CN111593115B - 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于β‑地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒，属于分子生物学检测技术领域；所述引物和探针组合包括第1组引物和探针组合～第12组引物和探针组合中的一组或几组；每组引物和探针组合中包括用于检测两种β‑地中海贫血基因突变型和对应的两种野生型的引物和探针；突变型情况由FAM荧光通道或HEX荧光通道指示，野生型由ROX荧光通道或CY5荧光通道指示；本发明的引物和探针组合能够对β‑地中海贫血突变基因的突变型与野生型中两个或多个位点同时进行检测，并通过四个不同的荧光通道读取信息读取检测结果，实现β‑地中海贫血的高通量、特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒。
背景技术
β-地中海贫血是由于β株蛋白基因的缺失或缺陷使β株蛋白链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，主要的突变方式为点突变，少数为缺失突变。完全不能合成β链称β0地贫，能够部分合成β链称β+地贫，可以通过不同的组合形成：β0地贫纯合子(β0/β0)、β0地贫双重杂合子(β0/β+)、β0杂合子(β0/βA)、β+地贫纯合子(β+/β+)和β+地贫杂合子(β+/βA)。其中重型β-地中海贫血的患者为β+地贫纯合子、β0地贫纯合子、β0地贫双重杂合子这些患者的β链几乎不能合成，引起溶血性贫血；中间型地贫的患者通常是某些β地贫变异型的纯合子，如β+地贫纯合子；轻型地贫是β0或β+地贫的杂合子状态，β链的合成仅轻度减少，故其病理生理改变极轻微。
β-地中海贫血是一组遗传性疾病，其临床表现多样，由轻到重，可以从正常到反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，给家庭和社会带来巨大的负担。且目前尚无根治手段，国内外都没有疗效标准。因此控制和降低β-地中海贫血患儿的出生率才能有效地监控该病的发生，通过人群筛查和遗传咨询，对有携带β地贫基因的孕龄夫妇所孕胎儿实施产前诊断，是目前最有效的控制重症β-地中海贫血患儿出生的方法。
DNA直接测序法是进行β-地中海贫血基因突变检测最直接最准确的方法，是检测未知的地贫突变基因的关键方法。但其需要对样品进行扩增、纯化、序列分析，所需的时间长，成本高，对取材和技术的要求都比较高。因此在临床应用上具有一定的限制。
反向点杂交法(RDB)是β-地中海贫血基因突变目前国内外最常用的技术，其优点在于一张杂交膜上可同时筛查多种点突变，从而改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。对于目前国内外的β-地中海基因突变的筛查试剂也大多使用该方法。但是该方法过程复杂，耗时长，容易污染出现假阳性，并且灵敏度较低，出现漏检现象。
实时荧光PCR技术是近几年发展起来的一种新技术，该技术在常规的PCR基础上加入了荧光标记探针或相应的荧光染料来实现定量或定性的功能。它摆脱了凝胶电泳技术，避免了有毒操作，操作简便。当前也有部分研究选择使用实时荧光PCR技术用于β-地中海贫血基因突变的检测，但都是单管检测一个位点，无法单管检测多个位点，无法进行高通量检测。
发明内容
本发明的目的在于提供用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒，本发明的引物和探针及试剂盒能够实现对β-地中海贫血基因突变进行检测，实现高通量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合，包括第1组引物和探针组合～第12组引物和探针组合中的一组或几组，每个组合中，引物和探针组合单独包装；
第1组引物和探针组合包括：41-42M上游引物、41-42M下游引物、41-42M探针、41-42W探针、IVS-Ⅱ-5M上游引物、IVS-Ⅱ-5M下游引物、IVS-Ⅱ-5M探针和IVS-Ⅱ-5W探针；所述41-42M上游引物、41-42M下游引物、41-42M探针和41-42W探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4所示；所述IVS-Ⅱ-5M上游引物、IVS-Ⅱ-5M下游引物、IVS-Ⅱ-5M探针和IVS-Ⅱ-5W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.93～SEQ ID NO.96所示；
第2组引物和探针组合包括：654M上游引物、654M下游引物、654M探针、654W探针、43M上游引物、43M下游引物、43M探针和43W探针；所述654M上游引物、654M下游引物、654M探针和654W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；所述43M上游引物、43M下游引物、43M探针和43W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.44所示；
第3组引物和探针组合包括：26M上游引物、26M下游引物、26M探针、26W探针、30M上游引物、30M下游引物、30M探针和30W探针；所述26M上游引物、26M下游引物、26M探针和26W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.28所示；所述30M上游引物、30M下游引物、30M探针和30W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85～SEQ ID NO.88所示；
第4组引物和探针组合包括：27-28M上游引物、27-28M下游引物、27-28M探针、27-28W探针、IVS-1-1M(T)上游引物、IVS-1-1M(T)下游引物、IVS-1-1M(T)探针和IVS-1-1W(T)探针；所述27-28M上游引物、27-28M下游引物、27-28M探针和27-28W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.40所示；所述IVS-1-1M(T)上游引物、IVS-1-1M(T)下游引物、IVS-1-1M(T)探针和IVS-1-1W(T)探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示；
第5组引物和探针组合包括：31M上游引物、31M下游引物、31M探针、31W探针、-28M上游引物、-28M下游引物、-28M探针和-28W探针；所述31M上游引物、31M下游引物、31M探针和31W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.36所示；所述-28M上游引物、-28M下游引物、-28M探针和-28W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示；
