CN111537603A - 一种基于qcm的细胞检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于QCM的细胞检测方法，属于生物检测技术领域。本发明公开的检测方法，包括晶片的清洗、Ramos细胞的培养、磁珠的预处理、Ramos细胞置换tDNA、晶片的修饰、晶片的进一步修饰和结晶。本发明研究基于碳酸钙原位选择性生长的石英晶体微天平检测技术对信号放大的作用，在引入适配体后用于Ramos细胞的检验；对于Ramos细胞的检测，本发明方法具有较高的灵敏度。石英晶体微天平信号响应与细胞浓度对数在5个/ml到6000个/ml(R2＝0.999)的浓度范围内呈现了良好的线性关系，其检测的灵敏度为5个/ml。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种基于QCM的细胞检测方法。
背景技术
石英晶体微天平(QCM)分析方法是一种操作方便的检测方法，具有无需标记、实时检测表面结合反应的优点，已经在生物化学分析中广泛应用。石英晶体微天平传感器具有高精度、高灵敏度和高稳定性的特点，可以检测到纳克以下的数量级。石英晶体微天平传感器不仅可以提供有关吸附过程的动力学信息，还可以提供最后形成的吸附层的表面覆盖度的信息。动力学参数可以通过频率-时间的图表获得，晶片频率会随着所吸附物质的质量的变化而变化，最后可以通过下降的总频率计算出所吸附物质的质量。主要有两种方法将分析物传送入传感器中，然后测量晶片的共振频率的变化。其中一种方法成为“浸渍和干燥”法，这种方法是通过测量两次晶片的共振频率，两次测量分别是在目标分析物连接到探针修饰的晶片之前和之后，通过两次共振频率变化的差值计算晶片吸附的质量。另外一种方法是流式注射分析系统，将分析物传送入传感器中并测量其频率的变化。小体积的样本通过流式注射分析系统将分析物传送入传感器中，在传感器中振荡回路与频率转换器连接，将质量的变化转换为共振频率的变化，最后频率转换器与电脑连接，将共振频率的变化以数据的形式在电脑上显示出来。这种方法可以实现数据的在线分析获得实时数据，这有利于研究键合体系由低到高的结合度。石英晶体微天平可以测量键合反应的共振频率变化和能量损耗的数据。但目前还没有利用定量控制方法将QCM用于细胞检测的相关报道。
因此，提供一种基于QCM的细胞检测方法，拓宽QCM的应用范围，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于QCM的细胞检测方法，在捕获DNA的基础上杂交适配体序列，特异性识别响应的细胞，一旦目标与其结合，由于结构变化适配体从捕获序列上脱离下来，给标记有-COOH的探针序列提供杂交位点，从而为CaCO3提供结晶位点，实现QCM的信号放大。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于QCM的细胞检测方法，具体步骤如下：
(1)晶片的清洗；
(2)Ramos细胞的培养：将Ramos细胞复苏，并将复苏后的Ramos细胞加入适量培养液中分散均匀，进行离心，倒掉上层清液的同时去除细胞中的凋亡细胞；离心后的细胞用细胞培养液分散均匀，移至培养瓶中，并在显微镜下观察细胞状态，将培养瓶放在培养箱中进行孵育，获得Ramos细胞溶液，需要及时观察细胞的生长状况，必要时进行传代；
(3)磁珠的预处理：
①取一定量羧基化的Fe3O4磁珠MNPs-COOH，用0.1M的咪唑盐酸溶液吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液；
②清洗后的磁珠中加入0.1M EDC和0.1M NHS对磁珠进行活化，温度保持在37℃，活化30分钟；活化结束后，在磁珠中加入适配体TDO5，在37℃下反应过夜，得到连接适配体后的磁珠MNPs-a；
③连接适配体后的磁珠用适量的1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入适量1xPBS对磁珠进行稀释；
④将MNPs-a溶液与tDNA溶液进行混合杂交，温度保持在37℃，反应1小时，得到MNPs-a与tDNA的杂交体MNPs-a-t；
⑤杂交结束后，用适量的1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入适量1xPBS对其进行稀释，备用；
(4)Ramos细胞置换tDNA：通过细胞计数板对Ramos细胞进行计数；将Ramos细胞溶液与制备的MNPs-a-t进行混合，温度保持在37℃，反应30分钟；在该过程中，细胞与适配体结合并将tDNA置换释放出来；反应结束后，进行磁分离，使磁珠与上层清液分离；
(5)晶片的修饰：
①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的cDNA溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③称取一定质量的HS-C11-NMe3Cl，溶解配置成10mM的溶液，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(6)晶片的进一步修饰：
