CN118028420B - 一种基于口腔取样的幽门螺旋杆菌检测试剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测试剂技术领域，具体涉及一种基于口腔取样的幽门螺旋杆菌检测试剂及其使用方法；所述幽门螺旋杆菌检测试剂含有抑菌剂、酶促活剂、营养剂等组分，其pH值为7.6且以干燥的粉剂形式密封保存，能够有效地检测幽门螺旋杆菌,且与其它同类产品相比，具有更优的特异性、灵敏度以及稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂技术领域，更具体地说，它涉及一种基于口腔取样的幽门螺旋杆菌检测试剂及其使用方法。
背景技术
早期筛查和诊断幽门螺旋杆菌(HP)的感染，是规范治疗幽门螺旋杆菌的前提，对于胃部炎症以及胃癌的发生具有重要的意义。根据检测方法取材是否需要通过内镜检查，可以将幽门螺旋杆菌的检测方法分为侵入性检测和非侵入性检测。侵入性检测包括胃粘膜标本直接涂片染色检菌、组织学染色、快速尿素酶试验、细菌培养、基于HP特定的基因检测等，但侵入性检测是一种对机体有损伤的检测方法，往往需要借助内镜检查作为辅助。而非侵入性检测包括呼气试验、粪便抗原检测、血清学检测等，具有不对胃部造成损伤的特点，接受度高。虽然侵入性检测的灵敏度高，但是对医生的操作经验要求高，设备器材费用高，且患者需要经受插镜痛苦、患者依从性低，并容易相互交叉感染。
当前，如何快速、准确、高效、便捷的对幽门螺旋杆菌HP进行筛查，仍是行业技术人员需要研究和解决的问题。而且，目前市面上的HP检测在对口腔样本进行检测时，相比于其它样品，更容易出现假阴性或假阳性，因为口腔的环境相对来说更加复杂，受食物影响很大。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于口腔取样的幽门螺旋杆菌检测试剂；本发明所提供的检测试剂能够有效地检测幽门螺旋杆菌,且与其它同类产品相比，具有更优的特异性、灵敏度以及稳定性。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于口腔取样的幽门螺旋杆菌检测试剂，其制备方法包括以下步骤：
S1：将缓冲液、抑菌剂、酶促活剂、营养剂混合均匀，得第一溶液；
S2：将检测母液加入到第一溶液中，混合均匀，得第二溶液；
S3：将第二溶液转移至试剂管中，干燥至粉末状，得检测粉体；
S4：将检测粉体与干燥剂热封于不透光的铝箔袋内，即得所述的幽门螺旋杆菌检测试剂。
优选地，所述第二溶液的pH值为7.6。
优选地，所述缓冲液包括以下质量百分比计的组分：氯化钠0.5～1.5％、氯化钾0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.5～1.5％、磷酸氢二钠0.5～1.5％、氢氧化钠0.2～0.6％，及纯水余量。
优选地，所述抑菌剂包括以下质量百分比计的组分：万古霉素10～12％、三羟甲基丙烷8～10％、两性霉素B 4～6％，及纯水余量。
优选地，所述酶促活剂为硫酸镁，其含量为2～10mM。
优选地，所述检测母液包括以下质量百分比计的组分：尿素10～12％、酚红0.01～0.02％，及纯水余量。
优选地，在步骤S3中，所述第二溶液在55～60℃的条件下干燥至粉末状。
本发明中幽门螺旋杆菌检测试剂的设计思路如下：
为了使尿素酶获得最高的反应活性，将检测试剂的体系pH值设为7.6，因为尿素酶的最佳反应pH值为7.6；为了使体系的pH值维持在7.6，本发明采用由磷酸盐缓冲溶液和氢氧化钠碱液组成缓冲液；为了使检测试剂能够保持高度特异性，本发明以万古霉素、三羟甲基丙烷(TMP)、两性霉素B等组成抑菌剂防止杂菌参与反应；为了使检测试剂能够保持高灵敏度，本发明以硫酸镁为酶促活剂添加到体系中；为了使检测试剂能够保持长期稳定，本发明将第二溶液干燥成粉末状状，且将其与干燥剂一起热封于不透光的铝箔袋内储存。
