CN117986381A - 一种胰岛素缀合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种胰岛素缀合物及其制备方法和应用。胰岛素缀合物的氨基酸结构为：GLP‑1(7‑37)类似物‑(GQAP)₃‑胰岛素类似物。本发明提供的缀合物能够用于治疗胰岛素依赖性糖尿病，具有优异的治疗效果，并且能起到降低食欲、减少体重增加的作用，解决传统胰岛素及其衍生物的使用会引起患者体重增加副作用的问题。

Description

一种胰岛素缀合物及其制备方法和应用

本申请要求2022年11月4日提交的申请号为202211379884.7的专利申请的全部优先权。该申请的全部内容全部以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种胰岛素缀合物及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和/或胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪等代谢紊乱性疾病，以高血糖为主要标志，可由遗传和环境等多种因素引起。糖尿病是人类三大致死疾病之一，它的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症。

胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，外源性胰岛素及胰岛素衍生物主要用来治疗糖尿病。胰岛素由A、B两个肽链组成，人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共51个氨基酸；其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来，此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。胰岛素由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌。胰岛素在细胞水平的生物作用是通过与靶细胞膜上的特异受体结合而启动的；胰岛素受体为胰岛素起作用的靶细胞膜上特定部位，仅可与胰岛素或含有胰岛素分子的胰岛素原结合，具有高度的特异性。

胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的促胰素，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、刺激胰岛β细胞增殖、诱导胰岛β细胞再生、阻止胰岛β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性和增加葡萄糖的利用等作用。因此，GLP-1及其类似物和衍生物在治疗I和II型糖尿病的发生、发展中起着重要作用。而且，GLP-1及其类似物优点在于其不仅能够有效降低血糖，且能够降低体重、调节血压血脂、使心血管获益、无低血糖风险。

目前，鲜有关于胰岛素和GLP-1相关多肽缀合物相关的研究和报道，鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胰岛素和GLP-1(7-37)相关多肽药物的缀合物，该缀合物通过特定的连接肽将胰岛素类似物和GLP-1(7-37)类似物连接而成。本发明的缀合物将两者缀合修饰，在具备完全的降糖效力的胰岛素基础上，引入后者的靶点活性，能起到降低患者食欲、减轻体重的作用，解决传统的胰岛素及其衍生物使用会引起患者体重增加的副作用的问题。

本发明缀合物中的胰岛素衍生物可以是天然胰岛素或胰岛素类似物，更优选为具备长效作用的胰岛素类似物。

如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指与天然胰岛素具有至少80％氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸残基上的一些基团可以被化学取代、缺失或修饰，并且该衍生物具有调节体内血糖水平的功能。

术语“GLP-1(7-37)类似物”是指是指在人天然GLP-1(7-37)基础上，通过添加、删除或突变一到多个氨基酸得到的类似物。

术语“胰岛素缀合物”是指胰岛素与其他多肽以共价键(包括Linker)相互连结而形成的多肽。

术语“胰岛素”是指为51个氨基酸残基多肽(5808道尔顿)的激素，其在许多关键细胞过程中起重要作用。人胰岛素的成熟形式由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808Da的A链(GlyAl-AsnA21)和B链(PheB1-ThrB30)。该分子通过两个链间(A20-B19，A7-B7)和一个链内二硫键(A6-A11)稳定。本发明的胰岛素包括天然的、通过合成提供的或基因工程化的(例如重组的)来源，在本发明的各种实施方式中，胰岛素可以是人胰岛素。

术语“促包涵体序列”是指连接在目的蛋白或多肽前，用于促进包涵体表达或形成的多肽序列。

术语“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸序列的分子，无论长度、翻译后修饰或功能。

本发明第一方面提出一种胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，胰岛素缀合物的氨基酸结构如下所示：