①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，将一定浓度的Ramos细胞置换出来的tDNA上层清液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③配制过量浓度pDNA，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(7)结晶：将修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl 6mM CaCl2溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末，用一个载体盛放置于氯化钙溶液附近，营造一种二氧化碳的氛围，为氯化钙的结晶提供反应物二氧化碳；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。
进一步，步骤(1)所述晶片的清洗步骤如下：将晶片在食人鱼洗液中浸泡10分钟，然后按照H2O：H2O2：NH3H2O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟。
由于Ramos细胞与适配体TDO5之间的结合反应，在检测DNA的基础上，利用相同的方法来检测Ramos细胞的浓度。适配体TDO5修饰在Fe3O4磁珠(MNPs)表面，之后与互补的DNA链杂交形成双链DNA。在Ramos细胞存在时，由于Ramos细胞与适配体TDO5之间具有更强的结合力，适配体TDO5就会与Ramos细胞结合，通过解链行为将互补的DNA链从磁珠上释放出来。释放出来的DNA链作为靶标DNA进入DNA检测体系中，并引发石英晶体微天平传感器的原位选择性结晶。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于QCM的细胞检测方法，在引入适配体后用于Ramos细胞的检验；对于Ramos细胞的检测，该方法同样具有较高的灵敏度。在该工作中，石英晶体微天平信号响应与细胞浓度对数在5个/ml到6000个/ml(R2＝0.999)的浓度范围内呈现了良好的线性关系，其检测的灵敏度为5个/ml。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明石英晶体微天平频率变化相对于Ramos细胞浓度的对数的线性工作曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
HS-C11-NMe3Cl购于Prochimia。用于石英晶体微天平检测的晶片购自BiolinScientific。Fe3O4磁珠(MNPs-COOH)购自天津市倍思乐色谱技术开发中心。DMEM培养液(高葡萄糖含量)购自HyClone公司，双抗购自GE医疗生命科学胎牛血清实验室，胎牛血清购自NATOCOR试剂公司，咪唑购自天津博迪化工股份有限公司，1–(3–二甲氨基醛)–3–乙基二亚胺盐酸盐(EDC)购自天津市巴斯夫化工有限公司，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，CaCl2，(NH4)2CO3和tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)购自阿拉丁试剂公司，20xPBS和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购自Sangon Biotech Co.,Ltd.(上海中国)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)购自铁塔试剂公司，氯化钠(NaCl)购自国药集团化学试剂有限公司，这些试剂均为分析纯。
杂交缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH＝7.4)，清洗缓冲液(5mM Tris，10mM NaCl，pH＝7.4)，固定化缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl，1mM TCEP，pH＝7.4)，所有缓冲液均用0.1M HCl或0.1MNaOH调节pH值。
过氧化氢(H2O2)，浓硫酸(H2SO4)，氨水(NH3·H2O)，无水乙醇(C2H5OH)等使用的其他化学试剂都为分析纯，没有特殊说明，实验过程中所用水为超纯水。
Q-Sense E1石英晶体微天平(Biolin Scientific)；
BC-J80S细胞培养箱(上海博迅公司)；
洁净工作台(上海博迅公司)，洁净等级为100；
280系列水浴锅(德国Thermo scientific公司)；
KDC-140HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；
Hitachi 3400扫面电子显微镜成像仪(日本Hitachi公司)；
磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)；
电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)，可精确到0.0001g；
电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，可精确到0.00001g；
pHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)；
16R型离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；
DHT型磁力搅拌控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；
气浴恒温振荡器(金坛市精达仪器制造厂)；
净化工作台(苏州博莱尔净化设备有限公司)。
实施例1一种基于QCM的细胞检测方法