第6组引物和探针组合包括：17M上游引物、17M下游引物、17M探针、17W探针、-29M上游引物、-29M下游引物、-29M探针和-29W探针；所述17M上游引物、17M下游引物、17M探针和17W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；所述-29M上游引物、-29M下游引物、-29M探针和-29W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.32所示；
第7组引物和探针组合包括：IVS-1-1M(A)上游引物、IVS-1-1M(A)下游引物、IVS-1-1M(A)探针、IVS-1-1W(A)探针、71-72M(A)上游引物、71-72M(A)下游引物、71-72M(A)探针和71-72W(A)探针；所述IVS-1-1M(A)上游引物、IVS-1-1M(A)下游引物、IVS-1-1M(A)探针和IVS-1-1W(A)探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.69～SEQ ID NO.72所示；所述71-72M(A)上游引物、71-72M(A)下游引物、71-72M(A)探针和71-72W(A)探针的核苷酸序列分别如SEQID NO.17～SEQ ID NO.20所示；
第8组引物和探针组合包括：14-15M上游引物、14-15M下游引物、14-15M探针、14-15W探针、41M上游引物、41M下游引物、41M探针和41W探针；所述14-15M上游引物、14-15M下游引物、14-15M探针、14-15W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.53～SEQ ID NO.56所示；所述41M上游引物、41M下游引物、41M探针和41W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.89～SEQ ID NO.92所示；
第9组引物和探针组合包括：IVS-1-5M上游引物、IVS-1-5M下游引物、IVS-1-5M探针、IVS-1-5W探针、71-72M(T)上游引物、71-72M(T)下游引物、71-72M(T)探针和71-72W(T)探针；所述IVS-1-5M上游引物、IVS-1-5M下游引物、IVS-1-5M探针和IVS-1-5W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.65～SEQ ID NO.68所示；所述71-72M(T)上游引物、71-72M(T)下游引物、71-72M(T)探针和71-72W(T)探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.24所示；
第10组引物和探针组合包括：-31M上游引物、-31M下游引物、-31M探针、-31W探针、CAP40-43M上游引物、CAP40-43M下游引物、CAP40-43M探针和CAP40-43W探针；所述-31M上游引物、-31M下游引物、-31M探针和-31W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.77～SEQ IDNO.80所示；所述CAP40-43M上游引物、CAP40-43M下游引物、CAP40-43M探针和CAP40-43W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.84所示；
第11组引物和探针组合包括：IntM上游引物、IntM下游引物、IntM探针、IntW探针、-32M上游引物、-32M下游引物、-32M探针和-32W探针；所述IntM上游引物、IntM下游引物、IntM探针和IntW探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.64所示；所述-32M上游引物、-32M下游引物、-32M探针和-32W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.45～SEQ ID NO.48所示；
第12组引物和探针组合包括：CAP-1M上游引物、CAP-1M下游引物、CAP-1M探针、CAP-1W探针、-30M上游引物、-30M下游引物、-30M探针和-30W探针；所述CAP-1M上游引物、CAP-1M下游引物、CAP-1M探针和CAP-1W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.57～SEQ IDNO.60所示；所述-30M上游引物、-30M下游引物、-30M探针和-30W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.52所示；
所述41-42M探针、654M探针、17M探针、26M探针、31M探针、27-28M探针、14-15M探针、CAP-1M探针、IntM探针、IVS-1-5M探针、IVS-1-1M(A)探针和-31M探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述-28M探针、71-72M(A)探针、71-72M(T)探针、-29M探针、43M探针、-32M探针、-30M探针、IVS-1-1M(T)探针、CAP40-43M探针、30M探针、41M探针和IVS-Ⅱ-5M探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述41-42W探针、654W探针、17W探针、26W探针、31W探针、27-28W探针、14-15W探针、CAP-1W探针、IntW探针、IVS-1-5W探针、IVS-1-1W(A)探针和-31W探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述-28W探针、71-72W(A)探针、71-72W(T)探针、-29W探针、43W探针、-32W探针、-30W探针、CAP40-43W探针、30W探针、41W探针、IVS-1-1W(T)探针和IVS-Ⅱ-5W探针的5’端分别标记有荧光报告基团CY5，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2。
本发明提供了上述方案所述引物和探针组合的试剂盒。
优选的，每组引物和探针组合中，每种引物或者每种探针的使用母液浓度分别为50μM。
优选的，所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油；
所述反应缓冲液包括以下组分：HEPES 50mM、(NH4)2SO425mM、KCl 125mM、MgCl27.5mM、体积百分含量为2.50％的甲酰胺、dNTPs 0.3mM和dUTP 0.6mM；
所述酶混合液包括以下组分：Taq DNA聚合酶4.0U/μL、尿嘧啶糖基化酶0.004U/μL和酶储存液；所述酶储存液包括以下浓度的组分：50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA·2Na，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为50％的甘油；
