CN1180251C - 双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量dna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法，在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜，然后让石英晶振选择性地吸附DNA，通过DNA分子杂交，结合成双链DNA，将标记有能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的化学药物或生物试剂标记纳米微珠作为放大标记物和上述与DNA杂交后形成的双链DNA作用，嵌入到此双链DNA中，然后进行质量信号检测和电化学信号测定。本发明以能与双链DNA选择性作用且具有电化学活性的药物或生物试剂作为导向分子修饰在纳米微珠上，通过电化学石英晶体微天平(EQCM)生物传感器技术从质量和电化学信号两方面相互映证、识别和放大测定目标DNA，进而双方面提高灵敏度。与常规的压电DNA生物传感器相比，本发明选择性强、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法。
背景技术
石英晶体微天平(QCM)又称压电传感器，其理论基础是基于压电效应。压电DNA生物传感器的原理是：先在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜，然后设法让石英晶振选择性的吸附DNA，通过DNA分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的DNA进行识别，结合成双链DNA，利用频率变化反映杂交情况。由于QCM能对增加在表面的纳克级的质量有频率响应，因而是一种非常敏感的质量检测装置，适于检测单链DNA(ssDNA)在杂交前后质量的改变，从而可应用与DNA生物传感器的研究。QCM与电化学技术联用构成了电化学石英晶体微天平(EQCM)。它既具有QCM的高质量灵敏度，可以进行纳克级质量测定；同时又可获得电化学信息，现场测定电极表面的微小变化。
近年来应用电化学石英晶体微天平作为生物传感器发展迅速，在核酸分子杂交识别和测定方面已经显示出了巨大潜力，具有广阔的应用前景，目前对于EQCM生物传感器的研究常只利用质量方面信号，为QCM生物传感器。虽然QCM是一种灵敏的质量检测器，可测得亚纳克级质量变化，但在实际检测中，DNA的浓度远远低于QCM直接检测的范围，特别是作为检测超痕量变化的生物传感器，其灵敏度还不能达到要求。
发明内容
本发明就是针对上述问题提供一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法，这种方法可检测超痕量的目标DNA，且灵敏度高。
本发明提供的技术方案是：一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法，在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜得到石英晶振，然后让石英晶振选择性地吸附DNA，通过DNA分子杂交，结合成双链DNA，其特殊之处是：将标记有能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的化学药物或生物试剂标记纳米微珠作为放大标记物和上述与DNA杂交后形成的双链DNA作用，嵌入到此双链DNA中，然后进行质量信号检测和电化学信号测定。
上述纳米微珠为磁性微珠或白蛋白微珠。
上述能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的化学药物为阿霉素类药物。
上述能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的生物试剂为放线菌素D。
上述石英晶振使用前先浸入到无水甲醇溶液10～60分钟，然后超声清洗1～3分钟，再用重蒸水洗涤3～5次，晾干。
本发明以能与双链DNA选择性作用且具有电化学活性的药物或生物试剂作为导向分子修饰在纳米微珠上，导向分子标记的纳米微珠与修饰在EQCM电极上的ds-DNA相互作用，因为纳米微珠的大质量，药物或生物导向分子和EQCM电极上的ds-DNA相互作用引起大幅度频率变化。这种方法可使最低检测下限从10-8mol/L数量级下降到10-13mol/L数量级。同时因为纳米微珠大的表面积，增大了导向分子在电极上的数量，在电化学测定时电化学信号大大地增强，从而通过电化学石英晶体微天平(EQCM)生物传感器技术从质量和电化学信号两方面相互映证、识别和放大测定目标DNA，进而双方面提高灵敏度。与常规的压电DNA生物传感器相比，本发明可使最低检测限改善2～5个数量级，因而不仅可检测超痕量的目标DNA，且选择性强、灵敏度高。
具体实施方式
实施例1：以阿霉素(ADM)修饰的纳米磁性微球对靶向双链DNA分子的形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
一、阿霉素修饰的磁性微球的制备：配制2.0×10-6mol/L阿霉素的水溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基磁性微球(可用市售产品)后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，微球在磁力架上用重蒸馏水清洗3次，加入0.5mL的重蒸水，4℃保存备用。
