CN118064453B - GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用，所述GhTLP8基因在NCBI中基因序列号分别为XM_016842862.2。本发明通过基因沉默方式获得GhTLP8沉默的植株，结果表明基因沉默植株在高盐胁迫下叶片萎蔫严重，黄化现象严重，表明其对高盐处理更为敏感。接着构建GhTLP8过表达载体p35S‑GhTLP8‑GFP，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥（Clo‑0，WT），获得过表达植株，分析结果表明在高盐胁迫下，相对于野生型，GhTLP8能够提高种子萌发率，增强拟南芥幼苗盐胁迫耐受性，从而为作物耐盐分子育种提供了基因资源。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用。
背景技术
陆生植物时常遭受着不同环境的胁迫，其中包括非生物胁迫和生物胁迫。非生物胁迫主要包括干旱、土壤盐分、重金属离子、高温、低温和洪涝灾害等。植物不能通过移动主动逃离胁迫环境以避免受到伤害，而是通过其形态、生理和生化代谢活动变化来抵御环境胁迫。
盐胁迫是由土壤盐渍化造成的，土壤盐渍化（soil salinization）是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程。盐胁迫会降低植物的光合作用，阻碍作物的生长，进而导致作物生理代谢紊乱、加速作物的器官衰老，最终导致植物的死亡，生命的结束。叶片细胞伸长和细胞分裂在盐胁迫环境下受到抑制，表现出叶面积变小并加厚，长时间的盐胁迫造成叶片内离子浓度达到离子毒害浓度，导致叶片提前衰老。盐分浓度越高，对棉籽发芽势和发芽率的抑制作用越明显，当浓度高到一定程度，严重影响了种子的吸水和萌动，导致棉花种子丧失发芽力。棉花具有较高的耐盐性，是开发利用盐碱地的“先锋作物”，常被用于研究作物耐盐机制的模式植物，因此研究棉花耐盐机制受到了广泛的关注。国内外围绕棉花耐盐机理、耐盐特性及提高棉花耐盐性的途径等方面开展了诸多研究，虽取得了一定的进展，但仍需继续努力。
F-box蛋白基因家族作为植物中最大的蛋白家族之一，在植物中广泛存在，并在植物生命活动中发挥重要作用。除了保守的F-box结构域，大多数FBPs的C端还有另外的结构域，且依据基序结构的不同已经成为将植物中的FBPs分类为9个亚家族，例如TUBBY （TUB）、Leucinte-richrepeat（LRRs）、Kelch repeat（Kelch）、F-boxassociated domain（FBA）、Domain present in F-box and BRCT domain（FBD）或WD40repeat（WD-40）。当前F-box蛋白已被证明参与植物各种生物学过程。其中，拟南芥中有生长素上调F-BOX蛋白1（AUF1）以及S期激酶相关蛋白（SKP2B），AUF1-2是根伸长的必需正调节因子，可能靶向控制生长素运输的正效应子，并介导生长素和细胞分裂素信号转导之间的拮抗相互作用。而SKP2B被证明是细胞根发育的负调节因子。拟南芥MAX2既能够通过诱发气孔关闭提高植物对细菌的抗性，MAX2也可以作为正调控因子参与了叶片的光形态建成。此外，TaFBA1正向调节烟草转基因植物的氧化和盐胁迫耐受性，GhTULP34基因负调控拟南芥的渗透胁迫。以上可知不同的基因家族之间，以及同一家族中不同基因之间的功能也迥然不同。
土壤盐渍化是造成棉花减产的重要因子之一，但目前对不同盐胁迫对棉花生长发育的影响机制仍不明晰，F-box蛋白在棉花生长发育以及棉花对盐胁迫的响应中的作用更是鲜有报道，需要进一步的鉴定与探究来填补F-box蛋白在棉花中的功能空缺，同时利用转基因技术培育能够抵御外界胁迫条件的棉花品种，对于我国棉花生产的长期稳定发展有着十分重要的意义，了解并找到与抗旱性和耐盐碱性更多相关的基因，从分子层面研究基因对棉花的生长发育及逆境抗性的影响具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：
本发明采用的GhTLP8基因在NCBI中基因序列号（Sequence ID）为XM_016842862.2，GhTLP8基因的信使RNA（mRNA）序列长度为2261 bp，GhTLP8基因的编码序列长度为1275 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括424个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物耐盐胁迫方面的功能也落入本发明的保护范围之内。
本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述GhTLP8基因，还包括与GhTLP8基因具有较高同源性（同源性高达99％）的同源基因在耐盐胁迫方面的功能。