所述稀释缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1mM，三羟甲基氨基甲烷9mM；
所述TE缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.6mM、三羟甲基氨基甲烷4.4mM和乙二胺四乙酸二钠盐1mM。
优选的，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品包括生理盐水；所述阳性对照品包括插入有β-地中海贫血突变基因的重组质粒。
优选的，所述第1组引物和探针组合～第12组引物和探针组合还分别和TE缓冲液混合，对应得到第1扩增液～第12扩增液。
本发明的有益效果：本发明提供了用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合，包括第1组引物和探针组合～第12组引物和探针组合中的一组或几组；每组引物和探针组合中包括用于检测两种β-地中海贫血基因突变型和对应的两种野生型的引物和探针；突变型情况由FAM荧光通道或HEX荧光通道指示，野生型由ROX荧光通道或CY5荧光通道指示；本发明的引物和探针组合能够对β-地中海贫血突变基因41-42M、654M、17M、-28M、71-72M(A)、71-72M(T)、26M、-29M、31M、27-28M、43M、-32M、-30M、14-15M、CAP-1M、IntM、IVS-1-5M、IVS-1-1(A)、IVS-1-1(T)、-31M、CAP40-43M、30M、41M和IVS-Ⅱ-5M的突变型与野生型中两个或多个位点同时进行检测，并通过四个不同的荧光通道读取信息读取检测结果，实现β-地中海贫血的高通量、特异性检测。
采用本发明的引物和探针组合对β-地中海贫血多重实时荧光PCR检测，与反向点杂交法(RDB)相比，本发明具有更高的灵敏度和特异性，操作简便；和普通实时荧光PCR法相比，具有更高的通量，可以实现同管检测多种基因突变位点的效果；和测序法或者NGS相比，具有更简便的操作过程，无需后期生物信息数据处理，直接给出结论；和ARMS(扩增阻滞PCR)法相比，无非特异性扩增，无需引入ΔCt，可直接判断结果。
附图说明
图1为检测正常人基因组DNA反应孔FAM和HEX实验结果图；
图2为检测正常人基因组DNA反应孔ROX实验结果图；
图3为检测正常人基因组DNA反应孔CY5实验结果图；
图4为3号样本实验结果图；
图5为4号样本实验结果图；
图6为5号样本检测结果；
图7为6号样本检测结果；
图8为7号样本检测结果；
图9为8号样本检测结果；
图10为9号样本检测结果；
图11为10号样本检测结果；
图12为11号样本检测结果；
图13为12号样本检测结果；
图14为13号样本检测结果；
图15为14号样本检测结果；
图16为15号样本检测结果；
图17为重复性参考品实验结果图。
具体实施方式
本发明提供了用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合，包括第1组引物和探针组合～第12组引物和探针组合中的一组或几组，每个组合中，引物和探针组合单独包装；引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上述组合方式能够实现在单个反应管里有多套引物探针同时扩增；
本发明的试剂盒的引物探针主要是靠探针的Tm值进行区分野生型和突变型的检测。由于野生型与突变型往往只是单个碱基的区别，故常规探针无法区分这一特性，本发明设计的探针Tm值经过primer3.0分析要在45～50℃之间；
第1组引物和探针组合包括：41-42M上游引物、41-42M下游引物、41-42M探针、41-42W探针、IVS-Ⅱ-5M上游引物、IVS-Ⅱ-5M下游引物、IVS-Ⅱ-5M探针和IVS-Ⅱ-5W探针；所述41-42M上游引物、41-42M下游引物、41-42M探针和41-42W探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4所示；所述IVS-Ⅱ-5M上游引物、IVS-Ⅱ-5M下游引物、IVS-Ⅱ-5M探针和IVS-Ⅱ-5W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.93～SEQ ID NO.96所示；
第2组引物和探针组合包括：654M上游引物、654M下游引物、654M探针、654W探针、43M上游引物、43M下游引物、43M探针和43W探针；所述654M上游引物、654M下游引物、654M探针和654W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；所述43M上游引物、43M下游引物、43M探针和43W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.44所示；
第3组引物和探针组合包括：26M上游引物、26M下游引物、26M探针、26W探针、30M上游引物、30M下游引物、30M探针和30W探针；所述26M上游引物、26M下游引物、26M探针和26W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.28所示；所述30M上游引物、30M下游引物、30M探针和30W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85～SEQ ID NO.88所示；
第4组引物和探针组合包括：27-28M上游引物、27-28M下游引物、27-28M探针、27-28W探针、IVS-1-1M(T)上游引物、IVS-1-1M(T)下游引物、IVS-1-1M(T)探针和IVS-1-1W(T)探针；所述27-28M上游引物、27-28M下游引物、27-28M探针和27-28W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.40所示；所述IVS-1-1M(T)上游引物、IVS-1-1M(T)下游引物、IVS-1-1M(T)探针和IVS-1-1W(T)探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示；
第5组引物和探针组合包括：31M上游引物、31M下游引物、31M探针、31W探针、-28M上游引物、-28M下游引物、-28M探针和-28W探针；所述31M上游引物、31M下游引物、31M探针和31W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.36所示；所述-28M上游引物、-28M下游引物、-28M探针和-28W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示；