GLP-1(7-37)类似物-(GQAP)₃-胰岛素类似物；

即，GLP-1(7-37)类似物、氨基酸序列为(GQAP)₃的连接肽和胰岛素类似物通过共价键依次连接，(GQAP)₃分别与胰岛素B链的N末端和GLP-1(7-37)类似物的C末端相连。

其中，本发明中的胰岛素类似物由胰岛素A链和胰岛素B链组成，胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；胰岛素B链和胰岛素A链通过分子间二硫键相连。

进一步优选的，胰岛素B链的赖氨酸的ε-氨基上连接有脂肪酸侧链，以延长其作用时间，达到长效效果。

作为本发明的一个优选的技术方案，GLP-1(7-37)类似物的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

作为本发明的又一优选的技术方案，脂肪酸侧链可以采用COOH(CH₂)_14～20CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-；优选采用COOH(CH₂)_18～20CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-；进一步优选采用COOH(CH₂)₁₈CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-。

其中，AEEA是指2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。

本发明的胰岛素上部分氨基酸使用代号如A7、B7、A20和B19表示，上述数字中A和B分别代表胰岛素A链和胰岛素B链，而其中的数字则表示对应天然人胰岛素A链和天然人胰岛素B链的氨基酸的位置。如A7表示在胰岛素序列中，对应天然人胰岛素A链第7位的氨基酸；B7表示在胰岛素序列中，对应天然人胰岛素B链第7位的氨基酸。对于天然人胰岛素而言，A7、B7、A20和B19均为半胱氨酸(Cys)，并分别利用半胱氨酸的巯基在A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)之间形成两个二硫键，使A、B两链连接起来，此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键；本发明衍生物中的胰岛素类似物部分，同样利用上述二硫键相连。

第二方面，本发明还提供了一种含有胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐的可溶性药物组合物。该药物组合物中还包括药学上可接受的辅料，辅料包括防腐剂、渗透压调节剂；防腐剂可以是苯酚和/或间甲酚，渗透压调节剂是甘油。优选地，辅料包括苯酚、间甲酚和甘油。更优选地，辅料包括苯酚和甘油。优选地，本发明可溶性药物组合物的pH＝7～8.5，优选为7.5～8.5，或7.8～8.5，或7.8～8.3。

进一步地，本发明提供了可溶性药物组合物包含多于2个锌原子/6分子胰岛素缀合物；优选为2～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或4～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或5～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或8～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或8～10个锌原子/6分子胰岛素缀合物。

本发明还提供该胰岛素缀合物的制备方法，方法可以采用化学合成法，也可以采用制备重组基因工程菌发酵表达法。

具体的，本发明第三方面提出一种融合蛋白，该融合蛋白可以通过重组基因工程菌发酵表达获得，用于进一步获得本发明第一方面的胰岛素缀合物。具体的，融合蛋白至少由促包涵体序列、酶切位点片段和胰岛素缀合物前体依次连接而成；促包涵体序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，酶切位点片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

胰岛素缀合物前体的氨基酸结构如下所示：

GLP-1(7-37)类似物-(GQAP)₃-胰岛素类似物前体；

其中，胰岛素类似物前体由胰岛素A链、胰岛素B链和linker组成，胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，胰岛素B链与胰岛素A链通过linker连接，linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；其中，(GQAP)₃分别与胰岛素B链的N末端和GLP-1(7-37)类似物的C末端相连。

即，胰岛素缀合物前体由GLP-1(7-37)类似物、(GQAP)₃、胰岛素B链、linker、胰岛素A链依次连接而成。

作为本发明的一个优选的技术方案，GLP-1(7-37)类似物的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

作为本发明一种具体的实施方式，融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.7。

本发明第四方面提出一种用于上述融合蛋白的多核苷酸片段，多核苷酸片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.8。

本发明第五方面提出一种表达载体，该表达载体包含本发明第五方面提出的多核苷酸片段。表达载体可以选用重组pET-28a(+)表达载体、重组pET-30a(+)表达载体或重组pET-32a(+)表达载体，并优选重组pET-30a(+)表达载体。

