CN103792370A - 利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片。本发明提供了一种制备用于检测CP4-EPSPS的QCM金片的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；2）将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片。本发明的实验证明，本发明利用石英晶体微天平生物传感器对MCMV的检测进行了研究，通过对两种修饰金片方法11-MUA单独修饰QCM金片和3-MPA和11-MUA共同修饰QCM金片作比较，分析3-MPA和11-MUA共同修饰QCM金片检测灵敏度高、特异性好，且能应用于实际检测的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片。
背景技术
草甘膦不仅是一种对于一年生和多年生杂草五中普遍适用的广谱、高效除草剂,而且具有土壤强吸收性和哺乳动物、鸟类、鱼类低毒性等有利于环境的特性。广泛用于果园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理,以及出苗后定向处理,是全世界除草剂使用量最大的品种之一。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)催化倒数第二个莽草酸途径,当底物磷酸烯醇丙酮酸盐有高度亲和性的时候酶表现出高度耐草甘膦特性，在催化合成芳香酸，苯基丙氨酸和酪氨酸时这是关键步骤，也伴随一些吲哚乙酸、木质素和植物抗毒素等次生化合物。是许多抗生素除草剂的首选靶标酶。草甘膦能与植物的EPSPs结合导致植物死亡。从天然的农杆菌菌系CP4中分离的EPSPs酶有很好的抗草甘膦功能，称CP4-EPSPs。
全球抗草甘膦作物种植面积呈逐年上升趋势。转基因作物进入市场以来，引起食品安全与控制的普遍警惕。草甘膦的长期使用会影响土壤微生物，加大大豆根部病害几率，而最为严重的是抗草甘膦杂草的出现，因此，掌握科学快速检测抗性杂草的方法以便及对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大。目前检测EPSPs基因方法主要有基于核酸水平的PCR法和基于蛋白水平的酶联免疫法和免疫层析试纸条法。阚贵珍等研究结果表明试纸条法中阴性样品一条带阳性样品两条带，PCR检测结果中阳性基因特异片段为146bp。董峰双夹心酶联免疫法结果表明检出限为80ppb。G.J.Rogan用酶联免疫法检测大豆中CP4-EPSPs蛋白的检出限为210μg/g，变异系数小于15%。
石英晶体微天平是一种简单，效价高，高分辨率，利用压电效应原理的质量传感技术。免疫学检测法可以检测具有抗原性的蛋白质类表达产物,它是通过抗原-抗体特异性反应来实现的，抗原-抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应,在一般情况下,抗原只和由自己诱导产生的抗体或具有相同抗原决定簇的抗原诱导产生的抗体进行特异性反应。所以,免疫学反应具有高度的特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备用于检测CP4-EPSPS的QCM金片的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；
2）将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片。
上述方法中，上述QCM金片为单侧镀金片，12mm×20mm，单侧镀金50nm，BioNavis公司，货号QSX301-Au-13052。
步骤1）中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备：将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中。
步骤1）中，所述浸泡为4℃浸泡12h；
上述方法中，
步骤1）中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔比为1:10。
上述方法中，
所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9M；
所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9M。
上述方法中，
步骤2）中，将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗目的蛋白抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过共价键连接。
步骤2）中，所述将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片具体按照如下方法制备：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修饰后金片表面，常温（25℃）下静置2小时；再滴加所述抗CP4-EPSPS抗体，37℃反应3小时；再滴加浓度为1mg/mLBSA，25℃下静置1小时，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片；
含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）和Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）的溶液：EDC和Sulfo-NHS溶于MES溶液，使EDC在溶液中的终浓度0.075M，NHS在溶液中的终浓度为0.015M。
MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：称取3.90g MES溶于180mLddH2O，调节pH至5.0，定容到200mL。
上述方法中，
