0.58nM以下，如使用SPR测量的。此结合有利地以慢解离速率K_d发生，所述慢解离速率K_d特别是4E-04s^-1～10E-04s^-1，优选为5E-04s^-1～8E-04s^-1，更优选为5.5E-04s^-1～7.5E-04s^-1，如使用SPR测量的。SPR可以使用生物传感器系统例如系统来测量。

H-330和H-330V1.2，如其与所有测试的L-变体(L-41或L-228)组合所例证的，为单克隆抗体提供了意想不到的高热稳定性，根据DSC其高于80℃，特别地为81℃至83℃、83.2℃或83.5℃。实施例中提供的附加数据以及VH和VL区的其他组合表明，无论互补的VH区如何，H-330是造成此提高的热稳定性的原因。具有C102S突变的H-330V1.2的热稳定性保持高热稳定性并且高于80℃。H-330和H-330V1.2，如其与所有测试的L-变体(L-41或L-228)组合所例证的，也为单克隆抗体提供了在CHO细胞中瞬时表达的意外地高的生产力，该生产力为高于200μg/ml，特别是230μg/ml～300μg/ml。这伴随着通过ELISA和的非常好的亲和力，以及对人源化变体H-330/L-228的最佳亲和力。相对于使用H-311与相同VL变体组合而获得的结果而言，与单克隆抗体中H-330或其突变形式C102S的存在相关的这些特殊性质是出人意料的，在某种程度上因为H-330和H-311之间仅存在6个氨基酸差异。

当与不同的轻链(L-41、L-228、L-315)结合时，在结合本文公开的βig-h3蛋白的表位(序列SEQ ID NO：16或30的表位)的单克隆抗体中，重链H-330，在其V1形式(SEQ ID NO：4)或其C102S V1.2突变形式(SEQ ID NO：28)中表现出高且意想不到的热稳定性。重链第102位的半胱氨酸突变为丝氨酸的变体显示出保留的与未突变mAb形式(H-330V1)类似的反应性和稳定性特性，并且代表用于药物适应性目的的有价值的候选物。

本文公开的DSC和CHO中的瞬时表达已按照测量方法部分中所述的进行测量。

在一个具体方面，本发明涉及一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体和抗原结合片段与所述βig-h3蛋白特异性结合，优选地与如序列SEQ IDNO：16或30所示的表位结合，尤其具有如上所述的结合亲和力和/或解离速率(高亲和力K_D，特别为1nM以下，优选0.7nM以下，更优选0.6nM或0.58nM以下，如使用SPR测量的；慢解离速率K_d，特别是4E-04s^-1～10E-04s^-1，优选为5E-04s^-1～8E-04s^-1，更优选为5.5E-04s^-1～7.5E-04s^-1，如使用SPR测量的)，并且包含：

(a)可变区VH(包含H-330变体或H-330V1.2的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：2所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3或27所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL，为18B3单克隆抗体的人源化变体，例如具有SEQ ID NO：18所示序列的18B3 VL区的人源化变体。

在实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO：4所示序列的VH区。

该单克隆抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白特异性结合，并且更具体地结合βig-h3蛋白的FAS1第四结构域(如SEQ ID NO：16或30所示的表位)。此结合以高亲和力K_D以及慢解离速率K_d发生，所述高亲和力K_D为1nM以下，优选0.7nM以下，更优选0.6nM或0.58nM以下，所述慢解离速率K_d为4E-04s^-1～10E-04s^-1，优选为5E-04s^-1～8E-04s^-1，更优选为5.5E-04s^-1～7.5E-04s^-1，如使用SPR测量的。SPR可以使用生物传感器系统例如系统来测量。

在另一个具体方面，本发明涉及一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体和抗原结合片段与βig-h3蛋白特异性结合，并且包含：

(a)可变区VH(包含H-330变体或H-330V1.2的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：2所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3或27所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL(包含L-41变体的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：7所示序列的L-CDR1；

-具有SEQ ID NO：8所示序列的L-CDR2；

-具有SEQ ID NO：9所示序列的L-CDR3。

在实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO：4或28所示序列的VH区和/或具有SEQ IDNO：10所示序列的VL区。

所述单克隆抗体或其抗原结合片段：

-与βig-h3蛋白结合，K_D为约5.8E-10M以下，特别是约5E-10M～约5.8E-10M以下，尤其是约5.35E-10M；和/或

-与βig-h3蛋白结合，K_d为约6E-04s^-1以上，特别是约6.2E-04s^-1～约7E-04s^-1，特别是约6.59E-04s^-1；和/或

-DSC稳定性(Tm Fab)为约79℃以上，特别是约79℃至约83℃、83.2℃或83.5℃，通常为约81.3℃；和/或

-具有在CHO细胞中瞬时表达的良好生产力，测量值约为275μg/ml。

在实施方式中，该人源化抗βig-h3单克隆抗体(H-330/L-41或H-330V1.2/L-41)或其抗原结合片段，包含：

-具有SEQ ID NO：4或28所示序列的VH区；

-具有SEQ ID NO：10所示序列的VL区。

在实施方式中，所述人源化抗βig-h3抗体包含：

-重链，包含所述可变区和恒定区CH，例如具有SEQ ID NO：14所示序列的CH；

-轻链，包含所述可变区和恒定区CL，例如具有SEQ ID NO：15所示序列的CL。

在另一个具体方面，本发明涉及一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体和抗原结合片段与βig-h3蛋白特异性结合，并且包含：

(a)可变区VH(包含H-330变体或H-330V1.2的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：2所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3或27所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL(包含L-228变体的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：11所示序列的L-CDR1；

-具有SEQ ID NO：12所示序列的L-CDR2；

-具有SEQ ID NO：9所示序列的L-CDR3。

在实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO：4或28所示序列的VH区和/或具有SEQ IDNO：13所示序列的VL区。

此单克隆抗体或其抗原结合片段：

-与βig-h3蛋白结合，K_D为约5E-10M以下，特别是约4.5E-10M～约5E-10M以下，尤其是约4.76E-10M；和/或

-与βig-h3蛋白结合，K_d为约5E-04s^-1以上，特别是约5.5E-04s^-1～约6E-04s^-1，特别是约5.83E-04s^-1；和/或

-DSC稳定性(Tm Fab)为约78℃以上，特别是约78℃～约82℃，通常约80.2℃；和/或

-具有在CHO细胞中瞬时表达的良好生产力，测量值约为249μg/ml。

在实施方式中，此人源化抗βig-h3单克隆抗体(H-330/L-228或H-330V1.2/L-228)或其抗原结合片段，包含：

-具有SEQ ID NO：4或28所示序列的VH区；

-具有SEQ ID NO：13所示序列的VL区。

在实施方式中，所述人源化抗βig-h3单克隆抗体包含：

-重链，包含所述可变区和恒定区CH，例如具有SEQ ID NO：14所示序列的CH；

-轻链，包含所述可变区和恒定区CL，例如具有SEQ ID NO：15所示序列的CL。

在另一个具体方面，本发明涉及一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体和抗原结合片段与βig-h3蛋白特异性结合，并且包含：

(a)可变区VH(包含H-311变体的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：5所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL(包含L-41变体的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：7所示序列的L-CDR1；

-具有SEQ ID NO：8所示序列的L-CDR2；

-具有SEQ ID NO：9所示序列的L-CDR3。

在实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO：6所示序列的VH区和/或具有SEQ ID NO：10所示序列的VL区。

此单克隆抗体或其抗原结合片段：

-与βig-h3蛋白结合，K_D为约5E-10M以下，特别是约4.5E-10M～5E-10M，尤其是约4.82E-10M；和/或

-与βig-h3蛋白结合，K_d为约6.8E-04s^-1以上，特别是约7E-04s^-1～约7.5E-04s^-1，特别是约7.26E-04s^-1；和/或

-DSC稳定性(Tm Fab)为约75℃以上，特别是约75℃～约79℃，通常为约77℃。

在实施方式中，此人源化抗βig-h3单克隆抗体(H-311/L-41)或其抗原结合片段，包含：

-具有SEQ ID NO：6所示序列的VH区；

-具有SEQ ID NO：10所示序列的VL区。

在实施方式中，所述人源化抗βig-h3单克隆抗体包含：

-重链，包含所述可变区和恒定区CH，例如具有SEQ ID NO：14所示序列的CH；

-轻链，包含所述可变区和恒定区CL，例如具有SEQ ID NO：15所示序列的CL。

在另一个具体方面，本发明涉及一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体和抗原结合片段与βig-h3蛋白特异性结合，并且包含：

(a)可变区VH(包含H-311变体的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：5所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL(包含L-228变体的CDR)，包含：

-具有SEQ ID NO：11所示序列的L-CDR1；

-具有SEQ ID NO：12所示序列的L-CDR2；

-具有SEQ ID NO：9所示序列的L-CDR3。

在实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO：6所示序列的VH区和/或具有SEQ ID NO：13所示序列的VL区。