第6组引物和探针组合包括：17M上游引物、17M下游引物、17M探针、17W探针、-29M上游引物、-29M下游引物、-29M探针和-29W探针；所述17M上游引物、17M下游引物、17M探针和17W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；所述-29M上游引物、-29M下游引物、-29M探针和-29W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.32所示；
第7组引物和探针组合包括：IVS-1-1M(A)上游引物、IVS-1-1M(A)下游引物、IVS-1-1M(A)探针、IVS-1-1W(A)探针、71-72M(A)上游引物、71-72M(A)下游引物、71-72M(A)探针和71-72W(A)探针；所述IVS-1-1M(A)上游引物、IVS-1-1M(A)下游引物、IVS-1-1M(A)探针和IVS-1-1W(A)探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.69～SEQ ID NO.72所示；所述71-72M(A)上游引物、71-72M(A)下游引物、71-72M(A)探针和71-72W(A)探针的核苷酸序列分别如SEQID NO.17～SEQ ID NO.20所示；
第8组引物和探针组合包括：14-15M上游引物、14-15M下游引物、14-15M探针、14-15W探针、41M上游引物、41M下游引物、41M探针和41W探针；所述14-15M上游引物、14-15M下游引物、14-15M探针、14-15W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.53～SEQ ID NO.56所示；所述41M上游引物、41M下游引物、41M探针和41W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.89～SEQ ID NO.92所示；
第9组引物和探针组合包括：IVS-1-5M上游引物、IVS-1-5M下游引物、IVS-1-5M探针、IVS-1-5W探针、71-72M(T)上游引物、71-72M(T)下游引物、71-72M(T)探针和71-72W(T)探针；所述IVS-1-5M上游引物、IVS-1-5M下游引物、IVS-1-5M探针和IVS-1-5W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.65～SEQ ID NO.68所示；所述71-72M(T)上游引物、71-72M(T)下游引物、71-72M(T)探针和71-72W(T)探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.24所示；
第10组引物和探针组合包括：-31M上游引物、-31M下游引物、-31M探针、-31W探针、CAP40-43M上游引物、CAP40-43M下游引物、CAP40-43M探针和CAP40-43W探针；所述-31M上游引物、-31M下游引物、-31M探针和-31W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.77～SEQ IDNO.80所示；所述CAP40-43M上游引物、CAP40-43M下游引物、CAP40-43M探针和CAP40-43W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.84所示；
第11组引物和探针组合包括：IntM上游引物、IntM下游引物、IntM探针、IntW探针、-32M上游引物、-32M下游引物、-32M探针和-32W探针；所述IntM上游引物、IntM下游引物、IntM探针和IntW探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.64所示；所述-32M上游引物、-32M下游引物、-32M探针和-32W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.45～SEQ ID NO.48所示；
第12组引物和探针组合包括：CAP-1M上游引物、CAP-1M下游引物、CAP-1M探针、CAP-1W探针、-30M上游引物、-30M下游引物、-30M探针和-30W探针；所述CAP-1M上游引物、CAP-1M下游引物、CAP-1M探针和CAP-1W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.57～SEQ IDNO.60所示；所述-30M上游引物、-30M下游引物、-30M探针和-30W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.52所示；
所述41-42M探针、654M探针、17M探针、26M探针、31M探针、27-28M探针、14-15M探针、CAP-1M探针、IntM探针、IVS-1-5M探针、IVS-1-1M(A)探针和-31M探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述-28M探针、71-72M(A)探针、71-72M(T)探针、-29M探针、43M探针、-32M探针、-30M探针、IVS-1-1M(T)探针、CAP40-43M探针、30M探针、41M探针和IVS-Ⅱ-5M探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述41-42W探针、654W探针、17W探针、26W探针、31W探针、27-28W探针、14-15W探针、CAP-1W探针、IntW探针、IVS-1-5W探针、IVS-1-1W(A)探针和-31W探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述-28W探针、71-72W(A)探针、71-72W(T)探针、-29W探针、43W探针、-32W探针、-30W探针、CAP40-43W探针、30W探针、41W探针、IVS-1-1W(T)探针和IVS-Ⅱ-5W探针的5’端分别标记有荧光报告基团CY5，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2。
表1本发明的引物和探针组合的核苷酸序列
本发明的引物和探针组合能够对β-地中海贫血突变基因41-42M(CD41-42：-TTCT)、654M(IVS-2nt654：C-T)、17M(CD17：A-T)、-28M(-28：A-G)、71-72M(A)(CD71-72：+A)、71-72M(T)(CD71-72：+T)、26M(CD26：GAG-AAG)、-29M(-29：A-G)、31M(CD31：-C)、27-28M(CD27-28：+C)、43M(CD43：G-T)、-32M(-32：C-A)、-30M(-30：T-C)、14-15M(CD14-15：+G)、CAP-1M(CAP-1：A-C)、IntM(Int：ATG-AGG)、IVS-1-5M(IVS-1nt5：G-C)、IVS-1-1(A)(IVS-1nt1：G-A)、IVS-1-1(T)(IVS-1nt1：G-T)、-31M(-31：A-C)、CAP40-43M(CAP40-43：-AAAC)、30M(CD30：A-G)、41M(CD41：+T)和IVS-Ⅱ-5M(IVS-2nt5：G-C)的突变型与野生型中两个或多个位点同时进行检测，并通过四个不同的荧光通道读取信息读取检测结果，实现β-地中海贫血的高通量、特异性检测。
