CN118064572B

CN118064572B - 一种用于红绿色觉异常诊断的引物探针组合和试剂盒及其应用

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Publication number: CN118064572B
Application number: CN202410303503.XA
Authority: CN
Inventors: 吴文辉; 于晓光; 秦川
Original assignee: Wenzhou Puxi Gene Technology Co ltd
Current assignee: Wenzhou Puxi Gene Technology Co ltd
Priority date: 2024-03-15
Filing date: 2024-03-15
Publication date: 2025-07-01
Anticipated expiration: 2044-03-15
Also published as: CN118064572A

Abstract

本发明属于基因检测领域，提供了一种用于红绿色觉异常诊断的引物探针组合和试剂盒及其应用，所述引物探针组合包括：第一引物探针组，所述第一引物探针组包含特异性扩增OPN1LW和OPN1MW基因p.T285A的第一引物对、第一探针和第二探针；第二引物探针组，所述第二引物探针组包含特异性扩增OPN1MW基因c.‑112的第二引物对、第三探针和第四探针；其中第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团，且荧光基团互不相同。本发明提供的引物探针组合，不依赖定量标准品和标准曲线，灵敏度、准确度和精密度高，由于检测结果不受扩增效率的影响，因此重复性高，更易标准化，适合产业化应用。

Description

一种用于红绿色觉异常诊断的引物探针组合和试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于红绿色觉异常诊断的引物探针组合应用。

背景技术

人类色觉是由视网膜中三种感受不同颜色的视锥细胞(红色、绿色、蓝色)感受到的三种颜色适当混合而成。人眼对颜色辨别不准确，辨色能力差，与常人不同，就是色觉异常(abnormal color vision)。按色觉异常的程度可分为色盲和色弱。其中红绿色盲最为常见。色觉障碍按程度可以分为色盲和色弱。色弱者的颜色辨别能力在个体之间具有较大差异，有些色弱者的颜色辨别能力接近正常色觉者，而有些色弱者则接近色盲。

目前临床常用的检测包括以下几种(葛坚,王宁利.眼科学[M].北京:人民卫生出版社,2015.；高强,马瑞青,强彦.色相测验和色盲检查镜对异常色觉的检测和分类[J].激光与光电子学进展,2023,60(09):501-508.)：

(1)假同色图。又称色盲本。在同一彩色图中既有相同亮度、不同颜色的斑点组成的图，也有相同颜色、不同亮度的斑点组成的图。正常人根据颜色分辨，色盲者只能以明暗来判断故而作出错误的回答。适用于大规模普筛，能高效筛出异常色觉者，但不能提供色觉异常的精确诊断，也无法分辨色盲、色弱、色弱的程度、红色觉或绿色觉异常。

(2)色相排列法。在固定照明条件下，令受检者将许多形状与大小一致但不同颜色的有色物品依次排列，将颜色最接近的物体排列在一起，根据其排列是否正常判断色觉障碍程度和类别。通常用FM-100-Hue或D-15测验。FM-100-Hue和D-15测验可以在各种电子设备上进行。色弱D-15通过率达73.6％，色盲通过率5.8％；该方法只能筛出色盲或重度色弱。FM-100-Hue很难区分普通色弱。

(3)色盲镜(anomaloscope)。色盲镜利用红光和绿光适当混合形成黄光，令受检者调配红光和绿光的比例，以判断色觉障碍的类型和程度。色盲镜是目前公认的用于异常色觉检测和分类最准确的仪器。但其价格昂贵，携带不便，且需专业技术人员操作，平均一个受检者耗时约30分钟，不适合大规模临床检查。

遗传学检测作为一种直接的诊断方法，可用于遗传性色觉缺陷的诊断。检测结果可以判定受检者是否存在色盲色弱，区分类型和严重程度。但是，OPN1LW与OPN1MW基因高度同源，因此常规的高通量测序技术无法准确比对到参考基因组上，不能进行准确判读，且该方法成本较高。一代测序可以检测特定SNP位点，但是只能分辨纯合/杂合，但是不能确定突变型占比。Haer-Wigman L等发明的MLPA检测技术可以对OPN1LW与OPN1MW基因拷贝数定量，但不适合大规模使用(Haer-Wigman L,den Ouden A,van Genderen MM,Kroes HY,VerheijJ,Smailhodzic D,Hoekstra AS,Vijzelaar R,Blom J,Derks R,Tjon-Pon-Fong M,YntemaHG,Nelen MR,Vissers LELM,Lugtenberg D,Neveling K.Diagnostic analysis of thehighly complex OPN1LW/OPN1MW gene cluster using long-read sequencing andMLPA.NPJ Genom Med.2022Nov 9；7(1):65.)。