本发明第六方面提出一种重组大肠杆菌工程菌，该重组大肠杆菌工程菌包含上述表达载体，具体的，大肠杆菌选自BL21(DE3)，其构建方法可采用：

(1)合成多核苷酸片段，具体如SEQ ID NO.8所示；

(2)将该多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

(3)将该表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌工程菌。

本发明第七方面提出一种胰岛素缀合物的制备方法，至少包括如下步骤：

(1)培养上述重组大肠杆菌工程菌，表达融合蛋白；

(2)融合蛋白经变性、复性和酶切，得到胰岛素缀合物前体；

(3)在胰岛素缀合物前体上连接脂肪酸侧链，获得胰岛素缀合物；

脂肪酸侧链为COOH(CH₂)_14～20CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-，连接于胰岛素B链的赖氨酸的ε-氨基上；

优选的，脂肪酸侧链为COOH(CH₂)_16～18CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-；

更优选为COOH(CH₂)₁₈CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-。

具体的，胰岛素缀合物的制备方法中的步骤(1)包括：

S11、菌种活化，得到活化种子培养液；

S12、发酵培养：将活化种子培养液接种至发酵培养基；

S13、诱导表达：当OD 600值为140～145时，添加IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0.9～1.1mmol。

根据目的蛋白表达量的研究发现，当诱导OD600不达到140时，目的蛋白的表达量略低。诱导OD 600值进一步优选为142，添加IPTG诱导表达，IPTG终浓度优选为1.0mmol。

本发明第八方面提出上述胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在制备治疗代谢性疾病的药物中的应用。具体的，代谢性疾病包括但不限于：糖尿病(I型糖尿病、II型糖尿病)、超重和肥胖、脂肪性肝炎(NASH、ASH)、心血管疾病、脂肪肝、肝硬化、非酒精性脂肪肝病、代谢综合征及各种糖尿病并发症。

本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明提供的缀合物能够用于治疗胰岛素依赖性糖尿病，具有优异的治疗效果，并且能起到降低患者食欲、减少体重增加的作用，解决传统的使用胰岛素及其衍生物会引起患者体重增加的副作用。

附图说明

图1为重组工程菌的诱导表达后的SDS-PAGE分析结果；

图2为重组工程菌的生长产曲线；

图3为高血糖动物模型的降糖实验结果；

图4为正常实验动物的减重实验结果；

图5为肥胖动物模型的减重实验结果。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

本实施例用于说明胰岛素缀合物的制备方法。

(1)胰岛素缀合物蛋白的表达

将促包涵体序列(SEQ ID NO:4)、酶切序列(SEQ ID NO:5)和本发明胰岛素缀合物前体串联作为融合蛋白，胰岛素缀合物前体的氨基酸结构由GLP-1(7-37)类似物、(GQAP)₃、胰岛素B链、linker、胰岛素A链依次连接而成；融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

构建上述融合蛋白的编码基因序列，并使用化学合成的方式获得基因片段，序列如SEQ ID NO:8所示。

通过NdeI和XhoI位点，将上述片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中并测序验证，得到表达质粒称作pET-30a(+)-HSP008-084。

(2)表达本申请GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌的构建：

取表达质粒pET-30a(+)-HSP008-084 2μL加入50μL BL21感受态细胞(TransGenBiotech)中，置冰上30min；42℃热激90sec，迅速置冰中5min；向离心管中加入900μL无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1小时，使细菌复苏。吸取100μL涂布于含有卡那霉素抗性的LB琼脂培养基平板上。倒置平板，37℃过夜培养。次日，使用接种环挑取单克隆菌落(平板背面进行标记)，接种于8mL的无菌LB液体培养基(含抗生素)，37℃220rpm摇床培养至OD600约3～4。保藏为相应GLP-1(7-37)类似物的一级种子液。