本发明提供了上述方案所述引物和探针组合的试剂盒。
在本发明中，每组引物和探针组合中，每种引物或者每种探针的使用母液浓度分别为50μM。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括反应缓冲液、酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油。
在本发明中，所述反应缓冲液包括以下组分：HEPES 50mM、(NH4)2SO425mM、KCl125mM、MgCl27.5mM、体积百分含量为2.50％的甲酰胺、dNTPs 0.3mM和dUTP 0.6mM；所述酶混合液包括以下组分：Taq DNA聚合酶4.0U/μL、尿嘧啶糖基化酶0.004U/μL和酶储存液；所述酶储存液包括以下浓度的组分：50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA·2Na，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为50％的甘油；所述稀释缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1mM，三羟甲基氨基甲烷9mM；所述TE缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.6mM、三羟甲基氨基甲烷4.4mM和乙二胺四乙酸二钠盐1mM。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品优选的包括生理盐水；所述阳性对照品优选的包括插入有β-地中海贫血突变基因的重组质粒。
在本发明中，所述第1组引物和探针组合～第12组引物和探针组合还分别和TE缓冲液混合，对应得到第1扩增液～第12扩增液。本发明中，所述第1扩增液～第12扩增液检测突变类型及对应的荧光通道信息参见表2。
表2扩增液检测突变类型及对应的荧光通道信息
在本发明具体实施过程中，所述第1扩增液～第12扩增液的配方。
第1扩增液:50μM的41-42M上游引物6μL，50μM的IVS-Ⅱ-5M上游引物6μL，50μM的41-42M下游引物6μL，50μM的IVS-Ⅱ-5M下游引物6μL，50μM的41-42M探针0.9μL，50μM的41-42W探针0.9μL，50μM的IVS-Ⅱ-5M探针0.9μL，50μM的IVS-Ⅱ-5W探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第2扩增液:50μM的654M上游引物6μL，50μM的43M上游引物6μL，50μM的654M下游引物6μL，50μM的43M下游引物6μL，50μM的654M探针0.9μL，50μM的654W探针0.9μL，50μM的43M探针0.9μL，50μM的43W探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第3扩增液:50μM的26M上游引物6μL，50μM的30M上游引物6μL，50μM的26M下游引物6μL，50μM的30M下游引物6μL，50μM的26M探针0.9μL，50μM的26W探针0.9μL，50μM的30M探针0.9μL，50μM的30W探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第4扩增液:50μM的27-28M上游引物6μL，50μM的IVS-1-1M(T)上游引物6μL，50μM的27-28M下游引物6μL，50μM的IVS-1-1M(T)下游引物6μL，50μM的27-28M探针0.9μL，50μM的27-28W探针0.9μL，50μM的IVS-1-1M(T)突变型探针0.36μL，50μM的IVS-1-1M(T)野生型探针0.9μL，TE缓冲液2.94μL；
第5扩增液:50μM的31M上游引物6μL，50μM的-28M上游引物6μL，50μM的31M下游引物6μL，50μM的-28M下游引物6μL，50μM的31M探针0.9μL，50μM的31W探针0.48μL，50μM的-28M探针0.9μL，50μM的-28W探针0.9μL，TE缓冲液2.82μL；
第6扩增液:50μM的17M上游引物6μL，50μM的-29M上游引物6μL，50μM的17M下游引物6μL，50μM的-29M下游引物6μL，50μM的17M探针0.9μL，50μM的17W探针0.9μL，50μM的-29M探针0.9μL，50μM的-29W探针0.78μL，TE缓冲液2.52μL；
第7扩增液:50μM的IVS-1-1M(A)上游引物6μL，50μM的71-72M(A)上游引物6μL，50μM的IVS-1-1M(A)下游引物6μL，50μM的71-72M(A)下游引物6μL，50μM的IVS-1-1M(A)探针0.48μL，50μM的IVS-1-1W(A)探针0.6μL，50μM的71-72M(A)探针0.9μL，50μM的71-72W(A)探针0.36μL，TE缓冲液3.66μL；
第8扩增液:50μM的14-15M上游引物6μL，50μM的41M上游引物6μL，50μM的14-15M下游引物6μL，50μM的41M下游引物6μL，50μM的14-15M探针0.9μL，50μM的14-15W探针0.9μL，50μM的41M探针0.9μL，50μM的41W探针0.36μL，TE缓冲液2.94μL；
第9扩增液:50μM的IVS-1-5M上游引物6μL，50μM的71-72M(T)上游引物6μL，50μM的IVS-1-5M下游引物6μL，50μM的71-72M(T)下游引物6μL，50μM的IVS-1-5M探针0.9μL，50μM的IVS-1-5W探针0.9μL，50μM的71-72M(T)探针0.9μL，50μM的71-72W(T)探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第10扩增液:50μM的-31M上游引物6μL，50μM的CAP40-43M上游引物6μL，50μM的-31M下游引物6μL，50μM的CAP40-43M下游引物6μL，50μM的-31M探针0.9μL，50μM的-31W探针0.9μL，50μM的CAP40-43M探针0.9μL，50μM的CAP40-43W探针0.78μL，TE缓冲液2.52μL；
