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CN118064493B - 一种表达重组红藻凝集素的植物表达载体、水稻及应用 - Google Patents

一种表达重组红藻凝集素的植物表达载体、水稻及应用 Download PDF

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CN118064493B CN202410291301.8A CN202410291301A CN118064493B CN 118064493 B CN118064493 B CN 118064493B CN 202410291301 A CN202410291301 A CN 202410291301A CN 118064493 B CN118064493 B CN 118064493B
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Abstract

本发明公开了一种在基因工程水稻中表达重组红藻凝集素的方法,包括植物表达载体构建、重组红藻凝集素的提取及检测方案。所述载体含有经水稻密码子优化的红藻凝集素基因,及上游经水稻密码子优化的信号肽序列。红藻凝集素基因包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3的DNA分子,或可以与SEQ ID NO.1序列进行杂交且编码红藻凝集素的DNA分子。本发明构建了在水稻胚乳细胞中表达的重组红藻凝集素表达载体,在水稻中成功地表达了重组红藻凝集素,建立了系统鉴定重组蛋白表达分布情况及一步法提取该红藻凝集素的方法。本发明的方法安全性高,容易规模化,成本极低,所获得的重组红藻凝集素具有显著的抗病毒活性,可在多个领域应用。

Description

一种表达重组红藻凝集素的植物表达载体、水稻及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种利用基因工程水稻表达重组红藻凝集素的植物表达载体、水稻及应用。
背景技术
红藻凝集素蛋白(GRFT)是从红藻(Griffithsia sp.)中分离的一种大小为12.7千道尔顿的凝集素,可以通过选择性结合病毒包膜糖蛋白上富含甘露糖的糖基来抑制多种病毒的传播,起到病毒病防治的作用。现有研究表明,GRFT对人类免疫缺陷病毒(HIV-1),严重急性呼吸综合症相关的冠状病毒(SARS-CoV)和其他冠状病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、日本乙脑病毒(JEV)和单纯疱疹病毒(HSV)等多种病毒表现出广谱抗病毒活性。因此,GRFT可以阻断多种病毒的初始感染和细胞间传播过程,并且具有可溶性高、免疫原性低、不引起血细胞凝集等优点,可以作为一类新型的抗病毒药物,具有广阔的市场前景。
由于天然藻类中GRFT含量较低,无法实现规模化生产,因此必须通过异源表达的方式才能满足其在人及动物病毒病防治中应用需求。在大肠杆菌中,重组GRFT的产量为每升培养基819毫克,但其中33%的蛋白质沉积为包涵体,错误折叠造成其生物活性较低。在本氏烟(N.benthamiana)中虽然可以瞬时表达GRFT,表达量可达到鲜重的千分之一,但在烟草叶片中表达的外源蛋白质稳定性较差,其中含有大量的次生代谢产物和侵染时使用的农杆菌中的内毒素,增加了其纯化成本和使用风险。
相比之下,水稻胚乳表达系统具有表达量大、活性高、稳定性高、成本低、无内毒素及次生代谢物等优点,已经成功用于药用蛋白、疫苗、维生素以及类黄酮和类胡萝卜素等物质的异源表达。国内科研和生产单位中,至今未见有关使用水稻胚乳来大规模生产重组GRFT的报道,主要涉及其表达元件选择,表达载体构建,遗传转化及表达产物的纯化及检测等多个环节。
发明内容
针对上述存在的问题,本发明旨在提供一种高效表达重组红藻凝集素的转基因载体及工程水稻,可以为规模化的利用水稻胚乳生物反应器来生产红藻凝集素提供生产原料。
为了实现转基因载体构建、遗传转化、转基因材料鉴定、表达产物提取及抗病毒活性检测等目的,本发明所采用的技术方案如下:
一种表达重组红藻凝集素(OsGRFT)的植物表达载体的构建,其特征在于:所述载体含有经水稻密码子优化的红藻凝集素基因,包含上游经水稻密码子优化的信号肽序列。