目前本领域亟需检测准确，且适合大规模使用，无需依赖特殊设备的遗传学检测方法。

发明内容

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术具有灵敏度高，抗干扰能力强，不依赖标准曲线进行绝对定量等优点。由于dPCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。因此开发了一种经优化的、适用于dPCR的OPN1LW与OPN1MW基因变异检测的试剂盒。本发明提供的基于dPCR检测的引物探针组合，不需要依赖定量标准品和标准曲线，灵敏度、准确度和精密度高，由于检测结果不受扩增效率的影响，因此重复性高，更易标准化。

现有技术CN117248008A公开一种红绿色觉异常的遗传学筛查方法，其基于OPN1MW基因和OPN1MW基因的dPCR检测，检测位点包括p.Y309F、p.S116T、p.S180A、p.I230T、c.-112A>C和p.I178V，内参基因为LCR。

CN117248008A虽然应用了dPCR检测，但其存在以下缺陷：检测结果依赖于多个位点，步骤繁琐，成本较高；内参引物基于X染色体上的管家基因(LCR)设计，导致需要根据性别分别进行结果判读，且X染色体拷贝数异常时结果会不准确，即不适用于X染色体拷贝数异常的样本检测，适用范围有限。

为了克服现有技术缺陷，本发明特此提出以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于红绿色觉异常诊断的引物探针组合，所述引物探针组合包括：

(1)第一引物探针组，所述第一引物探针组包含特异性扩增OPN1LW基因和OPN1MW基因p.T285A的第一引物对、第一探针和第二探针；

(2)第二引物探针组，所述第二引物探针组包含特异性扩增OPN1MW基因c.-112的第二引物对、第三探针和第四探针；

其中第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团，且荧光基团互不相同。

在一些实例中，所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物。

SEQ ID NO:1:CGCGCATGGTGGTGGTGATG。

SEQ ID NO:2:GGCAGCCATCAAAGGGTGG。

在一些实例中，所述第一探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。所述第二探针具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

本发明中第一探针和第二探针针对OPN1LW基因和OPN1MW基因的p.285设计，用于检测第285位的SNP，以鉴别具体的基因类型，若p.285为T(对应碱基为A)则为OPN1LW基因，若p.285为A(对应碱基为G)则为OPN1MW基因。

SEQ ID NO:3:ACCCTACACCTTCTT。

SEQ ID NO:4:ACCATACGCCTTCTT。

在一些实例中，所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5-6所示的引物。

SEQ ID NO:5:CCCAATTAAGAGATCAGATG。

SEQ ID NO:6:CACGGTGCTTTATACCGGCCA。

在一些实例中，所述第三探针具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。所述第四探针具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本发明中第一探针针对OPN1MW基因的c.-112设计，用于检测第-112位的SNP，以鉴别具体的碱基类型，若c.-112为CC，则为纯合突变；若c.-112为AC或AA，则为非纯合突变。

SEQ ID NO:7:TAGGATTTGGGAGCTTT。

SEQ ID NO:8:TAGGATTTGGGCGCTTT。

在一些实例中，所述引物探针组合还包括内参引物对和内参探针。

本领域技术人员理应知晓内参引物、探针基于内参基因(也称管家基因或持家基因)设计。而内参基因是指一类在生物体内有稳定表达的基因。一般用于实验时的内部参照。可以认为是一种在各种情况下，在各种不同组织、在不同时间点、各种不同外界及内部情况下，表达都很稳定的基因，包括常染色体和X染色体上的基因。本试剂盒的内参选取常染色体上的内参基因，例如：GAPDH、ACTB、RPP30、B2M、SDHA等。与X染色体上的内参基因相比，选取常染色体内参可以简化结果判断，并且适用于X染色体拷贝数异常的样本检测。

在一些实例中，所述内参引物和内参探针特异性扩增ACTB基因。

在一些优选的实例中，所述内参引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9-10所示的引物。

SEQ ID NO:9:GAACTCTGCAGGTTCTATTTG。

SEQ ID NO:10:CGAGCCAGTGTTAGTACCTAC。

在一些优选的实例中，所述内参探针具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11:CCAGATGAGCTCTTT。