本发明的另一目的是提供一种上述的的幽门螺旋杆菌检测试剂的使用方法，其包括以下步骤：使用一次性无菌采样拭子沿牙龈缝隙刷取2周(见图1黄色轨迹)，获取口腔样本；使用纯净水将粉状的所述的幽门螺旋杆菌检测试剂溶解成液体试剂；将空腔样品放入液体试剂中反应10min以上，观察液体试剂变色情况；若液体试剂不变色，则为阴性；若液体试剂变成红色或紫红色，则为阳性。
对于本发明的幽门螺旋杆菌检测试剂需求的取样过程，采用无菌采样拭子沿牙龈缝隙刷取2周即可，整个取样过程较为文雅温和，而市面上的检测试剂需求的是牙垢样品，整个牙垢取样过程较为简单粗暴。此外，本发明的幽门螺旋杆菌检测试剂在使用前需用纯净水将其溶解，然后放入采样后的拭子(即口腔样本)，使得液体形式的检测试剂对口腔样本非幽门螺旋杆菌带来的影响的耐受性更高，比如食物pH的影响等。
本申请具有以下有益效果：本发明所提供的检测试剂能够有效地检测幽门螺旋杆菌,且与其它同类产品相比，具有更优的特异性、灵敏度以及稳定性。
附图说明
图1是本发明中幽门螺旋杆菌检测试剂的使用方法的取样部位图；
图2是加入不同浓度抑菌剂的检测试剂的检测图；
图3是加入不同浓度硫酸镁的检测试剂在第1min时的检测图；
图4是加入不同浓度硫酸镁的检测试剂在第5min时的检测图；
图5是加入不同浓度硫酸镁的检测试剂在第10min时的检测图；
图6是加入不同浓度营养剂的检测试剂在第1min时的检测图；
图7是加入不同浓度营养剂的检测试剂在第3min时的检测图；
图8是加入不同浓度营养剂的检测试剂在第10min时的检测图；
图9是市售的幽门螺旋杆菌检测试纸图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
目前市面上已有的幽门螺旋杆菌检测试纸、幽门螺旋杆菌检测试剂，多为口腔样本的检测，但是检测结果不准确。据推测可能是试纸不耐受口腔样本pH，反应灵敏度低的影响，导致检测结果出现误差。此外，市面在售试纸存在较多的假阳性、假阴性问题。而本发明通过是试剂的pH值为7.6、且试剂含有抑菌剂、酶促活剂、营养剂等组分、试剂管为干燥状态，所以试剂的特异性、灵敏度、稳定性都更高。
实施例1：筛选不同浓度的抑菌剂来测试检测试剂的特异性
(1)制备抑菌剂：将10g万古霉素、8g三羟甲基丙烷、5g两性霉素B加入到量筒中，加纯水定容至100ml，均匀混合后即得。
(2)制备缓冲液：将1g氯化钠、0.04g氯化钾、1g磷酸二氢钾、1g磷酸氢二钠、0.5g氢氧化钠加入到量筒中，加纯水定容至100m l，均匀混合后即得。
(3)制备检测母液：将10g尿素、0.01g酚红加入到量筒中，加纯水定容至100m l，均匀混合后即得。
(4)制备营养剂：将5g葡萄糖、5g三羟甲基氨基甲烷(Tr i s)加入到量筒中，加纯水定容至100ml，均匀混合后即得。
(5)制备含有不同浓度抑菌剂的检测试剂：将20g缓冲液、Xg抑菌剂、5mM硫酸镁、2g营养剂、20g检测母液加入到量筒中，加纯水定容至100ml，均匀混合后即得。其中，Xg依次设置为0g、0.8g、1.6g及3.2g。
(6)加样：向上述制得的含有不同浓度抑菌剂的检测试剂里分别加入1uL混合菌液(由黑曲霉菌、白色念珠菌、奇异变形菌形成的混合菌液)。
(7)结果显示：抑菌剂添加量为1.6％及以上的检测试剂均不变色，故抑菌剂添加量为1.6％即可，测试结果如图2所示。
实施例2：筛选不同浓度的硫酸镁来测试检测试剂的灵敏度
(1)抑菌剂、缓冲液、检测母液、营养液的制备方法均如实施例1。
(2)制备含有不同浓度硫酸镁的检测试剂：将20g缓冲液、1.6g抑菌剂、YmM硫酸镁、2g营养剂、20g检测母液加入到量筒中，加纯水定容至100ml，均匀混合后即得。其中，YmM依次设置为2mM、5mM及10mM。
(3)加样：向上述制得的含有不同浓度硫酸镁的检测试剂里分别加入1uL尿素酶溶液(0.025U/uL)。