二、自组装α-硫辛酸单层膜：石英晶振使用前先浸入到无水甲醇溶液30分钟，然后超声清洗1分钟，再用重蒸水洗涤3次，空气中晾干。将洗涤干净的石英晶振迅速置于QCM的Teflon反应池，加入0.5毫升0.3mol/L α-硫辛酸的乙醇溶液，2小时后用重蒸水洗涤，空气中晾干。
三、探针的固化：从QCM的Teflon反应池中取出石英晶振，滴加10微升100mg/mL的盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和10微升100mg/Ml的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)至自组装单层膜修饰的石英晶振表面，放置20分钟。重蒸水洗涤，于空气中晾干。在石英晶振表面上加入10微升5‘端带有-NH2的ssDNA(5’-XATGGGTATTCAACATTTCCG，X＝-NH2)探针溶液(10-5mol/L)，反应30分钟。用1/15mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，pH＝7.0)洗涤，于空气中晾干备用。
四、杂交和嵌合：将经过上述处理后的石英晶振装入到QCM的Teflon反应池中，用0.2mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，含50％甲酰胺)作为杂交缓冲溶液，加入到QCM的Teflon反应池中，待晶振频率稳定后(Δf≤±1Hz/min)，加入10微升不互补目标DNA(ncDNA)(5-GACGTCAGCA)，启动QCM，记录频率变化作为空白对照，约5分钟后加入10微升其互补目标DNA(cDNA)(5’-CGGAAATGTTGAATACC)。频率变化稳定后，再向Teflon反应池中加入5-20微升Act D或经步骤一制备的0.5mg/mL Act D修饰过的纳米磁性微球，使之与ds-DNA嵌合15分钟，记录频率变化。
五、电化学测定：在Teflon反应小池加入2.0mol/L醋酸缓冲溶液，用三电极体系(经过修饰的EQCM金电极为工作电极，Ag/AgCl参比电极，铂对电极)进行示差脉冲伏安法(DPV)电化学测定，扫程为0-1.0V。测试完成后，石英晶振浸入到甲醇溶液中30min，超声清洗1min，再用重蒸水洗涤3次，每次1min，晶振即可重复使用。
其结果表明，与常规的压电DNA生物传感器相比，本发明极大地提高了QCM的灵敏度，使最低检测限下降至10-12～10-13mol/L。
实施例2：以放线菌素D(ActD)修饰的纳米磁性微球对靶向双链DNA分子的形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
放线菌素D修饰的纳米磁性微球的制备：配制1.0×10-6mol/L放线菌素D的丙酮溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基磁性微球后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，微球在磁力架上用丙酮清洗3次，加入0.5mL的丙酮，4℃保存备用。其余步骤同实施例1。
实施例3：以米托蒽醌修饰的白蛋白纳米微球对靶向双链DNA分子形成的进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
米托蒽醌修饰的白蛋白纳米微球的制备：配制2.0×10-6mol/L米托蒽醌的水溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基白蛋白微球后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，12000转/分钟离心，用重蒸馏水清洗3次，加入0.5mL的重蒸水，4℃保存备用。其余步骤同实施例1。
本发明也可用阿霉素表柔比星、佐柔比星等阿霉素类药物及比生群等其它蒽环类抗肿瘤药物或其它能与双链DNA选择性作用的药物或生物试剂标记的纳米微球作为放大标记物。
Claims (5)
1.一种双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量DNA的方法，在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜得到石英晶振，然后让石英晶振选择性地吸附DNA，通过DNA分子杂交，结合成双链DNA，其特征是：将标记有能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的化学药物或生物试剂标记纳米微珠作为放大标记物和上述与DNA杂交后形成的双链DNA作用，嵌入到此双链DNA中，然后进行质量信号检测和电化学信号测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述纳米微珠为磁性微珠或白蛋白微珠。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：上述能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的化学药物为阿霉素类药物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：上述能与双链DNA选择作用且具有电化学活性的生物试剂为放线菌素D。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：石英晶振使用前先浸入到无水甲醇溶液10～60分钟，然后超声清洗1～3分钟，再用重蒸水洗涤3～5次，晾干。
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