在一些实例中，所述荧光基团包括，但不限于：FAM、HEX、Cy3、VIC、ROX、NED、Cy5或A425。

在一些实例中，所述淬灭基团包括，但不限于：BHQ1、BHQ2、BHQ3、BHQ650TAMRA、DABCYL或MGB。

在一些优选的实例中，所述第一探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为MGB。

在一些优选的实例中，所述第二探针的荧光基团为ROX，淬灭基团为MGB。

在一些优选的实例中，所述第三探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为MGB。

在一些优选的实例中，所述第四探针的荧光基团为A425，淬灭基团为MGB。

在一些优选的实例中，所述第五探针的荧光基团为VIC，淬灭基团为MGB。

第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含前述任一引物探针组合。

在一些实例中，所述试剂盒还包括以下至少一种：

缓冲液，DNA聚合酶，UNG酶，dNTPs、镁盐、阳性质控品和/或阴性质控品。

在一些优选的实例中，所述缓冲液为TaqPath^TMProAmp^TMMaster Mix。

本发明优化了dPCR扩增的反应体系，尤其扩增缓冲液，使得拷贝数定量和突变检测更加准确、特异。

在一些优选的实例中，所述阴性指控品可以为无核酶水。

在一些优选的实例中，所述阳性指控品可以包含内参基因ACTB、OPN1LW与OPN1MW基因p.285和c.-112的重组质粒。

第三方面，本发明提供了前述任一引物探针组合或试剂盒在制备红绿色觉异常诊断的产品中的应用。

在一些实例中，所述产品包括诊断试剂、诊断设备或诊断系统。

第四方面，本发明提供了一种用于红绿色觉异常诊断的系统，所述系统包括：

检测装置、计算装置和输出装置。

在一些实例中，所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样品，所述检测器利用前述任一引物探针组合或试剂盒检测OPN1LW基因和OPN1MW基因p.T285A以及OPN1MW基因c.-112的拷贝数。

在一些实例中，所述样品的来源包括，但不限于：口腔拭子、咽拭子、组织或血液等。

在一些优选的实例中，所述检测器具有数字PCR(dPCR)检测功能。

在一些实例中，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：

1)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝0，则该受试者患有红色盲和绿色盲；

2)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝1，则该受试者患有红色盲；

3)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)≥2；则该受试者患有红色盲或红色弱；

4)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝1，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝0，则该受试者患有绿色盲；

5)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝1，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)≥1，则进行OPN1LW基因c.-112A>C纯合突变检测后进行如下判别：

若属于c.-112A>C纯合突变，则该受试者患有绿色盲或绿色弱；

若不属于c.-112A>C纯合突变，则该受试者正常或需要采用LR-PCR进一步鉴别；

6)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)≥2，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝0，则该受试者患有绿色盲或绿色弱；

7)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)≥2，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)≥1，该受试者正常或需要采用LR-PCR进一步鉴别。

在一些实例中，所述输出装置用于输出所述检测装置的检测结果和/或所述计算装置的判别结果。

第五方面，本发明提供了一种检测OPN1MW基因和OPN1LW基因p.T285A的拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤：

(ⅰ)采集待测样本，释放或分离待测样本的DNA；

(ⅱ)利用前述任一引物探针组合或试剂盒进行dPCR检测；

(ⅲ)根据步骤(ⅱ)获得的检测数据进行结果判读。

第六方面，本发明提供了一种检测OPN1LW基因c.-112的拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤：

ⅰ)采集待测样本，释放或分离待测样本的DNA；

ⅱ)利用前述任一引物探针组合或试剂盒进行dPCR检测；

ⅲ)根据步骤ⅱ)获得的检测数据进行结果判读。

第七方面，本发明提供了一种红绿色觉异常诊断的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)采集受试者的样本，释放或分离样本的DNA；

(b)利用前述任一引物组、试剂盒或系统进行dPCR检测；

(c)根据检测数据进行结果判读。

在一些实例中，所述结果判读包括以下步骤：

a)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝0，则该受试者患有红色盲和绿色盲；

b)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝1，则该受试者患有红色盲；

c)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)≥2；则该受试者患有红色盲或红色弱；

d)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝1，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝0，则该受试者患有绿色盲；

e)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)＝1，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)≥1，则进行OPN1LW基因c.-112A>C纯合突变检测后进行如下判别：