此单克隆抗体或其抗原结合片段：

-与βig-h3蛋白结合，K_D为约5E-10M以下，特别是约4.5E-10M～5E-10M，尤其是约4.9E-10M；和/或

-与βig-h3蛋白结合，K_d为约6.5E-04s^-1以上，特别是约6.8E-04s^-1～约7.3E-04s^-1，特别是约7.07E-04s^-1；和/或

-DSC稳定性(Tm Fab)为约73.5℃以上，特别是约73.5℃～约77.5℃，通常约75.5℃；

在实施方式中，此人源化抗βig-h3单克隆抗体(H-311/L-228)或其抗原结合片段，包含：

-具有SEQ ID NO：6所示序列的VH区；

-具有SEQ ID NO：13所示序列的VL区。

在实施方式中，所述人源化抗βig-h3单克隆抗体包含：

-重链，包含所述可变区和恒定区CH，例如具有SEQ ID NO：14所示序列的CH；

-轻链，包含所述可变区和恒定区CL，例如具有SEQ ID NO：15所示序列的CL。

在实施方式中，本文公开的人源化抗体包含人IgGl恒定区，优选SEQ ID NO：14的重链重人IgGl m1，17的恒定区，和/或轻链恒定区，尤其是κ，优选轻链(κ)的恒定区人-SEQID NO：15的轻人Km3。

定义和特征

抗体可变区中的残基根据Kabat等人设计的系统进行常规编号。该系统在Kabat等人，1987年，免疫学关注的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)中，美国健康与人类服务部，NIH，美国(以下简称“Kabat等人”)中提出。本说明书中使用该编号系统。Kabat残基命名并不总是与SEQ ID序列中氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可以包含比严格的Kabat编号中更少或附加的氨基酸，对应于基本可变区结构的结构成分(无论是框架区还是互补决定区(CDR))的缩短或插入。对于给定的抗体，残基的正确Kabat编号可以通过将抗体序列中同源的残基与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定。根据Kabat编号系统，重链可变区的CDR位于残基31-35B(H-CDR1)、残基50-65(H-CDR2)和残基95-102(H-CDR3)。根据Kabat编号系统(http：//www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef)，轻链可变区的CDR位于残基24-34(L-CDR1)、残基50-56(L-CDR2)和残基89-97(L-CDR3)。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合βig-h3抗原的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。术语抗体的抗原结合片段中涵盖的结合片段的实例包括Fab片段、由VL、VH、CL和CHl区组成的单价片段；Fab'片段，由VL、VH、CL、CH1区和铰链区组成的单价片段；F(ab')₂片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；由抗体的单臂的VH区组成的Fd片段；单域抗体(sdAb)片段(Ward等人，1989Nature 341:544-546)，该片段由VH区或VL区组成；以及，分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个区(VL和VH)是由单独的基因编码的，但它们可以使用重组方法通过人工肽接头连接起来，使它们能够制成单独蛋白链，其中，VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(ScFv)；参见例如Bird等人，1989Science242:423-426；和Huston等人，1988proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的缔合自发形成，或者可以通过肽接头偶联单价scFv而产生，例如二价sc(Fv)2。此类单链抗体包括抗体的一个或多个抗原结合部分或片段。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的实用性。一体式抗体(unibody)是另一种类型的缺乏IgG4抗体的铰链区的抗体片段。铰链区的缺失导致分子大小基本上是常规IgG4抗体大小的一半，并且具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。抗原结合片段可以掺入单域抗体、SMIP、大抗体(maxibodies)、小抗体(minibodies)、胞内抗体、双抗体、三抗体和四抗体中(参见，例如，Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23,9,1126-1136)。术语“双抗体”、“三抗体”或“四抗体”是指具有多价抗原结合位点(2个、3个或4个)的小抗体片段，该片段包含位于相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，使这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。抗原结合片段可以掺入包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人，1995Protein Eng.8(10)；1057-1062和美国专利号5,641,870)。

在实施方式中，本发明的抗体片段为选自由以下组成的组的抗原结合片段：Fab、F(ab)'2、单域抗体、ScFv、Sc(Fv)2、双抗体、三抗体、四抗体、一体式抗体、小抗体、大抗体、小型模块化免疫药物(SMIP)、由模拟抗体高变区作为分离的互补决定区(CDR)的氨基酸残基组成的最小识别单元，以及包含本文公开的VL或VH区或由本文公开的VL或VH区所组成的片段。

本发明的Fab可以通过用蛋白酶、木瓜蛋白酶处理与βig-h3特异性反应的抗体来获得。此外，可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入到用于原核表达系统或用于真核表达系统的载体中，并将该载体导入到原核生物或真核生物(视情况而定)中以表达Fab来产生Fab。

本发明的F(ab')2可以通过用蛋白酶、胃蛋白酶处理与βig-h3特异性反应的抗体来获得。另外，F(ab')2可以通过下文所述的经由硫醚键或二硫键结合Fab'来产生。

本发明的Fab'可以通过用还原剂(二硫苏糖醇)处理与βig-h3特异性反应的F(ab')2来获得。另外，可以通过将编码抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物用的表达载体或真核生物用的表达载体中，将该载体导入原核生物或真核生物(视情况而定)进行表达来产生Fab'。

本发明的scFv可以如下产生：如前所述获得编码VH和VL区的cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达scFv。为了产生人源化scFv片段，可以使用称为CDR移植的众所周知的技术，该技术涉及从供体scFv片段中选择互补决定区(CDR)，并将它们移植到已知三维结构的人scFv片段框架上(参见，例如WO98/45322；WO 87/02671；US5,859,205；US5,585,089；US4,816,567；EP0173494)。

本发明的人源化单克隆抗体可以通过获得编码CDR区的核酸序列、如前文所述，通过将它们插入具有编码以下(i)和(ii)的基因的动物细胞的表达载体中并且通过将该表达载体导入动物细胞来表达基因来构建人源化抗体表达载体，所述基因编码(i)与人抗体相同的重链恒定区和(ii)与人抗体相同的轻链恒定区。人源化抗体表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于不同的载体上的类型，也可以是两个基因存在于同一载体上(串联型)的类型。就构建人源化抗体表达载体的容易度、导入至动物细胞的容易度、动物细胞内抗体H链和L链的表达水平之间的平衡而言，优选串联型人源化抗体表达载体。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18等。生产人源化抗体的方法基于本领域已知的常规重组DNA和基因转染技术(参见，例如Riechmann L.等人，1988；Neuberger MS.等人，1985)。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；以及5,585,089)、镶饰或重塑(veneering or resurfacing)(EP 592,106；EP519,596；Padlan EA(1991)；Studnicka GM等人(1994)；Roguska MA等人(1994))，以及链改组(美国专利No.5,565,332)。用于制备此类抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。

如本文所使用，术语K_D意指解离常数，其由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可以使用本领域充分建立的方法来确定。测定抗体K_D的一种方法是使用SPR，特别是在测量方法部分中描述的条件下使用生物传感器系统，例如系统。

如本文所使用，术语“k_d”(秒^-1)是指特定Ab-抗原相互作用([Ab][抗原]/[Ab-抗原复合物])的解离速率常数。所述值也称为k_off值。

如本文所使用，术语“k_a”(M^-1x秒^-1)是指特定Ab-抗原相互作用的缔合速率常数并且是k_d的倒数。

如本文所使用，术语“K_D”(M)是指特定Ab-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过将k_d除以ka获得。

如本文所使用，术语“K_A”(M^-1)是指特定Ab-抗原相互作用的缔合平衡常数并且通过将k_a除以k_d获得。

如本文所用，热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)评估。其测量方法如测量方法部分中所述。

“人源化抗体”或“嵌合抗体”应指通过本领域技术人员可用的方法以及例如本文公开的那些方法，衍生自亲本鼠抗体的抗体。优选地，“人源化抗体”或“嵌合抗体”或其抗原结合片段将包含鼠抗体m18B3的6个CDR组，可以在CDR中具有突变。

作为嵌合抗体的人源化抗体和抗原结合片段保留或基本上保留亲本鼠抗体m18B3的抗原结合特性，并且如本文所公开的，人源化可以赋予鼠和/或嵌合18B3单克隆抗体令人感兴趣的和意想不到的功能。

CDR或其中一些可以与遵循SDR方法(超移植)或其他有用方法的小鼠CDR不同。本文所述的人源化允许为单克隆抗体及其抗原结合片段提供如本文所公开的令人感兴趣的和意想不到的功能，尤其是亲和力、解离速率、热稳定性(DSC)，以及用于治疗用途的功能特性。H-330和H-311被证明非常有吸引力，并且L-41和L-218也是如此。技术人员可以将氨基酸改变(例如，多达1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸)引入这些VH和VL区，无需实质性改变其中一些功能和功能特性。如此改变的VH和/或VL区仍将被这些VH和VL区的定义所涵盖。