第11扩增液:50μM的IntM上游引物6μL，50μM的-32M上游引物6μL，50μM的IntM下游引物6μL，50μM的-32M下游引物6μL，50μM的IntM探针0.9μL，50μM的IntW探针0.9μL，50μM的-32M探针0.9μL，50μM的-32W探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第12扩增液:50μM的CAP-1M上游引物6μL，50μM的-30M上游引物6μL，50μM的CAP-1M下游引物6μL，50μM的-30M下游引物6μL，50μM的CAP-1M探针0.9μL，50μM的CAP-1W探针0.9μL，50μM的-30M探针0.9μL，50μM的-30W探针0.78μL，TE缓冲液2.57μL；
本发明所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物和探针组合进行多重实时荧光PCR扩增反应；所述多重实时荧光PCR扩增反应过程中，利用全自动医用PCR分析系统(厦门安普利生物工程有限公司生产)收集荧光信号，进行荧光素设定为FAM、ROX、HEX和CY5；荧光信号收集设在58℃30s；
取3～12个循环的荧光信号作为基线，分析出基线阈值，将阈值线调整至刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，以Ct值＝0.0为准；
3)分析检测结果；阴性对照反应孔的四个通道应无扩增曲线，阳性对照反应孔的ROX和CY5通道应均有扩增曲线且41-42M、654M、17M突变反应孔对应的FAM通道应有扩增曲线，否则视为无效；
待测样本反应孔的FAM通道、ROX通道、HEX通道与CY5通道至少有一个荧光通道有扩增曲线，否则视为无效；若待测样本β-地中海贫血检测反应孔的FAM通道或HEX通道无扩增曲线，结果则判断为无突变；若待测样本β-地中海贫血检测反应孔的FAM通道或HEX通道有扩增曲线，且Ct值≤37，则进行判断ROX通道或CY5通道，如果有扩增曲线，且Ct值≤37，结果判断为对应突变类型的杂合突变；如果无扩增曲线，结果判断为对应突变类型的纯合突变；若同时存在两种及以上突变类型，则判断为复合突变；若待检样本Ct值范围在37＜Ct＜40，说明加入样本量太少，则需加大样本量或核酸量重检。
本发明首先提取待检测样品的基因组DNA；所述样品优选的包括β地中海贫血突变基因的样本；本发明对所述提取待检测样品的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
得到待检测样品的基因组DNA后，本发明以所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物和探针组合进行多重实时荧光PCR扩增反应；所述多重实时荧光PCR扩增反应过程中，利用全自动医用PCR分析系统(厦门安普利生物工程有限公司生产)收集荧光信号，进行荧光素设定为FAM、ROX、HEX和CY5；荧光信号收集设在58℃30s；取3～12个循环的荧光信号作为基线，分析出基线阈值，将阈值线调整至刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，以Ct值＝0.0为准；所述扩增的体系优选为总反应体积为50μL；所述扩增的程序优选为：38℃、5min；95℃、2min；95℃、15s，58℃、50s(30s后读荧光)，40个循环；38℃、30s。
得到检测结果后，本发明对检测结果进行分析；阴性对照反应孔的四个通道应无扩增曲线，阳性对照反应孔的ROX和CY5通道应均有扩增曲线且41-42M、654M、17M突变反应孔对应的FAM通道应有扩增曲线，否则视为无效；待测样本反应孔的FAM通道、ROX通道、HEX通道与CY5通道至少有一个荧光通道有扩增曲线，否则视为无效；若待测样本β-地中海贫血检测反应孔的FAM通道或HEX通道无扩增曲线，结果则判断为无突变；若待测样本β-地中海贫血检测反应孔的FAM通道或HEX通道有扩增曲线，且Ct值≤37，则进行判断ROX通道或CY5通道，如果有扩增曲线，且Ct值≤37，结果判断为对应突变类型的杂合突变；如果无扩增曲线，结果判断为对应突变类型的纯合突变；若同时存在两种及以上突变类型，则判断为复合突变；若待检样本Ct值范围在37＜Ct＜40，说明加入样本量太少，则需加大样本量或核酸量重检。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、本发明试剂盒包含以下组分：第1扩增液～第12扩增液各1支(24人份/支)、反应缓冲液4支(1.5mL/支)、酶混合液3支(50μL/支)、稀释缓冲液6支(1.5mL/支)、TE缓冲液2支(1.5mL/支)、石蜡油5支(1.5mL/支)、阴性对照品1支(500μL/支)和阳性对照品1支(500μL/支)。
其中反应缓冲液配方：50mM的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，25mM的(NH4)2SO4，125mM的KCl，7.5mM的MgCl2，2.50％的甲酰胺，0.3mM的dNTPs。0.6mM的dUTP。
酶混合液配方：4.0U/μL的TaqDNA聚合酶，0.004U/μL的UNG酶，酶储存液A补足至配制体积
稀释缓冲液配方：1mM的
9mM的
TE缓冲液配方：5.6mM的
4.4mM的
1mM的EDTA·2Na
阴性对照品配方：生理盐水
阳性对照品配方：1.0×104copies/μL的pGEM-T-Easy-41-42M、1.0×104copies/μLpGEM-T-Easy-654M、1.0×104copies/μL pGEM-T-Easy-17M、1.0×104copies/μL野生型质粒
2、人类基因组DNA样本(参见表3)：含有β地中海贫血基因突变的地中海贫血核酸检测国家参考品，原液浓度为20ng/μl，稀释20倍后进行检测，即1ng/μl。
表3人类基因组DNA样本
3、重复性参考品：
在对照品配制间取100μL 1.0×106copies/μL的pGEM-T-Easy-654M质粒，用10ng/μL的野生型人基因组DNA稀释至1.0×103copies/μL作为重复性参考品1。
在对照品配制间取100μL 1.0×106copies/μL的pGEM-T-Easy-41-42M质粒，用10ng/μL的野生型人基因组DNA稀释至1.0×103copies/μL，作为重复性参考品2。
在对照品配制间取100μL 1.0×106copies/μL的pGEM-T-Easy-654M质粒，用10ng/μL的野生型人基因组DNA稀释至1.0×103copies/μL，作为重复性参考品3。
在对照品配制间取100μL 1.0×106copies/μL的pGEM-T-Easy-28M质粒，用10ng/μL的野生型人基因组DNA稀释至1.0×103copies/μL，作为重复性参考品4。
4、试剂盒的使用方法
试剂准备(试剂准备区)
1)取出试剂盒中的反应缓冲液、酶混合液、β地贫扩增液、稀释缓冲液、TE缓冲液、石蜡油等室温放置，使其充分溶解，备用。
2)扩增液的配制：取出试剂盒中的扩增液稍微离心，每管扩增液加入12组0μL TE缓冲液进行配制，充分混合均匀，3000～5000g离心5s，备用。
3)酶反应混合液配制：按照标本数量，每0.5μL酶混合液+9.5μL稀释缓冲液进行配制，充分混合均匀，3000～5000g离心5s，移至标本处理区。
4)标本处理(标本处理区)