进一步的,所述红藻凝集素基因包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3序列,及可与该所述序列进行杂交且编码红藻凝集素的DNA分子。
进一步的,使用水稻胚乳特异性启动子SEQ ID NO.4序列,驱动所述红藻凝集素基因。
一种以基因工程方式在水稻胚乳中表达制备重组红藻凝集素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、构建在水稻种子中表达重组红藻凝集素的植物表达载体;
S2、将所述载体遗传转化并栽培获得水稻种子;
S3、鉴定所述水稻种子中重组蛋白表达量及存在部位;
S4、将制备的所述水稻种子晒干脱壳并粉碎,得粉碎物;
S5、将粉碎物利用缓冲液提取,后通过亲和纯化得到粗提物。
一种上述制备的水稻种子中红藻凝集素的抗病毒检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S6、将得到的粗提物进行抗BVDV病毒活性检测。
进一步的,在步骤S5中,缓冲液包含50mM NaH2PO4、300mM NaCl、5mM imidazole,pH8。
一种含有上述红藻凝集素的载体及水稻种子在抗病毒中的应用。
本发明的有益效果是:本发明构建了在水稻胚乳细胞中表达重组红藻凝集素的表达载体,在水稻中成功地表达了重组红藻凝集素,建立了系统鉴定重组蛋白表达分布情况及一步法提取该红藻凝集素的方法。本发明的安全性高,容易规模化,成本极低,所获得的重组红藻凝集素具有显著的抗病毒活性,可在多个领域应用。
附图说明
图1为pLF1载体结构示意图。
图2为pOsGRFT载体结构示意图。
图3为表达了OsGRFT-His的基因工程水稻T0代植株的PCR检测。图中,M为DNA标准分子量Marker,T0-1—T0-63为63个独立的T0代植株,其中2、5、6、8、11、14、15、16、18、19、20、22、23、24、27、30、32、35、36、37、38、39、40、43、45、47、48、49、51、52、54、55、56、60及63号植株为携带OsGRFT片段的转基因阳性植株。
图4为表达了OsGRFT-His的基因工程水稻胚乳中OsGRFT-His的免疫荧光检测。图中,左边为转基因产生的阴性植株,作为阴性对照。如图所示该重组蛋白在胚乳糊粉层、亚糊粉层及外层胚乳细胞中高表达。
图5为表达了OsGRFT-His的基因工程水稻胚乳中OsGRFT-His的免疫胶体金检测。如图所示该重组蛋白在形状不规则的二型蛋白体中高表达,金颗粒直径为10nm。
图6为一步法亲和纯化得到的蛋白提取物中OsGRFT-His重组蛋白的Western Blot检测结果。图中,M为预染蛋白标准品(Thermo Fisher,LC5925),其中8#、16#、36#和51#为转基因阳性单株,7#为转基因阴性单株(作为阴性对照),重组蛋白理论大小为13.6kDa。
图7为一步法亲和纯化的OsGRFT-His蛋白对BVDV的抗病毒作用检测(MDBK细胞中,免疫荧光法检测BVDV)。图中,A为只接种BVDV的MDBK细胞,作为空白对照;B为接种了BVDV+0.02ug/mL常规水稻提取物,作为阴性对照;C为接种了BVDV+0.02ug/mL重组OsGRFT-His提取物;D为接种了BVDV+0.005ug/mL重组OsGRFT-His提取物。结果显示重组OsGRFT-His具有显著的抗病毒活性,而常规水稻提取液不具备抗病毒活性。
图8为一步法亲和纯化的OsGRFT-His对BVDV感染载量的影响(RT-qPCR法检测MDBK细胞中BVDV RNA相对含量)。图中,“Mock”为只接种BVDV毒株的MDBK,作为空白对照;“Control”为接种BVDV+0.02ug/mL常规水稻提取物,作为阴性对照;“0.02ug”为接种了BVDV+0.02ug/mL重组OsGRFT-His提取物;“0.005ug”为接种了BVDV+0.005ug/mL重组OsGRFT-His提取物。每实验组设3个生物学重复及3次技术重复,P<0.05。结果显示重组OsGRFT-His具有显著的抗病毒活性,而常规水稻提取液不具备抗病毒活性。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员能更好的理解本发明的技术方案,下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明提供一种表达重组红藻凝集素的植物表达载体,所述载体含有经水稻密码子优化的红藻凝集素基因,及上游经水稻密码子优化的信号肽序列。其中,经优化的所述红藻凝集素基因包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3的DNA分子,或可以与SEQ ID NO.1序列可进行杂交且编码红藻凝集素的DNA分子。所述红藻凝集素基因使用水稻胚乳特异性启动子pGluC(SEQ ID NO.4)序列进行驱动,以确保高表达水平。