各种抗体分子和片段可以源自任何公知的免疫球蛋白类别，包括但不限于IgA、分泌性IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员已知的并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，使用IgG1。

“治疗”或“疗法”是指有疗效的治疗和预防性或防止性的措施。优选地，其是有疗效的治疗。

用于治疗或疗法目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养动物和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人类。除非有相反指示，术语“受试者”、“患者”等包括哺乳动物(包括人类)。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常特征在于不受调节的细胞生长。

本文中的术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸优选是单链或双链的并且通常含有磷酸二酯键。

抗体的氨基酸序列“变体”(或突变体)通过将适当的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成来制备。然而，此类修饰只能在非常有限的范围内进行，例如如本文所述。例如，修饰不会改变上述抗体特征，例如IgG同种型和抗原结合，但可以提高重组产物的产量、蛋白质稳定性或促进纯化。

分子的“变体”是与天然分子的序列基本上相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码与天然蛋白质相同的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体诸如这些可以使用已知的分子生物学技术来识别，该分子生物学技术例如使用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用编码天然蛋白质的定点诱变而产生的那些，以及编码具有氨基酸替换的多肽的那些。一般而言，本发明的核苷酸序列变体在至少一种实施方式中将与天然(内源性)核苷酸序列具有40％、50％、60％至70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，通常至少80％，例如81％～84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

术语“抑制”是指活性、应答、病症、疾病或其他生物学参数的降低。这可以包括但不限于活动、应答、病症或疾病的完全消除。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活动、应答、病症或疾病的10％减少。因此，降低可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或与天然或对照水平相比之间的任何降低量。

组合物和药物组合物

本发明的另一个目的是包含至少一种Hz单克隆抗体或其抗原结合片段的组合物或药物组合物，如本文所公开和提供的。组合物还可包含载体或稀释剂，特别是适合于抗体的预期用途的载体或稀释剂。如果该组合物是药物组合物，则使用药学上可接受的载体、或稀释剂。

药物组合物可以包含(i)根据本发明的至少一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，和(ii)至少一种另外的抗肿瘤药物，例如定向针对另一个靶标的抗体和/或化学疗法的药物(例如小分子)。两种活性成分可以存在于同一组合物中。或者，至少两种活性成分是分开的，例如在单独的小瓶或组合物中。在一方面，组合物包含至少两种活性成分，同时、单独或顺序给药至哺乳动物，包括人，用于治疗本文所述的癌症，和/或用于调节免疫。

作为另外的活性成分，可以特别提及阿霉素、吉西他滨、喜树碱、紫杉醇。它也可以是另一种抗体。其他抗体可以选自由另一种癌症标志物或受体、在免疫活性细胞上表达的另一种抗原、免疫检查点及其组合所组成的组。

可用于这些组合物中的药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的药物组合物可以口服给药、肠胃外给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、经鼻给药、经颊给药、阴道给药或通过植入储库给药。本文使用的包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、囊内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明组合物的无菌注射形式可以是水性悬浮剂或油性悬浮剂。这些悬浮剂可以使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，根据本领域已知的技术来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶剂或悬浮剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可接受的载体和溶剂中可以使用的为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘酯或双甘酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射剂的制备，天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是在它们的聚氧乙基化形式中。这些油溶剂或悬浮剂还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或通常用于药学上可接受的剂型(包括乳剂和悬浮剂)配制的类似分散剂。其他常用的表面活性剂，例如吐温、司盘和其他常用于药学上可接受的固体、液体或其他剂型的制造的乳化剂或生物利用度增强剂也可用以配制的目的使用。

本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服给药，该口服可接受的剂型包括但不限于胶囊、片剂、水混悬剂或溶液剂。对口服使用的片剂而言，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对以胶囊形式口服给药，有用的稀释剂包括，例如乳糖。当需要口服使用的水混悬剂时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。或者，本发明的组合物可以以用于直肠给药的栓剂的形式给药。这些可以通过将药剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此会在直肠中融化以释放药物。这些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。本发明的组合物还可以局部地给药，特别是当治疗目标包括通过局部给药容易到达的区域或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道疾病。可以容易地为这些区域或器官中的每一个制备合适的局部制剂。对于局部施用，可以将组合物配制在合适的软膏中，所述软膏含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性成分。用于局部给药本发明的化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将组合物配制为合适的洗剂或乳膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。下肠道的局部施用可以以直肠栓剂制剂(见上文)或以合适的灌肠剂制剂进行。也可以使用补片。本发明的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入给药。此类组合物根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂制备为盐水溶液。

例如，存在于本发明的药物组合物中的抗体可以以10mg/mL的浓度在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性小瓶中提供。该产品可配制为在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌注射用水中静脉注射给药。pH可调节至6.5。

用于注射(例如肌内、i.v.)的本发明的药物组合物可以制备成含有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，例如无菌缓冲水(例如1ml用于肌内)，以及根据本发明的抗体的约1ng～约100mg，例如约50ng～约30mg，或更优选约5mg～约25mg。

在某些实施方式中，考虑使用脂质体和/或纳米颗粒将抗体引入宿主细胞。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用是本领域技术人员已知的。纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获化合物。为了避免细胞内聚合物超载引起的副作用，这种超细颗粒(尺寸约0.1μm)通常使用能够在体内降解的聚合物来设计。满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒被考虑用于本发明，并且这种颗粒可以容易地制备。脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm～4μm。MLV的超声处理会形成直径在范围内的小单层囊泡(SUV)，其核心含有水溶液。脂质体的物理特性取决于pH值、离子强度和二价阳离子的存在。

用途、使用方法(例如治疗性处理)、制造用途

除非不适合，本文公开的所有特征均适用于本发明的不同目的，例如“用于…用途”、“使用的方法”或“治疗”、“用于制造药物的用途”。在实施方式中，患者或受试者为哺乳动物，优选人类。

本发明的另一个目的是如本文所公开的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段、或药物组合物用作药物的用途。

一方面，本发明涉及此人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段、或含有其的组合物，其用于(i)治疗实体癌或(2i)作为免疫调节组合物。具体地，免疫调节作用可以有助于治疗癌症或治疗癌症的过程。免疫调节可以包括恢复或激活CD8+T细胞活性。

另一方面，本发明涉及此人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段、或包含其的组合物用于降低基质的刚性的用途。特别地，该功能允许其他抗肿瘤药物(例如抗体、单克隆抗体)到达肿瘤。

因此，一般而言，本发明涉及此人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段、或包含其的组合物用于治疗实体癌的用途。

在实施方式中，实体瘤是其中βig-h3在基质中表达的实体瘤。

在优选的实施方式中，实体瘤可以是或选自乳腺癌、子宫癌/宫颈癌、食道癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胃癌、间质来源的肿瘤(即：纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、中枢和周围神经系统肿瘤(即：包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤)、甲状腺癌。优选地，实体瘤是胰腺癌、食管鳞状细胞癌、胃癌和肝癌、结肠癌或黑色素瘤。在优选的实施方式中，实体瘤是胰腺癌。更优选地，胰腺癌是胰腺导管腺癌。

本发明还涉及处理实体癌的方法，包括向有需要的患者给药足够量的此类抗体或其抗原结合片段、或包含其的药物组合物。

本发明还涉及免疫调节方法，包括向有需要的患者给药足够量的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，或此类药物或免疫调节组合物。抗体或片段可以帮助恢复或激活CD8+T细胞活性。

本文所用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treat)”是指可治愈性治疗或疾病缓解治疗，包括对患有癌症或被诊断为患有癌症的受试者的治疗，尤其是其中基质表达βig-h3的癌症，并且包括临床复发的抑制。治疗可以涉及患有癌症的受试者，为了治愈所述癌症、延迟所述癌症发作、减轻所述癌症严重性或改善所述癌症的一种或多种症状，或者为了延长受试者的生存期，使其超过缺乏这种治疗时的预期生存期。

所公开的抗体或其抗原结合片段可以作为治疗剂以以下的量给药于受试者，特别是人，以每天约0.001mg/kg～约100mg/kg、约0.01mg/kg～约50mg/k、约0.1mg/kg～约40mg/kg、约0.5mg/kg～约30mg/kg、约0.01mg/kg～约10mg/kg、约0.1mg/kg～约10mg/kg、或约0.5mg/kg～约25mg/kg，或约0.5mg/kg至约10mg/kg、5mg/kg、3mg/kg或2mg/kg的受试者体重的量，每天一次或多次，以获得期望的治疗作用。所需剂量可以每天递送三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在某些实施方式中，可以使用多次给药(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次给药)来递送所需剂量。