(1)晶片的清洗：将晶片(石英晶体微天平传感器晶片为瑞典Biolin scientific公司生产的，其直径为14mm，基本频率为5MHz)在食人鱼洗液中浸泡10分钟，然后按照H2O：H2O2：NH3·H2O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟；
(2)Ramos细胞的培养：将Ramos细胞复苏，并将复苏后的Ramos细胞加入适量培养液中分散均匀，进行离心，倒掉上层清液的同时去除细胞中的凋亡细胞；离心后的细胞用细胞培养液分散均匀，移至培养瓶中，并在显微镜下观察细胞状态，将培养瓶放在培养箱中进行孵育，获得Ramos细胞溶液，需要及时观察细胞的生长状况，必要时进行传代；
(3)磁珠的预处理：
①取一定量羧基化的Fe3O4磁珠MNPs-COOH，用0.1M的咪唑盐酸溶液吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液；
②清洗后的磁珠中加入0.1M EDC和0.1M NHS对磁珠进行活化，温度保持在37℃，活化30分钟；活化结束后，在磁珠中加入适配体TDO5，在37℃下反应过夜，得到连接适配体后的磁珠MNPs-a；
③连接适配体后的磁珠用适量的1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入适量1xPBS对磁珠进行稀释；
④将MNPs-a溶液与tDNA(靶标DNA)溶液进行混合杂交，温度保持在37℃，反应1小时，得到MNPs-a与tDNA的杂交体MNPs-a-t；
⑤杂交结束后，用适量的1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入适量1xPBS对其进行稀释，备用；
(4)Ramos细胞置换tDNA：通过细胞计数板对Ramos细胞进行计数；将Ramos细胞溶液与制备的MNPs-a-t进行混合，温度保持在37℃，反应30分钟；在该过程中，细胞与适配体结合并将tDNA置换释放出来；反应结束后，进行磁分离，使磁珠与上层清液分离；
(5)晶片的修饰：
①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的cDNA(捕获DNA)溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③称取一定质量的HS-C11-NMe3Cl，溶解配置成10mM的溶液，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(6)晶片的进一步修饰：
①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，将一定浓度的Ramos细胞置换出来的tDNA上层清液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③配制过量浓度pDNA(探针DNA)，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(7)结晶：将修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl 6mM CaCl2溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末，用一个载体盛放置于氯化钙溶液附近，营造一种二氧化碳的氛围，为氯化钙的结晶提供反应物二氧化碳；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。
核苷酸购自SangonBiotech Co.,Ltd.(上海中国)，其序列如下：
cDNA的核酸序列为：5’-GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3’；SEQ ID NO.1；其3’端修饰-(CH2)6-SH；
tDNA的核酸序列为：5’-CAC CAA GAG GAG ACC CTG AAC AGC CAC CGA ACT ATCCTC CAC-3’；SEQ ID NO.2；
pDNA的核酸序列为：5’-GTG GAG GAT AGT TCG GTG-3’；SEQ ID NO.3；其5’端修饰COOH-；
AptamerTDO5的核酸序列为：5’-AAA AAA AAA AAA CAC CGT GGA GGA TAG TTCGGT GGC TGT TCA GGG TCT CCT CCC GGT G-3’；SEQ ID NO.4；其5’端修饰NH2-(CH2)6-。
经石英晶体微天平传感器实时监测，绘制石英晶体微天平频率变化相对于Ramos细胞浓度的对数的变化，结果如图1所示，发现石英晶体微天平的频率变化与Ramos细胞浓度的对数之间呈现一定的线性关系，其适用范围从5个/ml到6000个/ml，最低检测限为5个/ml。该线性回归满足方程y＝1523.69-3015.04㏒N，其相关系数R2为0.999，其中y是表面结晶化过程中石英晶体微天平传感器的频率变化，N是Ramos细胞浓度。
实施例2基于石英晶体微天平质量放大信号技术的比较
不同的质量放大信号技术可以通过石英晶体微天平传感器用于DNA和细胞的检测，各种放大信号方法的性能比较如表2所示。通过与其他质量放大信号方法的比较，本发明的原位结晶生长放大信号方法检测范围更广，最低检测限LOD更低。
表2质量信号放大技术比较
其中aM为10-18M。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种基于QCM的细胞检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gttcagggtc tcctcccggt g 21