(3)表达本申请GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌的诱导表达：

挑取上述步骤(2)中转化平板上的单克隆(步骤(2)中一级种子液对应同一单菌落)接种于含50μg/mL卡那霉素的10mL LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1％接种量接种于50μg/mL卡那霉素的10mL LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6～0.8；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃220rpm摇床培养，诱导融合蛋白表达；之后收集菌体,进行SDS-PAGE检测分析。实验结果如图1所示。

(4)重组工程菌的发酵表达：

向50mL含50μg/mL卡那霉素的2xYT液体培养基中加入50μL上述步骤(2)保存的一级种子液菌液，混匀后置于恒温振荡器中，37℃、200rpm过夜培养，OD600＞5.0后取40mL接入含50μg/mL卡那霉素的200mL 2xYT培养基中，混匀后置于恒温振荡器中，37℃200rpm培养3h，OD600＞3.0，得二级种子培养液。取二级种子60mL，按1:10的比例接种于发酵培养基中(600mL)在2L发酵罐内进行培养，检测培养菌液OD600值达到140左右的时候，开始接入IPTG，终浓度为0.5mmol/L，诱导后培养24h结束培养，8000rpm离心30min，收集菌体，菌体收率约为280g/L发酵液，离心收获的菌体进行目的蛋白表达量测定，表达量均不低于10g/L。

其中两个批次的发酵数据如表1所示：

表1

批次号	HSP008-084-20221227-1	HSP008-084-20220823-1
			一级种子OD600(16h)	6.90	7.58
二级种子OD600(3h)	3.62	3.43
			接种体积(mL)	60.00	60.00
初始体积(L)	0.70	0.70
			初始OD600	NA	NA
pH控制	6.80	6.80
			诱导温度	32.00	32.00
诱导OD600	142.00	135.20
			IPTG终浓度(mM)	0.50	0.50
收菌OD600	335.20	328.00
			菌液体积(L)	1.500	1.500
菌体总湿重(g)	423.41	410.36
			cellmass(g/L)	282.27	273.57
菌液重量(g)	1503.00	1530.46
			浓度(mg/mL)	1.059	0.503
表达量g/g(占菌体％)	5.45	3.48
			表达量g/L	15.36	9.52

由表1可知，当诱导OD600不达到140时，目的蛋白的表达量略低。HSP008-084-20221227-1的微生物生产曲线如图2所示。

(5)制备胰岛素缀合物前体(GLP-1(7-37)-Insulin)

称取100g菌体，重悬于500mL的缓冲液1(50mM Tris-HCl、pH8.0，50mM NaCl)中，用超声波细胞粉碎机超声30min，以使细胞破碎，所得匀浆在4℃下以13000g离心30min，离心完成后收集沉淀，使用缓冲液2(8M尿素，40mM半胱氨酸，50mM Tris-HCl，pH8.0)溶解，然后用水稀释10倍即为酶切前样品溶液；

使用EK酶将标签序列切除：中间产物中加入稀盐酸、调pH至7.4，20℃条件下按照EK酶(1U/μL)：酶切前样品溶液＝1：15(体积比)加入EK酶混匀后酶切过夜；

酶切后的纯化：利用50mM柠檬酸(pH＝3.0)平衡过的Capto S(购自cytiva)对酶切样品进行浓缩，50mM柠檬酸(pH＝3.0)溶液淋洗后，再按0～100％洗脱液(50mM柠檬酸，pH＝3.0，1M氯化钠)梯度洗脱，得到粗品；

修饰前的精纯：利用平衡液3(含有0.1％TFA、20％乙腈的水溶液)平衡过的UniHybrid10-200 C8柱(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩，平衡液3淋洗后，再按0～100％洗脱液(含有0.1％TFA，80％乙腈的水溶液)梯度洗脱，经PR-UPLC纯度约为90％以上。