给药可以例如是静脉内、肌内、腹膜内或皮下给药，并且例如在接近靶标部位的位置给药。调整上述治疗方法和使用中的剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以给药单次药丸，可以随着时间的推移给药几次分开剂量，或者可以根据治疗情况的紧急状态所表明的来按比例减少或增加剂量。在一些实施方式中，在治疗期间，例如在预定的时间点，监测治疗的功效。在一些实施方式中，可以通过疾病区域的可视化或通过本文进一步描述的其他诊断方法来监测功效，例如通过进行一次或多次PET-CT扫描，例如使用本发明的标记抗体或其抗原结合片段。如果需要，药物组合物的有效每日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量在一天中以适当的间隔分开给药，任选地以单位剂型给药。在一些实施方式中，本发明的单克隆抗体通过长时间缓慢连续输注给药，例如24小时以上，以便最小化任何不需要的副作用。还可以使用每周、每两周或每三周的给药周期来给药有效剂量的本发明的抗体。给药期可以限制为例如8周、12周或直到已经建立临床进展。作为非限制性实例，根据本发明的治疗可以提供给受试者，尤其是人，以本发明抗体或其抗原结合片段的日剂量为约0.1mg/kg～100mg/kg的量，例如0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg每天，在治疗开始后持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天或40天之一，或者至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周或20周中之一，或其任意组合，使用单次剂量或每24、12、8、6、4或2小时或其任意组合的分次剂量。

组合

本发明还提供治疗应用或治疗方法，其中本发明的抗体或其抗原结合片段与至少一种另外的治疗剂组合使用，例如用于治疗癌症。这种给药可以是同时的、单独的或顺序的；即，两种活性成分的治疗可以同时(例如，同时或并行)、或在不同时间(例如，连续或相继)进行，或其组合。其他治疗剂通常与待治疗的病症相关。示例性治疗剂包括其他抗癌抗体、细胞毒剂、化疗剂、抗血管生成剂、抗癌免疫原、细胞周期控制/细胞凋亡调节剂、激素调节剂和下文描述的其他试剂。

在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段与化疗剂或抗体、特别是特异性靶向肿瘤抗原、受体或配体(例如ICI)的单克隆抗体组合使用。术语“化疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的化合物。

因此，本发明提供了用于同时或相继在实体瘤治疗中使用的以下组合：

i.如本文所公开的人源化抗体或其抗原片段；以及

ii.用于治疗癌症的治疗剂，如本文所述。

具体地，本发明提供了用于同时或相继在实体瘤治疗中使用的以下组合：

i.如本文所公开的人源化抗体或其抗原片段；以及

ii.免疫检查点抑制剂(ICI)。

通常，检查点阻断癌症免疫治疗剂是抗体。在一些实施方式中，所述检查点阻断癌症免疫治疗剂为选自由抗CTLA4抗体、抗PD1抗体、抗PDLl抗体、抗PDL2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、抗IDO1抗体、抗TIGIT抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体和抗B7H6抗体所组成的组的抗体。这些抗体优选是单克隆抗体或其抗原结合片段。该抗体可以特别是PD-1阻断抗体帕博利珠单(Pembrolizumab)、纳武利尤单抗、阿替利珠单抗、阿维单抗(Avelumab)或德瓦鲁单抗，或CTLA-4阻断抗体伊匹单抗(Ipilimumab)。该组合基于WO2020079164的公开，其描述了ch18B3和ICI的组合。该文献通过引用并入本文。

用本发明的靶向βig-h3蛋白的抗体或其抗原结合片段并组合现有的化疗治疗将比单独化学治疗更有效地杀死肿瘤细胞。实例包括但不限于顺铂、紫杉醇、依托泊苷、米托蒽醌、放线菌素D、喜树碱、甲氨蝶呤、吉西他滨、丝裂霉素、达卡巴嗪、5-氟尿嘧啶、阿霉素和道诺霉素。

本发明的抗体或其抗原结合片段可以与作为另外的抗癌剂的免疫检查点抑制剂组合使用，所述免疫检查点抑制剂例如抗PD1、抗PD-L1或抗CTLA4抗体。

在本发明的一种方法中，在第二抗癌剂给药之前将βig-h3结合抗体或片段给药于患者。

抗体的生产

这本发明的抗体及其抗原结合片段通过本领域已知的任何技术产生，例如但不限于单独或组合的任何化学、生物、遗传或酶技术。通常，知道所需序列的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过用于生产多肽的标准技术容易地生产所述抗体。例如，它们可以使用公知的固相方法合成，优选使用市售的肽合成装置(例如由Applied Biosystems，FosterCity，California制造)并遵循制造商的说明。或者，本发明的抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来合成。例如，在将编码抗体的DNA序列掺入表达载体并将此类载体引入将表达所需抗体的合适的真核或原核宿主中之后，可以获得作为DNA表达产物的抗体，随后可以使用已知的技术从其中分离它们。

哺乳动物细胞是生产治疗性抗体的首选宿主，因为它们能够以最适合人类应用的形式来糖基化蛋白质。细菌很少使蛋白质糖基化，并且像其他类型的常见宿主(例如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞)一样，产生与从血流中快速清除相关的糖基化模式。在哺乳动物细胞中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最常用的。除了提供合适的糖基化模式外，这些细胞还可以持续产生遗传稳定、高产的克隆细胞系。它们可以使用无血清培养基在简单的生物反应器中培养至高密度，并允许安全且可重复的生物过程的开发。其他常用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。

在实施方式中，根据本发明的抗体在哺乳动物细胞，优选野生型哺乳动物细胞，优选啮齿动物来源的，尤其是CHO细胞中产生或表达。

可以对本发明的抗体的结构进行修饰和改变，并且仍然获得具有相似特征的分子。例如，某些氨基酸可以替换序列中的其他氨基酸而不会明显损失活性。因为抗体的相互作用能力和性质决定了抗体的生物功能活性，所以可以在抗体序列(或者，当然，其潜在的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列替换，并且仍然获得具有类似特性的抗体。在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予抗体相互作用的生物学功能中的重要性是本领域普遍理解的。已知某些氨基酸可以替代具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸，并且仍然产生具有相似生物活性的抗体。每个氨基酸都根据其疏水性和电荷特性指定了亲水指数。

据信，氨基酸的相对亲水特性决定了所得抗体的二级结构，这反过来又定义了抗体与其他分子(例如酶、底物、受体、抗体、抗原等)的相互作用。本领域已知，氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一种氨基酸取代，并且仍然获得生物学功能等价的多肽。在这些改变中，优选取代亲水指数在±2以内的氨基酸，特别优选在±1以内的氨基酸，甚至更特别优选在+0.5以内的氨基酸。

类似氨基酸的取代也可以基于亲水性进行，特别是当由此产生的生物学功能等同的肽或多肽旨在用于免疫学实施方式时。美国专利4,554,101通过引用并入本文，或本领域技术人员可以参考，该专利指出，多肽的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性控制)与其免疫原性和抗原性相关，即具有多肽的生物学特性。

如美国专利4,554,101中详细描述的，下列亲水性值已指定给至氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一种氨基酸替代，并且仍然获得生物学等价的、特别是免疫学等价的多肽。在这些变化中，优选替换亲水性值在±2以内的氨基酸，特别优选在±1以内的氨基酸，并且甚至更特别优选在±0.5以内的那些。

如上文概述，因此氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。可以选择或不同地选择氨基酸取代。可能的替代已记载于WO99/51642、WO2007024249和WO2007106707中。

核酸和载体

本文公开和提供的分离的核酸序列也是本发明的目的。因此，本发明还涉及选自由核苷酸序列SEQ ID NO：21、22、23和24组成的组的分离的核苷酸序列，更具体地涉及分离或连接在一起的两个核苷酸序列的组合或组：SEQ IDNO：21和23、21和24、22和23、22和24。编码H-330V1.2的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，并且当需要突变形式的C102S时，可以用来代替SEQ ID NO：21以产生单克隆抗体。

如上文所述，生产抗体的方法是本领域技术人员已知的。用一种或多种表达载体转染哺乳动物细胞，优选啮齿动物细胞如CHO细胞，优选野生型细胞。优选地，用轻链表达载体和重链表达载体共转染细胞。细胞转染也是本领域技术人员已知的。作为可以进行的转染，可以提及但不限于本领域技术人员熟知的标准转染程序，例如磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、磁转染、核转染(AMAXA Gmbh，GE)、脂质体介导的转染(例如使用 或技术)或显微注射。

表达载体是已知的。作为可以使用的载体，可以提及但不限于：pcDNA3.3、pOptiVEC、pFUSE、pMCMVHE、pMONO、pSPORT1、pcDV1、pcDNA3、pcDNA1、pRc/CMV、pSEC。可以使用单个表达载体或表达抗体不同部分的多个表达载体。

本发明还涉及编码本发明的Hz抗体的重链的表达载体、编码本发明的Hz抗体的轻链的表达载体、或编码此Hz抗体的重链和轻链的表达载体。

本发明的另一个目的是含有本发明的载体或一组载体的宿主细胞。宿主细胞可以是哺乳动物细胞，优选啮齿动物细胞，更优选CHO细胞。还更优选地，宿主细胞可以是野生型哺乳动物细胞，优选野生型啮齿动物细胞，最优选野生型CHO细胞。