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caccaagagg agaccctgaa cagccaccga actatcctcc ac 42
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtggaggata gttcggtg 18
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaaaaaaaaa aacaccgtgg aggatagttc ggtggctgtt cagggtctcc tcccggtg 58
Claims (2)
1.一种基于QCM的细胞检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)晶片的清洗；Ramos细胞的培养、磁珠的预处理、Ramos细胞置换tDNA、晶片的修饰、晶片的进一步修饰和结晶
(2)Ramos细胞的培养：将Ramos细胞复苏，并将复苏后的Ramos细胞加入培养液中分散均匀，进行离心，倒掉上层清液的同时去除细胞中的凋亡细胞；离心后的细胞用细胞培养液分散均匀，移至培养瓶中，并在显微镜下观察细胞状态，将培养瓶放在培养箱中进行孵育，获得Ramos细胞溶液；
(3)磁珠的预处理：
①取一定量羧基化的Fe3O4磁珠MNPs-COOH，用0.1M的咪唑盐酸溶液吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液；
②清洗后的磁珠中加入0.1M EDC和0.1M NHS对磁珠进行活化，温度保持在37℃，活化30分钟；活化结束后，在磁珠中加入适配体TDO5，在37℃下反应过夜，得到连接适配体后的磁珠MNPs-a；
③连接适配体后的磁珠用1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入1xPBS对磁珠进行稀释；
④将MNPs-a溶液与tDNA溶液进行混合杂交，温度保持在37℃，反应1小时，得到MNPs-a与tDNA的杂交体MNPs-a-t；
⑤杂交结束后，用1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入1xPBS对其进行稀释，备用；
(4)Ramos细胞置换tDNA：将Ramos细胞溶液与制备的MNPs-a-t进行混合，温度保持在37℃，反应30分钟；反应结束后，进行磁分离，使磁珠与上层清液分离；
(5)晶片的修饰：
①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的cDNA溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③称取HS-C11-NMe3Cl，溶解配置成10mM的溶液，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(6)晶片的进一步修饰：
①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，将Ramos细胞置换出来的tDNA上层清液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③配制过量浓度pDNA，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(7)结晶：将修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl6mM CaCl2溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。
2.根据权利要求1所述的一种基于QCM的细胞检测方法，其特征在于，步骤(1)所述晶片的清洗步骤如下：将晶片在食人鱼洗液中浸泡10分钟，然后按照H2O：H2O2：NH3·H2O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟。
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|---|---|
| CN (1) | CN111537603A (zh) |
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| CN1376917A (zh) * | 2002-04-28 | 2002-10-30 | 武汉大学 | 双重放大技术电化学石英晶体微天平检测超痕量dna的方法 |
| CN102393342A (zh) * | 2011-10-25 | 2012-03-28 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法 |
| CN103792370A (zh) * | 2014-02-13 | 2014-05-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片 |
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2019
- 2019-07-26 CN CN201910683907.5A patent/CN111537603A/zh active Pending
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