若属于c.-112A>C纯合突变，则该受试者患有绿色盲或绿色弱；

f)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)≥2，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)＝0，则该受试者患有绿色盲或绿色弱；

g)若OPN1LW基因p.285T的拷贝数(L)≥2，OPN1MW基因p.285A的拷贝数(M)≥1，该受试者正常或需要采用LR-PCR进一步鉴别。

本发明提供了一种基于dPCR检测的引物探针组合，不需要依赖定量标准品和标准曲线，灵敏度、准确度和精密度高，检测结果非常接近目前公认的用于异常色觉检测和分类最准确的色盲镜。由于检测结果不受扩增效率的影响，因此重复性高，更易标准化。此外，本发明只检测两个位点(p.285、c.-112位点)就实现了准确鉴别色觉异常，与现有技术相比，还具有成本低廉的优势，适合大规模使用，具有较佳的产业化应用前景。

本发明不仅提供了适于dPCR检测OPN1LW基因和OPN1MW基因的p.285、c.-112位点的引物和探针，还针对内参引物探针进行改进，选择基于常染色体内参基因设计引物探针，对于结果解读更方便，不需要根据性别分别进行结果判读，提升了检测准确性。

本发明还针对反应体系进行了优化，经过大量筛选和验证，最终得到了适合本发明反应体系的缓冲液，使得拷贝数定量和突变检测更加准确、特异。

附图说明

图1为本发明检测方法的流程图。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。

本文所使用的数值范围应被理解为已经列举了对该范围内的所有数字。例如，1至20的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

本文所用的术语“包括(comprises)”或“包含(comprising)”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、要素，整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中，在整个申请中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。

本文所用的术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。本发明所用，“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。

本文所用的术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。

本文所用的术语“色觉异常(color vision anomalopia)”，指视觉器官对色觉的感受降低或缺失。临床上分色弱或色盲两种。色盲是指辨色能力消失；色弱是指对颜色辨认能力降低。临床出现辨色困难，可累及红绿色或影响黄-蓝和红-绿。治疗针对原发疾病。其中红绿色盲是最常见的先天性色觉异常，是由于X染色体上编码红绿视锥蛋白的基因异常所致，男性患者居多。蓝色盲患者罕见，其致病基因位于7号染色体，为隐性遗传。

本文所用的术语“红绿色盲(daltonism；red-green colorblindness)”，指是部分色盲，患者不能区分红色和绿色，看成两色调：长波(红、橙、黄、绿)部分为黄色，短波(青、蓝、紫)部分为蓝色。分为红色盲和绿色盲。其中“红色盲”，又称第一色盲。患者主要是不能分辨红色，对红色与深绿色、紫红色以及紫色不能分辨。常把绿色视为黄色，紫色看成蓝色，将黄色和蓝色相混为白色。“绿色盲”，又称第二色盲，患者不能分辨淡绿色与深红色、紫色与青蓝色、紫红色与灰色，把绿色视为灰色或暗黑色。

本文所用的术语“色弱(color weakness)”，指的是患者能辨认颜色但感受性较低，色弱患者对颜色辨别能力较差，只在颜色比较饱和时才能看到颜色；只在波长有较大差别时才能区分色调的变化。

本文所用的术语“LR-PCR”，是指长程PCR或长片段PCR(Long range PCR)，LR-PCR技术的原理是利用长读长的优势，直接跨越完整的LR-PCR扩增子并保留相位信息，可以更准确地鉴定假基因。具体来说，LR-PCR技术利用长距离的PCR扩增，能够直接跨越基因组中的复杂区域，避免了传统PCR方法可能出现的非特异性扩增问题。同时，该技术可以保留扩增子之间的相位信息，这有助于更准确地鉴定假基因。

本文所用的术语“p.T285A”，指OPN1LW基因和OPN1MW基因编码的氨基酸序列的第285个氨基酸，两基因的氨基酸序列同源性高，若第285个氨基酸为T(Thr，苏氨酸)，则表明该基因为OPN1LW基因，若第285个氨基酸为A(Ala，丙氨酸)，则表明该基因为OPN1MW基因。

本文所用的术语“c.-112A>C”，指OPN1MW基因cDNA序列上游112位核苷酸由A碱基突变成C碱基，若该位点只检测到C碱基，表明其为纯合突变，若该位点只检测到A碱基或同时存在A碱基和C碱基，则为非纯合突变。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)、Ausubel，F.M等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-lnterscience的出版中也进行了描述。