本领域技术人员完全掌握使用此载体和细胞(例如CHO细胞)产生根据本发明的抗体的方法。

本文使用的测量方法(为了完整性也可参见实施例)

亲和力和解离速率

仪器：Biacore T200(Cytiva)

温度：25℃分析温度，12℃样品隔间温度

传感器芯片：·S系列传感器芯片C1(Cytiva，订单号29104944)

·S系列传感器芯片CM5(Cytiva，订单号29104988)

流动池(fc)：fc1：参考

fc2：配体固定化(捕获)

FC3：参考

fc4：配体固定化(捕获)

检测：fc2-1和fc4-3；或fc2-1、fc3-1、fc4-1

分析缓冲液：A)10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％吐温20、0.22μm过滤

B)10mM HEPES(pH 7.4)、300mM NaCl、3mM EDTA、0.05％吐温20、0.25mg/mL BSA、0.22μm过滤

流量：·捕获配体期间为10μL/min(可逆固定)

·分析物相互作用分析(缔合和解离)期间为50μL/min

·表面再生期间为20μL/min

缔合：3min

解离：最多15min

再生：抗小鼠IgG：注射10mM甘氨酸，pH 1.7(3min，20μL/min)

抗人IgG：注射3M MgCl₂(1min，20μL/min)

DSC

差示扫描量热法(DSC)是分析技术，用于直接地表征天然形式的蛋白质或其他生物分子的稳定性。它通过测量以恒定速率加热时与分子的热变性相关的热变化来实现。

本文使用的DSC方案：

-MicrocalTM VP-毛细管DSC系统用于进行差示扫描量热法实验。

-样品储存在-20℃。解冻后，将所有样品离心(20.000g，5分钟，4℃)，必要时在PBS中稀释至浓度为1mg/mL。在DSC分析之前，使用IgG分析程序对Nanodrop ND-1000分光光度计(s/n：4847)的蛋白质含量进行定量。

-预平衡时间为3分钟，随后在20℃～110℃下以60℃/小时的扫描速率、25秒的过滤时间和介质反馈获取热分析图。在样品分析之前，测量了5次缓冲液/缓冲液扫描以稳定仪器，并在每次蛋白质/缓冲液扫描之间进行缓冲液/缓冲液扫描。

-将数据拟合到非-2-态解折叠模型，并减去转换前和转换后调整的基线。量热焓(ΔH)确定为转变峰下的面积，而范特霍夫焓(ΔHv)则根据所使用的模型确定。红色实线代表测量数据，黑色实线代表所用模型的最佳拟合，灰色线代表单个解折叠单元对整体蛋白质解折叠的贡献。

-DSC一般注意事项：

ο-Tm或变性/熔化温度是未折叠和折叠物质浓度相等的点，也是未折叠转变的中点。作为参数，它描述了蛋白质对热变性的敏感性，因此它与蛋白质的稳定性有关◇。Tm越高，蛋白质越稳定。

ο–T_开始是解折叠转变开始的温度。该参数的值通常比Tm低5℃～10℃。它也是描述蛋白质稳定性的参数，但与热变性的抵抗力相关。

ο-T1/2是峰的半高处转变的宽度。它描述了以1℃～15℃典型值转变的宽度。该参数与蛋白质堆积的紧密度相关，其中更宽的转变对应于更低紧密的蛋白质。

ο-ΔH是解折叠的量热焓，反映了蛋白质的分子内相互作用的破坏(即破坏结构域内和结构域间相互作用)。该过程是吸热的，因此给出正的焓值。

ο-总面积是解折叠的总焓(热分析图下的总面积)，它反映了热力学稳定性。

ο-单克隆抗体通常显示复杂的多域热谱图。最大、最突出的域峰是抗体的Fab。CH2和/或CH3区也很常见。不同结构域的相对位置和TM取决于特定的单克隆抗体，并且可以根据亚类和工程化而变化。

CHO细胞中瞬时转染

人源化“V1形式”抗体是在CHO细胞中产生的。CHO DG44细胞保存在37℃和5％ CO₂的轨道振荡器上的通风的锥形烧瓶(Corning)中。转染前一天，细胞以规定的密度传代(根据MO.CEL.120)。在转染当天(第0天)，将细胞与转染试剂和质粒DNA混合，用于生产中试批次(30ml)。

现在将参考附图使用非限制性实施例来描述本发明

附图说明

图1为人βig-h3的结构示意图。18B3 mAb可识别549-558表位，该表位包含对αvβ3和胶原蛋白结合很重要的YH18结构域。

图2是显示嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化变体的ELISA结果的图。为6次实验的平均值(+标准差)。

图3是显示嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化变体的细胞毒性CD8+T细胞活化和增殖的图。为3次实验的平均值(+标准差)。参数的统计学显著性通过使用GraphPadPrism软件完成的学生t检验和单因素方差分析进行评估。

图4是显示在存在对照IgG1 Ab、嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化变体的情况下，皮下植入的肿瘤胰腺癌肿瘤细胞的肿瘤重量的图。将肿瘤细胞作为塞子嵌入基质胶1:1混合物(Corning)中，并与每只小鼠6μg人源化形式mAb共同皮下注射到正常C57BL6小鼠的侧腹中。对照由不相关的同种型对照IgG1 mAb组成。相同的小鼠群体(n＝5)用于每个待评估的数量。分离肿瘤移植物，然后通过在4℃下的FACS染色评估移植物中肿瘤细胞的数量，并使用FlowJo软件进行分析。参数的统计学显著性通过使用GraphPad Prism软件完成的学生t检验和单因素方差分析进行评估。

图5是显示在存在对照IgG1 Ab、嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化变体的情况下，皮下移植物中肿瘤细胞的数量的图。将肿瘤细胞作为塞子嵌入基质胶1:1混合物(Corning)中，并与每只小鼠6mg人源化形式mAb共同皮下注射到正常C57BL6小鼠的侧腹中。对照由不相关的同种型对照IgG1mAb组成。相同的小鼠群体(n＝5)用于每个待评估的数量。分离肿瘤移植物，然后通过在4℃下的FACS染色评估移植物中肿瘤细胞的数量，并使用FlowJo软件进行分析。参数的统计学显著性通过使用GraphPad Prism软件完成的学生t检验和单引物方差分析进行评估。

图6是显示在存在对照IgG1 Ab、嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化变体的情况下，皮下移植物中未激活的CD8 T细胞的数量的图。将肿瘤细胞作为塞子嵌入基质胶1:1混合物(Corning)中，并与每只小鼠6mg人源化形式mAb共同皮下注射到正常C57BL6小鼠的侧腹中。对照由不相关的同种型对照IgG1 mAb组成。相同的小鼠群体(n＝5)用于每个待评估的数量。分离肿瘤移植物，然后通过在4℃下的FACS染色评估移植物中肿瘤细胞的数量，并使用FlowJo软件进行分析。参数的统计学显著性通过使用GraphPad Prism软件完成的学生t检验和单因素方差分析进行评估。

图7是显示在存在对照IgG1 Ab以及C102的原始形式(V1)和突变形式(V1.2)中2种人源化变体(H330/L41和H330/L228)的情况下，皮下移植物中肿瘤细胞的数量的图。针对这两种mAb，均在重链330的第102位实施了突变(用丝氨酸替换半胱氨酸残基)，以最大限度地降低翻译后修饰(PTM)的风险。

将肿瘤细胞作为塞子嵌入基质胶1:1混合物(Corning)中，并与每只小鼠6mg人源化形式mAb共同皮下注射到正常C57BL6小鼠的侧腹中。对照由不相关的同种型对照IgG1mAb组成。相同的小鼠群体(n＝5)用于每个待评估的数量。分离肿瘤移植物，然后通过在4℃下的FACS染色评估移植物中肿瘤细胞的数量，并使用FlowJo软件进行分析。参数的统计学显著性通过使用GraphPad Prism软件完成的学生t检验和单因素方差分析进行评估。

图8是显示在存在对照IgG1 Ab以及对C102的原始形式(V1)和突变形式(V1.2)中2种人源化变体(H330/L41和H330/L228)的情况下，皮下移植物中活化的CD8 T细胞的数量的图。将肿瘤细胞作为塞子嵌入基质胶1:1混合物(Corning)中，并与每只小鼠6mg人源化形式mAb共同皮下注射到正常C57BL6小鼠的侧腹中。对照由不相关的同种型对照IgG1 mAb组成。相同的小鼠群体(n＝5)用于每个待评估的数量。分离肿瘤移植物，然后通过在4℃下的FACS染色评估移植物中肿瘤细胞的数量，并使用FlowJo软件进行分析。参数的统计学显著性通过使用GraphPad Prism软件完成的学生t检验和单因素方差分析进行评估。