本发明公开的GhTLP8基因在植物耐盐胁迫中的生物学功能，具体表现在：在盐胁迫下，GhTLP8过表达拟南芥株系的种子萌发率高于野生型，叶片黄化程度低于野生型。而GhTLP8基因沉默株系的叶片萎蔫程度、黄化程度均高于野生型。
本发明所述盐胁迫耐受性为高浓度盐胁迫耐受性，所述高浓度是指盐浓度范围为：150 mM≤盐浓度≤400mM。
根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐盐胁迫的植株，具体地，可以通过将GhTLP8导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐盐胁迫能力高于目的植物。
具体地，GhTLP8基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，所述方法为通过调控目的植物中GhTLP8基因的表达来获得盐胁迫耐受性强于或/低于目的植物的植株。调控目的植物中GhTSD7基因的表达的方式为过表达、沉默或定向突变GhTSD7基因。
更加具体地可以通过以下方法，所述方法为以下（1）或（2）或（3）：
（1）通过增加目的植物中GhTLP8蛋白的活性，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；
（2）通过促进目的植物中GhTLP8基因的表达，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；
（3）通过抑制目的植物中的GhTLP8基因的表达，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株。
“促进目的植物中GhTLP8基因的表达”的实现方式可为如下（1）或（2）或（3）:
（1）将GhTLP8基因导入目的植物；
（2）引入强启动子和/或增强子；
（3）本领域内的其它常见方法。
其中，目的植物，本发明所述目的植物是棉花、拟南芥。
“抑制目的植物中GhTLP8基因的表达”的实现方式可为沉默所述GhTLP8基因。
目的基因，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。
调控基因表达水平包括利用DNA同源重组技术、病毒介导的基因沉默技术和农杆菌介导的转化体系调控所述GhTLP8表达，获得转基因植物株系。
本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：棉花、拟南芥，尤其是陆地棉（Gossypium hirsutum），凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
本发明的优点：
（1）本发明采用比较转录组学的方法，创新性地对陆地棉（Gossypium hirsutum）中响应逆境胁迫的GhTLP8进行了克隆。构建GhTLP8基因沉默载体TRV2-GhTLP8，利用农杆菌侵染棉花叶片的方法将含有TRV2-GhTLP8的农杆菌注射棉花叶片，获得GhTLP8沉默的植株，结果表明基因沉默植株在高盐胁迫下叶片萎蔫严重，黄化现象严重，表明对高盐处理更为敏感。接着构建GhTLP8的过表达载体p35S-GhTLP8-GFP，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥（Clo-0，WT），获得过表达植株，分析结果表明在高盐胁迫下，相对于野生型，GhTLP8能够提高种子萌发率。为作物耐盐分子育种提供基因资源。
（2）可以通过转基因的方式来获得耐盐性的植株，具体地，可以通过将GhTLP8基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐盐性高于目的植物，为植物耐盐育种提供一种新的途径。
附图说明
图1是盐胁迫条件下的表达水平分析及荧光检测结果；其中，图1A是盐胁迫条件下GhDUF4228-23基因的表达水平分析；图1B是盐胁迫条件下GhTLP8基因的表达水平分析；图1C是GhTLP8转基因拟南芥表达水平分析；图1D是GhTLP8转基因拟南芥荧光检测结果。
图2是种子萌发状况和萌发率分析；其中，图2A、图2B是不同浓度盐处理下WT和过表达GhTLP8拟南芥的种子萌发状况分析；图2C、图2D是不同浓度盐处理下过表达GhTLP8拟南芥的种子萌发率分析；图2E是第三天的种子萌发率统计情况。
图3是不同浓度盐处理下WT和过表达GhTLP8拟南芥的对比情况；其中，图3A、图3B是不同浓度盐处理下WT和过表达GhTLP8拟南芥的生长状况分析；图3C是对不同生长状态下的拟南芥进行叶片颜色的白化指标进行统计；图3D是不同浓度盐处理下WT和过表达GhTLP8拟南芥的幼苗鲜重统计情况。