(6)制备胰岛素缀合物：

脂肪酸修饰：步骤(5)制备得到的缀合物前体中加水，配制成0.5～10mg/mL溶液，加入1M氢氧化钠调整pH至11.0～11.5，摇匀使蛋白完全溶解，UV定量多肽浓度；按多肽与十八烷二酸单叔丁酯-谷氨酸(1-叔丁酯)-AEEA-AEEA-OSU-摩尔比1:4称取脂肪酸粉末溶于乙腈中，将多肽样品与脂肪酸溶液混合，将混合液于4℃静置一小时，然后样品加水稀释5倍，用1M柠檬酸(或10％乙酸)调pH至4.8终止反应，放于4℃静置酸沉10min，酸沉后以13000g、4℃离心30min，然后将沉淀放于-80℃保存；

脂肪酸脱保护与纯化：向得到的沉淀中加入TFA至多肽终浓度约10mg/mL，震荡使沉淀溶解，置于室温静置脱保护30min，然后滴入4M NaOH调节pH至7.5～8.5终止反应；

用蛋白纯化层析系统(赛谱SDL100)将反应终止后的反应液按3mL/min流速，泵入事先用平衡液3(含有0.1％TFA、20％乙腈的水溶液)平衡过的UniHybrid10-200 C8(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩，平衡液3淋洗后，再按0～100％洗脱液(含有0.1％TFA、80％乙腈的水溶液)梯度洗脱，收集洗脱峰经RP-UPLC检测纯度约为90％；洗脱峰用水稀释3倍，酸沉调整pH至4.80，4℃酸沉30min，离心后沉淀中加入PB缓冲液(pH7.0)复溶后-80℃冻存，得到胰岛素缀合物HS-008-084-C20。

实施例2：

本实施例用于说明实施例1制备得到的胰岛素缀合物HS-008-084-C20对高血糖动物模型的降糖效果。

(1)实验动物：

6～8周龄/雄性C57BL/6J小鼠，32只体重在18～20g之间；

(2)实验方法：

造模：小鼠在适应性饲养1周，高脂饲料饲养6～8周后，小鼠禁食16h后腹腔注射STZ(80mpk)诱导高血糖模型，诱导后7天检测血糖，随机血糖值在16.8mmol/L以上为造模成功。

分组与给药：按照表2对模型小鼠按照血糖和体重分组，并给药，阳性对照与实验组1为基本等摩尔给药；

表2

(3)结果统计

图3为血糖测试结果。由图3可知，本发明HS-008-084-C20与Icodec对比，降糖活性优于Icodec，药效持续更久，与体外活性检测结果相符。实验组1和实验组2的降糖效果均较好。

实施例3：

本实施例用于说明实施例1制备得到的胰岛素缀合物HS-008-084-C20对正常实验动物的减重效果。

(1)实验动物：

实验动物为BKS-LeprREM/Gpt小鼠，数量15只，周龄为6周龄，雄性；(2)实验方法：

造模：选取BKS-LeprREM/Gpt小鼠，按照体重随机分组，每组包含5只小鼠，分为模型对照组、阳性对照组(Icodec)和实验组(HS-008-084-C20)；阳性对照组与实验组为等摩尔给药。

给药方式：腹部皮下注射，给药频率为2天一次，连续给药5次，具体见表3：

表3

(3)结果统计

减重实验结果见图4。由图4可知，在等摩尔给药情形下，本发明胰岛素缀合物减重效果显著，远高于Icodec。因此，本发明的胰岛素缀合物不仅具备优异的胰岛素降糖活性，同时能显著抑制体重增加。

实施例4：

本实施例用于说明实施例1制备得到的胰岛素缀合物HS-008-084-C20对肥胖动物模型的减重效果。

(1)实验动物：

6～8周龄/雄性C57BL/6J小鼠，18只，体重在18～20g之间；

(2)实验方法：

造模：选取6～8周C57BL/6J雄性小鼠18只，高脂饲料(60％脂肪)饲养8周后，按照体重随机分组，每组包含6只小鼠，分为模型对照组、阳性对照组(Tirzepatide)和实验组(HS-008-084-C20)；阳性对照组与实验组为等摩尔给药。