具体实施方式

实施例1：表位作图

表位作图研究表明，该抗体靶向βig-h3蛋白(AA残基549-558)的βig-h3蛋白的FAS1第4个结构域(线性表位ALPPRERSRL)。参见图1。可以进一步将表位限制为LPPRERSR。

实施例2：

概念验证(PoC)阶段旨在证明定向针对βig-h3蛋白的18B3 mAb(Bae等人，2014Acta Physiol 2014,212,306–315)可以通过有效并特异性地消耗βig-h3蛋白，在癌症治疗中发挥关键作用，从而(i)增加CD8⁺T细胞的细胞毒活性，以及(ii)降低基质的刚性，恢复免疫系统对肿瘤的可及性，最终导致肿瘤显著减少和小鼠的存活率。

为了实现这一目标，在体外和体内都(在相关小鼠模型中)进行了大量的实验。值得注意的是，大多数实验都是在体内进行的，有证据表明抗βig-h3治疗性mAb可以单独或组合使用，有效治疗PDAC和其他潜在癌症。

简而言之，本次PoC阶段的结论如下：

1.在PDAC模型中，通过18B3 mAb靶向消耗βig-h3蛋白，允许：

a.限制肿瘤生长，

b.恢复CD8⁺T淋巴细胞的细胞毒活性，

c.降低基质的刚性，

这已在科学团队为此目的专门开发的体外和体内测定中得到证明。

2.使用形成胰腺肿瘤的2种不同小鼠品系进行的实验表明，每周两次皮下注射18B3，持续3周治疗的群体的肿瘤显著减少，存活率提高。

3.在更高剂量的18B3下进行的多项实验表明，增加mAb的浓度进一步减少肿瘤生长，并可以增加小鼠的存活。

4.我们分别基于小鼠HSG卵巢癌和膀胱癌证明，18B3 mAb治疗显著减少肿瘤生长。在抗PD1耐药性膀胱癌中，表明18B3 mAb是抗PD1的潜在补充物或替代物。

这组综合数据的总体结论是，使用βig-h3蛋白消耗mAb进行治疗应用的构思得到了证实。

实施例3：18B3鼠mAb的嵌合化和人源化

1.方法

该项目分4个阶段进行，具体如下：

·第1阶段：鼠18B3 mAb测序

·第2阶段：鼠18B3 mAb的嵌合化

·第3阶段：通过CDR移植(抗体重塑)设计人源化变体

·第4阶段：人源化变体的生产和分析测试

第1阶段：鼠18B3 mAb的测序

小鼠18B3(同种型IgG1/k)VH和VL区的序列使用cDNA测序方法从杂交瘤细胞中进行。

为此，从杂交瘤细胞中提取RNA。通过高保真RT-PCR合成相应的DNA链，随后合成第二链以获得双链cDNA。然后对cDNA进行测序并翻译成蛋白质序列。

VH序列：SEQ ID NO：17

VL序列：SEQ ID NO：18

第2阶段：18B3 mAb的嵌合化

嵌合化包括用人类序列替换小鼠18B3 mAb的恒定区。编码重链的可变区(VH SEQID NO：19)和轻链可变区(VL SEQ ID NO：20)的序列针对在哺乳动物细胞中的表达进行优化并合成。然后，将相应的合成基因克隆到含有IgGl重链(SEQ ID NO：25)和κ轻链(SEQ IDNO：26)的人恒定区的载体系统中。一旦经过测序验证后，对载体进行扩增，用于制备低内毒素质粒DNA，并再次进行测序验证。

然后，通过质粒的瞬时表达在CHO哺乳动物细胞中产生嵌合mAb，然后纯化：将CHODG44细胞维持在37℃和5％ CO₂下在定轨摇床上的通风的锥形瓶(Corning)中。转染前一天，细胞以规定的密度传代。在转染日(第0天)，将编码18B3嵌合抗体的轻链和重链的DNA质粒添加到与转染试剂混合的细胞悬浮液中，用于生产中试批次。

通过蛋白A亲和层析纯化上清液。在PBS中透析并无菌过滤(0.22μm)后，通过280nm处的分光光度读数测定总蛋白浓度。然后，将纯化的嵌合mAb储存在≤-20℃的温度下。

通过SDS-PAGE测试嵌合mAb的完整性。通过ELISA将嵌合体的配体亲和力与亲代小鼠18B3 mAb进行比较。

·对于ELISA：

将抗原(重组人βIG-H3：rhβIG-H3，R&D系统，目录号3409-BG，批号NDM061911A)以1μg/ml在4℃下包被过夜，

去除抗原并在室温下使用2.5％ PBS-Milk封闭非特异性位点，持续1小时。

从10μg/ml添加待测mAb(抗hβIG-h3 18B3亲本(鼠)或嵌合体)，然后在7个孔中稀释10倍，并在室温下孵育2小时，

移除并清洗板后，添加二抗：用于鼠18B3(亲本)的与HRP缀合的抗鼠IgG和用于嵌合18B3的与HRP缀合的抗人IgG(Fc特异性)，在室温下孵育2小时，

加入无色底物(TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，在HRP作用下变为蓝色。比色信号与抗原上结合的mAb的量成正比。

通过加入硫酸终止反应，然后TMB变为黄色。mAb的量通过在450nm处的分光光度法(光密度)进行评估。

与亲代鼠抗体相比，嵌合是成功的，具有非常相似的生物物理特征。第3阶段：通过CDR移植设计人源化18B3变体

这一阶段的目标是获得嵌合18B3的几种变体，这些变体已进一步人源化，以降低mAb在人类中的免疫原性并增加其半衰期。认为人类的百分比应该大于85％。

使用CDR移植技术进行人源化。

人源化策略是基于以下技术的组合，即：

·初级序列分析和比对，

·3D建模，

·最佳人类种系的选择。

事实上，结构(3D)模型与纯序列分析的结合可以潜在地区分CDR区域中真正的面向互补位的残基和非互补位的残基。此外，结构模型允许按照使用的所选择的种系主链推动有关回复突变的选择，从而实现更快的人源化过程。

值得注意的是，Kabat编号系统用于残基识别。

·第一步是选择序列与鼠18B3 mAb尽可能接近的人VH和VL种系。

ο为了设计抗HuβIG-H3 18B3鼠VH的CDR移植形式，选择了三种人类种系IGHV3-11*01、IGHV3-30*01和IGHV1-69*08(参见表2)。选择人种系IGHV3-11*01是因为它在整个V-基因上与mAb18B3-VH具有高度序列同一性；76.5％(总共98个残基中有75个相同残基)。尽管IGHV3-30*01和IGHV1-69*08具有较低的序列同一性(分别为72.4％和55％)，但选择它们是因为它们广泛用于人类抗体生产的种系序列(根据IMGT/基因频率数据库)并具有其他目的特征，并提供了在不同分子环境中移植CDR的可能性，特别是对于IGHV1-69*08。对于H-CDR3和框架4的N-端部分，选择人种系IGHJ6*01(J-GENE)作为最接近的候选物。

ο对于抗HuβIG-H3 18B3鼠VLκ的CDR移植形式的设计，三种人类种系IGKV4-1*01、IGKV2-28*01和IGKV3-15*01似乎是作为人类框架受体区域的最佳选择，所有3种人类种系的序列同一性百分比如下：IGKV4-1*01为82.2％，IGKV2-28*01为67.3％和IGKV3-15*01为64.4％。对于L-CDR3和框架4的N-端部分，选择人种系IGKJ2*01(J-GENE)作为最接近的候选物。

·第二步是将18B3鼠mAb的CDR移植到选择的VH和VL人类种系中，而不在序列中引入任何突变：这被称为人源化变体的V0形式。

·第三步是优化获得的序列，以便(i)保持人源化变体的功能和(ii)尽可能地增加人源化百分比。这导致了人源化变体的V1至V3形式。优化进行如下：

ο所选人种系可变区的框架区(Frs)中的一些氨基酸残基复原(回复突变)为其相应的鼠氨基酸残基。基于获得的免疫球蛋白可变区结构的信息，并在mAb 18B3(VH和VL)分子模型的指导下，Frs中的这些残基被鉴定为在维持CDR构象方面具有潜在的关键作用，或在重链和轻链的可变区之间的界面中发挥作用。

ο此外，VL和VH是两个相互作用但不形成共价键的结构域。两个结构域之间的相互作用通过氢键和静电键来维持。参与这种相互作用的残基也必须保留，否则互补位可能会被修饰并且抗体亲和力可能会改变。因此，它们被保留在人源化形式V1和V1.2突变形式C102S中。