本发明还提供一种基因工程水稻,其包含上述DNA片段及载体,可利用酶联免疫法鉴定上述重组红藻凝集素基因工程水稻种子重组红藻凝集素的含量,并在高表达株系中利用半薄切片-免疫荧光及超薄切片-免疫胶体金法分别在光镜及电镜水平下检测重组蛋白在胚乳细胞中的分布及特异性存储情况。
本发明还提供一种以基因工程方式在水稻胚乳中表达制备重组红藻凝集素的方法,包括以下步骤:
S1、构建在水稻种子中表达重组红藻凝集素的植物表达载体
所述载体含有经水稻密码子优化的红藻凝集素基因,及上游经水稻密码子优化的信号肽序列;
S2、将所述载体遗传转化并栽培获得水稻种子
用步骤S1所述的表达载体遗传转化水稻,获得基因工程水稻,栽培后获得含有重组红藻凝集素基因工程水稻种子;
S3、鉴定所述水稻种子中重组蛋白表达量及存在部位
用步骤S2所述的重组红藻凝集素基因工程水稻种子鉴定其中重组红藻凝集素蛋白的表达量,并利用免疫荧光和免疫胶体金法确认重组红藻凝集素在胚乳细胞中的存在部位;
S4、将制备的所述水稻种子晒干脱壳并粉碎,得粉碎物;
S5、将粉碎物利用缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,5mM imidazole,pH8)提取,后通过一步亲和纯化法提取得到粗提物。
本发明还提供一种上述制备的水稻种子中红藻凝集素的抗病毒检测方法,包括以下步骤:
S6、将S5得到的粗提物进行抗病毒活性检测,粗提物抗病毒活性可以但不限于使用BVDV侵染MDBK细胞的方法检测。
本发明还提供一种含有上述的红藻凝集素的载体及水稻种子在抗病毒活性检测中的应用。
【实施例1】胚乳特异高表达重组红藻凝集素双元载体的构建
1、重组红藻凝集素密码子优化序列的获得
依据公布红藻凝集素(Griffithsin[Aspergillus lentulus])基因序列(GeneID:54321200),根据水稻中密码子偏好性进行优化,进而委托金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成,其DNA序列具体如SEQ ID NO.1所示。
2、重组红藻凝集素基因双元表达载体的构建
利用PCR在上述序列SEQ ID NO.1的上游引入根据水稻进行密码子优化的信号肽序列序列,其DNA序列具体如SEQ ID NO.2所示,其编码产物为Sporamin A precurs or[Ipomoea batatas](GenBank:AAA33391.1)的1-35位氨基酸,并在下游引入组氨酸(His)亲和标签序列,得到用于在水稻中表达的重组红藻凝集素序列SEQ ID NO.3。本实施例选用水稻特异性pGluC启动子来驱动重组红藻凝集素基因在水稻胚乳细胞中表达,先将pGluC启动子(SEQ ID NO.4)克隆到双元表达载体pLF1(图1)的Xba I和SalI之间,再将上述重组红藻凝集素序列(SEQ ID NO.3)克隆到SmaI和SacI之间,将构建的双元载体命名为pOsGRFT(图2)。
3、用于创制表达重组红藻凝集素基因工程水稻农杆菌的转染
利用冻融法,将pOsGRFT质粒转化到根癌农杆菌EHA105(美国Invitrogen公司)中,经测序检测后,将甘油菌于-70℃冰箱冻存。
【实施例2】胚乳特异高表达重组红藻凝集素基因工程水稻的制备
1、基因工程水稻遗传转化
(1)种子消毒:取水稻成熟种子,人工或脱壳,挑选饱满光洁无菌斑的种子,按以下步骤消毒:将种子放入100mL无菌烧杯中,倒入70%酒精消毒1min;倒去酒精,加入100mL30%次氯酸钠(NaClO)溶液,浸泡30min;倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸馏水清洗种子4-5次,最后一次浸泡30min。消毒期间要经常摇动,使种子充分得到消毒。