将地中海贫血核酸检测国家参考品(原液浓度为20ng/μl)稀释20倍后进行检测，即1ng/μl。
5)加样(标本处理区)
取反应缓冲液20μL加入PCR反应管中，分别取12管配制好的扩增液10μL加入相应的PCR反应管，再分别加入配置好的酶反应混合液10μL，将步骤2制备的基因组DNA和对照品各取10μL依次加入PCR反应管，振摇混匀，加入25μL石蜡油，置入荧光PCR扩增仪内。
5、上机检测(扩增检测区)
1)循环条件设置
38℃、5min；95℃、2min；95℃、15s，58℃、50s(30s后读荧光)，40个循环；38℃、30s。
2)全自动医用PCR分析系统(厦门安普利生物工程有限公司生产)检测通道选择
荧光素设定为FAM、ROX、HEX和CY5，荧光信号收集设在58℃、30s，具体设置方法请参考仪器使用说明书。
6、结果分析条件设定
使用仪器进行分析时，取3～12个循环的荧光信号作为基线，仪器自动分析出基线阈值，若少数样本扩增曲线噪音太大则应手动将阈值线调整至刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值＝0.0为准。阈值循环数则为荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
7、检验结果的判定
阴性对照反应孔的四个通道应无扩增曲线，阳性对照反应孔的ROX和CY5通道应均有扩增曲线且41-42M、654M、17M突变反应孔对应的FAM通道应有扩增曲线，否则该次实验视为无效。待测样本反应孔的FAM通道、ROX通道、HEX通道与CY5通道至少有一个荧光通道有扩增曲线，否则该次实验视为无效。
若待测样本β-地中海贫血检测反应孔的FAM通道或HEX通道无扩增曲线，结果则判断为无突变；
若待测样本β-地中海贫血检测反应孔的FAM通道或HEX通道有扩增曲线，且Ct值≤37，则进行判断ROX通道或CY5通道，如果有扩增曲线，且Ct值≤37，结果判断为对应突变类型的杂合突变；如果无扩增曲线，结果判断为对应突变类型的纯合突变。
若同时存在两种及以上突变类型，则判断为复合突变。
若待检样本Ct值范围在37＜Ct＜40，说明加入样本量太少，则需加大样本量或核酸量重检。
8、检测结果参见表4以及图1～图17。
1)检测正常人基因组DNA，结果均为野生型；
2)检测β-地中海贫血基因突变的参考品，结果均为相应基因型别。
3)重复性参考品变异系数(CV)均小于5％，满足实验设计要求。
表4检测结果
图1为检测正常人基因组DNA反应孔FAM和HEX实验结果图；由图1可以看出，1号、2号样本：突变型检测反应孔FAM和HEX通道均无扩增曲线。图2为检测正常人基因组DNA反应孔ROX实验结果图。图3为检测正常人基因组DNA反应孔CY5实验结果图；由图2和图3可以看出，野生型检测反应孔ROX和CY5通道均由扩增曲线，说明该两个样本为野生型，即为正常人基因组DNA。图4为3号样本实验结果图；由图4可以看出，26M突变型反应孔Ct＝20.48，3号样本检测结果为26M杂合突变。图5为4号样本实验结果图；由图5可以看出，-28M突变型反应孔Ct＝20.95，4号样本检测结果为-28M杂合突变。
图6为5号样本检测结果；由图6可知，IVS-1-1M(T)突变型反应孔Ct＝24.25，5号样本检测结果为IVS-1-1M(T)杂合突变。图7为6号样本检测结果；由图7可知，71-72M(A)突变型反应孔Ct＝28.77，6号样本检测结果为71-72M(A)杂合突变。图8为7号样本检测结果；由图8可知，17M突变型反应孔Ct＝30.78，7号样本检测结果为17M杂合突变。图9为8号样本检测结果；由图9可知，CAP40-43M突变型反应孔Ct＝22.33，8号样本检测结果为CAP40-43M杂合突变。图10为9号样本检测结果；由图10可知，43M突变型反应孔Ct＝23.25，9号样本检测结果为43M杂合突变。图11为10号样本检测结果；由图11可知，IntM突变型反应孔Ct＝23.50，10号样本检测结果为IntM杂合突变。图12为11号样本检测结果；由图12可知，41-42M突变型反应孔Ct＝22.64，11号样本检测结果为41-42M杂合突变。图13为12号样本检测结果；由图13可知，27-28M突变型反应孔Ct＝26.16，12号样本检测结果为27-28M杂合突变。图14为13号样本检测结果；由图14可知，-29M突变型反应孔Ct＝20.83，13号样本检测结果为-29M杂合突变。图15为14号样本检测结果；由图15可知，14-15M突变型反应孔Ct＝21.18，14号样本检测结果为14-15M杂合突变图16为15号样本检测结果；由图16可知，654M突变型反应孔Ct＝24.42，15号样本检测结果为654M杂合突变。图17为重复性参考品实验结果图；由图17可知，本发明的试剂具有很好的重复性。
由上述实施例可以看出，本发明选择多重实时荧光PCR技术，在单个反应管中通过多重检测，利用不同荧光通道对β-地中海贫血基因突变进行检测，实现高通量检测，过程方便简洁，全程无需打开扩增管盖，从根本上克服了PCR遗留污染。本发明的β-地中海贫血突变基因检测试剂盒(荧光PCR法)12管一人份，共12支扩增液，能检测出共12组24种突变类型，每个反应管检测两种突变型和两种野生型，分别通过四个不同的荧光通道读取信息。突变型情况由FAM、HEX指示，野生型情况由ROX、CY5指示，对β-地中海贫血基因突变进行特异性检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门安普利生物工程有限公司
南京安浦精准医学检验有限公司
<120> 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cagggtgagt ctatgg 16
Claims (3)
1.用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括引物和探针组合，所述引物和探针组合由第1组引物和探针组合、第3组引物和探针组合、第8组引物和探针组合、第10组引物和探针组合和第12组引物和探针组合中的一组或几组组成，每个组合中，引物和探针组合单独包装；
第1组引物和探针组合包括：41-42M上游引物、41-42M下游引物、41-42M探针、41-42W探针、IVS-Ⅱ-5M上游引物、IVS-Ⅱ-5M下游引物、IVS-Ⅱ-5M探针和IVS-Ⅱ-5W探针；所述41-42M上游引物、41-42M下游引物、41-42M探针和41-42W探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.4所示；所述IVS-Ⅱ-5M上游引物、IVS-Ⅱ-5M下游引物、IVS-Ⅱ-5M探针和IVS-Ⅱ-5W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.93~SEQ ID NO.96所示；