所述抗目的蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
上述方法中，
所述目的蛋白为抗草甘膦蛋白，所述抗草甘膦蛋白具体为CP4-EPSPS；
所述抗目的蛋白抗体为抗CP4-EPSPS单克隆抗体。
由上述的方法制备的用于检测目标蛋白的QCM金片也是本发明保护的范围；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。
上述的用于检测目标蛋白的QCM金片在检测目标蛋白中的应用也是本发明保护的范围；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。
上述的用于检测目标蛋白的QCM金片在检测抗除草剂转基因植物中的应用也是本发明保护的范围；所述除草剂具体为草甘膦。
本发明的实验证明，本发明根据抗原抗体特异性结合的原理，将CP4-EPSPs蛋白单克隆抗体修饰到金片上，通过QCM生物传感器对有抗原性的CP4-EPSPs蛋白特异性检测，可以实现方便快捷，真实可靠，检测过程在两个小时以内，方便实际样品检测，灵敏度高达0.01%，与其他检测方法比较，具有很强的实际应用优势。本发明用QCM检测CP4-EPSPs转基因蛋白的方法，可以广泛应用到进出口植物检验检疫工作中，对于转基因检测有着重要的应用价值。作为特异性检测草甘膦转基因蛋白芯片,具有较好的稳定性与保存性,发挥出商业价值。
附图说明
图1为QCM检测CP4-EPSPs蛋白的灵敏度与重复性
图2为QCM检测CP4-EPSPs蛋白的特异性
图3为3-MPA和11-MUA共修饰的QCM金片检测实际样品柱形图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分列举如下：
石英晶体微天平（Biolin Scientific AB公司）；CP4-EPSPS蛋白（序列1）及抗CP4-EPSPS单克隆抗体（购自北京陆桥质检科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）（上海游然传感科技有限公司）；N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)二亚胺（EDC）（Sigma公司）；N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）（Sigma公司）；脂肪酸甲酯磺酸盐（MES）（上海共价化学科技有限公司）；缓冲液PBS（Sigma公司）；巯基十一酸（11-MUA）和3-巯基丙酸（3-MPA）（上海共价化学科技有限公司）；Tis-HCl（pH6.5）(上海共价化学科技有限公司)；30%氨水和氨水（北京翰隆达科技发展有限公司）。Bt蛋白抗原，10%转基因玉米标准品MON810（欧体标准物质与测量研究所，ERM-BF-413gk）和非转基因玉米。
下述实施例中所用的溶液的配置：
（1）3-巯基丙酸（3-MPA）乙醇溶液（10mM）：用分析天平称取0.1061g3-MPA溶于100mL无水乙醇中，混匀。
（2）巯基十一酸（11-MUA）乙醇溶液（10mM）：用分析天平称取0.2183g11-MUA溶于100mL无水乙醇中，混匀。
（3）MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：用分析天平称取3.90g MES溶于180mL ddH2O，调节pH至5.0，定容到200mL。
（4）含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）和Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）的溶液：用分析天平称取一定量的EDC和Sulfo-NHS溶于100μL MES溶液，振荡均匀，使EDC在溶液中的浓度0.075M，NHS在溶液中的浓度0.015M。现用现配。
（5）磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：用分析天平分别称取4g NaCl、0.72g Na2HPO4、0.12g KH2PO4和0.1g KCl溶于480mL灭菌后的蒸馏水中，使用酸度仪和HCl调节缓冲液的pH至7.4；然后再向瓶中加入灭菌蒸馏水，定容到500mL。
（6）Tris-HCl（0.1M，pH6.0）：用分析天平称取1.211g Tris-base溶于80mL的ddH2O，用HCl调节pH至6.0，然后定容到100mL。
实施例1、检测CP4-EPSPs蛋白的QCM金片的制备
1、QCM金片预处理
取出QCM金片（QSX301-Au-13052)，先用MilliQ水冲洗表面，之后将金片放入装有混合溶液（混合溶液是将30%氨水、30%双氧水以及MilliQ水按体积比1:1:5混合配制）的小烧杯中。先把水浴锅的温度设定为85℃并使之升温至所设温度，之后将小烧杯放入水浴锅中（注意烧杯不要与水浴锅加热管接触，防止烧杯裂碎），处理大约10分钟。取出烧杯，用平头镊子夹出金片，用MilliQ水清洗金片表面残留液体，用氮气吹干表面；之后用无水乙醇继续清洗金片表面，氮气吹干，为清洗后的QCM金片，待用。
2、修饰QCM金片
含有11-MUA和3-MPA乙醇溶液按照如下方法制备：将10mM的11-MUA和10mM的3-MPA溶于无水乙醇中，得到的溶液，按照1:10混合，其中：11-MUA在溶液中的终浓度为0.9M，3-MPA在溶液中的终浓度为9mM。
将上述1得到的预处理QCM金片置于装有含有11-MUA和3-MPA乙醇溶液的玻璃瓶中，为了防止溶液挥发用封口膜封闭瓶口，4℃浸泡12h，得到11-MUA和3-MPA共修饰的QCM金片。
3、固定单抗的QCM金片
将抗CP4-EPSPS单抗固定到修饰后金片为将抗CP4-EPSPS单抗与上述2得到的11-MUA和3-MPA共修饰的QCM金片上的11-MUA和3-MPA通过共价键连接；具体方法如下：
1）活化
用无水乙醇淋洗上述2得到11-MUA和3-MPA共修饰的QCM金片表面，然后用氮气干燥，再将含有0.075M的EDC和0.015M的Sulfo-NHS的溶液均匀滴加在QCM金片表面，常温（25℃）下静置2小时，用以活化固定在QCM金片表面的11-MUA和3-MPA的硫醇羧基，得到活化的金片。