(2)诱导与继代培养:(以下步骤需无菌操作)种子放在无菌滤纸上吸干,放置在诱导培养基中,每皿12-14颗;操作完毕用封口膜封好培养皿,在30℃光照培养箱培养4周;在超净工作台中打开培养皿,用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织(淡黄色,致密呈球状,有一定的硬度),在30℃光照培养箱,继代培养1周,暗培养一周。
(3)共培养:取培养好的pOsGRFT菌液1mL于1.5mL离心管中,4℃,5000rmp,离心1min,去上清。用含200μmol/L As的30mL AAM重悬农杆菌;将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出,放入农杆菌悬浮液侵染5min;将愈伤组织取出,置于无菌的滤纸上沥干30-40min;将愈伤组织置于共培养基上,共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸,28℃暗培养3天。
(4)愈伤组织的抗生素筛选:将愈伤组织取出,用无菌水清洗6次,其间需不停的振荡,再用含500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水浸泡30min-1h,最后置于无菌滤纸上沥干2h。
将沥干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮筛选,光照培养箱(30℃,24h光照)中培养14天。
将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素(Car)和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮筛选,30℃,光照培养10天,然后转移到组培室中培养4天。
将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素(Car)和80mg/L潮霉素的培养基上进行第三轮筛选。光照培养箱(30℃,24h光照)中培养7天。
(5)抗性愈伤组织的诱导分化和生根
挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中,用封口膜封好,放入恒温培养室中,等待分化成苗(30-60天)。苗长至7-8厘米时,把分化期间生长的根和愈伤用剪刀剪掉放入生根培养基中壮苗一到两周。
(6)转基因苗的锻炼和移栽
将根部和茎叶分化得较完好的苗从分化瓶中挑出(苗长至试管顶部,就要及时开盖),打开封口膜,加入适量无菌水(防止培养基长菌),炼苗3天,然后洗去琼脂,放到自来水中锻炼三天,同时进行潮霉素筛选,阳性苗单独分棵,并做好标记移栽到温室的土钵中生长。
2、基因工程水稻的分子鉴定
(1)水稻基因组DNA提取
取T0代潮霉素阳性再生苗的叶片约2cm,分别放入离心管中,编号;加入600μLCTAB提取缓冲液(2%CTAB,1.38M NaCl,0.1M Tris-HCl,20mM EDTA,pH8.0),加入氧化锆颗粒后置于匀浆机中粉碎,65℃保温15min,期间不时震荡;加入等体积的氯仿/异丙醇,轻缓颠倒离心管混匀,室温下,12000rpm离心10min;将上清液转入另一新的1.5mL离心管中,加入等体积的预冷乙醇,缓慢颠倒离心管混匀,室温下放置20min;12000rpm离心10min,去上清,70%乙醇漂洗,沉淀风干;风干后的DNA加入80μL的TE缓冲液溶解DNA,-20℃保存备用。
(2)目的基因PCR扩增检测
取1μL水稻基因组DNA作为模板,利用重组红藻凝集素正向引物G-F(SED ID NO.5)和反向引物G-R(SED ID NO.6))进行PCR扩增,产物理论大小为475bp。PCR扩增反应体系(25μL):2.5μL 10×Buffer,0.15μL rTaq酶5U/μL),4μL dNT P(2.5mM),引物各0.5μL,加ddH2O至25μL。PCR扩增条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,35个循环,最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,200mA电泳15min,Gel-Red染色,凝胶成像仪中观察结果。