第3组引物和探针组合包括：26M上游引物、26M下游引物、26M探针、26W探针、30M上游引物、30M下游引物、30M探针和30W探针；所述26M上游引物、26M下游引物、26M探针和26W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25~SEQ ID NO.28所示；所述30M上游引物、30M下游引物、30M探针和30W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85~SEQ ID NO.88所示；
第8组引物和探针组合包括：14-15M上游引物、14-15M下游引物、14-15M探针、14-15W探针、41M上游引物、41M下游引物、41M探针和41W探针；所述14-15M上游引物、14-15M下游引物、14-15M探针、14-15W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.53~SEQ ID NO.56所示；所述41M上游引物、41M下游引物、41M探针和41W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.89~SEQ IDNO.92所示；
第10组引物和探针组合包括：-31M上游引物、-31M下游引物、-31M探针、-31W探针、CAP40-43M上游引物、CAP40-43M下游引物、CAP40-43M探针和CAP40-43W探针；所述-31M上游引物、-31M下游引物、-31M探针和-31W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.77~SEQ IDNO.80所示；所述CAP40-43M上游引物、CAP40-43M下游引物、CAP40-43M探针和CAP40-43W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.81~SEQ ID NO.84所示；
第12组引物和探针组合包括：CAP-1M上游引物、CAP-1M下游引物、CAP-1M探针、CAP-1W探针、-30M上游引物、-30M下游引物、-30M探针和-30W探针；所述CAP-1M上游引物、CAP-1M下游引物、CAP-1M探针和CAP-1W探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.57~SEQ ID NO.60所示；所述-30M上游引物、-30M下游引物、-30M探针和-30W探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.49~SEQ ID NO.52所示；
所述41-42M探针、26M探针、14-15M探针、CAP-1M探针、IVS-1-5M探针和-31M探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述-30M探针、CAP40-43M探针、30M探针、41M探针和IVS-Ⅱ-5M探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述41-42W探针、26W探针、14-15W探针、CAP-1W探针、IVS-1-5W探针和-31W探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述-30W探针、CAP40-43W探针、30W探针、41W探针和IVS-Ⅱ-5W探针的5’端分别标记有荧光报告基团CY5，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述第1组引物和探针组合、第3组引物和探针组合、第8组引物和探针组合、第10组引物和探针组合和第12组引物和探针组合还分别和TE缓冲液混合，对应得到第1扩增液、第3扩增液、第8扩增液、第10扩增液和第12扩增液；
第1扩增液:50μM的41-42M上游引物6μL，50μM的IVS-Ⅱ-5M上游引物6μL，50μM的41-42M下游引物6μL，50μM的IVS-Ⅱ-5M下游引物6μL，50μM的41-42M探针0.9μL，50μM的41-42W探针0.9μL，50μM的IVS-Ⅱ-5M探针0.9μL，50μM的IVS-Ⅱ-5W探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第3扩增液:50μM的26M上游引物6μL，50μM的30M上游引物6μL，50μM的26M下游引物6μL，50μM的30M下游引物6μL，50μM的26M探针0.9μL，50μM的26W探针0.9μL，50μM的30M探针0.9μL，50μM的30W探针0.9μL，TE缓冲液2.4μL；
第8扩增液:50μM的14-15M上游引物6μL，50μM的41M上游引物6μL，50μM的14-15M下游引物6μL，50μM的41M下游引物6μL，50μM的14-15M探针0.9μL，50μM的14-15W探针0.9μL，50μM的41M探针0.9μL，50μM的41W探针0.36μL，TE缓冲液2.94μL；
第10扩增液:50μM的-31M上游引物6μL，50μM的CAP40-43M上游引物6μL，50μM的-31M下游引物6μL，50μM的CAP40-43M下游引物6μL，50μM的-31M探针0.9μL，50μM的-31W探针0.9μL，50μM的CAP40-43M探针0.9μL，50μM的CAP40-43W探针0.78μL，TE缓冲液2.52μL；
第12扩增液:50μM的CAP-1M上游引物6μL，50μM的-30M上游引物6μL，50μM的CAP-1M下游引物6μL，50μM的-30M下游引物6μL，50μM的CAP-1M探针0.9μL，50μM的CAP-1W探针0.9μL，50μM的-30M探针0.9μL，50μM的-30W探针0.78μL，TE缓冲液2.57μL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油；
所述反应缓冲液包括以下组分：HEPES 50mM、（NH4）2SO4 25mM、KCl 125mM、MgCl2 7.5mM、体积百分含量为2.50%的甲酰胺、dNTPs 0.3mM和dUTP 0.6mM；
所述酶混合液包括以下组分：Taq DNA聚合酶4.0U/μL、尿嘧啶糖基化酶0.004U/μL和酶储存液；所述酶储存液包括以下浓度的组分：50mM、pH 8.0的Tris-HCl，100mM NaCl，0.1 mMEDTA•2Na，体积百分含量为1%的Triton X-100，体积百分含量为50%的甘油；
所述稀释缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1mM，三羟甲基氨基甲烷9mM；
所述TE缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.6mM、三羟甲基氨基甲烷4.4mM和乙二胺四乙酸二钠盐1mM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品包括生理盐水；所述阳性对照品包括插入有β-地中海贫血突变基因的重组质粒。
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