图4是不同浓度盐水浇灌WT和过表达GhTLP8拟南芥的对比情况；其中，图4A、图4B是不同浓度盐水浇灌WT和过表达GhTLP8拟南芥的生长状况分析；图4C、图4D和图4E分别是不同浓度盐水浇灌情况下的相对花青素含量、相对叶绿素含量和鲜重统计情况。
图5是盐胁迫下棉花GhTLP8沉默植株和正常植株的对比情况；其中，图5A是对照正常植株（TRV::00）出现白化图；图5B是GhTLP8基因沉默植株中GhTLP8表达水平分析；图5C是盐胁迫下棉花GhTLP8沉默植株（TRV::GhTLP8）和正常植株（TRV::00）表型对比；图5D和图5E分别是盐胁迫下棉花GhTLP8沉默植株和正常植株的相对叶绿素含量和株高统计情况。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。
生物材料
棉花TM-1种子为实验室保存；拟南芥Col-0种子为实验室保存；
基因沉默载体空载体和阳性对照载体TRV::GhCLA为实验室保存；过表达载体pSuper-1300-GFP为实验室保存；
大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101为实验室保存；
引物合成及测序，由郑州擎科生物公司完成。
实验试剂
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购买自诺唯赞生物科技有限公司；
NaCl等常用试剂购买自索莱宝公司；
潮霉素购买自索莱宝生物公司；
MS培养基购买自北京酷来搏科技有限公司；
各种核酸内切酶购买自莫纳生物科技有限公司；
一步克隆酶购买自诺唯赞生物科技有限公司；
质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司。
实验设备
PCR仪购买自Bio-rad公司；
制冷离心机购买自Eppendorf公司；
定量PCR仪购买自Bio-rad公司；
激光共聚焦显微镜购买自蔡司公司；
高温高压灭菌器MLS-3750购买自日本三洋公司；
核酸检测仪Nanodrop 2000C购买自Thermo Scientific公司；
常温离心机、酶标仪SpectraMax iD5购买自Thermo Scientific公司。
实施例1GhTLP8基因的克隆及其氨基酸序列分析
提取生长14天的陆地棉TM-1的RNA，以反转录反应获得的cDNA为模板，由NCBI数据库中获得的基因序列经Primer Premier5.0设计特异性引物经过PCR反应，克隆出了GhTLP8基因的编码序列。经ORF finder在线工具将核酸序列转化为蛋白质序列。
结果表明，棉花GhTLP8基因的编码序列，包含1275 bp碱基。所编码的蛋白包括424个氨基酸。
为了分析GhTLP8是否参与棉花响应高盐胁迫的过程，首先，分析了高盐胁迫条件下GhTLP8的表达模式。以正常生长14天的野生型棉花植株TM-1为实验材料，后取出浸泡于400 mM NaCl溶液，分别于0 h，1 h，3 h，6 h，9 h，12h和24 h对叶片进行取样，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测GhTLP8的表达水平。
结果发现，高盐胁迫诱导表达的标志基因GhDUF4228-23的表达量在盐胁迫处理后均得到了大幅度的上升，其中在24 h时上升倍数竟高达6倍以上（图1A），表明棉花幼苗确实受到高盐胁迫的处理；在盐胁迫处理第9 h时，GhTLP8的表达量升高到10倍（图1B）。这一结果暗示，GhTLP8可能参与调节棉花对高盐胁迫的响应过程。以下是围绕这个方面对这个基因展开的实验。
实施例2过表达拟南芥载体p35S-GhTLP8-GFP的构建
为了进一步分析GhTLP8的功能，发明人构建了GhTLP8的过表达载体p35S-GhTLP8- GFP，获得了过表达拟南芥植株。具体过程简要介绍如下。
首先，设计带有限制性内切酶pst1和kpn1酶切位点的引物，序列如下：
1300-GhTLP8-F：5' - TCTAGAAAGCTTCTGCAG ATGTCGTTCCGAAGT-3'；
1300-GhTLP8-R：5' - CTTGCTCACCATGGTACC TTCACATGCCAAT-3'；
然后，以实施例1制备的cDNA样品为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物；
第三，对p35S-GFP载体采用pst1和kpn1进行双酶切，对酶切产物进行纯化；
第四，把PCR扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接，构建1300-GhTLP8过表达载体；
第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行K+（卡那霉素，50 μg/mL）抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用；