本发明涉及的主要试剂或设备如表1所示。

表1

实施例1引物探针组合在红绿色觉异常诊断中的应用

本实施例的引物探针组合如表2所示。

表2

提取临床样本的DNA，利用如下扩增体系(表3)进行dPCR检测。

表3

试剂名称	体积(μL)
		TaqPath^TMProAmp^TMMaster Mix	3
285-F(10μM)	1μL
		285-R(10μM)	1μL
285T-P(10μM)	0.5μL
		285A-P(10μM)	0.5μL
112-F(10μM)	1μL
		112-R(10μM)	1μL
112A-P(10μM)	0.5μL
		112C-P(10μM)	0.5μL
ACTB-F(10μM)	0.6μL
		ACTB-R(10μM)	0.6μL
ACTB-P(10μM)	0.3μL
		模板(～2ng/μL)	3
ddH₂O	补足至15μL

其中TaqPath^TMProAmp^TMMaster Mix包含DNA聚合酶、UNG酶、dNTPs和MgCl₂等。

扩增程序为：95℃，2min；(95℃，5s；60℃，45s)40个循环。

dPCR扩增结束后，根据dPCR结果整理数据，进一步分析OPN1LW与OPN1MW基因拷贝数和位点突变信息。

根据OPN1LW(FAM)与OPN1MW(ROX)基因与内参基因ACTB(VIC)的荧光浓度(copies/μL)比值计算对应基因的拷贝数(CN)，判读标准如表4所示。其中荧光浓度为dPCR扩增后仪器给出的读数。

表4

比值	结果判断
		比值≤0.1	CN＝0
0.4≤比值≤0.6	CN＝1
		比值≥0.8	CN≥2

分析得到拷贝数后，根据OPN1LW与OPN1MW基因拷贝数和位点突变信息判断色盲色弱情况，具体流程如图1所示。

实施例2引物探针组合的准确性测试

本实施例的引物探针组合以及反应体系(包括扩增体系和扩增程序)均同实施例1。

2.1LW/MW拷贝数检测(p.285位点检测)

本实验以MLPA检测作为对照组。

MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)，指多重连接探针扩增技术，是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，已经应用于多个领域、多种疾病的研究。

检测结果及分析如表5所示。

表5

结果显示，采用本实施例的引物探针组合测定的30例临床样本血液DNA中OPN1LW和OPN1MW的拷贝数，与MLPA分析结果完全一致，灵敏度和特异度均为100.0％。

2.2OPN1MW c.-112A＞C位点检测

本实验以一代测序的结果作为对照。

检测结果如表6所示。

表6

结果显示，采用本实施例的引物探针组合测定的30例临床样本血液DNA中OPN1MWc.-112A＞C位点，与一代测序结果结果完全一致，灵敏度和特异度均为100.0％。

实施例3引物探针组合检测与色盲镜检查对比

检测200例接受过色盲镜检查的受检者的血液样本DNA，其中30例色盲镜检测阳性的受检者样本，利用本引物探针组合检测有28例判为色盲或色弱，2例需要进一步做长程PCR(LR-PCR)验证。

170例色盲镜检测阴性受检者样本利用本试剂盒检测有169例判为色觉正常，1例需进一步做LR-PCR验证。

3例需要进一步做LR-PCR的样本最终确定均为色弱。

因此，本引物探针组合的灵敏度达93.3％(28/30)，特异性为99.4％(169/170)，准确度为98.5％(197/200)，阳性符合率为100％(28/28)，阴性符合率为100％(169/169)，总符合率为100％。

对比例1

本对比例针对OPN1MW c.-112A＞C位点进行检测，目的是为了对比本发明针对c.-112A＞C位点设计的引物探针(SEQ ID NO:5-8)与参比引物探针的检测效果。参比引物探针的序列如表7所示。

检测方法与具体参数同实施例1和实施例2。

表7

序列名称	序列编号	序列(5’-3’)	标记基团
				112F-S	SEQ ID NO:12	TAAGTCCCAGGCCCAATTAAGA	-
112R-S	SEQ ID NO:13	ATACCGGCCAGTGGGATCA	-
				112PA-S	SEQ ID NO:14	TGTAGGATTTGGGAGCT	5’CY5,3’MGB
112PC-S	SEQ ID NO:15	TGTAGGATTTGGGCGCT	5’A425,3’MGB