下表2总结了所获得的人源化百分比的结果：

第四阶段：人源化变体的制造和测试

该阶段的目标是制造选择的人源化变体，结合3个选择的VH和3个选择的VL，从而产生9个不同的变体。

视情况使用VH和VL核苷酸序列SEQ ID NO：21-24，以与对嵌合体所述完全相同的方式进行生产和纯化。

使用多种方法对9种制造的人源化变体进行了分析测试：

·通过序列比对和种系选择实现的人源化百分比

·通过哺乳动物细胞中的瞬时表达水平来评估生产力。

·如上所述通过ELISA评估抗体亲和力(第2阶段嵌合化)。

·通过差示扫描量热法(DSC)评估热稳定性：测量使用：MicrocalTM VP-毛细管DSC系统，如上述测量方法中所述。通过高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)检查纯度(聚集)：

οShimadzu Prominence HPLC，具有以下组件：CBM-20A系统控制器、SPD-M20A光电二极管阵列检测器；柱温箱CTO-20A；自动进样器SIL-AC；泵LC-20AD和脱气单元DGU-20A5。

ο柱使用来自GE Healthcare的Superdex 200增加5/150GL柱。该柱先前在PBS1x中平衡，0.25mL/min，柱温箱设置为30℃。

ο所有样品均经过离心(20.000xg，5分钟，4℃)，并在SEC分析之前通过NanodropND-1000分光光度计和IgG分析程序定量它们的蛋白质含量。必要时，在样品注射前将样品在PBS中稀释至1mg/mL的浓度。

ο等度程序设置为在18分钟内，以0.25mL/min注射约15μg的每个样品。SEC分析后，从原始数据中提取280nm色谱图，并通过峰积分进行分析。

ο来自GE Lifesciences的分子量SEC校准试剂盒中的一系列蛋白质用于在样品分析过程中使用的相同条件和缓冲液中校准色谱柱。使用的蛋白质是：抑肽酶(6.500Da)、核糖核酸酶A(13.700Da)、碳酸酐酶(29.000Da)、卵清蛋白(44.000Da)、伴清蛋白(75.000Da)和醛缩酶(158.000)。使用蓝色葡聚糖来测定柱的空隙体积。根据凝胶过滤校准试剂盒说明(GE Lifesciences)进行柱校准。

对9个变体产品的生产和分析测试表明：

·所有变体都具有良好的生产力，尤其是具有重链#330和#311的变体(程度较小)；具有重链#169的变体低于嵌合抗体的生产力

·ELISA测定中变体的亲和力与嵌合体(以及ELISA中的亲本)相比显示出相似的结合亲和力；然而，使用重链#169的变体再次看起来不太良好。

·在HP-SEC中，所有变体都显示出非常高的纯度，具有低于2％～3％的潜在聚集体

·在DSC中，所有变体的Tm均高于70℃，更稳定的变体是使用重链#330的变体(Tm高于嵌合抗体且达到预料不到的水平)。

表3

·4种产生的人源化变体针对人βIg-h3的反应性相对相似。没有观察到对靶标的反应性的明显丧失或生物物理特性的行为退化：

·使用最接近的种系基因H311-V1的变体表现出与嵌合mAb相似的反应性和稳定性特性。

·使用H330-V1的变体(尤其是变体H330-V1/L41-V1和H330-V1/L228-V1)显示出预料不到的高Fab Tm，这可以与较低的聚集倾向相关，并且表现出与嵌合mAb类似的反应特性。

·通过分析整个数据集，似乎是，包含H-311或H-330的重链在与靶标的结合中起主要作用，与轻链相反，轻链似乎在结合中不起主要作用；这使得H-311或H-330成为与不同VL区组合的良好选择。

·优选V1候选H-311/L-41(使用VH和VL二者及其一般特性的最接近种系基因)和H-330/L-228。

·H330-V1.2/L41-V1和H330-V1.2/L228-V1的DSC仍高于80℃，稳定性特性与未突变形式(具有H-330V1)相似。

V1候选物获得的人源化百分比非常好。

框架经过轻微修饰以增加人源化，同时保留已知参与CDR构象(“定向”)的氨基酸残基。

在CDR中，2个突变引入VH 330和VH 311的CDR#2的第57位和第60位。3D模型显示这些AA不参与互补位并“隐藏”在mAb的构象中。

表4：免疫原性

所有6个选择的变体都表现出高于规格的人源化百分比，在89％～97％的范围内，这是一个非常高的分数，并且显著降低了人类前进中免疫原性的风险。

实施例4：ELISA

分析方法基于直接ELISA测试。

将抗原(重组人βig-h3蛋白)包被到96孔板的表面。然后加入待测mAb。

然后，加入与辣根过氧化物酶(HRP)酶缀合的二抗-人mAb。

加入无色底物(TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，在HRP作用下变为蓝色。比色信号与抗原上结合的mAb的量成正比。

通过加入硫酸终止反应，TMB变为黄色。

mAb的量通过450nm处的分光光度法(光密度)进行评估。

图2总结了嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化先导变体获得的结果。统计分析(单因素方差分析)。

获得的结果表明，与嵌合变体相比，人源化变体H-311/L-228对靶标的亲和力较低。与嵌合体相比，其他3种人源化变体没有统计学上的显著性差异，表明人源化过程没有改变亲和力(通过ELISA测量)。尽管根据EC50和统计分析，3种变体显示出非常相似的亲和力，但具有重链330的变体始终显示出最佳的EC50(并且平均优于嵌合体)。

实施例5：体外功能生物测定

该测试的原理是评估针对抗βig-h3蛋白的不同mAb的功效，通过消耗该蛋白来恢复细胞毒性CD8⁺T细胞活化和增殖的能力。

首先，将新鲜脾脏提取的CD8⁺T细胞置于与抗原呈递细胞(即具有加工的OVA肽的骨髓衍生细胞)接触，以促进活化和增殖。

然后，添加rhβig-h3蛋白(已知可阻断CD8⁺T细胞激活途径)以及待测试的mAb。

72小时后，通过流式细胞术(FAC)分析定量评估CD8⁺T细胞的活化和增殖。

通过比较与同种型对照(不相关)mAb相比的激活/增殖水平，对mAb的效率进行统计评估。

骨源性骨髓细胞获取自C57BL6野生型小鼠的骨骼，并在体外培养5天～6天。然后，通过与LPS孵育12小时使它们成熟，并通过加入OVA肽(SIINFEKEL)将其激活为抗原呈递细胞，该OVA肽将被加工并呈递在BMDC(OVA处理的BMDC)表面。

同时，通过粉碎并制备单细胞悬浮液，从OT1小鼠的脾脏和淋巴结中提取CD8⁺T细胞。

将带OVA的BMDC和CD8⁺T细胞与待测试的rh-βig-h3蛋白和mAb放在一起。然后，在37℃下孵育72小时，以激活和增殖CD8⁺T细胞。

然后，在4℃下通过FACS染色评估CD8⁺T细胞的增殖和活化，并使用FlowJo软件进行分析。

通过使用GraphPad Prism软件进行的学生t检验和单因素方差分析来评估增殖的统计学显著性。

图3总结了获得的嵌合18B3(被视为参考mAb)以及4种人源化先导变体和阴性对照的结果。统计分析(单因素方差分析)。

获得的结果表明，与阴性对照相比，所有人源化变体都针对靶标具有统计学上显著的功能。该功能在统计上与参考mAb(嵌合18B3)完全相当。结果，体外功能测试表明，所选择的人源化变体的工程化并未改变其针对特定靶标的体外功能。尽管它们都非常相似，但排名显示，具有重链H-330的变体给出了最佳结果，而变体H-330/L-41是最高效的。

实施例6：体内功能生物测定

这组实验的目的是证明18B3 mAb与PDAC特异性肿瘤细胞的共同给药可以用于限制肿瘤生长(通过移植物中肿瘤细胞的数量评估)并恢复CD8⁺T细胞激活途径，如与使用同种型对照IgG1 mAb治疗的对照小鼠相比。

本实验的具体目的是表明上述效果与给药的18B3的量成正比。

PDAC肿瘤细胞取自2.5月龄的KIC小鼠的分离胰腺，并在体外培养。

KIC细胞作为塞子嵌入基质胶1:1混合物(Corning)中，与每只小鼠的多种增加量的18B3 mAb共同皮下注射到正常C57BL6小鼠的侧腹中。对照由不相关的同种型对照IgG1mAb组成，以待评估的最高18B3量来给药。相同的小鼠群体(n＝8)用于每个待评估的数量。

然后，对小鼠进行10天的监测，然后牺牲小鼠。

然后对肿瘤移植物进行称重、测量并用胶原酶缓冲液消化，以获得单细胞悬浮液，并在流式细胞术之前进行染色处理。

然后，在4℃下通过FACS染色评估移植物中肿瘤细胞的数量以及CD8⁺T细胞的增殖和活化，并使用FlowJo软件进行分析。

参数的统计学显著性通过使用GraphPad Prism软件完成的学生t检验和单因素方差分析进行评估。

结果表明：在人源化候选物与嵌合体之间以及各种人源化候选物之间观察到统计学差异。携带重链H-330的人源化变体总体上显示出更好的结果。人源化变体H-330/L-228是先导变体，显示出与嵌合体相当或比嵌合体甚至更好的值。该变体还在所有3个参数上表现出最高的同质性(homogeneity)(最小分散性-SEM)。人源化变体H-330/L-228显示出最佳特征。