鉴定结果表明,通过根癌农杆菌介导转化获得35株阳性的重组红藻凝集素转基因水稻,部分基因工程水稻目的基因PCR鉴定结果如图3所示。
【实施例3】基因工程水稻中重组红藻凝集素蛋白产物的鉴定
1、重组红藻凝集素蛋白产物表达量的鉴定
将上述获得的重组红藻凝集素阳性苗移栽到生长室中生长至成熟,收取能够正常结实的单株的种子。采用His标签ELISA检测试剂盒(His Tag ELISA Detection Kit,L00436,GenScript)进行重组蛋白的定量检测。向His标签板的每个孔中加入50μL的His标签标准品及按照实施案例4所述方法提取的水稻籽粒粗蛋白,向所有孔中加入50μL的Anti-His单克隆抗体,室温(20-25℃)孵育30min。
用1倍洗涤溶液洗板四次,每次加入260μL。向所有孔中加入100μL的抗体示踪剂,在室温孵育30min,用1倍洗涤溶液洗板四次,每次加入260μL。向所有孔中加入100μL的TMB底物,在室温孵育10-15min,向所有孔中加入50μL的停止溶液以停止酶反应,在450nm处使用微孔板读取器读取吸光度。以吸光度为纵轴,以His标签标准品浓度为横轴,绘制标准曲线,将样品OD值带入标准曲线计算得到样品中His标签重组蛋白含量。
测定结果显示,所有经PCR鉴定阳性的重组红藻凝集素阳性转基因水稻单株均成功表达了红藻凝集素蛋白,其种子中重组红藻凝集素表达量从189.6μg/g到332.6μg/g不等。
2、重组红藻凝集素蛋白产物在胚乳中分布的检测
(1)半薄切片及免疫荧光标记重组红藻凝集素
水稻胚乳放入固定液中4℃过夜,用磷酸缓冲液漂洗3次,依次用30%、50%、70%乙醇溶液脱水(各2h),而后用70%乙醇:LR White(2:1)及70%乙醇:LR White(1:2)各置换6h,在4℃下用100%LR White树酯置换过夜后,在-20℃紫外照射聚合4d,用Leica UC7切片机切片(厚度1μm),用捞片圈将切片转移至新载玻片上,40℃烤片30min。
用移液枪滴加少量TBST湿润切片10min,再滴加封闭液(3%BSA的TBST)封闭1h,除去封闭液,滴加用1%BSA的TBST稀释的His荧光抗体(abcam,ab3554)(1:100),放入37℃恒温培养箱中孵育2h,在摇床上用TBST洗6次,每次5min,Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜观察并拍摄照片(图4)。
(2)透射电镜观察及免疫胶体金标记重组红藻凝集素
水稻胚乳放入固定液中4℃过夜,用磷酸缓冲液漂洗3次,依次用50%,70%,80%,90%丙酮梯度脱水(各2h),分别用树脂:丙酮(3:1),树脂:丙酮(1:1),树脂:丙酮(1:3)进行替换,用100%Epon812树脂处理样品10h以上,37℃下聚合24h,45℃聚合24h,60℃聚合72h,用超薄切片机切成70nm的切片,将切片捞至载网上。
先用含1%BSA的PBS封闭镍网1h,后滴加30μL用含1%BSA的PBS稀释的His抗体(abcam,ab18184)(1:100)至石蜡封口膜上孵育镍网切片2h,用含1%BSA的PBS清洗3次,滴加30μL含1%BSA的PBS稀释的金标二抗(1:100)至石蜡封口膜上孵育镍网切片1h,用含1%BSA的PBS清洗3次,用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行染色,使用日立H7650透射电镜观察并拍照(图5)。
【实施例4】从基因工程水稻中提取重组红藻凝集素粗产物
将成熟的稻米种子磨成细粉,并在4℃条件下在五倍体积的溶解缓冲液(50mMNaH2PO4,300mM NaCl,5mM imidazole,pH 8)的中浸提过夜。在4℃下以8000g的速度离心两次,每次离心30min,去除不溶性杂质。
每个样品以2mL/min的流速加载到亲和层析柱上(填料为ProfinityTMIMAC Resin,Ni-charged,10ml#1560131Bio-Rad)。柱子用洗涤缓冲液洗涤(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,10mM imidazole,pH 8),然后用洗脱缓冲洗脱(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mMimidazole,pH 8)以获得重组白质。