检测结果如表8所示，检测c.-112位点纯合突变(CC基因型)的样本，本发明的引物探针只有A425通道有荧光浓度，CY5通道荧光浓度为0，而参比引物探针CY5通道也有非特异的荧光浓度；检测c.-112位点野生型(AA基因型)样本只有CY5通道有荧光浓度，A425通道荧光浓度为0，而参比引物探针A425通道也有非特异的荧光浓度；检测c.-112位点杂合突变(AC基因型)样本，两组引物探针的CY5和A425通道均有荧光浓度。上述结果表明，本发明提供的引物探针组在鉴别c.-112位点基因型中特异性更佳。

表8

对比例2

本发明针对dPCR体系的缓冲液进行了改进，选用TaqPath^TMProAmp^TMMaster Mix效果最佳。本对比例选用参比缓冲液作为对照，以证明本发明选用的缓冲液效果更好。

本对比例的检测方法、反应体系和引物以及结果判读均同实施例1和实施例2。

检测结果如表9所示，检测4例样本的OPN1LW基因和OPN1MW基因拷贝数，本发明选用的TaqPath^TMProAmp^TMMaster Mix检测的拷贝数(OPN1LW基因或OPN1MW基因荧光浓度与内参基因荧光浓度比值)更接近参考值(MLPA检测)，而参比缓冲液Hieff UniversalTaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)检测的拷贝数偏高。

表9

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种用于红绿色觉异常诊断的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合由第一引物探针组、第二引物探针组、内参引物对和内参探针组成；

（1）第一引物探针组，所述第一引物探针组为特异性扩增OPN1LW基因和OPN1MW基因p.T285A的第一引物对、第一探针和第二探针；

（2）第二引物探针组，所述第二引物探针组为特异性扩增OPN1MW基因c.-112的第二引物对、第三探针和第四探针；

其中第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团，且荧光基团互不相同；

所述第一引物对为核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-2所示的引物；

所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；

所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示；

所述第二引物对为核苷酸序列如SEQ ID NO: 5-6所示的引物；

所述三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；

所述第四探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；

所述内参引物对和内参探针特异性扩增ACTB基因；所述内参引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO: 9-10所示的引物；所述内参探针具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、Cy3、VIC、ROX、NED、Cy5或A425；和/或

所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、BHQ650TAMRA、DABCYL或MGB。

3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为MGB；

所述第二探针的荧光基团为ROX，淬灭基团为MGB；

所述第三探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为MGB；

所述第四探针的荧光基团为A425，淬灭基团为MGB；

所述第五探针的荧光基团为VIC，淬灭基团为MGB。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3中任一所述的引物探针组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下至少一种：缓冲液，DNA聚合酶，UNG酶，dNTPs、镁盐、阳性质控品和/或阴性质控品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性指控品为无核酶水；所述阳性指控品包含内参基因、OPN1LW与OPN1MW基因p.285和c.-112的重组质粒；所述缓冲液为TaqPath™ ProAmp™ Master Mix。

7.根据权利要求1-3中任一所述的引物探针组合或权利要求4-6中任一项所述的试剂盒在制备红绿色觉异常诊断的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包括诊断试剂、诊断设备或诊断系统。

9.一种用于红绿色觉异常诊断的系统，其特征在于，所述系统包括：检测装置、计算装置和输出装置；

所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样品，所述检测器利用权利要求1-3中任一所述引物探针组合或权利要求4-6中任一项所述的试剂盒检测OPN1LW基因和OPN1MW基因p.285以及OPN1MW基因c.-112的拷贝数。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述样品的来源包括口腔拭子、咽拭子、组织或血液。

11.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：

1）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）=0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）=0，则该受试者患有红色盲和绿色盲；

2）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）=0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）=1，则该受试者患有红色盲；

3）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）=0，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）≥2；则该受试者患有红色盲或红色弱；

4）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）=1，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）=0，则该受试者患有绿色盲；

5）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）=1，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）≥1，则进行OPN1LW基因c.-112 A>C纯合突变检测后进行如下判别：

若属于c.-112 A>C纯合突变，则该受试者患有绿色盲或绿色弱；

若不属于c.-112 A>C纯合突变，则该受试者正常或需要采用LR-PCR进一步鉴别；

6）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）≥2，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）=0，则该受试者患有绿色盲或绿色弱；

7）若OPN1LW基因p.285T的拷贝数（L）≥2，OPN1MW基因p.285A的拷贝数（M）≥1，该受试者正常或需要采用LR-PCR进一步鉴别。

12.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述输出装置用于输出所述检测装置的检测结果和/或所述计算装置的判别结果。