给药方式：腹部皮下注射，给药频率为2天一次，连续给药5次，具体见表5：

表5

(3)结果统计

减重实验结果见图5。由图5可知，在等摩尔给药情形下，本发明的胰岛素缀合物减重效果显著，稍弱于Tirzepatide。因此，本发明胰岛素缀合物不仅具备优异的胰岛素降糖活性，同时能显著抑制体重增加。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (15)

1.一种胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，所述胰岛素缀合物的氨基酸结构如下所示：

GLP-1(7-37)类似物-(GQAP)₃-胰岛素类似物；

其中，所述胰岛素类似物由胰岛素A链和胰岛素B链组成，所述胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述胰岛素B链和所述胰岛素A链通过分子间二硫键相连；

所述(GQAP)₃分别与所述胰岛素B链的N末端和所述GLP-1(7-37)类似物的C末端相连；

所述胰岛素B链的赖氨酸的ε-氨基上连接有脂肪酸侧链，所述脂肪酸侧链为COOH(CH₂)_14～20CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-。

2.根据权利要求1所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述GLP-1(7-37)类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种含有如权利要求1～2任一项所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐的可溶性药物组合物，其特征在于，所述可溶性药物组合物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括防腐剂和渗透压调节剂中的至少一种；

优选的，所述防腐剂选自苯酚和/或间甲酚，所述渗透压调节剂选自甘油。

4.根据权利要求3所述的可溶性药物组合物，其特征在于，所述组合物包含2～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物；

优选为4～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，更优选为8～10个锌原子/6分子胰岛素缀合物。

5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少由促包涵体序列、酶切位点片段和胰岛素缀合物前体依次连接而成；所述促包涵体序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述酶切位点片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述胰岛素缀合物前体的氨基酸结构如下所示：

GLP-1(7-37)类似物-(GQAP)₃-胰岛素类似物前体；

所述胰岛素类似物前体由胰岛素A链、胰岛素B链和linker组成，所述(GQAP)₃分别与所述胰岛素B链的N末端和所述GLP-1(7-37)类似物的C末端相连；

所述胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述胰岛素B链的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；所述胰岛素B链与所述胰岛素A链通过linker连接，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1(7-37)类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列选自SEQID NO.7。

8.一种用于编码权利要求6或7所述的融合蛋白的多核苷酸片段，其特征在于，所述多核苷酸片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.8。

9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求8所述的多核苷酸片段。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自重组pET-28a(+)表达载体、重组pET-30a(+)表达载体、重组pET-32a(+)表达载体。

11.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌包含如权利要求9或10所述的表达载体，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)。

12.根据权利要求11所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：

(1)合成如权利要求8所述的多核苷酸片段；

(2)将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

(3)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。

13.一种胰岛素缀合物的制备方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

(1)培养如权利要求11或12所述的重组大肠杆菌工程菌，表达所述融合蛋白；

(2)所述融合蛋白经变性、复性和酶切，得到胰岛素缀合物前体；

(3)在所述胰岛素缀合物前体上连接脂肪酸侧链，获得所述胰岛素缀合物；

所述脂肪酸侧链为COOH(CH₂)_14～20CO-γ-Glu-AEEA-AEEA-，连接于所述胰岛素B链的赖氨酸的ε-氨基上。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：

S11、菌种活化，得到活化种子培养液；

S12、发酵培养：将所述活化种子培养液接种至发酵培养基；

S13、诱导表达：当OD 600值为140～145时，添加IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0.9～1.1mmol。

15.如权利要求1～3任一项所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐、或如权利要求4所述的药物组合物在制备治疗代谢性疾病的药物中的应用。