洗脱所得蛋白使用Bio-Rad公司的小型电泳槽进行SDS-PAGE凝胶电泳,凝胶浓度15%,电泳结束后利用Bio-Rad公司的转膜设备转膜,转膜结束后,将PVDF膜用PBS漂洗后放入封闭液(PBS溶解的5%脱脂奶粉)中,在摇床上封闭1h,用PBST漂洗PVDF膜,然后将PVDF膜放入用封闭液稀释的一抗(abcam,ab18184)溶液中,在摇床上孵育2h,后用PBST漂洗PVDF膜3次,每次5min,将PVDF膜放入用封闭液稀释的HRP标记的二抗溶液中,在摇床上孵育1h,后用PBST漂洗PVDF膜6次,使用ECL化学发光试剂盒(Tanon公司)检测粗提物中的重组红藻凝集素蛋白(图6)。
【实施例5】水稻重组红藻凝集素粗产物抗病毒活性验证
1、MDBK细胞和BVDV的培养
MDBK细胞传代:将细胞轮廓清晰,状态良好,融合度约90%的MDBK细胞进行传代。将PBS和8%FBS DMEM培养基提前预热。在生物安全柜中,弃去培养瓶中的培养基,加入5mLPBS轻轻润洗瓶壁,重复3次。倒出PBS,加入1mL胰酶消化液,37℃孵育约30s左右,在倒置显微镜下观察细胞边缘皱缩,变圆,此时将胰酶倒掉加入5mL 8%FBSDMEM培养基终止消化,用吸管轻轻吹打,使细胞完全分散,混匀后分装于细胞培养瓶中,于37℃5%CO2培养箱中培养,约48h后,细胞可再次进行传代。
BVDV的增殖:将BVDV病毒液分别接种在融合度为80%的单层MDBK中,感染1h后,加入含有3.5%的马血清DMEM培养基,继续培养72h后收获病毒。将培养物反复冻融3次,4℃4000rpm离心15min收集上清液,分装后-80℃保存备用。
2、细胞感染与样品收集
使用感染复数为1MOI的BVDV病毒液感染MDBK细胞,具体操作如下:
(1)取对数生长期的MDBK细胞置于6孔板内,每孔加入1×106个细胞,置于37℃5%CO2培养箱中培养;
(2)当细胞融合度为70%左右时,弃掉旧培养基,以1MOI的BVDV病毒液分别接种MDBK细胞,共设置四个实验组,依次为:第一组,BVDV;第二组,BVDV+0.02ug/mL常规水稻提取物;第三组,BVDV+0.02ug/mL重组红藻凝集素粗提物;第四组,BVDV+0.005ug/mL重组红藻凝集素粗提物。将孔板放置在37℃5%CO2培养箱,在病毒感染36h后收集细胞样品用于病毒检测。
3、间接免疫荧光试验(IFA)检测BVDV
用预冷(4℃)的4%多聚甲醛固定细胞15min后弃掉固定液,用灭菌PBS洗涤3次。加入0.5%Triton X-100/PBS透化细胞8min,PBS洗涤3次。加入5%脱脂奶粉37℃封闭1h,弃去封闭液,PBS洗涤3次后加入牛病毒性腹泻黏膜病阳性血清,37℃孵育1h。PBS洗涤3次,加入Goat Anti-BovineIgG(H+L)-FITC 37℃孵育1h,PBS洗涤3次,置于倒置荧光显微镜下观察(图7)。
4、RT-qPCR试验检测BVDV
用TRIzon Reagent提取细胞内总RNA,并反转形成cDNA。以cDNA作为模板,按照以下体系进行qPCR:TB Green Premix Ex Taq II(Tl i RNaseH Plus)(2×),12.5uL;前引物、后引物各1uL;cDNA,1uL;RNase Free dH2O,9.5uL。
根据Genbank中的BVDV 5'-UTR序列,用Primer Premier 5.0设计扩增BVDV 5'-UTR的特异性引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。病毒引物为5'UTR-F(SEQ IDNO.7),5'UTR-R(SEQ ID NO.8)。内参引物为GAPDH-F(SEQ ID NO.9),GAPDH-R(SEQ IDNO.10)反应程序如下:95℃30s;95℃5s,58℃30s,反应进行40个循环。(图8)
本申请涉及序列如下:
SEQ ID NO.1
ATGTCCTTGACCCACAGAAAATTCGGAGGCTCTGGGGGTTCCCCTTTCTCTGGGCTCTCTTCCATTGCTGTTAGGTCCGGTAGCTACCTTGATGCCATTATCATTGATGGAGTGCATCACGGAGGCAGCGGGGGTAACTTGTCTCCCACATTCACTTTTGGATCCGGCGAATATATCAGCAATATGACCATTAGAAGCGGCGATTACATCGATAACATTTCTTTCGAGACAAATATGGGAAGAAGGTTTGGCCCTTATGGAGGCTCTGGGGGTTCTGCAAACACATTGTCTAACGTTAAGGTTATTCAAATTAACGGGTCTGCTGGAGATTACCTCGATTCCCTTGATATCTATTACGAGCAGTATTGA