第六，将所提取的质粒转化至农杆菌感受态细胞GV3101中，-80℃保存备用；
第七，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥（Clo-0，WT），将收获的种子在含有潮霉素的MS培养基上筛选，对潜在的转基因植株单株收获种子，再次在含有潮霉素的培养基上筛选，直至T3代筛选获得潜在的纯合转基因植株。
利用qRT-PCR分析潜在转基因植株中GhTLP8的表达水平。结果发现，在GhTLP8潜在转基因植株中，GhTLP8的表达量在3个不同株系中上调了约10000倍（图1C）。通过激光共聚焦显微镜观察过表达拟南芥叶的GFP荧光，结果表明，所筛选到的GhTLP8转基因植株的叶片，均能检测到GFP荧光（图1D）。这些结果表明，所构建的GhTLP8转基因拟南芥为GhTLP8- GFP过表达植株。
实施例3过表达拟南芥验证GhTLP8基因在拟南芥盐胁迫耐受性中的功能
高盐胁迫能抑制种子的萌发，为了进一步分析GhTLP8是否参与调控高盐胁迫抑制种子萌发的过程，我们将WT、过表达GhTLP8拟南芥种子分别播种在含有不同浓度NaCl（0 mM和150 mM）的MS培养基上，在4°C低温处理3 d，然后放置于12h光照/12h黑暗的温室（21°C）中，分别在每间隔8小时和12 h于体式显微镜下统计种子的萌发情况。
结果表明，在MS培养基上生长的过表达种子萌发率与WT基本一致，无明显差异，表现为48 h时过表达GhTLP8的种子萌发率接近100%。（图2A和图2C）；而在150 mM浓度的NaCl处理下，明显抑制了种子的萌发，且过表达GhTLP8的种子萌发率明显高于WT（图2B和图2D）。而且，随着时间的延长，差距愈发明显，第三天时，过表达GhTLP8的种子萌发率均超过60%，而WT的种子萌发率不到40%（图2E）。
这些结果表明，在拟南芥中过表达GhTLP8可以促进高盐胁迫下种子的萌发。
同时，为了进一步分析过表达GhTLP8转基因植株是否参与拟南芥调控高盐胁迫的耐受性，我们将在正常MS培养基上竖直生长6天的WT和过表达GhTLP8拟南芥幼苗分别摆放于含有不同浓度NaCl（0 mM和150 mM）的MS培养基上，然后放置于12h光照/12h黑暗的温室（21°C）中，观察幼苗的长势情况。幼苗在不同浓度的培养基生长8天后，我们可以明显地观察到0 mMNaCl的MS培养基上的WT和过表达GhTLP8拟南芥幼苗的生长基本一致（图3A），而在150 mM NaCl的MS培养基上WT的长势明显低于过表达GhTLP8拟南芥（图3B）。分别对不同浓度的幼苗的叶片颜色和鲜重进行统计，可以得出，在高浓度的NaCl处理下，WT的叶片出现明显的白化死亡现象（图3C），而过表达GhTLP8拟南芥植株白化叶片明显减少，鲜重较WT明显提高（图3D），表现了更强的高盐耐受性。
此外，为了进一步验证过表达GhTLP8转基因植株具有高盐胁迫的耐受性，在WT和过表达GhTLP8转基因植株正常生长24天，用含有150 mM NaCl的水溶液对植株进行浇灌胁迫处理，并以不含NaCl的水溶液进行对照。结果发现，在高盐胁迫20天后，在对照组中，WT和过表达GhTLP8转基因植株无明显差异，而高盐胁迫均明显抑制了WT和过表达GhTLP8转基因植株的生长，均表现出较小的莲座叶（图4A），并对所有莲座叶进行摆放展示（图4B）。对相对花青素含量、相对叶绿素含量和鲜重（图4C、图4D和图4E）进行统计，可以得出，在150 mMNaCl的水溶液对植株进行浇灌胁迫处理下，与WT相比，过表达GhTLP8的三个株系的相对花青素含量、相对叶绿素含量和鲜重均高于WT，且均呈现出显著性差异，进一步证实了过表达GhTLP8基因可以提高拟南芥对高盐胁迫的耐受性。
实施例4沉默GhTLP8基因验证其在棉花盐胁迫耐受性中的功能
为了深入研究GhTLP8在陆地棉对高盐响应中的功能，针对GhTLP8的保守区域，利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）体系，发明人构建了GhTLP8的基因沉默载体TRV2-GhTLP8，获得了GhTLP8沉默的棉花植株（GhTLP8的同源性较高，构建的TRV2-GhTLP8载体可以同时沉默GhTLP8基因及其同源基因）。具体过程简要介绍如下。
第一，设计带有限制性内切酶EcoR Ⅰ和KpnⅠ酶切位点的引物，序列如下：
TRV2-GhTLP8-F：5'-TGAGTAAGGTTACCGAATTCCTGGGTCAAGGGATGGAACC-3'；
TRV2-GhTLP8-R：5'-CGCGTGAGCTCGGTACCATAGAACCTTCGGCTTCGGC-3'；
第二，以实施例1制备的cDNA样品为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物；