(4)结果显示：在第1分钟时三组均未变色；在第5分钟时5mM组变色，2mM组和10mM组均未变色；在第10分钟时三组均变色。测试结果如图3～5所示。
实施例3：筛选不同浓度的营养剂来测试检测试剂的灵敏度
(1)抑菌剂、缓冲液、检测母液、营养液的制备方法均如实施例1。
(2)制备含有不同浓度营养剂的检测试剂：将20g缓冲液、1.6g抑菌剂、5mM硫酸镁、Zg营养剂、20g检测母液加入到量筒中，加纯水定容至100ml，均匀混合后即得。其中，Zg依次设置为0g、5g及10g。
(3)加样：向上述制得的含有不同浓度营养剂的检测试剂里分别加入1uL幽门螺旋杆菌液。
(4)结果显示：在第1分钟时三组均未变色；在第3分钟时0g组未变色，5g组和10g组均变色；在第10分钟时三组均变色；即营养剂为5g(5wt％)时就能达到提高灵敏度的效果，其测试结果如图6～8所示。
实施例4：测试干燥状态和液体状态保存12个月后检测试剂的稳定性
(1)抑菌剂、缓冲液、检测母液、营养液的制备方法均如实施例1。
(2)制备检测试剂：将20g缓冲液、1.6g抑菌剂、5mM硫酸镁、5g营养剂、20g检测母液加入到量筒中，加纯水定容至100ml，均匀混合后即得。
(3)将上述制得的检测试剂分两组，一组直接热封于不透光的铝箔袋；另外一组置于鼓风干燥箱中于55℃干燥至粉状，然后和干燥剂热封于不透光的铝箔袋内；两组检测试剂均在室温下避光储存12个月。
(4)12个月后液体组直接查看外观和性能测试；干燥组加100u l纯水溶解后查看外观和性能测试。
(5)更具体的步骤(4)性能检测的方法为向检测试剂内分别加入1u l阳性质控和1u l阴性质控；阳性质控为幽门螺旋杆菌液，阴性质控为由黑曲霉菌、白色念珠菌、奇异变形菌组成的混合菌液。
(6)10分钟后查看检测液体是否变色，需注意的是液体组在反应前已经为红色液体，则以是否变色为综合性能评判标准。
(7)每组重复5次测试，结果下表1所示：
表1检测试剂在不同状态保存的稳定性
实施例5：本发明的检测试剂与市售的试纸检测效果对比按下表2所示方法进行测试，其结果如表3所示。
表2对比测试方法表
表3对比测试结果
由表1～4可知：本发明所提供的检测试剂能够有效地检测幽门螺旋杆菌,且与其它同类产品相比，具有更优的特异性、灵敏度以及稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于口腔取样的幽门螺旋杆菌检测试剂，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
S1：将缓冲液、抑菌剂、酶促活剂、营养剂混合均匀，得第一溶液；
S2：将检测母液加入到第一溶液中，混合均匀，得第二溶液；
S3：将第二溶液转移至试剂管中，干燥至粉末状，得检测粉体；
S4：将检测粉体与干燥剂热封于不透光的铝箔袋内，即得所述的幽门螺旋杆菌检测试剂；
所述第二溶液的pH值为7.6；
所述缓冲液由以下质量百分比计的组分组成：氯化钠0.5～1.5%、氯化钾0.02～0.05%、磷酸二氢钾0.5～1.5%、磷酸氢二钠0.5～1.5%、氢氧化钠0.2～0.6%及纯水余量；
所述抑菌剂由以下质量百分比计的组分组成：万古霉素10～12%、三羟甲基丙烷8～10%、两性霉素B 4～6%及纯水余量；所述抑菌剂在所述幽门螺旋杆菌检测试剂中的添加量为1.6-3.2%；
所述酶促活剂为硫酸镁，其含量为2～10 mM；
所述营养剂由以下质量百分比计的组分组成：葡萄糖4～6%、三羟甲基氨基甲烷4～6%及纯水余量；
所述检测母液由以下质量百分比计的组分组成：尿素10～12%、酚红0.01～0.02%及纯水余量；
在步骤S3中，所述第二溶液在55～60℃的条件下干燥至粉末状。
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