实施例7：表面等离子共振(Biacore)–亲和力、结合速率和解离速率。

使用Biacore T200仪器进行测定。它分两步进行：

·第一步，称为适用性测试，旨在确定运行测定的最佳条件：在此，评估最佳传感器芯片和运行缓冲液条件以确定最佳信/噪比。

·第二步是运行本身，一式三份进行，以确保结果的可重复性和稳健性。

第一步，使用亲本和嵌合18B3 mAb作为参考来评估2个传感器和各种缓冲条件。然后，确定传感器芯片C1是最合适的，含有300mM NaCl和0.25mg/mL BSA的缓冲液减少非特异性结合并增加信号。

对于运行本身，方案如下：

1.通过抗小鼠或抗人IgG二抗(共价固定化)进行测试抗体的可逆固定化。

2.抗原与捕获抗体的相互作用分析。

3.再生：从二抗表面S完全去除抗体和抗原。

测量方法部分给出了更多详细信息。

通过SPR，测定rhbIG-H3与六种抗体相互作用的速率常数(k_a，k_d)和平衡解离常数(K_D)。实验数据符合1:1结合模型。列出的是n＝3的独立实验的平均值±SD。

SPR测定的优化设置运转的非常好，并提供了非常准确和可重复的结果。

所有mAb具有的亲和力(KD)都在亚纳摩尔范围内。

所有样品的ka、kd和KD总体差异不大：

ο与所有其他样品相比，小鼠抗体m18B3的结合速率(ka)稍慢，

ο人源化(Hz)变体的解离速率(kd)出人意料地低。

ο嵌合抗体ch18B3的总体KD值(亲和力)最低(0.2nM)，而亲本小鼠和所有人源化样品的总体KD值(亲和力)非常相似(0.4～0.5nM)。

实施例8：表面等离子共振-H330中具有突变C102S的抗体的亲和力、结合速率和解离速率。

通过SPR评估亲和常数

固定化程序

运行缓冲液(RB)：HBS-EP+，由10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v组成

表面活性剂P20，pH 7.4，温度：25℃

根据Cytivia 22064888AF通知，使用胺偶联将抗人IgG(Fc)抗体化学移植到CM5传感器芯片上。简而言之，表面首先通过注射NHS-EDC混合物来激活。然后，进行抗人IgG(25μg/ml在固定缓冲液中)的多次注射(试剂盒上提供的10次中的3次)，进行接触时间调整。最后，用乙醇胺1M pH 8.5使表面失活。

在每个流动单元上以5μL/min顺序地进行测试抗体的固定化，直至固定化水平为90～100RU。在60秒内注射20μg/mL MAb溶液(用RB稀释的MAb)导致固定化信号在850～2500RU。当获得高固定化水平时，在新注射之前，进行注射30s的再生溶液(MgCl₂ 3M)，并调整浓度和接触时间。

阴性对照Ab固定在传感器流动单元1(Fc1)上，阳性对照(嵌合18B3 mAB)固定在Fc2上。18B3变体Ab固定在Fc3和Fc4上：

单循环动力学(SCK)测定

运行缓冲液(HBS-EP+)：10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4，温度：25℃，流速：30μL/min

在180秒内，在每个流动单元上进行浓度递增(5nM；10nM；25nM；50nM；100nM)的抗原(hβIG-H3)的注射。在每个抗原浓度之间的RB中进行短解离。注射最高抗原浓度(100nM)后，在3600s内记录RB中的解离。

·在抗原循环之前进行三个其中注射五次RB的类似循环，以进行双重减法程序(空白运行)。

·在空白运行之前进行三个其中注射五次RB的类似循环，并且解离时间为600s，以稳定系统(启动运行)。

采用1:1交互模型分析：

结论：

·4种测试的mAb具有亚纳摩尔亲和力(KD)。

·人源化变体的亲和力比嵌合形式的亲和力稍低。

·2个变体(H-330/L-228和H-330/L-41)之间没有显著差异，无论是在亲本V1形式上，还是在突变的V1.2形式(C102->S102)上。

·对于每个变体，其亲形式本与其突变形式C102->S102之间没有显著差异。可以观察到非常小的差异，并且似乎与实验条件有关，因为测试是在2个系列中进行的(即使用两个SPR芯片)。

Claims (16)

1.一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，包含可变区VH和可变区VL，例如所述抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白的表位特异性结合，所述表位如序列SEQ IDNO：16或30所示，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)具有SEQ ID NO：4或28所示序列的可变区VH，

(b)具有SEQ ID NO：18所示序列的可变区VL，所述可变区VL为鼠18B3 VL区的人源化变体，

其中，所述抗体或抗原结合片段在79℃以上的DSC(Tm Fab)中表现出热稳定性，特别是在79℃或80℃至83℃、83.2℃或83.5℃的DSC(Tm Fab)中表现出热稳定性。

2.根据权利要求1所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

-具有SEQ ID NO：4或28所示序列的VH区；以及

-具有SEQ ID NO：10或13所示序列的VL区。

3.一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，包含可变区VH和可变区VL，例如所述抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白的表位特异性结合，所述表位如序列SEQ IDNO：16或30所示，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)可变区VH，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：2所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3或27所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL，包含：

-具有SEQ ID NO：7所示序列的L-CDR1；

-具有SEQ ID NO：8所示序列的L-CDR2；

-具有SEQ ID NO：9所示序列的L-CDR3。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段：

-与βig-h3蛋白结合，K_D为约5.8E-10M以下，特别是约5E-10M～约5.8E-10M以下，尤其是约5.35E-10M；和/或

-与βig-h3蛋白结合，K_d为约6E-04s^-1以上，特别是约6.2E-04s^-1～约7E-04s^-1，特别是约6.59E-04s^-1；和/或

-在约79℃以上的DSC(Tm Fab)中具有稳定性，特别是在约79℃～约83℃，通常为约81.3℃的DSC(Tm Fab)中具有稳定性；和/或

-在CHO细胞中瞬时表达的生产力为约275μg/ml。

5.根据权利要求3或4所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

-具有SEQ ID NO：4所示序列的VH区；

-具有SEQ ID NO：10所示序列的VL区。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体，所述抗体包含：

-重链，包含所述可变区和恒定区CH，优选具有SEQ ID NO：14所示序列的CH；

-轻链，包含所述可变区和恒定区CL，优选具有SEQ ID NO：15所示序列的CL。

7.根据权利要求1所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)可变区VH，包含：

-具有SEQ ID NO：1所示序列的H-CDR1；

-具有SEQ ID NO：2所示序列的H-CDR2；

-具有SEQ ID NO：3或27所示序列的H-CDR3；

(b)可变区VL，包含：

-具有SEQ ID NO：11所示序列的L-CDR1；

-具有SEQ ID NO：12所示序列的L-CDR2；

-具有SEQ ID NO：9所示序列的L-CDR3。

8.根据权利要求7所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段：

-与βig-h3蛋白结合，K_D为约5E-10M以下，特别是约4.5E-10M～约5E-10M，尤其是约4.76E-10M；和/或

-与βig-h3蛋白结合，K_d为约5E-04s^-1以上，特别是约5.5E-04s^-1～约6E-04s^-1，特别是约5.83E-04s^-1；和/或

-在78℃以上的DSC(Tm Fab)中具有稳定性，特别是在约78℃～82℃，通常为约80.2℃的DSC(Tm Fab)中具有稳定性；和/或

-在CHO细胞中瞬时表达的生产力为约249μg/ml。

9.根据权利要求7或8所述的人源化抗βig-h3抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

-具有SEQ ID NO：4或28所示序列的VH区；以及

-具有SEQ ID NO：13所示序列的VL区。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体，所述抗体包含：

-重链，包含所述可变区和恒定区CH，例如具有SEQ ID NO：14所示序列的CH；

-轻链，包含所述可变区和恒定区CL，例如具有SEQ ID NO：15所示序列的CL。

11.一种人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，包含可变区VH和可变区VL，例如所述抗体或其抗原结合片段与βig-h3蛋白的表位特异性结合，所述表位如序列SEQ IDNO：16或30所示，所述抗体或其抗原结合片段包含：

-具有SEQ ID NO：6所示序列的VH区；

-具有SEQ ID NO：10或13所示序列的VL区。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段用作药物的用途。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗患者的癌症的用途。

14.根据权利要求13所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段的用途，其中，所述癌症是其中表达基质蛋白βig-h3的癌症。

15.根据权利要求13或14所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段的用途，其中，所述癌症是胰腺导管腺癌(PDAC)、肺癌、头颈癌、结肠癌、膀胱癌或黑色素瘤。

16.一种药物组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的人源化抗βig-h3单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。