第三，对TRV2载体采用EcoR Ⅰ和KpnⅠ进行双酶切，对酶切产物进行纯化；
第四，把PCR扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接，构建TRV2-GhTLP8表达载体；
第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行K+（卡那霉素，50 μg/mL）抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用；
第六，将所提取的质粒转化至农杆菌感受态细胞GV3101中，-80℃保存备用；
第七，利用农杆菌侵染棉花叶片的方法将含有TRV2-GhTLP8、TRV2、TRV-CLA、TRV1的农杆菌注射棉花叶片，获得GhTLP8沉默的植株。
结果显示，在农杆菌侵染7天后，作为阳性对照组的转化TRV::GhCLA（TRV::00）植株出现叶片白化的表型（图5A），表明基因沉默体系发挥了作用。通过qRT-PCR实验检测VIGS体系创制GhTLP8沉默的不同植株中GhTLP8的表达水平，结果显示，所检测的棉花幼苗植株的GhTLP8的表达水平均低于对照组的1/5（图5B），结果表明成功创制了GhTLP8沉默植株。
在前述实施例3结果分析基础上，用含有400 mM NaCl的水溶液处理基因沉默植株TRV::GhTLP8和TRV::00，用不含有NaCl的水溶液处理作为对照。在处理14天后可以发现，不同处理之间出现明显差异（图5C）。对不同处理的相对叶绿素含量进行统计，可以发现，高盐溶液的浇灌会导致植株叶片黄化，萎蔫，且在含有400 mM NaCl的水溶液处理下，与TRV::00植株叶片相比，TRV::GhTLP8植株叶片萎蔫较为严重，相对叶绿素含量明显降低（图5D）。此外，对株高进行统计，可以发现，在正常水溶液浇灌情况下，TRV::GhTLP8植株明显高于TRV::00植株，具有一定的发育较快表型，而当进行含有400 mM NaCl的水溶液胁迫处理下，发育较快表型被抑制（图5E）。以上结果表明GhTLP8正调控棉花对高盐胁迫的耐受性。
综上，过表达拟南芥后其盐胁迫耐受性提高，表明GhTLP8基因正调控拟南芥对高盐胁迫的耐受性；而沉默GhTLP8基因后棉花的盐胁迫耐受性降低，同样表明GhTLP8基因正调控棉花对高盐胁迫的耐受性。可见，GhTLP8基因在调控植物高盐胁迫方面起着重要的作用，对于培育能够抵御外界胁迫条件的棉花品种具有重要的意义。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (4)
1.GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用，其特征在于，通过构建GhTLP8过表达载体，获得盐胁迫耐受性高的转基因植株，所述GhTLP8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为棉花或拟南芥，所述盐胁迫耐受性为高浓度盐胁迫耐受性，所述高浓度是指盐浓度范围为：150 mM≤盐浓度≤400mM；所述盐胁迫耐受性表现为：在盐胁迫下，GhTLP8基因沉默株系的叶片萎蔫程度和黄化程度均高于野生型，而GhTLP8过表达株系的种子萌发率高于野生型，叶片的黄化程度低于野生型。
2.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）：
（1）通过增加目的植物中GhTLP8蛋白的活性，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；
（2）通过促进目的植物中GhTLP8基因的表达，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；
所述GhTLP8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GhTLP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述目的植物为棉花或拟南芥。
3.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为通过抑制目的植物中的GhTLP8基因的表达，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株；所述GhTLP8基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述目的植物为棉花。
4.根据权利要求3所述的植物育种方法，其特征在于，抑制目的植物中的GhTLP8基因的表达的方法为沉默所述GhTLP8基因。
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