SEQ ID NO.2
ATGAAGGCTTTCACTCTTGCCTTGTTTCTCGCACTTTCCTTGTATTTGCTCCCTAACCCAGCCCATAGCAGATTCAATCCCATCAGGCTTCCTACTACCCATGAA
SEQ ID NO.3
ATGAAGGCTTTCACTCTTGCCTTGTTTCTCGCACTTTCCTTGTATTTGCTCCCTAACCCAGCCCATAGCAGATTCAATCCCATCAGGCTTCCTACTACCCATGAATCCTTGACCCACAGAAAATTCGGAGGCTCTGGGGGTTCCCCTTTCTCTGGGCTCTCTTCCATTGCTGTTAGGTCCGGTAGCTACCTTGATGCCATTATCATTGATGGAGTGCATCACGGAGGCAGCGGGGGTAACTTGTCTCCCACATTCACTTTTGGATCCGGCGAATATATCAGCAATATGACCATTAGAAGCGGCGATTACATCGATAACATTTCTTTCGAGACAAATATGGGAAGAAGGTTTGGCCCTTATGGAGGCTCTGGGGGTTCTGCAAACACATTGTCTAACGTTAAGGTTATTCAAATTAACGGGTCTGCTGGAGATTACCTCGATTCCCTTGATATCTATTACGAGCAGTATCATCACCATCACCATCACTGA
SEQ ID NO.4
GTTCAAGATTTATTTTTGGTATTTAATTTACTTGCTTAAGTCAGATATATTCCCATCGTTGCAGGTTTGTCACTTAGTATTATTATTAAGCGCTCTAGCACTAGGACTCTGGATAAATAAGAAAGTTTATTCACGAGGCTAGAGTAGTAATCAATAACATAAGCGTGGTGTCTAGGTCAGCGGTTATCTTCATATGTAGTGTGCTCCATGGAAAGTGAGGTAGGAGGAAGGTGGTGACAGTCCCGTCCGTCCTTTGTATCCCTCCATGTTCGGGTATATCATAGAGCTACAGGCTAGACTTAGCTTGGCAGACTAGGGGAGAGCCGGTGCTCGAAGCAATCCATGAGGCTTTACATTTAACATAAGTTAGTAAATTAACCCATAGGAATCATCTCTAGACTGAACCTACCAGTAGTTGTGCTTGGATATAATTATATTCCTACATATACATACACGTTCCCTGCGATTAGATACCCTTGGAATACTCTAAGGTGAAGTGCTACAGCGGTATCCGTGCGCTTGCGGATTTATCTGTGACCGTATCAAATACCAACAGGTAGATACAAGGAATCATCTCTCCTATCCATTGGTTTATCATCTTTTAAAATTATCTCTTGCTCTCCTATTGCCTCTGCAACTGCGGATAGGTGTTTCTCAACAATGAAGGTTGTGAAGAATGCTTTGTGCAACAAGATGGATGACAAGTATCTCAGCCATAGCCTCATTTGCTTTGTAGAAAAGGATATGTCGGACACAATCACTAAGTATCACCGTGGAAAGGATGCACTGTATGCCCTATCTATATTTACCATTTAGTAATATTTATATGGCTTGTGCTAACTTTATGTTGTCTTTACAGGCAATAACATTATTTGGAAGGCATATCTATATATTACTATTTAAGATAATGTAATATCTCAAAGTTTTTATAAGCTGCAATGAGGTGAGTTTCACTTAGCTTTCTAACTTGTTATGAGTTATAGATGCATGCCACCAGTCATTTTTTATCTTGCATCAGCCCCTGCCTGTTAGAATATGTTTCTTTGTCTGGGAGTCCATGTCAACTAGCCAATTTCCAAATATATGAACAAAACTATGTGGCCTTTGTAACCCAAATGAGATAAAGACTACTCTCCATAGAAATTTAGCAAACATGGCACTCAAAGAAAATGTGTTGGATAGTTTCATCATGCATACAAAAGCAACACTTTTGAACTACCATTCCAAATCCTTTTTGTAAATTATCTTTGCTTAACACTACCCCTTTGAGCAAATGTGGCTTTGTGCGGAAAAAACTCAAACTTGGTAGGGTAGACATCCATTTATATAATTGGATCCATGTACATAAGTTGTTGAGTACTTCAAGTACTTACCCTTGTGATATACATCTCAAATATATTGAAGAAGAGAAGTTCTTTTTTTGAGAGAGGTTGAAGAAGAGAAGTTTGTCCATAGCTGAAGAGGAGTTTTATAGTGTCTAGCTTACCTTGCTGCTGATTGCATGTCTAAAATGTCGTTTAATTTGGGCTATAATGAAATATTCACCAATATTTCTGCTGGTCTATTAAAGTTTAATAGTTACTCGTAACTCATTTATTTTGGGCTATAATTTAATATTCACCTATGTTTTTGTTAGTCTATTTTATTTCCCTAGTGTGCACTAGCTTAACCCCAAATTAGTTTTGAACACTTAACCTAAATGTGTCTATTATGGTCAGACACTCTCTCACGGCACTCTAACAAAAAGTGAATTTTGTTGTTATGTTTTTGTCATGATCTCACAAGCAATGTACATGTACGTTTCTAGAGTGCAATCTTATGCTAGCCTGATTGTGAATTTAGTGTAGTTTGTTTTCTCTTTTTGTAGCTACACTACCAATAACCTATTGTCCTCTAGTCATACCACGTAATCACAAGGCAAATCCCTAACTCTCACCTTTAAAAGCATGTCTTTATTTTCTTGGGTGGCACTAATACAAAATCTTTTTCAGCATTCCTATGTGCGATAGCAAGAAAACATGGCATAACTCTTGCTTCACTCTAACAAAAAAAACACTTTTCCAACTTTAAAACAATGGTATCTATGTGTTTAATGATCAATCAAGCATATAATGACTTACAAGTTTTTACCTATGCCCTTTTTGCATCATCTTGTTTGCAACAGACAAACTAGATATTCCTTTAGGCTATAAACACATCAGCATGATAAAGAGAT TAGGTAAGTTTGTTATCCCTTTTTGCATATATTCTCGTCTACTCCGTGTATATAAGCCCCTCTCCTCCAACTCGTCCATCCATCACCAAGAGCAGTGGGAAACTAAGTGAATAACT
SEQ ID NO.5
CACTCTTGCCTTGTTTCTCG
SEQ ID NO.6
GTGATGGTGATGGTGATGAT
SEQ ID NO.7
GTAGTCGTCAGTGGTTCGAC
SEQ ID NO.8
TCAACTCCATGTGCCATGTAC
SEQ ID NO.9
TTCAACGGCACAGTCAAGGCA
SEQ ID NO.10
CCACCACATACTCAGCACCAGC
本发明的原理是:本发明利用水稻胚乳细胞,成功高效表达了重组OsGRFT蛋白,系统检测表明其具有表达量高、易纯化、生物活性高等优点,是一种绿色、安全、容易规模化的红藻凝集素表达生产方案。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (2)

1.一种水稻胚乳特异高表达重组红藻凝集素的双元表达载体,其特征在于:所述载体含有经水稻密码子优化的重组红藻凝集素基因和用于驱动所述重组红藻凝集素基因的启动子,所述重组红藻凝集素基因序列如SEQ ID NO.3所示,所述启动子序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种如权利要求1所述的水稻胚乳特异高表达重组红藻凝集素的双元表达载体在抗病毒中的应用,其特征在于:所述病毒为BVDV病毒。
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