2）固定单抗
倒掉经过1）处理的活化的金片上的含有0.4M的EDC和0.1M的Sulfo-NHS的溶液，用无水乙醇清洗金片表面，并用氮气吹干表面；将Tris-HCl（0.1M，pH6.0）稀释CP4-EPSPS蛋白单抗浓度为0.2mg/mL，然后将单抗溶液均匀地滴加在QCM金片表面，放在调好温度的（37℃）恒温箱内反应3小时，3小时后用MilliQ水清洗QCM表面残留的单抗溶液并用氮气吹干；在QCM金片表面滴加BSA，浓度为1mg/mL（PBS稀释），常温（25℃）下静置2小时，达到封闭未结合的NHS-酯基的目的；然后清洗金片表面，用氮气吹干待用（存放于PBS溶液中，4℃），得到固定抗CP4-EPSPS单抗的QCM金片。
实施例2、利用石英晶体微天平传感器检测CP4-EPSPs蛋白
石英晶体微天平传感器检测方法：将修饰好的金片固定于QCM传感器中，打开蠕动泵开始流速为200μl/min，样品管通入PBS，等基线稳定流速改为50μl/min,通入待检测抗原，PBS稀释到目标浓度，通过Qsoft软件的中F和D的变化，实时观察反应结果。
1、QCM检测CP4-EPSPS蛋白的灵敏度
将待测抗原CP4-EPSPS蛋白用PBS稀释成500ng/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL，取100μL的每个浓度的CP4-EPSPS蛋白按照上述的方法进行QCM检测。
结果如图1所示，当进样时间约20min左右秒后，蠕动泵将抗原溶液送达金片表面，引起金片频率下降和耗散上升，说明抗原与QCM金片表面固定的抗体特异性地结合在一起。抗原溶液样品浓度越大，与金片表面单抗结合的抗原越多，引起频率下降越多。由图1可知用QCM检测CP4-EPSPs蛋白的灵敏度可以达到500ng/ml,其频率下降分别为1.39、1.55和1.72HZ。
2、QCM检测CP4-EPSPS蛋白的重复性
在同样的条件下分别对15片QCM金片进行清洗、修饰活化、固定单克隆抗体等过程，将固定好单抗的QCM金片用于检测上述5种浓度的抗原，每个浓度测量三次，得到结果如表1，计算了三次测量值的平均值、SD及CV%。得到的CV%均小于相应平均值的10%，说明QCM金片检测CP4-EPSPs蛋白的重复性较好。
结果如表1所示，每次检测都有明显的反应，且同一浓度的响应值差异很小，随蛋白浓度的降低反应响应值也相应减小，表明QCM检测CP4-EPSPS的重复性较好。
表1 QCM金片的重复性
3、QCM检测CP4-EPSPS蛋白的特异性
为了验证QCM检测CP4-EPSPS蛋白（序列1）的特异性，选用由Bt基因编码的Bt蛋白cry1Ah1（序列2）作为对照，分别用两种蛋白CP4-EPSPS和cry1Ah单独及其等体积混合样进行检测，进样体积均为1ml，浓度为15μg/mL，按照上述的QCM检测方法进行特异性检测实验。
结果如图2，检测同样浓度的样品溶液，只有含有CP4-EPSPs蛋白的抗原溶液有明显的响应。说明该方法修饰的金片金片具有良好的特异性。
4、QCM检测待测样品中的CP4-EPSPS蛋白
称取100mg转基因含量分别为0.1%转基因玉米（0.1%Mon810，已经证明含有CP4-EPSPS蛋白）和0.01%转基因玉米（0.01%Mon810，已经证明含有CP4-EPSPS蛋白）（欧盟联合研究中心标准物质与计量研究所ERM-BF-413gk），使用研磨仪将样品砸成粉末，用1000ul PBS溶解样品，室温（25℃）静置10min,12000r离心10min，吸取上清液后过滤，按照上述方法用QCM进行检测。10%的阳性样品为阳性对照，非转基因的阴性样品为阴性对照，重复三次，记录实验数据取平均值。
结果如图3所示，可以看出，两个浓度的转基因玉米溶液均有响应，因此可知此方法可用作检测实际的转基因样品。
Claims (10)
1.一种制备用于检测目的蛋白的QCM金片的方法，包括如下步骤：
1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；
2）将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备：将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔比为1:10。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9M；
所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9M。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
步骤2）中，将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗目的蛋白抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过共价键连接。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述抗目的蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述目的蛋白为抗草甘膦蛋白，所述抗草甘膦蛋白具体为CP4-EPSPS；
所述抗目的蛋白抗体为抗CP4-EPSPS单克隆抗体。
8.由权利要求1-7任一所述的方法制备的用于检测目标蛋白的QCM金片；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。
9.权利要求8所述的用于检测目标蛋白的QCM金片在检测目标蛋白中的应用；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。
10.权利要求8所述的用于检测目标蛋白的QCM金片在检测抗除草剂转基因植物中的应用；所述除草剂具体为草甘膦。
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